オキソエイコサノイドシグナルはゼブラフィッシュの初期抗菌防御を媒介する

レポート| 第42巻 第1号 111974号 2023年1月31日発行
オキソエイコサノイドシグナルはゼブラフィッシュの初期抗菌防御を媒介する
馬延安
キング・ラム・ホイ
Zaza Gelashvili
フィリップ・ニートハマー 3

脚注を表示するオープンアクセス公開日:2023年1月10日DOI:https://doi.org/10.1016/j.celrep.2022.111974
PlumX メトリクス

ハイライト

5-oxoETEとその受容体OXER1は細菌感染によって誘導される

OXER1のオルソログは魚類とヒトには存在するが、一般的なげっ歯類モデルには存在しない

OXER1の自然免疫機能は、ゼブラフィッシュのモデルで明らかになった
まとめ
5-oxoETE は、ホスホリパーゼ A2 の活性化と酸化ストレスが重なったときに生成するアラキドン酸由来の生理活性脂質である。5-oxoETEは、Gタンパク質共役型受容体OXER1を介して、白血球の走化性因子として作用する。しかし、その生理的機能は、OXER1の異常な保存パターンにより、これまで不明なままであった。OXER1は魚類から霊長類まで保存されているが、齧歯類では保存されていないため、マウスでの遺伝子欠損研究は不可能であった。我々は、OXER1の生理的役割を明らかにするために、ゼブラフィッシュのOXER1オルソログhcar1-4の遺伝子改変とトランスクリプトーム、リピドミクス、眼窩内イメージングアッセイを組み合わせて行った。緑膿菌感染症は、他の炎症経路とともに、5-oxoETEとその受容体の合成を誘導する。Hcar1-4欠損は好中球の動員を減弱させ、感染後の生存率を低下させるが、これはhcar1-4またはヒトOXER1の異所性発現によって回復することができた。5-oxoETEが、非齧歯類の脊椎動物における初期抗菌反応の支配的な脂質制御因子であることを明らかにしたことで、我々の研究は、ネズミを中心とした現在の初期炎症の見方を拡大するものである。
図解要約

図のサムネイルfx1
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研究テーマ
CP:免疫学
CP：メタボリズム
はじめに
アラキドン酸（AA）由来の代謝産物は、エイコサノイドと呼ばれるシグナル伝達脂質の大きなファミリーである。これらの脂質は、炎症時や自然免疫防御時の細胞間情報伝達において重要な役割を担っている。エイコサノイドシグナル伝達を標的とする薬剤は、あらゆる医薬品の中で最も多く処方されているが、近年、技術革新がほとんど止まっている。これは、エイコサノイドの生物学がすでに完全に理解され、治療法として活用されていることを反映しているのかもしれない。あるいは、ヒトの病態を必ずしも正確に予測できないネズミのモデルに頼りすぎているのかもしれない。1,2 エイコサノイドの合成経路、受容体機構、生理的役割の多くは、まだほとんど解明されていない。5-オキソETEは、5-リポキシゲナーゼ（ALOX5）と遺伝的に未同定の酵素である5-ヒドロキシエイコサノイドデヒドロゲナーゼ（5-HEDH）の作用により、あるいは非酵素的脂質過酸化によりAAから生成する3）。ALOX5とロイコトリエンA4ハイドロラーゼ（LTA4H）によってAAから生成される、よく研究されている好中球誘引物質ロイコトリエンB4（LTB4）と同様に、純粋な5-oxoETEは白血球、特に好酸球を誘引する4。虚血またはアレルギー性のチャレンジは、in vivoで5-oxoETEレベルを上昇させる5,6 OXER1の薬理学的アンタゴニズムは、サルのアレルギー性の炎症を軽減させる7,8 ヒトの癌では、OXER1遺伝子は頻繁にフレームシフト変異（S78Pfs∗64およびS78Vfs∗61）を示す9。細胞培養研究では、5-oxoETEは濃度によって増殖性または抗増殖性に作用すると報告されている10,11。ゼブラフィッシュでは、OXER1 のオルソログである hcar1-4 をモルフォリノでノックダウンすると、感染していない尾びれの傷に好中球が集まるのを阻害する12。そこで、我々は、ゼブラフィッシュの感染モデルにおいて、オキソエイコサノイドシグナル伝達の役割を明らかにすることを目的とした。
研究成果
自然免疫の研究において、透明なゼブラフィッシュの幼生は、マウスに代わる強力な研究手段です。14 ゼブラフィッシュの幼生は、薄くて半透明であるため、眼窩内イメージングにより、その場で簡便に研究することができます。他の多くのヒト遺伝子（CASP10、ADA2 など）と同様に、OXER1 はマウスやラットには記述されていないが、魚類にはある（図 1A と S1A; 表 S1）。純粋な5-oxoETEや化学的なOXER1拮抗薬もげっ歯類に効果を示すことから、未知のOXER1代替物質が存在する可能性がある15,16,17,18,19。しかし、それが見つかるまで、つまり、それが存在する限り、マウスの遺伝学的手法でオキソエイコサノイド経路を調べることはできない。
図のサムネイルgr1

図1緑膿菌によるゼブラフィッシュ幼虫の耳感染で誘導される5-oxoETE経路
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ENSEMBLデータベース（release 107）によると、206のnot-rat-nor-mouse（NRNM）遺伝子（ここでは、ヒトやネコで保存されているがラットやマウスでは保存されていないゼブラフィッシュ遺伝子と定義）がある（Table S1）。このリストには、高親和性LTB4受容体（BLT1）など、齧歯類のホモログが知られている遺伝子も含まれている。DIOPT20メタサーチ・エンジン（バージョン9.0、2021年9月）を用いて、このような潜在的な偽陽性を除外した結果、NRNM遺伝子と思われる153個が残った（表S1）。齧歯類以外の哺乳類では、眼球内イメージングや遺伝子欠損研究は非常に困難であるため、生理学的役割を明らかにするためには、ゼブラフィッシュモデルが有力な選択となる。
解離した白血球レポーター幼生の蛍光活性化セルソーティング（FACS）と定量的RT-PCR（qRT-PCR）により、2つのゼブラフィッシュオルソログ、hcar1-3およびhcar1-4の転写物が好中球に濃縮されていることが確認された（図1B）12、21。hcar1-4とは異なり、hcar1-3のmRNAもマクロファージに極めて濃縮されている。感染に対する初期転写反応をプロファイルするために、受精後3日目（dpf）のゼブラフィッシュ幼虫の耳小骨への緑膿菌（PA）注入前、注入後2時間および4時間の幼虫のmRNA配列決定（mRNAseq）を既報通りに実施した（図1C）。 22,23,24 mRNAseq発現プロファイルは、本研究のために開発した新規遺伝子相関解析法により、すべての可能な二値遺伝子発現表現型に対する相関距離によってソートした（図S1B、表S2、最初のタブ）。我々の単純な遺伝子相関解析（sGCA）は、他の不偏クラスタリング法のように相互相関によって遺伝子発現プロファイルをクラスタリングするのではなく、実験グループによって定義された二値の「理想表現型」（IP、すなわち論理ゲート）に対する類似性によってクラスタリングする（図S1B）。sGCAは、感染後4時間で最大に誘導される遺伝子からなる最大の炎症クラスタ（IP60）とhcar1-4を関連付けた（図1C、表S2、2および3タブ目）。その最高位の遺伝子オントロジー用語によって、機能プロファイリングはIP60クラスターを「免疫系プロセス」および「防御反応」に分類した（表S2、4番目のタブ）。全てのIPクラスターに対する機能プロファイリング結果を表S2に示す。感染時のhcar1-4の発現時間経過は、cxcr1（インターロイキン8のGPCR）、ltb4r、ltb4r2aおよびltb4r2b（LTB4の高および低親和性GPCR）などの既知の免疫遺伝子を連想させる（図1C、挿入部分）。hcar1-3はmRNAseqではほとんど検出されなかったが、qRT-PCRでは感染時にわずかに誘導されることが示された（図S1C）。Hcar1-4が炎症性遺伝子の転写を制御しているかどうかを調べるために、CRISPR-Cas9を用いて2種類のhcar1-4変異体（hcar1-4mk213とhcar1-4mk214）を作製した（図S1DとS1E）。IP21とIP42は、hcar1-4変異によって有意に誘導または抑制される遺伝子を含んでいる。これらの遺伝子の中には免疫に関連するものもあるが、機能プロファイリングによって有意な炎症性シグネチャーは検出されなかった。Hcar1-4は炎症性遺伝子転写の調節因子というよりも、むしろ標的である可能性がある。ゼブラフィッシュのムチンmucms1 (567x down, P21) とカスパーゼ6 (casp6a, 167x up, P42) は、これらのIPクラスターで最も制御されている遺伝子である（図1C、表S2、2番目と3番目のタブ）。興味深いことに、サルにおける薬理学的なOXER1阻害は、気管支上皮の粘液産生細胞数を減少させることが示された8。これは、粘膜の恒常性におけるOXER1経路の、非炎症性の追加機能と一致している。
微生物感染によって生理的に適切な濃度の 5-oxoETE が生成されるかどうかを調べるため、UC San Diego の LIPIDMAPS 施設で感染したゼブラフィッシュ幼虫の液体クロマトグラフィー結合質量分析法を行った25 。検出された 78 種の脂質のベースライン濃度はかなりの差を示し、中でも 5-oxoETE 前駆体 5-HETE は最も豊富で有意に誘導される種であった。5-oxoETE およびその他の酸化脂肪酸誘導体のベースライン濃度は、受動的な試料酸化の影響を含んでいる可能性があるが、ベースライン補正された感染誘発濃度変化は、生物由来のものである可能性が高い。5-oxoETE は、LTB4 ではなく、感染によってベースラインから約 2 μM の強い有意な増加を示した (図 1D)。先行研究によると、この濃度範囲はin vitroおよびin vivoで好中球を誘引するのに最適な濃度である。
次に、OXER1経路が何らかの関連した抗菌保護を伝えているかどうかを調べた。実際、hcar1-4変異体の微生物増殖の抑制と感染後の生存率は、野生型（WT）の同胞対照と比較して著しく低下していたが（図2A-2C、S2A）、ヒトOXER1またはHcar1-4を赤色蛍光タンパク質（mKate2、mk2）で融合した異所発現により救済された（図2C、S2B）。好中球は脊椎動物における主要な抗菌免疫細胞タイプであり、観察された5-oxoETEレベルはヒトおよびゼブラフィッシュ好中球の走化性を仲介すると予想されるので、感染後の生存率の低下は、少なくとも部分的には、好中球の採用減少に起因していると思われる。ゼブラフィッシュの尾びれを用いた以前の実験と同様に12、純粋な5-oxoETEへの曝露は、AA由来の化学誘引物質の内因性放出をブロックする等張水浴条件下で、WT幼虫では感染耳への著しい好中球移動を誘発したがhcar1-4mk214突然変異体では誘発しなかった12、24、27（図2D）。重要なことは、スーダンブラック染色により、通常の（低張）感染条件下で、hcar1-4変異体の感染耳への好中球の動員は顕著に減少したことである（図2E、S2C、およびS2D）。同時に、WTと変異体の全体の好中球数はほぼ同じであった（図S2EとS2F）。さらに、幼虫をCCV/DC（common cardinal vein/duct of Cuvier）にPA注射して系統的に感染させた28後、動物の生存率と尾部造血組織（CHT）の好中球数はhcar1-4mk213 -/-で著しく減少したがWT幼虫では認められなかった（図S2G-S2J）。これらの結果は、白血球の化学走性、脱顆粒、生存率、あるいはこれらすべての障害を反映しているのか、まだ解明されていない。以上の結果から、5-oxoETE/OXER1シグナルは感染防御に広く関与していることが示唆された。

図サムネイルgr2
図2感染部位への抗菌性好中球の早期動員を媒介する5-oxoETE 経路
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感染耳への早期白血球動員をin situでモニターするため、hcar1-4およびhcar1-3のF0 CRISPR変異を蛍光白血球レポーターラインに導入した29,30（図2F、S2K～S2P、S3A～S3C）。ライブイメージングにより、hcar1-3ではなくhcar1-4のF0 CRISPR幼虫の耳領域への白血球浸潤が感染後約1時間で減弱することが確認された（図2FおよびS3A、ビデオS1およびS2）。一方、初期のマクロファージの動員はいずれの受容体の変異によっても影響を受けなかった（図S3BおよびS3C、ビデオS3およびS4）。興味深いことに、尾鰭切断後、hcar1-4変異体（図S3DとS3E）およびmorphants12は、損傷後最初の1時間の間に好中球の動員を欠損し、それは感染耳への好中球動員で観察されるよりも早かった（図2）。この時間的オフセットは、感染後1時間の間に5-oxoETEリガンドやHcar1-4受容体の利用が制限されていることが原因であると考えられる。5-HEDHまたは非酵素的機序による5-oxoETE合成は、酸化ストレスによって制御される。31,32 また、ゼブラフィッシュ尾びれの傷と感染部位の酸化還元の違いが、5-oxoETE合成の遅れに影響を与える可能性があることは、以前から指摘されている22。同様に、最初は好中球の部分集団（例えば、CHT の好中球）だけが、5-oxoETE に直ちに反応するのに十分な Hcar1-4 を発現し、Toll 様受容体（TLR）を介した微生物パターン認識は、5-oxoETE への反応が遅れるにしても、より均一な反応に必要である可能性がある。この考えに基づき、TLRアダプター分子であるMyd88をF0 CRISPRでノックダウンすると、感染によるhcar1-4の発現が鈍化した（図1Cおよび図2G）。hcar1-4と微生物のパターン認識との関係をさらに調べるため、WTおよびhcar1-4mk214 -/-動物の両方で、myd88およびpycard33,34のCRISPR F0によってToll-およびNOD様受容体シグナルを摂動させた（図S4A-S4F）。myd88、pycard、hcar1-4変異はいずれも同様の好中球の動員障害を引き起こしたが（図3A、3B）、myd88やpycardをhcar1-4と一緒に変異させると、さらに悪化することがない。このことは、hcar1-4、myd88、pycardが、微生物のパターン認識によってhcar1-4の発現が促される経路の一部であることを示唆している。
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図3LTB4シグナルではなくオキソエイコサノイドシグナルが、微生物のパターン認識とともに好中球の初期動員を制御している。
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動画S1. WTおよびhcar1-4 F0CRISPR幼虫（TG(lyz:pm2-mk2)バックグラウンド）における耳への好中球勧誘のライブイメージング、図2F関連
感染後最初の2時間にわたる耳への好中球の動員を示す代表的なタイムラプスムービー。シアン、PAと共注入したシアン蛍光ビーズを耳へ注入。赤色、mKate2発現好中球。スケールバー、200μm。

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動画S2. WTおよびhcar1-3 F0CRISPR幼虫（TG(lyz:pm2-mk2)バックグラウンド）における耳への好中球採用のライブイメージング、図S3A関連
感染後最初の2時間にわたる耳への好中球の動員を示す代表的なタイムラプスムービー。シアン、PAと共注入したシアン蛍光ビーズを耳へ注入。赤色、mKate2発現好中球。スケールバー、200μm。

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動画S3. WTおよびhcar1-4 F0CRISPR幼虫（TG(mpeg1:eGFP)バックグラウンド）におけるマクロファージの耳への動員を示すライブイメージング、図S3B関連
感染後最初の2時間における耳へのマクロファージ動員を示す代表的なタイムラプスムービー。緑、eGFP発現マクロファージ。赤、感染した耳をマークするためにPAと共注入した赤色蛍光ビーズ。スケールバー、200μm。

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ビデオ S4. WTおよびhcar1-3 F0CRISPR幼虫（TG（mpeg1：eGFP）バックグラウンド）における耳へのマクロファージ勧誘のライブイメージング、図S3C関連
感染後最初の2時間における耳へのマクロファージ動員を示す代表的なタイムラプスムービー。緑、eGFPを発現するマクロファージ。赤、感染した耳をマークするためにPAと共注入した赤色蛍光ビーズ。スケールバー、200μm。

LTB4に対する初期感染反応における5-oxoETE-OXER1の相対的な化学走性役割を比較するために、我々はWTおよびhcar1-4mk214 -/-動物においてF0 CRISPRを用いてlta4hおよびltb4rに変異を与えた（図S4G-S4L）。LTB4はその高親和性受容体Ltb4r（BLT1）を介して、マウスやゼブラフィッシュで好中球の群れ形成時に走化性中継信号として働く。35,36,37 しかし、耳感染後2時間以内に、LTB4hまたはLTB4r変異体の単独またはhcar1-4変異と組み合わせた顕著な好中球動員障害は観察しなかった（図3Cおよび図3D）。マウスのBLT1遺伝子欠損は、傷害後約30分と早くも真皮の耳創傷部位への好中球の群れを減弱させるが35、我々のデータおよび先行研究は、ゼブラフィッシュでそのような即時効果をほとんど支持しない。2017年現在、LTB4経路を標的としたほとんどの臨床試験の報告は失敗しており39、ヒトにおけるその正確な病態生理学的役割はほとんど未解決であった。
考察
炎症性LTB4シグナル伝達の種差（図4）に対するいくつかの可能な説明は、さらなる調査に値する。ひとつは、OXER1を持たない動物では、初期炎症におけるその機能がBLT1などの他の受容体に取って代わられた可能性である。OXER1のようなNRNM遺伝子が炎症遺伝子回路に絡んでいれば、長年指摘されてきたヒトとマウスの炎症プログラムの違いの少なくとも一部を説明できるかもしれない1,2。つまり、マウス遺伝学の盲点を突くためにゼブラフィッシュを使えば、遺伝学的にアクセスしにくい炎症メカニズムの生理学的・病態生理学的機能を明らかにすることができるのです。
図のサムネイル gr4

図4傷害や感染後の炎症性メディエーター配列の模式図
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研究の限界
Hcar1-4は、白血球以外にも様々な組織で広く発現している。今回の研究では、この受容体の潜在的な組織特異的機能については触れていない。つまり、Hcar1-4の骨髄系と上皮系の機能が、観察された表現型にどのように寄与しているのかを正式に区別していないのである。ここで用いたF0 CRISPRアプローチは、完全な（すなわち、非モザイク）、ホモ接合性の遺伝子変異の影響を過小評価する可能性がある。CCV感染実験では、Hcar1-4欠損がどのような細胞メカニズム（走化性、白血球生存、脱顆粒などの欠陥）で観察された表現型（生存障害、スダン黒染めの減少）を引き起こすかは明らかにされていない。我々のデータは、5-oxo-EPE（ここでは測定していない）のような構造的に関連した脂質もHcar1-4のリガンドであることを正式に否定するものではない。
STAR★Methods
主要リソース表
REAGENT または RESOURCE SOURCE IDENTIFIER
細菌・ウイルス株
Wt PA14 Joao Xavier (MSKCC) N/A
化学物質、ペプチド、リコンビナントタンパク質
青緑色蛍光ビーズ（Ex/Em=430/465） Thermo Fisher Cat#F13080
赤色蛍光ビーズ (Ex/Em=580/605) Thermo Fisher Cat#F8810
デキストラン、フルオレセイン、500,000 MW、アニオン性、リジン固定化可能 Invitrogen Cat#D7136
アガロースLMゴールド バイオテクノロジー社 Cat#A-204-100
5-oxoETE Cayman Cat#34250
ジメチルスルホキシド (DMSO) Sigma Cat#D8418
3-アミノ安息香酸エチル メタンスルホン酸 (トリカイン) Sigma Cat#E10521
トリトンX-100 シグマ社 Cat#SLBW7103
リン酸緩衝生理食塩水 (PBS) Sigma Cat#79382
FastDigest NotI 制限酵素 Thermo Fisher Cat#FD0593
FastDigest BstXI 制限酵素 Thermo Fisher Cat#FD1024
FastDigest BseLI 制限酵素 Thermo Fisher 社、Cat#FD1204
FastDigest MseI (Tru1I) 制限酵素 Thermo Fisher Cat#ER0981
FastDigest BseNI 制限酵素 Thermo Fisher Cat#FD0884
FastDigest HpaII 制限酵素 Thermo Fisher Cat#FD0514
FastDigest Eco47I 制限酵素 Thermo Fisher Cat#FD0314
FastDigest OliI 制限酵素 Thermo Fisher Cat#FD1634
FastDigest PvuI 制限酵素 Thermo Fisher Cat#FD0624
FastDigest Bsp1286I(SduI)制限酵素 Thermo Fisher Cat#FD0654
FastDigest SmlI (SmoI) 制限酵素 Thermo Fisher Cat#ER1981
FastDigest SalI 制限酵素 Thermo Fisher Cat#FD0644
重要な市販アッセイ
mMessage mMachine SP6 キット Thermo Fisher Cat#AM1340
Trizol 試薬 Thermo Fisher Cat#15596026
RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit Thermo Fisher Cat#K1621
RNeasy Plus Micro キット QIAGEN Cat#74034
High-Capacity cDNA Reverse Transcript Kit サーモフィッシャー Cat#4368814
Maxima SYBR Green/Fluorescein qPCR マスターミックス サーモフィッシャー社 Cat#K0242
寄託データ
RNA-seq 本紙 GSE201604
コード 本紙 https://doi.org/10.5281/zenodo.7419586
実験モデル 生物／系統
Zebrafish: wt casper White et al., 200841 https://doi.org/10.1016/j.stem.2007.11.002
ゼブラフィッシュ TG(lyz:pm2-mk2) Stoddard et al., 201942 https://doi.org/10.1038/s41598-018-36771-9
ゼブラフィッシュ TG(mpeg1:eGFP) Stoddard et al., 201942 https://doi.org/10.1038/s41598-018-36771-9
ゼブラフィッシュ：hcar1-4mk213 +/+ この論文 N/A
ゼブラフィッシュ：hcar1-4mk213 -/- 本紙N/A
ゼブラフィッシュ：hcar1-4mk214 +/+ 本紙N/A
ゼブラフィッシュ: hcar1-4mk214 -/- 本紙 N/A
オリゴヌクレオチド
オリゴヌクレオチドについては、表 S3 を参照 本紙 N/A
ソフトウェアとアルゴリズム
ImageJ/FIJI (ImageJ 1.53t, v2.9.0.) Johannes Schindelin https://fiji.sc/
MATLAB (9.12.0.1975300 (R2022a) Update 3) Mathworks Inc., USA http://mathworks.com
Bioinformatics Toolbox Version 4.16 (R2022a) Mathworks Inc.、米国 http://mathworks.com
Computer Vision Toolbox Version 10.2 (R2022a) Mathworks Inc.、米国 http://mathworks.com
Curve Fitting Toolbox Version 3.7 (R2022a) Mathworks Inc.、米国 http://mathworks.com
Deep Learning Toolbox Version 14.4 (R2022a) Mathworks Inc.、USA http://mathworks.com
Fuzzy Logic Toolbox Version 2.9 (R2022a) Mathworks Inc.、米国 http://mathworks.com
Global Optimization Toolbox Version 4.7 (R2022a) Mathworks Inc.、米国 http://mathworks.com
Image Processing Toolbox Version 11.5 (R2022a) Mathworks Inc.、米国 http://mathworks.com
MATLAB コンパイラー Version 8.4 (R2022a) Mathworks Inc.、米国 http://mathworks.com
Mapping Toolbox Version 5.3 (R2022a) Mathworks Inc.、米国 http://mathworks.com
Optimization Toolbox Version 9.3 (R2022a) Mathworks Inc.、米国 http://mathworks.com
Parallel Computing Toolbox Version 7.6 (R2022a) Mathworks Inc., USA http://mathworks.com
偏微分方程式ツールボックス Version 3.8 (R2022a) Mathworks Inc.、米国 http://mathworks.com
Sensor Fusion and Tracking Toolbox Version 2.3 (R2022a) Mathworks Inc.、米国 http://mathworks.com
Signal Processing Toolbox Version 9.0 (R2022a) Mathworks Inc.、米国 http://mathworks.com
Statistics and Machine Learning Toolbox Version 12.3 (R2022a) Mathworks Inc.、米国 http://mathworks.com
NIS イメージングソフトウェア (Nikon, v5.11.01) Nikon Microscope Product https://www.microscope.healthcare.nikon.com/products/software/nis-elements
Prism (GraphPad, v8.3.0) グラフパッドソフトウェア https://www.graphpad.com/scientific-software/prism
Imaris (Bitplane, v9.6.0) MSKCC の Molecular Cytology Core Facility https://imaris.oxinst.com/
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利用可能なリソース
リード連絡先
リソースや試薬に関する詳細な情報やリクエストは、リードコンタクトのPhilipp Niethammer (NiethamP@mskcc.org)までお願いします。
試薬の入手方法
本研究で使用される全てのユニークな試薬、安定化試薬は、材料提供契約を締結した上で、主担当者から入手可能である。
実験モデルおよび被験者の詳細
一般的な魚の手順
成体の wt およびトランスジェニックレポーター casper41 ゼブラフィッシュは、Memorial Sloan Kettering Cancer Center (MSKCC) Zebrafish Core Facility43 で維持し、MSKCC の Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) の承認を得て、機関内動物医療ガイドラインに従って実験に付した。注射および創傷アッセイでは，受精後 2.5-3 日目の幼虫を 0.2 mg/mL 3-aminobenzoate methanesulfonate ethyl (Tricaine/Syncaine, Sigma, E10521) を含む標準低張E3培地 (5 mM NaCl, 0.17 mM KCl, 0.33 mM CaCl2, 0.33 mM MgSO4) で麻酔をした。本研究で使用した2.5-3dpfのゼブラフィッシュ幼生については、性別の判定ができず、研究中の生物学的プロセスに影響を与える可能性は低い。
方法の詳細
細菌株と増殖条件
PA14 は、Dr. Joao Xavier (MSKCC, New York, NY)から提供された野生型 Pseudomonas aeruginosa (wt 株 PA14) を用いて、LB 培地で増殖させた。最終的な接種物を調製するために、細菌懸濁液を希釈またはペレット化し、所望の細菌密度（OD600 = 7）を達成した。
耳（局所）または総頚静脈／クビレ管（CCV/DC）（全身）注射による細菌感染
PA耳への注入は以下のように行った24：蛍光ビーズ、青緑（Cyan）（Ex/Em = 430/465）（Thermo Fisher、F13080）または赤（Ex/Em = 580/605）（Thermo Fisher、F8810）FluoSphereは注入前に細菌懸濁物と1：1に混合させた。ジメチルスルホキシド（DMSO、Sigma、D8418）中の1μM 5-oxoETE（Cayman, cat#34250）を等張E3（標準E3＋140 mM NaCl）中のPAと混合し、幼虫の耳小骨（すなわち耳）に注入した。CCV/DC 注入は 2.3 nL PA14 (OD600 = 7) で行った44 。1× phosphate buffered saline (PBS, Sigma, 79,382) に 1 mg/mL の濃度で溶解した dextran (Invitrogen, D7136) は、CCV/DC注入成功のモニタリングに使用された。1回の注入につき約2×104CFUで耳介注入とCCV/DC注入を行った。
尾びれの切断
創傷実験では，麻酔した 2.5-3 dpf 幼虫の尾鰭先端を外科用マイクロブレード (Fine Science Tools, 10,318) でノトコルドを傷つけずに切断した45．
スダンブラック染色
好中球の動員を可視化するために、幼虫は創傷または耳感染後、4%ホルムアルデヒドを1×PBSに溶かし4℃で一晩固定し、Sudan-blackで30分染色した。染色したゼブラフィッシュ幼虫を70％エタノールで3回洗浄し、その後PBSTで5分間再水和させた。最後に、幼虫を脱色液（10% KOH, 30% H2O2）で洗浄し、画像化前にPBSTで2回洗浄した46。
hcar1-4変異株の作製とジェノタイピング
hcar1-4 (ENSDARG00000087084) の4つの独立したgRNA (hcar1-4-sgRNA-1, hcar1-4-sgRNA-2, hcar1-4-sgRNA-3, hcar1-4-sgRNA-4) を設計し、IDT (Integrated DNA Technologies) に注文した。Cas9-gRNA（単一のhcar1-4-sgRNA-1または4つのhcar1-4-sgRNA-1, hcar1-4-sgRNA-2, hcar1-4-sgRNA-3, hcar1-4-sgRNA-4） ribonucleoprotein complex solutionを1細胞期ゼブラフィッシュ胚の細胞質に注入した。注入したF0幼虫が性成熟まで成長した後（受精後2〜3ヶ月）、個々のF0成虫を野生型成虫と交配し、F1子孫を得た。これらのF1幼虫を性成熟まで成長させ、その尾鰭からゲノムDNAを単離し、遺伝子型を決定した。このために、尾鰭を一部切断し、250μLの50mM NaOHに懸濁した後、95℃で10分間インキュベートした。その後、サンプルを氷上で10分間冷却し、25μLの1M Tris-HCl (pH 8)で中和し、ボルテックスで攪拌した。ジェノタイピングプライマーを表S3に示す。F1 hcar1-4-sgRNA-1成魚のPCR産物をFastDigest BstXI (Thermo Fisher Scientific; FD1024) 酵素と37℃で一晩インキュベートし、反応混合物をアガロースゲル電気泳動で分離した。F1ヘテロ接合体は、3つのDNA断片(∼422, 269, 153 bp)の存在によって同定された。422bpは、Cas9による変異でBstXI部位が破壊された変異体である。422bpのバンドはアガロースから分離し、サンガーシークエンスで塩基配列を決定した。目的のフレームシフト変異（11bp挿入、hcar1-4mk213、図S1）を持つF1ヘテロ接合体成体ゼブラフィッシュをホモ接合に交配させた。F1 hcar1-4-sgRNA-1, hcar1-4-sgRNA-2, hcar1-4-sgRNA-3, hcar1-4-sgRNA-4 heterozygous adult zebrafishのPCR産物をアガロースゲル電気泳動で分離した。目的の大きな切断（313bp、hcar1-4mk214、図S1）を持つF1ヘテロ接合体成体ゼブラフィッシュを交配して、F2ホモ接合体変異体hcar1-4mk214の子孫を得た。
F0 CRISPR遺伝子擾乱アプローチ
潜在的なgRNA標的部位は、ウェブプログラムCHOPCHOP (http://chopchop.cbu.no/index.php)を用いて同定された。全てのgRNA標的配列は、STAR Methodsに記載されている。hcar1-4（ENSDARG00000087084）、myd88（ENSDARG000010169）、pycard（ENSDARG00000040076）、ltb4r（ENSDARG00000032631）に対する3つの独立したgRNA、およびhcar1-3（ENSDARG00000062874）、およびlta4h（ENSDARG0000006029）に対する4つの独立したgRNAが設計されてIDTに発注された。これらの標的特異的Alt-RTM crRNA（Crispr RNA）と共通Alt-R tracrRNA（Trans-Activating Crispr RNA）をヌクレアーゼフリー二重鎖バッファ（IDT；11-01-03-01）に溶解して100μMストック溶液とした。crRNA：tracrRNA二重鎖を調製するために、等量の100μM Alt-R crRNA（1：1：1または1：1：1）および100μM Alt-R tracrRNAストック溶液を、それぞれ最終濃度10μMとなるようにヌクレアーゼフリー二重鎖バッファーと混合させた。続いて、この混合物を95℃で5分間加熱し、その後室温まで冷却した。ALT-R S.p. Cas9 Nuclease（IDT, 1081058）をCas9ワーキングバッファー（20 mM HEPES, 150 mM KCl, pH 7.5）で1 mg/mLに希釈した。crRNA：tracrRNA二重鎖とCas9タンパク質溶液を1：1（vol/vol）として組み合わせることで、Cas9-gRNAリボ核タンパク質複合体を構築した。マイクロインジェクションに先立ち、Cas9-gRNAリボ核タンパク質複合体溶液を37℃で5分間インキュベートした後、室温に置いた。約2.3nLのCas9-gRNAsリボ核タンパク質複合体溶液を1細胞期のゼブラフィッシュ胚の細胞質内に注入した。2.5-3 dpfで、ゲノムDNAを18個のF0幼虫から遺伝子型決定のために単離した。各幼虫に50μLの50mM NaOHを加え、95℃で10分間インキュベートし、その後、ゲノムDNAを氷上に置き、5μLの1M Tris-HCl (pH 8.0) を加えた47。次に、PCR産物をFastDigest制限酵素（hcar1-4-sgRNA-1産物はBstXI、hcar1-4-sgRNA-5産物はBseLI、 hcar1-4-sgRNA-6 産物はMseI、 hcar1-3-sgRNA-1 産物はBseNI、 hcar1-3-sgRNA-2 産物はBseLI、 hcar1-3-sgRNA-3 産物は HpaII、 hcar1-3-sgRNA-4 産物は Eco47I）とインキュベーションし、 hcar1-4-sgRNA-1 産物を BseXI で処理し、 hcar1-3-sgRNA-5 産物は BseLI で処理して、harl-3-sgRNA-4産物は ECO47 I を用いて処理した。myd88-sgRNA-1 は BseNI、 myd88-sgRNA-2 は OliI、 myd88-sgRNA-3 は BseLI； pycard-sgRNA-1 は PvuI、 pycard-sgRNA-2 は Bsp1286I、 pycard-sgRNA-3 は SmlI です。lta4h-sgRNA-1 の BseLI、 lta4h-sgRNA-2 の BseLI、 lta4h-sgRNA-3 の SalI、 lta4h-sgRNA-4 の BstXI; ltb4r-sgRNA-1 の BseLI、 ltb4r-sgRNA-2 の BseLI、 ltb4r-sgRNA-3 の BstXI）37℃で少なくとも 2 時間、反応させ た。その後、アガロースゲル電気泳動により試料を分離した（表S4）。
生存率アッセイ
耳感染後の生存率、およびCCV/DC全身感染後の生存率は、以下のように行った。2.5-3 dpf幼虫を、耳またはCCV/DCのいずれかに、標準低張E3中でPAに感染させた。その後，感染幼虫を48ウェルプレートのウェルに入れ，注入後5日間，生存率をモニターした．死亡幼虫は、透明性と心拍の喪失によってスコア化した。
コロニー形成単位（CFU）アッセイ
感染した2.5-3dpfのゼブラフィッシュ幼虫のCFUを以下のように測定した48：簡単に言えば、感染後2時間または4時間に、合計40匹の幼虫を8つのグループ（グループあたり5匹の幼虫）に1.5mLのEppendorfチューブに分配した。感染幼虫をPBSで3回洗浄し、付着した細菌を除去した。幼虫を1% Triton X-100 (Sigma, SLBW7103) を含むフィルター滅菌したPBS中でホモジナイズした（幼虫あたり40μL）。この懸濁液を1:100に希釈し、10μLをLB寒天培地プレートにプレーティングした後、37℃で一晩培養を行った。LBプレートのコロニーカウントにより、感染幼虫の菌負担を推測した。
スピニングディスク共焦点イメージング
ライブイメージングのために、麻酔したTG(lyz:pm2-mk2)42またはTG(mpeg1:eGFP)42 2.5-3 dpf幼虫に、蛍光シアンまたは赤ビーズと混合したPAを注入して耳領域をマークさせた。その後、ガラス底ディッシュ（MatTek Corporation, P35G-1.5-20-C）に標準低張E3に溶解した1%低融点アガロース（Gold Biotechnology, A-204-100）約200μL中に幼虫を埋め込んで固定化させた。寒天が固化した後、マウントした幼虫を2-3 mLのE3-トリケインで覆い、乾燥防止とイメージング中の麻酔を維持した。
イメージングには、CFI Plan Apochromat Lambda D 10× Objective lens (NA 0.45), 電動ステージ、横河CSU-W1 Spinning Disk unit, Photometrics Prime BSI Scientific CMOS camera (2x2 binning) および NIS imaging software (Nikon, 5.11.01) を備えた倒立顕微鏡 Nikon Eclipse Ti の加熱イメージング室 (TOKAI HTI, WPI inc.) で28℃で実施した。蛍光発光は405、488、561 nmのダイオードレーザー（Nikon）で励起した。本研究で使用したチャンネル取得強度/露光時間は以下の通りである。80%/100ms (561 nm) または 50%/100ms (488 nm) のレーザー出力設定を使用して、好中球またはマクロファージのいずれかを検出した。注入した赤色（Ex/Em：580/605）またはシアン（Ex/Em：430/465）の蛍光性ポリスチレンビーズは、レーザー出力をそれぞれ30%/100 ms（561 nm）または40%/100 ms（405 nm）に調節して励起させた。発光は455/50（シアン）、525/36（グリーン）または605/52（レッド）バンドパスフィルターを用いて収集した。
画像処理とデータ解析
取得した共焦点ZスタックをImaris（Bitplane, 9.6.0）に取り込み、耳領域における白血球の経時的な計数を行った。この目的のために、Imarisワンドツールを用いて耳の中心を（ビーズ蛍光に基づいて）手動でマークすることにより、3D関心領域（390 μm × 390 μm × 100 μm）を構築した。Imarisのスポット検出ツールとウィザードフィルターツールを使用して、サイズ（直径約13μm）または蛍光信号強度閾値フィルターに基づいて白血球の手動3Dセグメンテーションと定量化のための非特異的信号を除去し、発光の質を手動で調整し、定量化した。
mRNAの調製と注入
ゼブラフィッシュhcar1-4またはヒトOXER1救助実験のために、pCS2+hcar1-4-mKate2またはpCS2+OXER1-mKate2を、FastDigest NotI (Thermo Fisher Scientific; FD0593）を用いて線形化し、mMessage mMachine SP6 kit (Thermo Fisher Scientific; AM1340）を用いてインビトロ転写を行った。2.3 nL の約500 ng/μL mRNA を1細胞期ゼブラフィッシュ胚の卵黄に注入した。
セルソーティングと定量RT-PCR
2.5-3 dpf幼虫(n∼400)を、好中球またはマクロファージにそれぞれ赤(mKate2)または緑(eGFP)の蛍光タンパク質を発現するTG(lyz:pm2-mKate2) または TG(mpeg1:eGFP) transgenic lineから回収した。幼虫を以下のように単細胞懸濁液に解離した49：eGFPまたはmKate2陽性および陰性細胞の細胞選別および収集は、mKate2については561nmの励起および670／30nmの発光波長、GFPについては488nmの励起および525／50nmの発光に基づいてFACS (Aria, BD Bioscience) によって実施された。
mRNAをRNeasy Plus Microキット（QIAGEN；74,034）を用いて単離し、cDNAをHigh-Capacity cDNA Reverse Transcriptionキット（Thermo Fisher Scientific；cat#4368814） を用いて調製し、Maxima SYBR Green/Fluorescein qPCR Master Mix (Thermo Fisher Scientific；K0242) を用いてリアルタイムPCR装置（Bio-Rad， Watford, Hertfordshire, UK）で定量RT-PCRを実施した（図1B）。データは 2-ΔΔCt 法を用いて β-actin に正規化した。50 プライマー配列は表 S3 に示す。
リピドミクス解析
2.5-3 dpf wt幼虫（合計約1200、各複製につき約400）を、2時間のPA耳注入後に収集した。非感染wt幼虫（合計約1200、各サンプルにつき約400）を対照として収集し、UC San Diego Lipid Maps施設に送って完全エイコサノイドパネルクロマトグラフィー／質量分析に供した。ゼブラフィッシュ幼虫を、Bead Mill 24 (Fisher Scientific, 15-340-163) を用いて、1 mL 10% 水中メタノール中でホモジナイズした。100 μLのホモジネートに26種の重水素化内部標準物質を添加した。Phenomenex Strata-X polymeric reversed phase columnsを用いた固相抽出（SPE）により、エイコサノイドを抽出した。サンプルは乾燥させ、バッファA（水/アセトニトリル/酢酸 60/40/0.02, v/v/v）に取り込まれた。サンプルは、Waters Acquity UPLCとAB Sciex 6500 QTrap装置とのインターフェイスを使用して分析されました。クロマトグラフィー分離は、100%バッファAから100%バッファB (acetonitrile/isopropanol 50/50, v/v) まで5分間のステップグラジエントにより達成された。標準曲線は、同一条件下で並行して取得しました。データ解析は、Analyst および Mulitquant ソフトウェアパッケージで行った25。
胚の採取、RNA 抽出、シークエンス
図 S1C の qRT-PCR では、2.5-3 dpf wt 幼虫（各時点約 120、各サンプル 40）を PA ear injection 後 0 h、1 h、2 h、4 h、8 h、12 h、24 h に採取し、mRNA は Trizol reagent (Thermo Fisher Scientific; cat#15596026) を用いて製造者のプロトコルに沿って単離した。cDNAはRevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit (Thermo Fisher Scientific; K1621)を用いて調製し、QPCRはMaxima SYBR Green/Fluorescein qPCR Master Mix (Thermo Fisher Scientific; K0242)を用いて実施した。図1CのmRNA-sequencingに関しては、2.5-3 dpfのhcar1-4mk213 +/+またはhcar1-4mk213 -/-幼虫を2時間および4時間のPA耳注入後に回収し、注入しないhcar1-4mk213 +/+またはhcar1-4mk213 -/-幼虫をコントロールとして用いた。mRNAは上記のように抽出された。以下の手順は、MSKCC Genomics and Bioinformatics core facilitiesによって以下のように行われた24: 簡単に言うと、RNA-seqライブラリーは、Illumina HiSeq2500プラットフォームでペアエンド50bpシングルリードで配列決定し、サンプルあたり平均2000-3000万リードとなった。配列データ（FASTQファイル）は、rnaSTAR alignerを用いて処理され、ゼブラフィッシュゲノムGRCz11（UCSC）にマッピングされ、ゲノム的にスプライスジャンクションを越えてリードを分解した。得られたSAMファイルをPICARDツールで処理し、BAMファイル形式への変換と圧縮を行いました。マップされたリードは、R/BioConductorのDESeqを使用して処理され、サンプル間の遺伝子発現の差異が解析されました。mRNAseqデータは https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/query/acc.cgi?acc=GSE201604 で公開されている。
オルソログ解析
ヒト（homo sapiens）、ネコ（felis catus）、ラット（rattus norvegicus）、マウス（mus musculus）におけるゼブラフィッシュ遺伝子の配列オルソログ（one2one or one2many or many2many）をBioMartとENSEMBL release 107 (Jul 2022) を使用して検索した。これらのオーソログのベン図をウェブツール（https://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/Venn/）を用いて作成し、図1Cに表示した。ENSMBL NRNM リストから偽陽性と思われるもの（すなわち、マウスやラットではなく、ヒトとネコの ENSEMBL オルソログを持つ 206 のゼブラフィッシュ遺伝子）を取り除くために、DIOPT ortholog finder webtool (version 9.0, Sept 21, beta) 20 を使用した。これは Alliance of Genome Resources (AGR) データベース全体を、 AGR 選定アルゴリズムによって検索するもの。NRNM遺伝子は、ENSEMBLでNRNM遺伝子と判定されたものの、高ランクのDIOPTラットまたはマウスオルソログ（Weighted score >2 & Rank = High & Best Score = Yes & Best Score Reverse = Yes）を有する遺伝子と定義した。これらの(n = 53; Table S1, tab four & five tab)偽陽性と考えられるものは、オリジナルのENSEMBL NRNMリストから削除され、153のNRNM遺伝子と考えられる最終リストが残った（Table S1, second tab）。この "クリーン "なNRNMリストから49個は、上記のDIOPT基準に従って "高 "ランクのヒトオルソログを有していた。
単純遺伝子相関解析(sGCA)
sGCAは、すべての実際のmRNAseq発現表現型と「理想」表現型（IP）との相関距離（CD、MATLABの定義に従って、値のシーケンスとして扱われるポイント間のサンプル相関を1マイナス）を計算します。すなわち、CD = 0は発現プロファイルがそれぞれのIPと完全に相関することを意味し、CD = 1はその逆を意味する。遺伝子はIPに割り当てられると、そのフォールドレギュレーションは1-グループ-条件の平均を0-グループ-条件の平均で割ることによって計算される（「条件」＝正規化mRNAseqカウントマトリックスの列で、行は遺伝子を示す）。それぞれのPadjは、Benjamini-Hochberg調整付きの負の二項モデルを使用して計算されます。平均塩基は、1群条件と0群条件の平均の平均として計算される。図1Cのヒートマップは、CD < 0.25, Padj < 0.05, fold-regulation >2, および mean base >20の遺伝子のみが表示されている。IP-association、それぞれのCD、統計値を含む完全な、注釈付き遺伝子リストについては、表S2を参照。sGCAスクリプトとMATLABアプリはGitHub (https://github.com/niethamp/sGCA-Ma-et-al.-2022-)で公開されている。
定量化および統計解析
2時間PA耳感染時の好中球またはマクロファージ追跡におけるエラーバーは平均値の標準誤差（SEM）を示し、その他のエラーバーは標準偏差（STDEV）を示す。ほとんどの平均値の比較について、p値は、Prism（GraphPad）またはExcel（Microsoft）を用いて、学生のt検定（2尾、2標本不等分散検定、異種分散）により導出した。Kaplan-Meier生存曲線の比較には、Prismの対数順位（Mantel-Cox）検定を使用した。統計解析のために、異なる実験日の動物実験を集計した。サンプルサイズは統計的手法によって予め決定されたものではない。実験は無作為化されておらず、治験責任医師は実験中または結果評価中の割り付けについて盲検化されていない。
データおよびコードの利用可能性

RNA配列データはGEO data depositoryでGSE201604の番号で入手可能である。このアクセッション番号は、主要なリソースの表にも記載されている。

また、オリジナルコードはZenodoに寄託されており、公開日現在で入手可能です。DOI (https://doi.org/10.5281/zenodo.7419586) は、Key resources table に記載されています。sGCAスクリプトとMATLABアプリはGitHub (https://github.com/niethamp/sGCA-Ma-et-al.-2022-)でも公開されています。

本論文で報告されたデータの再解析に必要な追加情報は、要求に応じて主担当者から入手可能です。
謝辞
本研究は、NIH の R01GM099970, R21AI139986, R35GM140883, P.N. の BRIA award, K.L.H. の Tow fellowship により資金提供されたものである。ゼブラフィッシュの射出成形型の設計を担当したMichelina Stoddardに感謝する。Tim Mitchison, Tobias Hohl, Justin Perry, Danielle Bolton, Miklos Lengyelには、原稿に対する貴重なコメントをいただいた。
著者の貢献
Y.M.、K.L.H.、P.N.がプロジェクトの構想を練った。K.L.H.はhcar1-4mk213 -/-系統を作製した。Y.M.とK.L.H.はhcar1-4mk214 -/-系統を作製した。Y.M.は、ほとんどの実験を一人で行い、ライブイメージング実験ではZ.G.と一緒に行った。Y.M.は、図1CのオルソログおよびmRNA-seq解析を除いてすべての実験を解析し、これはP.Nが行った。P.Nは、sGCA解析を考え、それをMATLABに実装した。Y.M.、Z.G.、P.N.は論文を執筆した。
利害関係の宣言
著者らは、競合する利害関係を宣言しない。
補足情報
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ドキュメントS1. 図S1〜S4、表S3、S4
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表S1. NRNM検索
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表S2. mRNAseqデータおよび解析結果
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出版年
オンライン公開 2023年1月10日
受理されました。2022年12月23日
改訂版受理：2022年12月23日 2022年10月19日
受理：2022年10月19日 2022年5月17日
身分証明書
DOI: https://doi.org/10.1016/j.celrep.2022.111974