微生物叢はニッチにおける炎症性シグナルを媒介として造血幹細胞および前駆細胞の発生を制御する

2023年2月17日 10:27

記事｜42巻2号、112116頁、2023年2月28日発行
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微生物叢はニッチにおける炎症性シグナルを媒介として造血幹細胞および前駆細胞の発生を制御する

https://www.cell.com/cell-reports/fulltext/S2211-1247(23)00127-4?_returnURL=https%3A%2F%2Flinkinghub.elsevier.com%2Fretrieve%2Fpii%2FS2211124723001274%3Fshowall%3Dtrue

ダン・チョン 8
Haowei Jiang 8
周成碩（Chengzhuo Zhou
葛美
張成宏
ジン・リリ 9
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脚注を表示するオープンアクセス公開日:2023年2月15日DOI:https://doi.org/10.1016/j.celrep.2023.112116

ハイライト

ゼブラフィッシュの胚発生における微生物叢の枯渇は、HSPCの発達を阻害する

ゼブラフィッシュの胚発生におけるHSPCの形成は、微生物相の減少によって阻害される - chd8-/-の微生物相の乱れはHSPCの形成を減少させ、骨髄造血を促進する

株によってHSPCニッチでのサイトカイン発現量が異なる。

局所的なサイトカイン発現がHSPCの形成と骨髄系分化を制御する
まとめ
骨髄の造血幹細胞・前駆細胞（HSPC）の自己複製と分化は、常在菌である微生物叢が制御していると言われている。しかし、胚発生過程において微生物叢が造血幹細胞の発生に影響を与えるかどうか、またどのように影響を与えるかは不明である。我々は、ノトビオティック・ゼブラフィッシュを用いて、微生物叢がHSPCの発生と分化に必要であることを示した。また、個々の細菌株は、骨髄系細胞への影響とは別に、HSPC形成に異なる影響を与えることを明らかにした。chd8-/-ゼブラフィッシュの初期生命異常は、HSPCの発達を損なう。野生型細菌は腎臓ニッチにおける基礎炎症性サイトカイン発現を制御することでHSPCの発達を促進し、chd8-/-交配細菌はHSPCを減少させ骨髄系分化を促進する炎症性サイトカインの上昇を誘発する。我々は、免疫調節活性を持つAeromonas veronii株を同定し、野生型魚ではHSPCの発生を誘導しないが、chd8-/-ゼブラフィッシュでは腎臓のサイトカイン発現を選択的に抑制しHSPC発生のバランスを整えることを明らかにした。本研究は、成体造血系の前駆体が適切に確立されるためには、造血幹細胞発生初期にバランスのとれたマイクロバイオームが重要な役割を果たすことを明らかにした。
図解要旨
図のサムネイルfx1
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キーワード
造血幹細胞・前駆細胞形成
常在細菌叢
chd8
炎症性シグナル
ゼブラフィッシュ
研究テーマ
CP：微生物学
CP：幹細胞研究
はじめに
造血幹細胞は、成熟した血球に分化し、自己複製する能力を持つ。造血幹細胞集団の増殖と分化を媒介する内在性および外在性の因子を理解することは、血液の恒常性や悪性腫瘍の理解にとどまらず、再生医療への応用にも重要である。
3 腸内細菌叢は、宿主の多くの生物学的プロセスに影響を与え、造血も例外ではありません。最近の研究から、腸内細菌叢が骨髄の造血幹細胞および前駆細胞に直接作用し、定常状態およびストレス条件下での自己複製と分化を制御できることが明らかになっています6、7、8、9。炎症性腸疾患（IBD）などの腸内細菌叢の変化は、HSPCに大きなストレスを与え、血液学的な悪影響と関連します。10,11 これらの研究は、HSPC活性の制御における健康でバランスのとれた細菌叢の重要性を強調しています。しかし、HSPCに対する個々の細菌株の役割や、微生物叢とHSPCの調節を結びつけるメカニズムは、まだほとんど分かっていません。
HSPCはもともと胚発生時の一連の過程を経て生成されます。12,13,14 成人HSPCを制御する多くのシグナルは、炎症性シグナルなど発生時のHSPC生成も制御します。15,16,17,18 マイクロバイオタがHSPC発生をいかに仲介するのかを調べることにより、成人HSPC制御への手掛かりが得られる可能性があります。微生物が異なる表現型の生成に重要な発生シグナルを与えることは知られている19。しかし、HSPCの発生における微生物相の役割についてはほとんど知られておらず、微生物相の異常が胎生期のHSPC生成に与える影響についてはさらに知られていない。
ゼブラフィッシュは、宿主と微生物叢の複雑な相互作用、特に発生過程を研究するための強力なモデルとしてますます利用されるようになっている。20,21,22 マウスモデルと比較して、ゼブラフィッシュは無菌状態（GF）を維持し、定義した細菌株またはコミュニティで容易にコロニー化できる23,24。コロニー形成は、受精後2-3日目（dpf）に絨毛から孵化した幼生に起こります。一方、HSPCプールの確立は、細菌のコロニー形成と同時に起こり、ゼブラフィッシュと哺乳類の間でほぼ保存されています。ゼブラフィッシュのHSPCは、まず大動脈-生殖腺-中咽頭（AGM）領域内の造血内皮から出現する。これらの細胞は、2dpfから尾部造血組織（CHT）（哺乳類の胎児肝臓に相当）に移動し、最終的に5〜6dpfから腎臓髄（哺乳類の骨髄に相当）にコロニーを形成する。HSPCは発生初期にCHTと腎臓髄で急速に拡大し、27,28は微生物叢が最初に確立される時点と一致しており、微生物叢がHSPCの発生に関与している可能性が高いことが支持される。
Chd8遺伝子は、ATP依存性のクロマチンリモデリング酵素をコードしており、自閉症スペクトラム障害のサブタイプで頻繁に変異しています。30最近の研究では、Chd8欠損マウスは、IBDを思わせる腸の炎症の増加と腸内細菌叢の乱れを示すことがわかりました31。また、これまでの研究で、ゼブラフィッシュのchd8をモルフォリノでノックダウンすると、消化管の欠損が生じることが示されている。29 我々は、chd8変異体が、HSPCの発生における生物学的微生物の異常の役割を研究するための良いモデルになると仮定している。本研究では、ゼブラフィッシュのchd8変異体を作製し、gnotobiotic野生型（WT）およびchd8変異体胚を用いて、正常およびdysbiotic微生物叢がHSPC発生に及ぼす影響を研究することとした。GF魚と微生物叢の個々のメンバーとの単離を通して、WTとchd8変異体の異なる宿主におけるHSPC発生に対する単一の細菌株の影響、および細菌とHSPCの間の基礎的な分子コミュニケーションについて研究した。
研究結果
微生物叢は胚発生中のHSPCの発達を促進する
HSPCの発生における常在細菌叢の役割を明らかにするために、我々は以前に記述したように準備したGF魚とその通常飼育（CONR）同胞の胚発生中の造血を調べた（図S1AおよびS1B）。24, 32 GF処理は、異なる段階において、HSPC形成に影響を及ぼす2つの既知の要因である血管の発達や血液循環に影響しなかった（図S1C、S2A、およびS2B）。33 ホールマウント in situ ハイブリダイゼーション（WISH）と定量的 PCR（qPCR）分析により、微生物が存在しない場合、AGM の cmyb+/runx1+HSPCはわずかに減少し（図 S1D-S1F）、5-6 dpf の CHT と 7 dpf の kidney でさらに減少することが分かった（図 1A-1C )。また、GF投与後の骨髄系とリンパ系の分化についても検討した。マクロファージ（ニュートラルレッドで染色）と rag1+ T リンパ球37 の分化も GF 条件下で阻害され（図 1D、1E、S2C）、HSPC 形成の減少を裏付けている。β e1-globin (hbbe1) 38 の発現とベンジジン染色で可視化した赤血球の発生は、5-6 dpf の CHT において微生物叢非存在下で変化せず（図 1D、1E、S2D）、おそらくこの段階の細胞のほとんどが原始赤血球であるためであると考えられた。さらに、3dpfのGFゼブラフィッシュにCONR対照の微生物叢を接種すると、5dpfのCHTのGF幼生と7dpfの腎臓におけるHSPCの発生が回復することがわかった（図1F-1J）。これらの結果は、常在菌の微生物叢がゼブラフィッシュのHSPCの発生を促進することを裏付けている。
図サムネイルgr1
図1HSPCの発生に必要な常在細菌叢の存在
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chd8-/-ゼブラフィッシュは、幼生および成体において、HSPCの発達の欠損と腸内細菌叢のアンバランスを示す
最近の研究から、マウスのChd8欠損は消化器系の合併症を引き起こし、腸内細菌叢のバランスを崩すことが示唆されている。31 HSPC発生におけるdysbiosisを研究するモデルを確立するため、CRISPR-Cas9技術を使用してchd8-変異体ゼブラフィッシュを作成した。2つのchd8-/-変異体が得られ、同様の表現型を示した（図S3AおよびS3B）。本研究では、エクソン12に5塩基の欠失を有する変異体を使用した。我々はまず、chd8変異体における血液形成の特徴を調べた。WISH染色により、AGMにおけるHSPCの出現はchd8-/-では無傷であったが（図S3C）、5 dpfのCHTと7 dpfの腎臓ではWTコントロールと比較してHSPCの発生が著しく減少していた（図2A-2C ）。一方、骨髄系やリンパ系の分化は、mpx や rag1 の染色、ニュートラルレッドの染色で示されるように、chd8-/- で強く拡大した（図 2A-2C および S3D）。chd8-/-のゼブラフィッシュのサブセットは、成体まで生存していた。成魚の腎臓骨髄全体について、造血細胞の細胞学的解析を行った。その結果、chd8-/-では兄弟魚に比べて前駆細胞の数が減少し、骨髄単球の集団が拡大していることが示され（図2Dおよび2E）、胎生期の造血障害と一致した。このように、ゼブラフィッシュのchd8欠損は、幼生から成体にかけてHSPCの発達を低下させ、免疫細胞の分化を促進させることがわかった。
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図2chd8-/-ゼブラフィッシュは、幼生および成体において、HSPC形成の阻害、腸の構造障害、微生物相の変化を示す。
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次に、幼生および成体のchd8-/-の腸の完全性を評価した。腸の横断面をヘマトキシリン・エオジン染色した。幼生期のchd8-/-の腸では、腸細胞の数が減少し、腸のひだはWTのものと比べてほとんど消失していた（図2F）。成体腸では、杯細胞の数はchd8-/-で強く減少し、多くのchd8-/-腸細胞は基底膜から離れた位置に核を持つ大きな立方体に見えた（図2F)。これらの結果は、chd8-/-の胚および成体における腸管上皮の崩壊を示唆し、Chd8欠損マウスの欠陥と同様に、chd8-/-魚の腸管透過性が増加していることを示している31。
WT と chd8-/- ゼブラフィッシュの腸内細菌叢の構成を比較するために、WT と chd8-/- の幼生と成体の腸の 16S ribosomal RNA (rRNA) 遺伝子シークエンスを行いました。幼生腸では、Shannon diversity indexによるα多様性解析とBray-Curtis距離に基づく主座標分析（PCoA）によるβ多様性解析の両方から、chd8-/-幼生腸の微生物構造はWT対照と著しく異なり、chd8-/-は著しく多様性が減少していることが示された（図2G）。また、chd8-/-の腸内細菌叢の組成は、Aeromonasのレベルが増加していた（図2H）。成体腸では、PCoAが示すように、chd8-/-の微生物構造もWTのそれと有意に異なっていた（図2G）。chd8-/-ではWTに比べ、Aeromonasのレベルが増加したままであった。さらに、成体chd8-/-の腸内細菌叢は、CetobacteriumとVibrioのレベルが減少していた（図2H）。これらの結果から、chd8-/-魚は幼生期から成魚期にかけてWT魚とは異なる腸内細菌叢を保有していることが明らかになった。
chd8-/-の乱れた微生物相は、HSPC形成を抑制し、骨髄系分化を促進する
次に、chd8-/-の微生物叢がHSPCの発生に影響を与えるかどうかを調べた。そこで、まずchd8-/-胚の微生物叢をGF処理で除去し、3日目のGF胚をCONR WT対照の微生物叢で通常処理した（CONV）。幼生期のchd8-/-では、GF処理は過剰なmpx+好中球の分化を部分的に抑制し、HSPCの発生には影響しなかった（図3A-3E ）。重要なことは、GF chd8-/-幼虫にCONR微生物叢を接種するとHSPCの発生が回復し、5dpfと7dpfの好中球生産がそれ以上増加しなかったことである（図3A-3E）。これらの結果は、chd8-/-の微生物叢の異常が、その発生的な造血の欠陥の少なくとも一部に関与していることを示唆するものであった。
図サムネイル gr3
図3chd8-/-の制御された微生物叢はHSPCの発生を抑制し、骨髄系分化を促進する
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さらにchd8-/-の微生物相が造血に与える影響を検証するため、CONR chd8-/-幼虫から微生物相を採取し、GF WT胚に接種したが、chd8-/-幼虫の微生物相が限られているためか、明らかな効果は観察されなかった。そこで、WTあるいはchd8-/-の成体腸から微生物叢を採取し、GF WT幼虫に移植したところ、WTあるいはchd8-/-の成体腸から採取した微生物叢は、GF WT幼虫に移植された。その結果、WT由来の微生物叢を移植すると、5dpfと7dpfのGF胚でHSPCの形成が強固に誘導された（図3F-3H）。一方、chd8-/-の微生物群は、WTの微生物群と比較して、5dpfのCHTにおけるHSPCの生成を有意に増加させず、7dpfの腎臓におけるrunx1およびcmybの発現誘導も少なかった（図3F-3H）。さらに、chd8-/-微生物叢は好中球の分化をより強く誘導していた（図3F、3G、3I）。このように、chd8-/-の乱れた微生物叢は宿主のHSPCの発生に影響を与える可能性があることが示唆された。
HSPCの発達に影響を与える細菌の種類とその能力
HSPCの形成は、微生物相の違いによって異なる影響を受けるため、次に個々の細菌株がHSPC形成に果たす役割について検討した。成体ゼブラフィッシュの腸から31の細菌株を分離し、16s rRNAの全長配列を決定して分類を確認した（表S4）。これらの菌株を3 dpfのGF WT胚に個々に接種し、5 dpfの宿主におけるHSPCの発生を解析した。その結果、個々の菌株に対するHSPCの応答は、GFおよびCONR魚で観察される範囲内であった（図4A ）。その結果、ほとんどの菌株がGF魚のHSPCの発育を開始させることができた。しかし、少数の細菌株は、HSPC形成に全く影響を及ぼさないか、あるいは負の影響を示した（図4A）。このように、個々の細菌は、HSPCの発生を誘導する上で、異なる機能を示している。
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図4ゼブラフィッシュの微生物叢の個々の細菌は、HSPCの発生に異なる効果を示す
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Aeromonas属はゼブラフィッシュに多く生息し、様々なAeromonas株が宿主の体力に影響を与える多様な機能を示しています20,22。そこで、Aeromonasの中から異なる効果を示す2つの株、Aero. 1 と Aero. 10を選び、さらに個々の細菌のHSPCへの影響を分析した。2株の全ゲノム配列解析の結果、Aero. 1はAeromonas veroniiに属し、Aero. 10はAeromonas dhakensisであることがわかった（図S4AおよびS4B）。これらの配列は、Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomesによってアノテーションされ、機能解析のために分類された。両株の遺伝子発現プロファイルを比較した結果、代謝、細胞運動性、他の二次代謝産物の生合成などに違いがあることが明らかになった（図S4C）。系統樹は、Aero. 1、Aero. 10、および3属（Pseudoalteromonas、Vibrio、Aeromonas）に属する他の共通分類種26種の系統樹を図S4Dに表した。その結果、Aero. 1株およびAero. 10株はゼブラフィッシュに良好にコロニー形成することが確認された（図S4E）。Aero.1株は、Aero. 1株は、CHTおよび腎臓におけるHSPC形成を全く誘導できないが、Aero.10株は、HSPC形成を強固に回復させた。10株は、両部位においてGF幼生でのHSPC形成を強固に回復させた（図4B-4DおよびS4F）。興味深いことに、2つの株はHSPC形成に対して異なる効果を示したが、どちらも好中球の分化を有意に促進した（図4E〜4G）。
微生物に対する宿主応答のトランスクリプトーム研究により、腸と腎臓における炎症性シグネチャーが明らかになった
微生物に対するゼブラフィッシュ幼虫の応答の転写基盤を調べるために、5dpfのCONRとGF幼虫の腸から抽出した総RNAについてRNA配列解析を行った。また、腎臓は6齢以降の魚類の主なHSPCの存在部位であることから20,39、7齢のCONRおよびGF幼虫から分離した腎臓の全体トランスクリプトームも解析した。その結果、5dpfの腸サンプルについて、GF群とCONR群の間で948個の有意に異なる発現遺伝子（DEG）を見出し、GF処理後に416遺伝子が発現上昇、577遺伝子が発現低下した（図S5A、図S5B）。7dpfの腎臓については、743個のDEGが見つかり、GF群で387個の遺伝子がアップレギュレートされ、356個の遺伝子がダウンレギュレートされた（図S5DおよびS5E）。遺伝子オントロジー（GO）解析の結果、コロニー形成によって誘導される遺伝子には、代謝や細胞シグナル伝達経路に関連するシグナル伝達経路が濃縮されており（図S5G-S5J）、全胚の転写変化を調べた以前の報告における知見と同様であった40。また、免疫応答、炎症反応、サイトカイン受容体結合、NF-κBシグナルなどの炎症性サイトカイン産生に関与するシグナル伝達経路は、コロニー形成後の両部位で濃縮されていた（図5A、5B、S5I、およびS5J）。Gene set enrichment解析でも、GF処理で抑制された遺伝子にサイトカイン活性化や免疫反応を伴う遺伝子シグネチャーが陽性濃縮されていた（図S5CおよびS5F）。GF処理により有意に減少した遺伝子は、il1b, il4, tnfa, il8, rela (nfkb) であった（図5C、図5D）。また、CONR WT幼虫とCONR chd8-/-幼虫の腸と腎臓の組織について、それぞれトランスクリプトームを比較検討した。発現差解析の結果、両群の幼虫の腸の間には 3,756 個の DEG が、腎臓の間には 1,085 個の DEG が存在した（図 S6A-S6D）。GO解析の結果、chd8-/-の腸と腎臓では、免疫反応やサイトカイン活性化におけるシグナル伝達経路が有意に濃縮されていた（図S6EおよびS6F）。
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図5腸、尾部、腎臓で炎症シグナルを媒介する微生物叢
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CONRおよびGF幼虫の5dpf腸、5dpf尾部（CHTを含む）、7dpf腎臓における代表的なサイトカインの発現をqPCRアッセイで検証した（図5E）。実際、これらの遺伝子はすべて、CONR対照と比較してGF魚のこれらの組織で強く発現低下していた（図5F-5H）。一方、chd8-/-では、これらのサイトカイン遺伝子のほとんどが3つの組織すべてで有意に発現上昇していた（図5I〜5K）。最近の研究では、炎症シグナルが発生途上の胚におけるHSPCの発生を促進すること15,16,17,18,41や、il1bやtnfaなどのサイトカインの過剰発現がHSPCの自己再生と増殖に影響を与えること42,43が示されている。したがって、今回の結果は、微生物とHSPC間のクロストークに炎症サイトカインが関わっていると思われることを示すものであった。
異なる細菌種が組織特異的に炎症性サイトカイン反応を誘導する
次に、幼生期の腸や腎臓において、微生物叢が炎症性サイトカインの発現に直接影響するかどうかを評価するために、3dpfのGF WT幼生にWTおよびchd8-/-成体腸の微生物叢を接種し、以前に胚性HSPC産生の強固な促進が判明したIL1bおよびtnfaの発現を試験した44。その結果、WTとchd8-/-の両方の魚の微生物叢は腸と腎臓でil1bとtnfaの発現を増加させるが、chd8-/-の魚の微生物叢はWTからのものよりはるかに高い発現を誘導した（図5L-5M）。興味深いことに、chd8-/-魚とWT魚の微生物叢によって誘導されるil1bとtnfaの倍率の差は、腸よりも腎臓で非常に大きくなっていることがわかった。また、単一菌種（Aero.1またはAero.10）によるサイトカイン発現についても検討した。モノコロン化後、両菌株はGF幼虫の腸と尾でil1bとtnfaの発現を有意に増加させたが（図5N、5O、S7A）、腎臓ではAero.10のみがil1bとtnfaの発現を有意に増加させた。Aero.1はGF幼虫の腎臓でil1bとtnfaを完全に誘導できなかった（図5Nと5O）。また、その他のサイトカインの発現についても検討した。Aero.10と比較して、Aero.1は再び腎臓でifng、il6、il8を誘導することができなかった（図S7B）。Aero.1が腎臓でのサイトカイン発現を誘導できないことは、HSPCの発生を促進できないことと矛盾しない。このように、異なる細菌種は腸と腎臓で異なる炎症性サイトカイン産生パターンを誘導し、腎臓のようなHSPC常在部位での局所サイトカイン発現は、細菌のHSPC発生制御能力に密接に関係している。
微生物叢は炎症性サイトカインを介してHSPCの発生を媒介する
次に、HSPCの発生に対する微生物叢の影響を媒介するために、炎症性サイトカインが必要であるかどうかを検討した。CONR WT胚でil1b45またはtnfa46をモルフォリノでノックダウンすると、HSPCの発生とCHTでの好中球の分化が減少した（図6A-6D）。これは、HSPC生成に炎症性サイトカインが必要なことを裏付けている。また、Il1bやtnfaはAGMにおけるHSPCの出現を促進することが知られている。18,47 初期段階でのHSPC出現への干渉を避けるため、3dpfから炎症性サイトカインの生成を抑制するために、従来型のGF WT幼虫にNLRP3阻害剤MCC95048,49を処理した。MCC950処理により、コロニー形成によって誘導された腸と腎臓のil1bの発現が強く減少し（図S7C）、さらにCONV幼虫のCHTにおけるHSPCの発生と好中球の分化が著しく抑制された（図6Eおよび図6F）。このように、il1bなどの炎症性サイトカインは、常在菌の微生物叢によって促進されるHSPCの発達に必要であることがわかった。
図1.サムネイルgr6
図6微生物が促進するHSPCの発生は、基礎の炎症性サイトカインの発現に依存する
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病原体関連分子パターンなどの微生物叢由来の炎症性分子は、Toll様受容体（TLR）を刺激し、中心的アダプター分子であるMyd88を介してシグナルを送り、炎症性サイトカインの転写を誘発すると考えられる40,50。微生物叢によるHSPC生成における炎症性シグナルの役割をさらに特徴付けるために、myd88-/-変異体のHSPCに対する微生物叢の影響を検討した。CHTにおけるHSPCの発生は、コントロールと比較してmyd88-/-魚で減少し（図6Gおよび6H）、GF処理はmyd88-/-におけるHSPC発生をさらに抑制することはなかった。さらに重要なことに、GF myd88-/-幼虫における微生物コロニー形成はHSPC形成を誘導することができず、myd88-/-が微生物叢を介したHSPC形成に必要であることが示された。このように、微生物が炎症性シグナルを介してHSPCの発生を促進することを支持する結果となった。
微生物介入によるHSPCニッチでの過剰なサイトカイン発現の部分的抑制は、chd8-/-のHSPC発生をリバランスさせる。
il1bやtnfaなどの過剰な炎症性サイトカインは、HSPCの自己複製を阻害し、HSPCを骨髄系分化に向かわせる可能性がある42,43。我々は、サイトカインの発現上昇がchd8-/-のHSPC欠損に寄与しているかもしれないと推論した。この仮説を検証するために、まずTg(hsp:il1b-EGFP)を用いて熱ショックによりil1bの過剰発現を誘導した51。その結果、WT幼生において5dpfと7dpfで、強い熱ショック誘導による過剰発現が実際にHSPC生成を阻害することがわかった（図S7E-S7G）。次に、chd8-/-でMOを用いてil1bをノックダウンした。MOを注入すると、chd8-/-のil1b発現はWT対照のレベルまで減少し、chd8-/-幼虫のHSPC形成を回復し、過剰に生成される好中球を減少させることに成功した（図7A-7C ）。また、CONR chd8-/- 幼虫に MCC950 を投与し、HSPC の形成に炎症性シグナルが影響している可能性を検討したところ、3dpf から MCC950 を投与した幼虫は、HSPC の形成が有意に減少した。MCC950の投与により、chd8-/-の腸と腎臓におけるil1bの発現は著しく低下し（図S7D）、5dpfと7dpfのchd8-/-幼虫のHSPC形成が回復した（図7D-7F）。このように、il1bなどのサイトカインの発現上昇が、chd8-/-におけるHSPC産生の低下と骨髄系分化の亢進に関与していることが明らかになった。
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図7マイクロバイオータ介入によるchd8-/-腎臓のサイトカイン発現上昇の選択的抑制は、HSPCの発生と骨髄系分化をリバランスさせる
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次に、WT魚の微生物叢が炎症性サイトカインを抑制し、chd8-/-のHSPCの発生を救済するかどうかを検討した。CONRおよびGF条件下でのchd8-/-のサイトカイン発現と、WT魚由来の微生物叢を慣用したGF chd8-/-幼生でのサイトカイン発現を調べた。GF条件下のchd8-/-幼虫では、腸や腎臓でのサイトカイン（il1bとtnfa）の発現が減少し、特に腎臓でのtnfaの発現が減少した（図7Gおよび図7H）。WT幼生からGF chd8-/-幼生への微生物相の再コロニーでは、腸でのサイトカイン発現は変化しなかったが、腎臓でのtnfa発現はWT魚のレベルまで減少した（図7Gおよび図7H）。これらの結果は、GF chd8-/-におけるHSPCの発生と分化がWTからの微生物叢によって部分的に救済されたこと（図3A-3D）と合わせて、HSPCの存在場所である腎臓でのサイトカイン産生の上昇が、chd8-/-におけるHSPC発生不全と密接に関連していることを裏付けている。
また、Aero. 1は特に腎臓でサイトカインの低発現を誘導したことから、Aero.1がchd8-/-のHSPC発生を救済できるかどうか検討した。1はchd8-/-のHSPCの発生を抑制することができるのだろうかと考えた。Aero. 1をCONR chd8-/-幼虫に投与したところ、腸のサイトカイン発現には影響がなかったが、腎臓のtnfa発現は著しく低下した（図7Iおよび図7J）。さらに重要なことは、Aero. 1をCONR chd8-/-に投与すると、CHTと腎臓のHSPC産生を回復させることに成功し、さらにchd8-/-幼虫全体における好中球の分化を抑制した（図7K-7N）。これらの結果は、Aero.1の抗炎症作用を支持するものである。1の抗炎症作用を支持し、微生物の介入によってchd8-/-HSPC部位で上昇した炎症性サイトカインを選択的に抑制することで、宿主の欠陥HSPC発生を逆転できることを支持した。
考察
本研究では、胚の段階でのHSPC形成における微生物相の発達的役割を明らかにした。また、GFゼブラフィッシュの幼生にWTまたはchd8-/-の微生物叢をコロニー形成させると、HSPCおよび骨髄細胞の発達に異なる影響を与えることがわかった。微生物叢は、myd88に依存したHSPCの発生と、HSPCニッチにおける炎症性サイトカインの局所的発現を媒介する。我々の研究は、マイクロバイオータがHSPCの強力な制御因子であり、胚におけるHSPC発生と成体におけるHSPCの恒常性に共通して存在することを支持するものであった。
本研究では、常在細菌がHSPCの発生と分化の制御に重要な役割を果たし、異なる細菌株がHSPC生成に異なる効果を示すこと、例えば、Aero. 1とAero. 10. これまでの研究で、微生物叢がゼブラフィッシュの好中球の発生を促進することが示されている20。我々は、Aero. 1 と Aero. 10は好中球の分化に同様の効果を示すことから、HSPCと好中球の誘導は、微生物叢からの異なる合図によって独立して制御されている可能性が高いことが示唆された。chd8変異は腸内細菌叢に影響を与えることが示されている31。ここでは、chd8-/-の制御されない微生物叢が胚発生中のHSPC発生を阻害し、骨髄系分化を促進することを証明した。興味深いことに、chd8-/-幼虫もGF幼虫も同様にHSPCの産生が減少していた（図S3EおよびS3F）。chd8-/-はごく少数が成体まで生存したことから、これらの魚に残存するHSPCは定常状態では成体の血液形成に十分であるが、ストレス下では問題が生じる可能性がある。また、マウスの造血細胞におけるChd8の条件付き欠失は、HSPCの破壊をもたらすことが報告されており、HSPC形成におけるChd8の直接的な役割を支持している。52,53 GF条件下では、chd8-/-魚はHSPC形成の低下と好中球の分化増加を示し、魚におけるHSPC形成もchd8によって直接制御されている可能性があることが支持された。このように、chd8-/-におけるHSPCの発達障害は、宿主の遺伝とマイクロバイオームの変化の両方が関与していると考えられる。ASDのCntnap2-/-マウスモデルでは、宿主の遺伝とマイクロバイオームによって社会行動が異なって制御されているように、54 chd8の組織特異的欠損を用いて今後研究が進めば、chd8-/-のHSPC発達に対する宿主遺伝と微生物の貢献が正確に明らかになるであろう。
TNF-αやIL-1bなどの炎症性サイトカインは、ゼブラフィッシュとマウスの両方で胚発生期のHSPCの発生を促進する15,16,17,18,55。微生物叢由来の化合物は、TLR/Myd88を介してシグナルを送り、様々な炎症性サイトカインの発現を活性化する可能性がある。40 今回の結果は、常在細菌がCHTと腎臓におけるHSPCの生成を刺激する炎症性シグナルに貢献していることを支持している。これらの知見と一致するように、chd8-/-幼虫のIL-1bを直接または微生物叢の介入によって阻害すると、HSPCの形成が回復し、骨髄系細胞が減少したことから、サイトカインの過剰生産が、chd8-/-異食症によるHSPC形成の欠陥の根底にあるということが支持された。このように、HSPCの発生を促進するためには、常在微生物由来の炎症性シグナルが緊張状態にあることが重要であり、一方、マイクロバイオータの異常は炎症性サイトカインを過剰に活性化し、HSPCの拡大・分化を侵すことがわかった。また、chd8-/-では、様々なサイトカインがGF処理後に減少、あるいは上昇すること、また、あるサイトカインを標的とするとHSPCの発生に効果があることがわかり、これらの炎症シグナルがこのプロセスにおいてユニークかつ重複した機能を果たしている可能性を支持するものであった。今後、マイクロバイオータによるHSPC制御における異なるサイトカインの複合効果やその相互依存性を解析するための研究が必要である。
また、今回の結果から、微生物が組織特異的に炎症性サイトカインの発現を制御していることが明らかとなった。このことは、腎臓がchd8-/-微生物相の変化に対してより敏感であることを示唆している。さらに、Aero.1株とAero.10株は、ともに炎症性サイトカインの発現を誘導した。1とAero.10株はともにGF WT幼虫の腸で炎症性サイトカインの発現を誘導したが、Aero.10株のみ腸で炎症性サイトカインの発現を上昇させた。10は腎臓での発現を上昇させた。また、Aero. 1をCONR chd8-/-に投与すると、腸でのサイトカイン発現には影響がなかったが、腎臓でのtnfa発現をWTレベルまで抑制し、宿主HSPCの発生を回復させることに成功した。このように、腎臓ニッチにおける炎症性サイトカインの局所発現は、HSPC発生の表現型産生と密接な関係があることがわかった。マウスを用いたこれまでの研究で、定常状態では、マイクロバイオームがTNF-αやIL-1bなどの炎症性サイトカインの発現を、その血清レベルを上げることなくBMに誘発し、HSPCの基礎的な拡大を維持することが示されている55,56。また、高齢のマウスでは、微生物がBMにおけるil1bを含むサイトカインの局所的な増加を促し、加齢に伴うHSPCの障害を媒介する。56 今回の結果はこれらの結果と一致し、HSPCの発生と恒常性の形成において微生物が誘導するサイトカイン発現の重要なニッチ効果を強調するものであった。細菌が腎臓における炎症性サイトカインの局所的な発現をどのように制御しているかは、まだ解明されていない。細菌由来の化合物や代謝物が循環を介して腎臓に移行している可能性がある。腎臓の複数の細胞型が反応してサイトカインを産生する可能性もある。マウスのBMでは、骨髄系細胞が炎症性サイトカインの主な供給源の一つである56。ゼブラフィッシュでは、細菌由来の分子も骨髄系細胞の炎症性サイトカイン発現を媒介する可能性がある。今後、微生物がどのように腎臓のサイトカイン発現を制御しているのか、微生物の機能的特徴や関与する細胞種を明らかにする研究が必要である。
哺乳類におけるHSPCの発生は、ゼブラフィッシュのそれと類似している。哺乳類でも、HSPCはまずAGMに出現し、その後胎児肝臓、そしてBMへと移動する。発達中の胎児では、HSPCは胎児の肝臓とBMで急速に拡大する。57,58 通常、微生物のコロニー形成は母親から乳児への垂直感染によって出生時に始まると考えられており、55,59 生後のHSPC発生における微生物相の役割を支持しています。しかし、最近の研究では、コロニー形成は出生に先行する可能性があり、母親の微生物叢からの代謝物が胎盤を通過して胎児に移行することが示唆されており、胎児のHSPC発達における微生物叢の役割の可能性が示されている59。また、ゼブラフィッシュでは、3 dpfで孵化する前の早い段階で微生物由来の手がかりが絨毛に浸透する可能性が示唆されている20。我々は、ゼブラフィッシュAGMにおけるHSPC形成が受精後36時間の時点ですでにわずかに減少していることを見出し、宿主HSPC形成におけるコロニー形成前の初期の微生物手がかりの役割を支持するものであった。HSPCは胚発生時に主に確立されること、また、ディスバイオシスによるHSPCの発生阻害は宿主に生涯にわたって影響を及ぼす可能性があることを考慮すると、この研究は重要である。今後、哺乳類の異なる段階でのHSPC発生における常在細菌の役割や、成体HSPC機能への長期的影響を明らかにする研究が必要である。
結論として、今回の研究結果は、胚発生期の適切なHSPCの発生とホメオスタシスにバランスのとれた微生物相が重要であることを浮き彫りにしている。異なる細菌種は、HSPC近傍の炎症性サイトカインの局所的産生を調節することで、HSPCの形成と分化に特異的な効果を示すことがわかった。本研究は、骨髄不全患者や造血幹細胞移植後の患者を治療するための、微生物叢に基づく新しい戦略を開発するための理論的根拠となり得る。
研究の限界
CHT組織の分離が困難であったため、CHTニッチにおける炎症性サイトカイン発現は測定していない。HSPCの発生は両部位で同様に制御されているので、CHTの炎症性サイトカイン発現は腎臓のそれと同様に制御されている可能性がある。さらに、幼生と成体のchd8-/-では微生物叢の構成が異なるが、HSPCの発生には同様の欠陥が生じた。今後、特定の微生物がchd8-/-のHSPC異常と異なるステージで特異的に関連しているかどうかを調べる必要がある。最後に、腎臓のどのような細胞が微生物叢に反応してサイトカインを産生するのか、またHSPCが炎症性サイトカイン刺激に直接反応するのかについても、まだ解明されていない。今後、単細胞解析、機能研究、顕微鏡イメージングを用いた研究が、より正確なメカニズムの解明に役立つと思われる。
STAR★Methods
主要リソース表
REAGENTまたはRESOURCE SOURCE IDENTIFIER
抗体
抗Digoxigenin-AP Fab断片 Roche Cat#11093274910; RRID: AB_2734716
細菌・ウイルス株
Aeromonase veronii b1-3 (Aero. 1, GenBank: CP091140-CP091142) ゼブラフィッシュから分離（本論文） N/A
Aeromonas dhakensis b2-100 (Aero. 10, GenBank: CP091091) ゼブラフィッシュから分離（本紙） N/A
化学物質、ペプチド、リコンビナントタンパク質
次亜塩素酸ナトリウム溶液 Aladdin Cat#S101636; CAS:7681-52-9
ポリ（ビニルピロリドン）-ヨウ素錯体（PVP-I） Adamas Cat#42099A; CAS:25655-41-8
カナマイシン硫酸塩 Aladdin Cat#K103024; CAS: 25389-94-0
アンピシリンナトリウム Macklin Cat#A6265; CAS:65-52-3
アンフォテリシン B Aladdin Cat#A105482; CAS: 1397-89-3
RNA後溶液 Thermo Fisher Cat#AM7020;
Trizol 試薬 Thermo Fisher Cat#15596026
DIG RNA ラベリングミックス Roche Cat#11277073910
RNase 阻害剤 NEB Cat#M0314S
BCIP(5-Bromo-4-chloro-3-indolyl-phosphate) Roche Cat#11383221001
NBT（4-Nitro blue tetrazolium chlorie） Roche Cat#11383213001
ギムザ染色、修正液 Sigma-Aldrich Cat#48900
メイグランバルト溶液 Sigma-Aldrich Cat#63590
NeutralRed Adamas Cat# 65117A; CAS:

553-24-2
ベンジジン Aladdin Cat#B108444; CAS: 92-87-5
スダンブラック B Aladdin Cat#S109070; CAS: 4197-25-5
MCC950 Selleck Cat#S7809; CAS: 256373-96-3
LB Lennox Broth Sangon Biotech A507005
ブレインハートインフュージョンブロスホープバイオ社 HB8297-5
ウシ血清アルブミン（BSA） Sangon Biotech A600332-0025
重要な市販アッセイ
TB Green Premix Ex Taq タカラ RR820A
QIAamp DNA マイクロキット QIAGEN 56304
qPCR用 Strand cDNA Synthesis SuperMix YEASEN 11141ES60
Bacteria Genomic DNA Kit CWBio CW0552S
pMD 19-T ベクタークローニングキットタカラ 6013
DNeasy PowerLyzer Microbial Kit QIAGEN 12255
寄託データ
RNASeqの生データと解析データ本紙GEO: GSE200577
Aeromonas 1の全ゲノム配列と解析結果本紙GenBank: CP091140-CP091142
Aeromonas 10の全ゲノム配列とその解析本紙GenBank: CP091091
実験モデル生物/系統
ゼブラフィッシュ AB野生型系統中国ゼブラフィッシュリソースセンター CZ1
Zebrafish: Tg(kdrl:mCherry) Bertrand et al.60 ZDB-TGCONSTRCT-081212-4
ゼブラフィッシュ Tg(hsp70:il1b-EGFP) Yan et al.51 ZDB-TGCONSTRCT-150729-2
ゼブラフィッシュ：myd88変異体（hu3568） Vaartら.61 ZDB-ALT-130729-6
ゼブラフィッシュ: chd8 変異体この論文 N/A
オリゴヌクレオチド
プライマー一覧は表S1参照本紙N/A
il1b ATG MO：5′-TAACCAGCTGAAATGATGCATG-3′ Banerjee et al.45 N／A
tnfaスプライスMO：5′-GGGCAGGATTTTCACCTTATGGAGC-3′Nguyen-Chiら、46 N／A
ソフトウェアとアルゴリズム
画像解析 Photoshop CS6 https://www.adobe.com
画像解析 ImageJ https://imagej.nih.gov/ij
画像フォーマット Adobe Illustrator CS6 https://www.adobe.com/
データ統計解析 SPSS 16.0 https://www.ibm.com/spss
データ解析 GraphPad Prism バージョン 7 https://www.graphpad.com/
バクテリアの系統樹 MEGA7 https://www.megasoftware.net
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リソースの有無
リード連絡先
リソースや試薬に関する詳細な情報やリクエストは、リードコンタクトのLili Jing (lilijing@sjtu.edu.cn)までお願いします。
材料の入手方法
本論文で作成した動物モデルは、主担当者に依頼すれば、自由に共有することができます。
実験モデルおよび被験者の詳細
ゼブラフィッシュの飼育
ゼブラフィッシュは、上海交通大学の機関動物管理委員会（IACUC）の標準プロトコルに従って維持、取り扱い、繁殖させた。ゼブラフィッシュの成魚は、循環水システムで、26-28℃、14時間/10時間の明暗サイクルのもと、1日2回の給餌で飼育した。胚を採取し，直径 10cm のシャーレに 80-100 個の胚が入るように，既報32 の胚培地で 28.5℃ で保存した．胚は受精後数時間（hpf）および受精後数日（dpf）により段階づけした。
トランスジェニック系統
WT AB を含むゼブラフィッシュ系統と Tg(kdrl:mCherry)60 (Chinese National Zebrafish Resource Center), myd88-/- mutants61 (Southwest University of China の L. Li Lab), Tg(hsp70:il1b-EGFP)51 (Chinese Academy of Zoology Institute の F. Liu Lab) を含むトランスジェニックラインがある。6 ヶ月から 12 ヶ月までの WT、変異体、トランスジェニックフィッシュを交配し、個々の実験に用いる異なる胚を得た。WISH、qPCR、RNA-seq、化学染色の実験に用いた胚は、各図に示すように、5 dpf、6 dpf、7 dpfの3つの年齢層のものである。図2のサイトスピンおよび腸内細菌叢組成解析に用いた成魚は6ヶ月齢で、雄と雌がほぼ半々であった。
方法詳細
無菌（GF）ゼブラフィッシュ胚
GFゼブラフィッシュ胚は、以前に記述された方法で作製した。24,32 手短に言うと、交配前の夕方（Day -1）に、親ゼブラフィッシュを仕切りで雄と雌を分けたペア交配水槽に入れる。翌朝（Day 0）の光周期の開始時に、親魚はオートクレーブしたシステム水を入れた新しい清潔なペアメイト水槽に移し、交尾させた。産卵した魚から1時間以内に受精卵を採取し、その後、滅菌胚培地（SEM）で洗浄し、抗生物質含有フィルター滅菌胚培地（ABEM）の入った滅菌シャーレに移した。健康な胚は2時間で新鮮なABEMに選別し，28.5℃で6〜8時間インキュベートした。その後、胚を0.1%ポリビニルピロリドンで90秒間室温で洗浄し、その後SEMで3回室温でリンスした。0.003% 次亜塩素酸ナトリウムに室温で 16 分間浸漬した後，SEM で 3 回洗浄した．洗浄した胚を最終的に細胞培養フラスコに移し，28.5℃で培養した．導出後、GF動物を無菌の通気性組織培養フラスコで、SEM1ミリリットル当たり平均10個体の密度で飼育した。交互に、参考文献22に記載されている微生物培養法を用いてGF動物の無菌性を検査した（図S1AおよびS1B）。全群の死卵は毎日確認し、除去した。
GF魚の微生物叢およびモノアソシエーションのコロニー化
ゼブラフィッシュのコンベンショナル（CONV）幼生を作製するため，3 dpf の GF 胚に CONR フラスコの培地を接種した（最終濃度 105 cfu/ml）．
野生型ゼブラフィッシュ成体の微生物相（M-W）またはchd8-/-ゼブラフィッシュ成体の微生物相（M-C）で慣用化した胚を生成するために、野生型とchd8-/-成体を別々に滅菌システム水を備えた清潔な生簀で5〜6時間飼育した。糞を含む培地は3dpfのGF胚に接種した。その後、EM中の菌濃度を105cfu/mlに調整した。
単縁魚については、GF魚に3dpfで単一細菌種をコロニー形成させた。分離した細菌株は、Luria-Bertani（LB）ブロスまたはBrain Heart Infusion（BHI）ブロスを用いて、好気的条件下でそれぞれ一晩培養した（28.5℃）。各菌株の懸濁液を7000rpmで10分間遠心分離して上清を除去し、滅菌PBS緩衝液で3回洗浄した。その後、ペレットをSEMで再懸濁し、最終濃度が105cfu/mlとなるようにGF胚に塗布した。
ゼブラフィッシュ腸内細菌叢からの単一菌株の単離
ゼブラフィッシュ成魚を無菌環境下で解剖し、新鮮な無傷の腸管を無菌PBS溶液に入れた。組織を切断し、滅菌ハサミとペストルで粉砕した。ホモジネートを滅菌PBS溶液で10-6まで連続希釈し、各希釈液をLBまたはBHI寒天培地プレートに撒いた。28.5℃で24〜72時間培養後，プレート上のコロニーをLBまたはBHIプレート上で3回ストリーキングして単離・精製した。
分離した単一菌株の同定
分離した各菌株の全DNAを1mlの菌体懸濁液からbacteria genomic DNA kit（Cvbio, China）を用いて抽出した。プライマー5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′および5′-AAGGAGTGATCCAGCCGCA-3′を用いてポリメラーゼ連鎖反応（PCR）により16s rRNA遺伝子全長を増幅し，TAクローニングとシークエンシングにより解析した．
Aeromonas 1とA. 10の全ゲノム配列の決定と解析
細菌ゲノムDNAキット（QIAGEN, USA）を用いて、2つの汚れの全DNAを抽出した。そして、PromethION プラットフォーム (Oxford Nanopore Technologies Ltd., Oxford, UK) を用いて塩基配列を決定した。アノテーションはGLIMMER Version3.0263 (Grandomics biotechnology)で行った。ゲノム配列はnational center for biotechnology information (NCBI)からアクセッション番号GenBankでダウンロード可能である。CP091140-CP091142 および CP091091 でダウンロードできる。
ホールマウントRNA in situハイブリダイゼーション(WISH)
ゼブラフィッシュ胚のWhole-mount in situ hybridizationは、以前に記述したように行った(64)。簡単に言えば、RNAプローブはジゴキシゲニン（DIG）で標識したSP6またはT7ポリメラーゼによって転写されたものである。胚を4%パラホルムアルデヒド (PFA) で一晩固定し，PBT (PBS plus 0.1% tween) で洗浄した後，1% H2O2 で漂白し，メタノールで-20℃，少なくとも2時間，脱水した．脱水した胚は，メタノール濃度の低い順（75%，50%，25%メタノール/PBT）にて再水和し，プロテイナーゼK（10μg/ml）で処理し，DIG標識アンチセンスRNAプローブと65℃で15～60時間ハイブリダイゼーションした．その後、胚を75%、50%、25% hyb- solution/2×SSC solution (15 min/each buffer), 100%, 75%, 50%, 25% 0.2X SSC solution/PBT (10 min/each buffer), PBT 10 minで順次洗浄した。PBTで洗浄し、PBT＋2％羊血清およびBSAでブロッキングした後、胚をPBT中で1：5000に希釈した抗Digoxigenin-AP Fab断片と4℃で15時間インキュベートした。インキュベーションバッファーを除去した後，胚をPBTで15分間，6回洗浄し，NBT/BCIP溶液で染色した．染色した胚は，SZX16 実体顕微鏡または BX53 顕微鏡（Olympus, Japan）により撮影した．
Neutral red, Sudan black, benzidine染色
ゼブラフィッシュのマクロファージのニュートラルレッド染色は、以前に記載したとおりである65。ゼブラフィッシュの幼生は、胚培地中の2.5 μg/mlのニュートラルレッドで5時間生きたまま染色した。染色後、幼生は新鮮なEMで洗浄し、トリケインで麻酔して直ちに画像化した。
固定した幼虫をSudan Black（0.18％ストック、70％エタノール、0.1％フェノールで1：5希釈）で染色するまで約4時間行い、70％エタノール、70％エタノールとPBSの1：1比、100％PBSで順次洗浄した。PBTで水戻し後、1%水酸化カリウム/1%過酸化水素で幼虫の色素を除去した。幼虫は洗浄し、画像化する準備が整うまでPBSで保存した。
生きた胚をベンジジン染色液（メタノールに溶解した 2ml 5mg/ml ベンジジン，16.7μl 3M NaOAc溶液，100μl H2O2 および 2.483ml H2O）中で暗所で30分間インキュベートし，PBTで洗浄後，既出の方法で4%PFA中で一晩固定した67．
定量的 PCR (qPCR)による遺伝子発現解析
ゼブラフィッシュ幼生の腸（5 dpf）、尾部（5 dpf）、腎臓（7 dpf）の total RNA を TRIzol Reagent（Invitrogen）で抽出し、幼生の尾部、腸または腎臓約 30-40 個を 1 サンプルとした。cDNA Synthesis SuperMix (Yeasen, Shanghai, China) を用いて相補的DNA (cDNA) を作製した。その後、StepOnePlus Real-Time PCR System (Applied Biosystems) を用いて、TB Green Premix Ex Taq (Takara) を用いてqPCRを実施した。使用したRT-qPCRプライマーを表S1に示す。結果は、3つの独立した実験からの平均±標準誤差（SEM）として示し、スチューデントのt検定を用いて比較した。
ゲノムワイドな転写変化の解析とRNA-seq解析
ゼブラフィッシュ胚の腸（5 dpf）および腎臓（7 dpf）の total RNA を Trizol Kit（Thermo）を用いて製造元のプロトコルにしたがって抽出した。鎖特異的 RNA-seq のライブラリーは、以前に記述したように構築した。68 サンプルは、シングルエンド配列決定のために Novogene Bio Technology (Nanjing, Jiangsu, China) に送られた。トランスクリプトーム解析の全工程は、R studio (version: R-3.4.1) と Linux (version 4.4.7) で実施した。行リードは品質管理を行い、trim galoreでフィルタリングした。69 フィルタリングしたリードは、STARプラットフォームでゼブラフィッシュGRCz11ゲノム（https://uswest.ensembl.org/Danio_rerio/Info/Index）にアライメントした。64 Featurecountsプラットフォームを用いて各サンプルについて遺伝子発現数を定量した70。無菌（GF）条件と通常飼育（CONR）条件における正規化リードカウントの比率は、Benjamini Hochberg 法に基づく偽発見を最小化した後、±1.5の変化率カットオフと p ≤ 0.05 の厳しい有意カットオフを用いて区別されました71。有意差のある遺伝子セットをもとに、KEGGデータベースおよびGOデータベースで順次クラスタリングし、遺伝子パスウェイを可視化した。転写発現ヒートマップは ggplot と pheatmap パッケージで行った。GSEA (gene set enrichment analysis)はgseaplotパッケージで処理した。RNA-seqの生データは全てGEO (Gene Expression Omnibus database)にアクセッション番号GSE200577でアップロードされている。
イルミナライブラリーの作成と16S rRNAアンプリコン配列解析
ゼブラフィッシュの幼生および成体の腸を無菌環境下で解剖した。成体腸1個を、溶解バッファと1 mmジルコニアシリカビーズ（Biospec Products, USA）の入った2 mlスクリューキャップチューブに入れ、ミニビーズビーター（Biospec Products, Bartlesville, OK, USA）で撹拌しながら組織をホモジナイズした。6dpf胚の腸は、200μlの酵素溶解バッファー（Tris-EDTA pH8.0 with 0.1% v/v Triton X-100）中で0.1mmジルコニアシリカビーズで摩砕し、既報の通りQIAamp DNA Micro KitでDNA抽出を行った26．
16S rRNA遺伝子のV3-V4領域のイルミナライブラリーは、メーカーの説明書（Part # 15044223Rev.B; Illumina Inc., San Diego, CA, USA）に従って2段階のアプライを行い、既報のように改善した73。各サンプルから抽出したDNAを鋳型として、Platinum Pfx DNA polymerase (Invitrogen, USA) とバーコード付きプライマーを用いて、16s rRNA遺伝子のV3-V4領域を増幅した。米国）とバーコード付きプライマー、フォワードプライマー338F（5′-sampleIDtag-ACTCCTACGGGAGGCAGCA-3′）およびリバースプライマー806R（5′-sampleIDtag-GGACTACHVGGTWTCTAA T-3′）を用いて、16s rRNA遺伝子のV3〜V4領域を増幅した。次に、Nextera XT Index KitのN7とS5 Index primerを使用してIndex PCRを実施した。最後に、精製した産物を等比数で混合し、Illumina MiSeqプラットフォーム（Illumina, Inc.、米国）を通じてシークエンシングを行った。
MiSeq Illuminaリードは、QIIME2（バージョン2021.4）を用いて処理された。簡単に言うと、Zhangらによる生データの品質管理後、73のフォワードおよびリバースプライマーを除去した。次に、ソフトウェアパッケージ Divisive Amplicon Denoising Algorithm 2 (DADA2)74 (QIIME2 の "dada2" プラグイン) を適用して、配列のノイズ除去を実行した。次に、"feature-table "で代表的な配列を抽出し、"feature-classifier "で分類した。decontam R package75 を用いて、アンプリコン配列バリアント（ASV）の同定と汚染物質の除去を行った。アルファ多様性とベータ多様性（主座標分析（PCoA）を含む）は、サンプリング深さに応じて QIIME2 s の "core-metrics-phylogenetic" で計算された。ゼブラフィッシュの異なる遺伝子型間の統計的有意性は、QIIME2 の "diversity beta-group-significance" を用いて、pairwise permutational multivariate analysis of variance (PERMANOVA) で解析された。PCoAとPERMANOVA解析はいずれもBray-Curtis距離ベースであった。
全腎臓骨髄細胞のMay-Grunwald染色とGiemsa染色
成魚の腎臓骨髄を解剖し、10％FBSを含むPBSに入れた。40μmのフィルターでピペッティングと濾過を行い、腎臓骨髄から造血単一細胞を生成した。単細胞懸濁液を15,000-30,000cells/mLに希釈し、サイトスピン遠心機（Thermo, USA）を用いて600rpmで4分間細胞遠心分離した。血液塗抹標本は，May-Grünwald and Giemsa double stain (63,590/48,900, Sigma-Aldrich, St Louis, MI, USA) で処理し，形態学的解析と細胞数を算出した．
ゼブラフィッシュ成魚および7dpf齢胚の腸管のヘマトキシリン・エオジン（H&E）染色
新鮮な幼魚と成魚の腸管を4%パラホルムアルデヒドで固定し、パラフィンに包埋した。切片化後，ヘマトキシリン・エオジン（H&E）染色した（Wuhan Servicebio Technology Ltd., Wuhan, China）。染色した胚は，BX53 顕微鏡（Olympus）で画像化した．
MCC950 処理
GF WT および CONR chd8-/- 胚を 3 dpf で CONR フラスコから得た培地（最終濃度 105 CFU/ml）に接種し，20 μM の MCC950 で処理した．サンプル採取時点まで、毎日約60％の培地を交換した。
il1bモルフォリノのマイクロインジェクションおよび過剰発現
il1bモルフォリノ（MO）（5′-TAACCAGCTGAAATGATGCATG-3′）45およびtnfa MO（5′-GGGCAGGATTTTCACCTTATGGAGC-3′）46 はGene Toolsから購入した。ddH2Oで希釈して1mM MOストック溶液を調製し、6〜8ngのMOを1セル期ゼブラフィッシュ胚に注入した。
il1b の過剰発現に用いた Tg(hsp70:il1b-GFP) 胚は，3 dpf から 5 dpf または 7 dpf のサンプル採取時点まで毎日 38.5°C で 1 時間または 2 時間熱ショックした．
chd8ノックアウトゼブラフィッシュの作製(SI)
CRISPR-Cas9システムにより、chd8ノックアウト変異体を作製した。つのchd8特異的ガイドRNA（図S3B）を、エクソン1および12を標的とするように設計した。簡単に言えば、1細胞期WT胚に、100ng／μL Cas9 mRNA及び20ng／μL gRNAを含む溶液を1nL注入した。注入されたF0魚は成魚まで成長し、WT魚と交配させた。F1変異体子孫は、標的遺伝子座周辺のプライマーを用いたT7 endonuclease I (NEB, M0302S) assayで同定した。各標的遺伝子座はゲノムDNAからPCRで増幅され、DNAシークエンスにより変異が明らかにされた。F1魚はWTとアウトクロスを行い、安定したF2変異株を得た。T7E1アッセイおよびPCR増幅に使用したプライマーを表S1に示す。
M1変異を特異的に検出するPCRプライマーは以下のように設計した：chd8KOフォワードプライマー：5′-ATGTGTGTCTGCTTCAGGGAACC-3′、野生型フォワードプライマー：5′-ATGTGTGTGTCTGCTTCAGGATG-3′、共通リバースプライム：5′-ATGGTAGAGCACCTCACCACC-3′．PCR条件は、95℃、5分；31サイクル（95℃、30秒；62℃、30秒；そして72℃、40秒）；72℃、5分である。
定量および統計解析
画像解析
生画像データは、photoshop CS6, ImageJ, Adobe Illustrator CS6で処理した。
統計解析
SPSS 16.0およびGraphPad Prism 7.0を使用して、すべてのデータを解析した。WISH 染色結果を算出するため、染色後の胚を顕微鏡で解析し、染色結果に応じて高染色群と低染色群に分けた。統計解析には、染色性の高いグループを使用した。すべての実験の値は，各群約20-50個の胚を用いた3回の独立した実験の平均±平均の標準誤差（SEM）として示した．多変量比較の有意性は、一元配置分散分析によって決定した。対照からの一対の変動は、統計的比較のために、対応のない両側Students t-testによって決定された。
データおよびコードの入手方法

この原稿で生成されたRNA-seqデータは、Gene Expression Omnibusデータベース（GEO）に寄託されている。GSE200577 に寄託され、一般に公開されている。本論文で作成した細菌の全塩基配列は、GenBank:CP091140-CP091142 および CP091091 の Accession Number で National Center for Biotechnology Information (NCBI) にアップロードされている。

本論文では、オリジナルコードは報告していません。

この論文では、オリジナルのコードは報告していない。この研究で報告されたデータを再解析するために必要な追加情報は、要求に応じて主席研究員から入手できる。
謝辞
myd88-/-魚を提供してくださった西南大学のLi Li教授、Tg(hsp:il1b-EGFP)を提供してくださったFeng Liu教授、技術支援をしてくださった上海交通大学生命科学・生物工学部コア設備・技術サービスセンターのHaixia Jiang博士に感謝する。このプロジェクトは、中国国家自然科学基金（31900099、31930022、81871091）、上海交通大学革新的薬物標的同定オープンプラットフォーム（WH101117001）、重慶市自然科学基金プロジェクト（cstc2021jcyj-mmxmX1000）、中国上海獣医生命工学重点実験室基金（Shklab202002）、によって支援されています。
著者の貢献
D.Z.、M.G.、C.H.Z.、L.J.は本研究を構想し、設計した。D.Z.とH.J.はゼブラフィッシュの実験、画像解析、クローニング、シークエンス、データ解析を行った。C.Z.Z.は細菌の培養と接種を手伝った。A.A.、X.W.、M.T.はchd8変異体の作製と魚の維持に協力した。H.L.、Q.L.、H.X.はゲノムデータ解析に協力した。M.G.、C.H.Z.、L.J.はデータの解析と指導を行った。D.Z.とJ.H.は原稿を執筆し、L.J.は編集を担当した。
利害関係の宣言
著者らは、競合する利害関係を宣言しない。
補足情報
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ドキュメントS1. 図S1〜S7、表S1
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表S2. 図2に関連する、ゼブラフィッシュ幼生腸の16S rRNA遺伝子配列決定によるASVレベル表
.xlsx (.02 MB)のダウンロード
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表S3. 図2に関連した、ゼブラフィッシュ成体腸の16S rRNA遺伝子配列決定によるASVレベル表
.xlsx (.03 MB)のダウンロード
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表S4. 単離した細菌株の完全長16s rRNA遺伝子の配列、図4と関連あり
.xlsをダウンロード (4.76 MB)
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表S5. RNA-seqによるCONR幼虫とGF幼虫の5dpf時の腸内における遺伝子発現の違い（図5、S5参照
.xlsをダウンロード (4.76 MB)
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表S6. 図5およびS5に関連した、RNA-seqに基づくCONRおよびGF幼虫間の7 dpfにおける腎臓での遺伝子発現の違い。
.xlsxのダウンロード (2.54 MB)
xlsxファイルに関するヘルプ
表S7. 図5およびS6に関連した、RNA-seqに基づくWTおよびchd8-/-幼虫の5 dpfにおける腸での遺伝子発現の違い。
.xlsxのダウンロード (2.54 MB)
xlsxファイルに関するヘルプ
表S8. RNA-seqに基づくWTとchd8-/-幼虫の7dpfにおける腎臓での遺伝子発現の差、図5とS6に関連する。
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掲載履歴
オンライン公開 2023年2月15日
受理されました。2023年1月27日
改訂版受理 2022年12月23日
受理：2022年12月23日 2022年10月12日
身分証明書
DOI: https://doi.org/10.1016/j.celrep.2023.112116

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図
図のサムネイルfx1
図表の概要
図のサムネイル gr1
図1HSPCの発生には常在菌の微生物叢が必要である。
図1HSPCの発生に必要な常在細菌(gr2)
図2chd8-/-ゼブラフィッシュは、幼生および成体においてHSPC形成の阻害、腸の構造障害、微生物叢の変化を示す。
図2chd8-/-Zebrafish
図3chd8-/-の制御された微生物叢はHSPCの発生を阻害し、骨髄分化を促進する
図3gr4
図4ゼブラフィッシュの微生物叢の個々の細菌は、HSPCの発生に差違効果を示す
図サムネイルgr5
図5腸、尾、腎臓で炎症シグナルを媒介する微生物叢
図1.gr6
図6微生物が促進するHSPCの発生は、基礎的な炎症性サイトカインの発現に依存する
図サムネイルgr7
図7マイクロバイオータ介入によるchd8-/-腎臓のサイトカイン発現上昇の選択的抑制は、HSPCの発生と骨髄系分化をリバランスさせる
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