池沼養殖ヒラメ（Paralichthys olivaceus）のタンパク質代謝に対する消化管内細菌叢の反応

2023年3月2日 10:40

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ORIGINAL RESEARCH（オリジナル研究）論文
Front. Mar. Sci.、2023年3月1日
第2部微生物の共生
第10巻 - 2023年｜https://doi.org/10.3389/fmars.2023.1033094
池沼養殖ヒラメ（Paralichthys olivaceus）のタンパク質代謝に対する消化管内細菌叢の反応
Yan Jiang1† Jun Wang2† Lin Lin2 Yongjiang Xu1* Aijun Cui1 Kaijie Wang1 Xuezhou Liu1 and Bin Wang1
1中国漁業科学院黄海漁業研究所青島海洋科学技術試験所深海漁業工学共同実験室（中国・青島
2中国漁業科学院南シナ海漁業研究所南シナ海漁業資源探査・利用重点実験室（中国・広州市
タンパク質代謝は、生物の様々な生命活動のエネルギー源となる。しかし，宿主によるタンパク質代謝に伴う消化管内細菌叢構造の継承に関する研究はほとんどない。本研究では、生理生化学的手法、qRT-PCR法、16S rDNAハイスループットシーケンス法を用いて、池沼養殖ヒラメ（Paralichthys olivaceus）の各消化管組織におけるプロテアーゼ活性特性および関連遺伝子発現量、ならびに消化管内細菌叢構造の分布特性および継代を検出した。その結果、幽門側盲腸および腸管におけるペプシン、トリプシン、キモトリプシンの活性および関連遺伝子の相対発現量は、最初に増加し、次に減少したが、アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ（ASP）およびアラニンアミノトランスフェラーゼ（ALA）活性は逆の傾向が見られた。これらは、消化管内容物の栄養組成が動的であり、消化管内細菌叢のα多様性と構造に明らかな変化を引き起こしたことを反映している。Lactobacillus, Acinetobacter, Bacteroides, Escherichia-Shigella, Prevotella, Lachnospiraceae_NK4A136_group および MND1 で表される属, Sphingomonas, Alistipes, Alloprevotella, Enterobacter, Helicobacter, Myroides, Ruminiclostridium および Romboutsiaが優勢，共通性および定着率から主要消化管微生物叢として挙げられた．3つの消化管組織におけるLactobacillusとAcinetobacterの相対量は、最初に増加し、その後減少した。共有・優占属の数、一部の属の継代の一貫性、3組織間の微生物相構造の類似性の増加から、微生物相は消化管栄養組成の影響を受けると推察された。消化管マイクロバイオータの遺伝子は、KEGGパスウェイによると主に代謝経路に濃縮されており、エネルギー蓄積の代表であるFirmicutesとBacteroidetesの比率は、各組織で最初は増加、次に減少の傾向をたどった。このことから、主要な消化管内細菌叢が宿主のエネルギー蓄積に相乗的な役割を果たしていることが明らかとなった。本研究は、池沼養殖カレイの消化管内微生物相を制御することにより、高効率配合飼料の開発および飼料効率の向上を図るための参考となるであろう。

1 はじめに
タンパク質は，成長期や生殖期におけるタンパク質の同化・異化を通じて，損傷組織の維持・修復や酵素・ホルモン・抗体の産生など，生物にとって必須の生理プロセスに関与するため，最も重要な栄養素の一つである（Tuら, 2015; Santosら, 2020a; Santosら, 2020b）。プロテアーゼは、タンパク質分解の際にアミノ酸間のペプチド結合を特異的に切断する酵素である。ペプシン、トリプシン、キモトリプシンは、それぞれペプシノーゲン、トリプシノーゲン、キモトリプシノーゲンに由来する主要なプロテアーゼである。ペプシンの前駆体であるペプシノーゲンは、アスパラギン酸プロテアーゼファミリーに属し、胃の酸性環境下で活性化され、生物学的に活性なペプシンに変化する（Foltmann、1981；Korbova and Kohout、1981；Chi et al.2013；Nazemroaya et al.2020 ）。テレウスの膵臓セリンプロテアーゼであるトリプシノーゲンとキモトリプシノーゲンは、腸内で生物学的活性機能を発揮するために活性化される（Berger and Schechter, 1970; Psochiou et al, 2007; Santos et al, 2020a; Santos et al, 2020b)．ペプシノーゲン、トリプシノーゲン、キモトリプシノーゲンの合成は、それぞれの遺伝子（ペプシノーゲン、トリプシノーゲン、キモトリプシノーゲン）の発現により制御されている。消化管は、多細胞生物における栄養代謝の中心であり、食物はタンパク質の主な供給源である。食物中のタンパク質の栄養素は、摂取後、消化管に入る。この刺激を受けた生体は、これらの遺伝子の発現を上昇させ、タンパク質栄養素を遊離アミノ酸に分解するプロテアーゼの合成を促進する。そして、これらのアミノ酸は、関連するトランスポータータンパク質によって血液循環中に輸送され、タンパク質の同化および異化に利用される（Bröer, 2008; Santigosa et al, 2008; Verri et al, 2017; Wei et al, 2020）。

養殖魚の消化機能を有する消化管組織には、主に胃、幽門側盲腸、腸がある。近年、腸内細菌叢は、分子生物学、オミックス、バイオインフォマティクス技術の発展により進展したホットな研究分野となっている。腸にコロニーを形成している微生物は何兆個もあり、その組成や活性は、種、食性、生理的段階などの宿主の特性や、食餌栄養、環境細菌、ストレスなどの環境因子と密接に関係しているという研究報告がある（Liら、2012；Nicholsonら、2012；Banerjee and Ray、2017；Dwivediら、2017；Jiangら、2019；Walburnら、2019；Horlickら、2020；Jiangら、2020；など）。同様に、腸にコロニーを形成する微生物叢は、ひいては、栄養、エネルギー吸収、免疫、特に極限環境への適応を含む宿主の多くの生理活動に参加し、影響を与えることができる（Shabatら、2016；Zhangら、2016；Legrandら、2018）。これまで、全生物において130種類のグリコシド加水分解酵素、22種類の多糖類リアーゼ、16種類の糖質エステラーゼが報告されており、そのほとんどが微生物ゲノムにコードされている（Cantarelら、2009; Flintら、2012)。したがって、消化管にコロニーを形成する微生物叢は、ビタミン、有機酸、アミノ酸、成長促進因子、消化酵素、その他の生理活性代謝産物を分泌するなど、内容物を変化させる代謝機能を発揮し、宿主の生理活動に参加することが可能である。しかし、消化管内容物の栄養組成は栄養代謝の過程で常に変化しており、消化管組織が異なれば栄養組成も異なり、消化管微生物叢の構造も変化してしまう。つまり、宿主は消化管内の栄養レベルを変化させることで、消化管内細菌叢と相互作用しているのである。

日本産ヒラメ（Paralichthys olivaceus）は中国における経済種である。しかし、この種の栄養代謝に伴う消化管内細菌叢の構造変化に関する研究はほとんど発表されていない。本研究では、池沼養殖ヒラメの栄養代謝時における消化管内細菌叢の構成と分布、プロテアーゼ活性および関連遺伝子発現パターンの推移を調べ、その影響を解析した。これらは、池沼養殖カレイの高効率配合飼料の開発および在来型プロバイオティクスのスクリーニングの参考となるものである。

2 材料と方法
2.1 日本産カレイの供給源と養殖管理
本実験で使用したヒラメは、中国山東省青島市の養殖場で池養殖されたものである。この養殖場にある1つのヒラメの養殖池（35.63°N, 119.89°E）を実験池として無作為に選択した。この池の面積は約6660平方メートル、平均水深は3mであった。池で養殖されたヒラメの平均体長は47.97±0.54cm、平均体重は1043.44±38.06gであった。

餌は通常1日2回（6:00と16:00）、その量は魚体重の3%から5%であった。冷凍A. personatusは大量に購入し、冷蔵倉庫で保管した。給餌前に倉庫からA. personatusを取り出し，ある程度まで自然解凍した後，真水で数回洗浄した．この実験では，水温20〜22℃，溶存酸素5 mg/L以上，塩分濃度28〜31の水質を条件とした．24時間の飢餓状態の後、実験を開始した。なお，実験では給餌サイクルを1回としたため，池沼養殖ヒラメの給餌は1回（6：00）のみとした．

2.2 試料の採取
2.2 試料の採取過去の研究から，試料採取時刻を 0 時間（摂餌前），6 時間（摂餌後），12 時間（摂餌後）と設定した．各サンプリング時間において、ヒラメ養殖池から9個体を無作為に選び、サンプル魚とした。これらの個体はMS-222（Sigma-Aldrich, St.Louis, MO, USA）を用いて完全に麻薬化し、苦痛を最小限に抑えた。すべての魚のサンプルの採取は、地方政府からの規制および中国漁業科学院黄海水産研究所の機関動物管理使用委員会に従って厳密に実施された。それぞれの体重と体長を測定した。75％アルコールで洗浄後、使い捨て注射器で各魚の尾静脈から血液サンプル（2 mL）を素早く採取し、4℃の冷蔵庫で4時間静置した。

その後、これらの個体を解剖し、無菌条件下で滅菌ハサミと鉗子を用いて消化管を取り出した。消化管表面の脂肪組織や血管などを取り除き、75％アルコールで洗浄した後、サンプルを軽く絞り、消化管内に残っている内容物を除去した。その後、あらかじめ冷却した1.5%生理食塩水で3～5回洗浄した。胃、幽門側盲腸、腸などの各消化管をその構造的特徴により区別し、滅菌ハサミで分離し、滅菌・RNAaseフリー遠心管に充填し、液体窒素で保存した。

2.3 酵素活性測定および細菌 DNA 抽出
血液サンプルを冷蔵庫から取り出し、4℃、4000 r/minで10分間遠心分離を行った。その後、上澄み液（血清）を吸引した。3人分の血清サンプルを1つのサンプルに混合した。混合した血清試料を用いて、アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ（ASP）およびアラニンアミノトランスフェラーゼ（ALA）活性を、ELISAキット（Meilian、上海、中国）およびRT-6100（Rayto、深セン、中国）を用いて、製造者の説明書に従って決定した。

プロテアーゼ活性の検出のために、3人の個体の消化管組織を無作為に選択した。各消化管組織サンプルは、液体窒素から取り出した後、氷上で自然解凍した。一定量の組織を秤量し、1：9（w/v）の比率に従って予め冷却した組織ホモジネートを加えた後、T10 Basic S25 tissue homogenizer（IKA, Staufen, Germany）を用いて試料を均質化し、5000 r/minで4℃、30分間遠心分離した。その後、上清を回収し、ELISAキット（Meilian, Shanghai, China）およびRT-6100を用いて、ペプシン、トリプシン、キモトリプシン活性を製造者の説明書に従って測定するために使用した。

別の3人の消化管組織を液体窒素で取り出し、液体窒素で粉砕し、それぞれDNA Extraction Kit（DNeasy PowerSoil Kit, Qiagen, Germany）を用いて、製造元の指示に従って微生物叢の全ゲノムDNAを抽出した。DNAの濃度はNanoDropとアガロースゲルで調べた。ゲノムDNAを鋳型として、バーコード付きプライマーとTks Gflex DNA Polymerase (Takara, Japan)を用いてPCR増幅を行った。微生物相の多様性解析のために、16S rDNAのV3-V4可変領域をユニバーサルプライマー343 F (5′-TACGGRAGCAGCAG-3') と798 R (5′-AGGGTATCTAATCCT-3') でPCRして増幅させた。アンプリコン品質をゲル電気泳動で可視化し、AMPure XPビーズ（Agencourt, Beverly, Massachusetts, USA）で精製し、もう一回PCRで増幅させた。再度AMPure XPビーズで精製した後、最終的なアンプリコンを定量した。等量の精製アンプリコンをプールし、その後のシークエンスに用いた。シークエンスにより、ペアエンドリード（2×250 bp）を生成した。

2.4 遺伝子発現検出
最終3個体の消化管組織のトータルRNAは、RNAiso Plus試薬（TaKaRa, Dalian, China）を用いて、製造者の説明書に従って抽出された。RNAの純度と濃度はNanoDropで評価し、RNAの完全性は1%アガロースゲル電気泳動で確認した。PrimeScript™ RT reagent kit with gDNA Eraser (Perfect Real Time) (Takara, Dalian, China) を用いて、cDNAの一本鎖を製造者の指示に従い合成した。リアルタイム定量ポリメラーゼ連鎖反応（qRT-PCR）法を用いて、池沼養殖ヒラメ消化管の栄養代謝に伴う遺伝子発現量を測定した。qRT-PCRアッセイに用いるペプシノーゲン、トリプシノーゲン1、トリプシノーゲン3、キモトリプシノーゲン1、キモトリプシノーゲン2、およびハウスキーピング遺伝子（β-アクチン）（Kimら、2004）のプライマーを表1に記載する。qRT-PCR は SYBR Green Real-time PCR Master Mix (TaKaRa, Dalian, China) を用いて Mastercycler® ep realplex Real-time PCR System (Eppendorf, Hamburg, Germany) を用いて実施した。また、融解曲線をプロットし、単一PCR産物の存在を確認した。

表 1
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表 1 池沼培養ヒラメの qRT-PCR アッセイに使用したプライマー配列。

2.5 統計解析
プロテアーゼ活性および代謝酵素活性は、標準曲線法に従って算出した。標的遺伝子の発現量は、β-actin に対して正規化し、2-ΔΔCT 法により定量した。

その後、ペアエンドリードをTrimomaticソフトウェア（Bolger et al., 2014）を用いて前処理し、あいまいな塩基（N）を検出・カットした。また、スライディングウィンドウトリミング法を用いて、平均品質スコアが20以下の低品質配列をフィルタリングした。トリミング後、ペアエンドリードをFLASHソフトウェア(Reyon et al., 2012)を用いてアセンブルした。アセンブルのパラメータは以下の通り。10 bpの最小オーバーラップ、200 bpの最大オーバーラップ、20%の最大ミスマッチ率である。配列は、以下のようにさらにノイズ除去を行った。相同性に乏しいリードや長さ200bp以下のリードは除外し、Q20以上の塩基が75%以上のリードを残し、キメラを含むリードを検出して削除した。これらの処理は、QIIME ソフトウェア (Caporaso et al., 2010) (version 1.8.0) を用いて行われた。これらの処理後、全サンプルから有効なタグが取得された。Vsearch (v 2.4.2) (Rognes et al., 2016) を用いて、共有配列決定同一性が97%より高い場合、いくつかの有効タグを操作的分類単位 (OTU) にクラスタリングした。各OTUの代表的な配列を選択し、RDP Classifier (v 2.2) (Edgar, 2013) とSilva database (v 123) (Quast et al., 2013) を用いて、閾値が0.7より高い場合に種を注釈した。サンプリング効果の違いを制御するために、各サンプルごとに22,951配列（全サンプル中の最小配列量）に希釈してから多様性指標を算出した。この均質化処理に基づき、相対的存在量およびα・β多様性解析を行った。KEGGパスウェイ解析は、Tax4fun (0.3.1)を用いて行った。

データの正規分布特性を解析するために、K-S 検定を使用した。データの解析にはSPSS 17.0を用いた一元配置分散分析（ANOVA）を用い、実験全体における遺伝子発現および血清指標の変化における異なるサンプリング時間間の差の多重比較にはDuncanの検定を使用した。消化管内細菌叢の値の3つのサンプリング時間間の差の検出には、Kruskal-Wallis H検定を使用した。有意水準はp＜0.05とし、結果は平均値±SDで表した。

3 結果
3.1 プロテアーゼ活性と血清代謝酵素活性の特徴
池沼養殖カレイのペプシン活性は、実験期間中、最初に増加し、その後減少した（表2）。しかし、胃内では3回のサンプリング時刻の間で有意な差は見られなかった（P > 0.05）。幽門側盲腸と腸のトリプシン活性の傾向は、いずれも最初に上昇し、次に下降した。幽門側盲腸のトリプシン活性は摂取後12時間よりも6時間で有意に高かったが（P < 0.05）、腸の活性には3つのサンプリング時間間で有意差はなかった（P > 0.05）。幽門側盲腸と腸のキモトリプシン活性は、最初に上昇し、その後低下した。一方、腸のキモトリプシン活性は摂取後6時間で他の2つのサンプリング時間より有意に高かったが（P < 0.05）、幽門側盲腸では3つのサンプリング時間間で有意差はなかった（P > 0.05）。

表2
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表2 池沼養殖カレイの各消化管組織のプロテアーゼ活性（新鮮重量）。

池沼養殖カレイの栄養代謝過程における血清 ASP および ALA 活性の特徴を表 3 に示す。これら2つの代謝酵素活性は、消化吸収に伴い最初に低下し、その後上昇し、それぞれ0時間（95.00 U/L）および12時間（16.23 U/L）で高い値が得られた。血清ASPおよびALA活性は、6時間後に他の2つのサンプリング時間より有意に低かった（P < 0.05）。

表3
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表 3 池沼養殖ヒラメの血清 ASP および ALA 活性の特徴

3.2 消化器組織におけるプロテアーゼ遺伝子発現パターン
各池沼産カレイの消化管組織における栄養代謝過程でのペプシノーゲン、トリプシノーゲン1、トリプシノーゲン3、キモトリプシノーゲン1、キモトリプシノーゲン2などのプロテアーゼ遺伝子の発現特性を図1A〜Iに示した。胃のペプシノーゲン、幽門側盲腸と腸のトリプシノーゲン1、トリプシノーゲン3、キモトリプシノーゲン1、キモトリプシノーゲン2の相対発現量は最初に増加し、その後減少し、その値は6時間後に他の二つのサンプリング時間より有意に高かった（P < 0.05）．

図1
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図 1 池沼養殖カレイの消化管組織におけるペプシノーゲン、トリプシノーゲン1、トリプシノーゲン3、キモトリプシノーゲン1、キモトリプシノーゲン2の発現レベル。(A) 胃のペプシノーゲン、(B) 幽門側盲腸のトリプシノーゲン1、(C) 幽門側盲腸のトリプシノーゲン3、(D) 幽門側盲腸のキモトリプシノーゲン1。(E) 幽門側盲腸のキモトリプシノーゲン2； (F) 腸のトリプシノーゲン1； (G) 腸のトリプシノーゲン3； (H) 腸のキモトリプシノーゲン1； (I) 腸のキモトリプシノーゲン2。小文字の違いは、各遺伝子のサンプリング時間の違いで値が有意に異なることを表す（n = 3, P < 0.05）。

3.3 消化管内細菌叢のα多様性の変化
栄養代謝中、池沼養殖ヒラメの各消化管組織における微生物相のα多様性を図2に示す。微生物相のChao 1指数とShannon指数は、胃で最初に減少し、次に増加したが、3つのサンプリング時間間の差は有意ではなかった（P > 0.05）（図2A）。幽門側盲腸の微生物相は、栄養代謝中にChao1指数とShannon指数が徐々に増加する傾向を示し、Chao1指数は0時間よりも12時間で有意に高くなった（P < 0.05）（図2B）。腸内細菌叢のChao1指数およびShannon指数の変化は幽門側盲腸と同様であったが、3つのサンプリング時刻の間に有意差は認められなかった（P > 0.05）（図2C）。

図2
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図2 ヒラメの消化管内細菌叢のα多様性。(A)胃、(B)幽門側盲腸、(C)腸。* A）胃，（B）幽門側盲腸，（C）腸．

3.4 消化管内細菌叢の構造の変遷
図3Aには、各サンプルにおける上位10相（各処理における各消化管組織の3つの並行サンプルの平均相対存在量による）が示されており、それらはProteobacteria、Firmicutes、Bacteroidetes、Actinobacteria、およびGemmatimonadetesを含んでいる。Proteobacteria、Firmicutes、Bacteroidetesの相対存在量はいずれも20%以上であった。一方、消化管内の各採取地点では、FirmicutesとBacteroidetesの比率は最初に増加し、その後減少した。最も高い比率を示したのは幽門側盲腸であった（図3B）。同消化管内では、栄養代謝の進行に伴い、FirmicutesとBacteroidetesの比率が最初に増加し、その後減少することが示された。

図3
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図3 消化管内微生物叢の門レベルでの構造的特徴。(A）相対的な存在量の上位10門、（B）ファーミキューテスとバクテロイデテスの比率。

各サンプルの平均相対存在量による上位15種の微生物叢の属レベルの組成をFigure 4に示す。Lachnospiraceae_NK4A136_groupで表される乳酸菌、Acinetobacter、Bacteroides、Escherichia-Shigella、Sphingomonas、Prevotellaは、池沼培養ヒラメの栄養代謝中の3消化管組織で優勢かつ共通の属種であった。また、これらの微生物群は池沼養殖カレイの消化管に定着する微生物群でもあった。胃では、Lactobacillus、Lachnospiraceae_NK4A136_groupで表される属、Acinetobacter、Romboutsia、Helicobacter、Escherichia-Shigellaの相対量が最初に増え、次に減少した（図4A）。胃では、Bacteroides、Alistipes、Sphingomonas、Myroides、Pseudomonas、Haliangiumの相対量が徐々に減少する傾向を示し、他の優勢属の相対量は徐々に増加した。幽門側盲腸では、Lactobacillus、Lachnospiraceae_NK4A136_groupに代表される属、Prevotella、Acinetobacter、Ruminiclostridium、Enterobacter、Myloidが最初に増え、その後減少した（図4B）。幽門側盲腸では、Bacteroides、Glycomyces、Fusobacterium、Alloprevotella、Escherichia-Shigella、Helicobacterの相対量が徐々に減少し、他の優勢属の相対量は徐々に減少する傾向がみられた。腸管では、Bacteroides、Lactobacillus、Lachnospiraceae_NK4A136_groupで表される属、Acinetobacter、Alistipes、Romboutsia、Sphingomonas、Ruminiclostridium、Helicobacterの相対量が増加した。Escherichia-Shigella、Pseudomonas、Enterobacter、Myroidesは最初に増加し、その後減少したが、Prevotella、Glycomyces、Alloprevotellaの相対量は徐々に減少した（図4C）。幽門側盲腸のGlycomycesを除き、各消化管組織の優占種は3回のサンプリングで有意な差はなかった（P > 0.05）。

図4
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図4 池沼養殖カレイの消化管微生物相の優占種（上位15種、各処理における各消化管組織の平行3サンプルの相対存在量の平均値による）。(A)胃、(B)幽門側盲腸、(C)腸。* はサンプリング時間の違いによる同属の有意差を表す（p < 0.05）。

3.5 ベータ多様性解析
NMDS（Nonmetric Multidimensional Scaling）とは、研究対象（サンプルや変数）を多次元空間や低次元空間に簡略化し、対象間の本来の関係を保持したまま位置づけ、分析、分類を行うデータ解析手法である。ANOSIM 分析は、異なるサンプル間の全体的な差異を分析するための手法である。今回実施したANOSIM解析によると、サンプル間の微生物叢構造に有意差はなく（p＞0.05）（図5）、消化管微生物叢の多様性は消化と有意な相関がないことが示された。

図5
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図5 NMDS（nonmetric multidimensional scaling）解析の様子。

各サンプルに含まれる属の数は、各サンプルの3つの複製間で共通の基準で得られた（図6）。栄養代謝中、各消化管組織の属数は増加傾向を示した。摂取後、幽門側盲腸の固有属数は明らかに減少し、他のサンプルの固有属数は緩やかな増加傾向を示した。

図6
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図 6 池沼養殖カレイの各消化管組織における属数の特徴。

3.6 消化管内細菌叢の機能的特徴
各消化管組織のレベル1における優勢なKEGGパスウェイの相対量（平均相対量1%以上）に従って、代謝パスウェイ、遺伝情報処理、環境情報処理、細胞プロセスが相対量に応じてランク付けされた（図7）。胃の細胞プロセス、幽門側盲腸の環境情報処理と遺伝情報処理は、栄養代謝の過程で相対量が徐々に減少した。胃と腸の環境情報処理と遺伝情報処理は、栄養代謝中に最初に相対量が増加し、その後減少した。しかし、各消化管組織において、各優位KEEG経路のサンプリング時刻の違いによる有意差は認められなかった（P > 0.05）。

図7
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図 7 池沼養殖カレイの消化管内微生物相の支配的 KEGG パスウェイ。

4 考察
4.1 タンパク質の消化と代謝
ペプシン、トリプシン、キモトリプシンなどのプロテアーゼは、動物がタンパク質栄養素を消化するための重要な酵素である。これらのプロテアーゼの合成は、主に関連遺伝子によって制御されている。本研究では、池沼養殖カレイの栄養代謝過程において、すべてのプロテアーゼ活性が最初に増加し、その後減少した。しかし、ペプシン活性、腸内トリプシン活性、幽門盲腸内キモトリプシン活性には、サンプリング時間の違いによる有意な差は認められなかった。さらに、ペプシノーゲン、トリプシノーゲン1、トリプシノーゲン3、キモトリプシノーゲン1、キモトリプシノーゲン2の発現量は、いずれも栄養代謝に伴って有意に変化していることがわかった。これらの遺伝子はペプシノーゲン、トリプシノーゲン、キモトリプシノーゲンの合成を制御することができるが、その活性化は消化管内の特定の環境にも関連している。プロテアーゼ活性は、生体の生理段階や健康状態、飼料の栄養レベル、温度、外来性プロテアーゼなどの内在的・外在的要因に影響されるとする研究もある（Liu et al., 2019; Choi et al., 2020; Hassani et al., 2020; Santos et al., 2020a; Santos et al., 2020b）. 本研究で使用したヒラメのうち、餌、生活環境、種、生理的ステージに違いはない。興味深いことに、摂取後、生体はプロテアーゼ関連遺伝子の発現を上昇させ、プロテアーゼの合成と分泌を促進し、プロテアーゼ活性の上昇につながった。タンパク質の消化が進むと、消化管内容物のタンパク質栄養レベルが徐々に低下し、プロテアーゼの合成・分泌が抑えられ、プロテアーゼ活性が徐々に低下していく。消化管内の栄養レベルが常に変動しているということは、生体の反応もダイナミックに変化しているということであり、したがって、プロテアーゼ関連遺伝子の発現やプロテアーゼ活性もダイナミックに変化していたのである。このことが、池沼養殖カレイのプロテアーゼ活性や関連遺伝子発現がダイナミックに変化する重要な理由であった可能性がある。

ASPとALAは重要なアミノ酸転移酵素であり、タンパク質代謝に重要な役割を果たす（de Sousa and Sodek, 2003; de la Torre et al., 2014）。通常時、血清中のASPおよびALA活性は低いが、動物が栄養不良やストレスを受けると、血清中のASPおよびALA活性は上昇する（Lemaireら、1991；Jiaら、2021）。本研究では、摂取後 6 時間に最も低い ASP および ALA 活性が記録されたが、これは消化管に豊富な栄養があり、ASP および ALA は主にタンパク質代謝に関与していることが関係している可能性がある。Karlsson ら（2006）は、Oncorhynchus mykiss の血漿中の遊離アミノ酸濃度は摂取後 6 時間で最も高い値を示したと報告しており、これも飼料を消化する際に活発な代謝が行われる段階であることを示唆している。このことから、生理的特性に関連する研究において、試料採取時間の重要性も明らかになった。消化酵素および代謝酵素の活性特性に関する研究は、大型ヒラメ用高効率配合飼料の開発の参考となるものである。

4.2 消化管内細菌叢の構造的特徴
飼料組成、栄養レベル、添加物によって、養殖動物の腸内細菌叢の構造と構成が明らかに変化しうることが、数多くの研究で報告されている（Zhao et al., 2018; Bi et al., 2019; Hassani et al., 2020; Abou-Kassem et al., 2021）。本研究では，池で養殖したヒラメに1日2回，魚体重の3～5%に応じた餌を与え，基本的に満腹にさせた。養殖魚は野生のプランクトンや小魚を捕らえることができたが、これらの餌の割合は非常に少なかった。そのため、消化管内細菌叢の構造に与える影響については考慮しなかった。また，池沼養殖ヒラメの飼料である冷凍A. personatusは，真水で数回洗浄してから魚に供給し，冷凍A. personatusが運ぶ微生物叢がヒラメの消化管微生物叢に与える影響を最小限にとどめるようにした．タンパク質の栄養消化・代謝データから、消化管組織内の栄養基質の変化が、本研究における微生物叢の構造とα多様性の変化につながったことが示唆された。支配的な属の相対量の差は有意ではなかったが、Bacteroides、Lactobacillus、Lachnospiraceae_NK4A136_groupで表される属、Acinetobacter、Prevotella、Romboutsiaといった部分属の相対量の変化はより明らかであった。消化管内細菌叢の変化は動的で複雑であり、消化管内容物の栄養レベルによって変化しやすいと推論された。Bacteroides属，Lactobacillus属，Lachnospiraceae_NK4A136_groupおよびMND1に代表される属，Acinetobacter，Escherichia-Shigella，Sphingomonasを優占，共通性，定着性の原則に基づいて分類した。本実験では、池沼養殖カレイの消化管内の主な微生物相として、Prevotella、Alistipes、Alloprevotella、Enterobacter、Helicobacter、Myroides、RuminiclostridiumおよびRomboutsiaが挙げられた。

一般に、養殖におけるプロバイオティクスとして期待されているのは乳酸菌であり、宿主の成長性能を促進するために飼料中にBifidobacteriumと組み合わせて与えられることが多い（Hassani et al.、2020）。バクテロイデスに属する菌株の中には、抗炎症作用を有する多糖類Aを合成・分泌できるものがある（Hiippalaら、2020）。Shaoら（2020）は、廃水から分離したSphingomonas sp. PDD-57b-25とAcinetobacter towneriが、アンモニア性窒素、亜硝酸性窒素、全リン同化能が高いことを示す証拠を提示した。ヒトの腸内におけるプレボテラの相対的存在量の増加は、食物繊維によって誘導されるグルコース代謝を改善する可能性がある（Kovatcheva-Datchary et al.、2015）。エシェリキア・シゲラは、心臓弁置換術を受けた患者の抗凝固療法への反応に有害である可能性がある（Wang et al, 2020）。しかし、養殖魚におけるEscherichia-Shigellaの病原性についての研究は行われていない。Ruminiclostridiumに属するいくつかの株はセルロース分解に重要な役割を果たす（Rettenmaierら、2021）。Enterobacter, Alistipes, Alloprevotella, Helicobacterに属する菌株の中には、ヒトの臨床感染に関連するものがある可能性がある。しかし，これらの主要属の相対存在量は上昇しておらず，また，これらの属が養殖場で疾病を引き起こしたという相対的な報告もこれまでない。従って、これらの養殖物は安全かつ普通に食することができる。

野外で捕獲したショウジョウバエから分離した微生物がアミノ酸の収穫を促進し、栄養不足のハエの寿命を延ばすことを報告した研究がある（Yamada et al.、2015）。腸内細菌叢は、特に極端な環境条件下で、正常な生理活動を維持するためのエネルギー吸収で宿主を助けることができる（Shabatら、2016年；Zhangら、2016年）。エネルギー蓄積の代表であるFirmicutesとBacteroidetesの比率の変化（Ley et al., 2006; Cox et al., 2015）は、摂取後6時間で本研究の他のサンプリング時間よりも高く、この時間は栄養代謝が強く、エネルギー蓄積が速いことが示された。この変化は、プロテアーゼ活性や関連遺伝子発現の変化と一致し、栄養タンパク量の変化に伴い、宿主が生理活動に必要なエネルギーをできるだけ多く得られるような消化管内微生物叢構造の急激な変化があったことを示している。これらは、消化管内細菌叢が宿主と協力してタンパク質栄養代謝を行っていることも反映していた。さらに、ほとんどの消化管内細菌は、池沼養殖ヒラメのエネルギー供給代謝経路に主に関与しており、このことがヒラメの急速な成長・発達に関連している可能性が示唆された。また、消化管に定着する優占属の相対量は、池沼養殖ヒラメのタンパク質代謝中も高く、主な定着属は宿主の生理活動に関与する同属であることが示された。同じ海域で同じ種類の魚が同じ餌を一定期間摂取することで、魚の消化管内細菌叢構造の類似性が高くなった可能性がある。短期的な餌の変化は明らかに腸内細菌叢の構成に影響を与えるという研究報告もある（David et al.，2014）。これらはすべて、飼料が消化管内微生物叢の構造的特徴に重要な影響を与えることを示している。消化管内微生物叢の関連研究は、大型ヒラメのための在来および機能性プロバイオティクスのスクリーニングに役立つだろう。

5 結論
プロテアーゼ活性、関連遺伝子発現、血清代謝酵素活性の変化から、池沼養殖カレイのタンパク質代謝は正常であることが示唆された。また、消化管内容物の栄養組成がダイナミックに変化し、消化管内細菌叢の構造も変化した。優勢・共通・定着の原則から，Bacteroides，Lactobacillus，Lachnospiraceae_NK4A136_groupおよびMND1で表される属，Acinetobacter，Escherichia-Shigella，Sphingomonas，Plevotella，Alistipes，Alloprevotella，Enterobacter，Helicobacter，Mylides，RuminiclostridiumおよびRomboutsiaが主要微生物叢として分類された．また、FirmicutesとBacteroidetesの比率の変化と消化管内細菌叢のKEGGパスウェイ解析から、池沼養殖ヒラメのタンパク質代謝に主要なコロニー形成細菌叢が大きな相乗効果をもたらすと思われると結論づけられた。

データ利用許諾書
本研究で発表された原著論文は一般に公開されています。このデータはここで見ることができます。NCBI, アクセッション番号: PRJNA876070 https://www.ncbi.nlm.nih.gov/search/all/?term=PRJNA876070。

倫理に関する声明
この動物実験は、中国漁業科学院黄海漁業研究所の動物管理使用委員会の審査と承認を受けた。

著者の貢献
YX: 概念化、方法論、検証、執筆-レビューと編集、資金獲得; YJ: 概念化、方法論、検証、正式な分析、調査、執筆-原案作成; JW: 検証、調査; LL: 正式分析、データ管理; AC, BW, KW: データ管理; XL: 監修. すべての著者が論文に貢献し、提出されたバージョンを承認した。

資金提供
本研究は，山東省自然科学基金（ZR2020QC207），中国農業農村部南海漁業資源探査利用重点実験室基金（FREU2020-06），中央公益科学機関基礎研究基金（CAFS）（番号 20603022021011, 2020TD47）および中国農業研究システム（CARS-47）により助成されたものである。

利益相反
著者らは、本研究が利益相反の可能性があると解釈される商業的または金銭的関係がない状態で行われたことを宣言する。

査読者ZMは、査読時に著者JWおよびLLと共通の所属をハンドリングエディターに宣言した。

出版社からのコメント
本論文で表明されたすべての主張は、あくまで著者のものであり、必ずしも所属機関のもの、出版社、編集者、査読者のものを代表するものではない。この記事で評価される可能性のある製品，またはそのメーカーによる主張は，出版社によって保証または是認されるものではありません。

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キーワード Paralichthys olivaceus、タンパク質代謝、プロテアーゼ活性、遺伝子発現、消化管内微生物叢

引用元 Jiang Y, Wang J, Lin L, Xu Y, Cui A, Wang K, Liu X and Wang B (2023) Responses of the gastrointestinal microbiota to the protein metabolism of pond-cultured Japanese flounder (Paralichthys olivaceus). Front. Mar. Sci. 10:1033094. doi: 10.3389/fmars.2023.1033094

Received: 05 September 2022; Accepted: 2023年2月10日
公開：2023年03月01日

編集者

中国海洋大学ユン・リー（中国
査読者：Omid Safari, Ferdowsi University of Mashhad, China

オミド・サファリ（イラン、マシュハド・フェルドウシ大学
Zhenhua Ma, 中国南海漁業研究所（CAFS）, 中国
Quanqi Zhang, 中国海洋大学, 中国
Copyright © 2023 Jiang, Wang, Lin, Xu, Cui, Wang, Liu and Wang. これは、クリエイティブ・コモンズ表示ライセンス（CC BY）の条件の下で配布されるオープンアクセス記事です。原著者および著作権者のクレジットを表示し、本誌の原著を引用することを条件に、他のフォーラムでの使用、配布、複製を許可する。本規定に従わない使用，配布，複製は認めない．

*Correspondence: Yongjiang Xu, xuyj@ysfri.ac.cn

これらの著者は、この研究に等しく貢献しています。

免責事項：本論文で表明されたすべての主張は，あくまで著者のものであり，必ずしも所属機関のもの，あるいは出版社，編集者，査読者のものを代表するものではありません。この記事で評価される可能性のある製品、またはそのメーカーが行う可能性のある主張は、出版社によって保証または承認されるものではありません。

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鄒志勇、陳潔、呉維嘉、羅景浩、濤龍、呉慶松、王乾龍、陳江波、趙永鵬、王玉超、陳永明、周曼、徐麗嘉

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