腸内細菌叢は非小細胞肺癌の免疫療法に対する反応性に影響する

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腸内細菌叢は非小細胞肺癌の免疫療法に対する反応性に影響する

https://onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1111/1759-7714.15303


任 申南, 馮 玲欣, 劉 浩蘭, 毛 佑克, 兪 荘
初出：2024年4月4日
https://doi.org/10.1111/1759-7714.15303
について
セクション

要旨
背景
免疫療法はがん治療に革命をもたらした。最近の研究では、腸内細菌叢の影響により免疫療法の有効性がさらに高まることが示唆されている。本研究では、臨床サンプルの解析と動物モデルでの検証を組み合わせることにより、がん免疫療法の有効性に対する細菌の影響を調べることを目的とした。

方法
微生物叢の多様性と組成、および免疫チェックポイント阻害薬（ICI）に対する反応性との関係を明らかにするため、免疫チェックポイント阻害薬（ICB）による治療前の進行非小細胞肺がん（NSCLC）患者71名の便サンプルについて、16SリボソームRNA（rRNA）およびGC-MSシーケンシングを行った。さらに、異なる患者からマウスへの糞便微生物叢移植（FMT）を行い、ルイス肺がん細胞株を用いて皮下腫瘍モデルを樹立し、腸内細菌叢が異なるマウスに対するPD-1の治療効果を評価した。

結果
その結果、腸内細菌叢の多様性の上昇とICIによる治療効果との間に有意な関連があることが示された（p<0.05）。反応者（R）の腸内細菌叢ではフェカリス菌が顕著に増加し、短鎖脂肪酸（SCFA）レベル、特にブタン酸、酢酸、ヘキサン酸の増加を伴っていた（p<0.05）。さらに、Rおよび非応答者（NR）のFMTは、抗がん作用を促進し、マウスの腫瘍におけるKi-67細胞の発現を減少させた（p＜0.05）。さらに、RおよびNRのFMTは、マウスの腫瘍組織におけるPD-L1発現を変化させなかった（p＞0.05）。腸内細菌叢の多様性は、免疫療法を受けたNSCLC患者の楽観的な予後と一貫して相関しており、これはSCFAによって機能的に媒介されている可能性がある。

結論
本研究の結果から、腸内細菌叢およびSCFAの多様性が免疫療法の有効性に関連することが示された。FMTは腫瘍の進行を効果的に遅延させ、免疫療法の効果を増強することができ、したがってNSCLC患者における免疫療法の有効性を改善する根拠となる。

はじめに
免疫チェックポイント阻害薬（ICI）の相互作用の開発は、進行非小細胞肺がん（NSCLC）患者の治療状況を一変させた。1-3 免疫療法、特にICIは、顕著な有効性を示し、全毒性および副作用の発現率が低いことから、進行NSCLCに対する有望な治療選択肢となっている4。腫瘍微小環境（TME）は、ICIに対する免疫反応に重要な役割を果たしている7-9。腸内細菌叢はTMEを再プログラムすることが示されており、腸内細菌叢とその代謝産物は抗腫瘍治療に対する反応性に影響を及ぼす可能性がある10。さらに、腸内細菌叢は、その免疫調節特性により、がん治療の効果や合併症と関連している11-13。上皮バリア表面の細菌叢の組成と存在量は、炎症、免疫応答、上皮細胞および間質細胞の恒常性に同時に影響を及ぼす可能性がある。14, 15 研究により、腸内細菌叢と免疫療法に対する腫瘍患者の反応との間に密接な関係があることが確認されており、腫瘍免疫療法の有効性を予測する指標となりうる16。Tヘルパー17（Th17）細胞の分化は、おそらくIL-6、IL-21、IL-23などのサイトカインを介した明瞭な常在細菌とのコロニー形成に依存している17。腸内細菌叢はまた、様々な化学療法薬と相乗的に作用して腫瘍細胞の酸化ストレス障害を誘発し、免疫細胞の免疫応答を制御することができる18。リポ多糖、胆汁酸、硫化水素、短鎖脂肪酸（SCFA）などの代謝産物は、様々な分子メカニズムを通じて腫瘍の進行を促進または抑制することができる19。SCFAとその受容体は、制御性T細胞、樹状細胞、マクロファージなどの様々な免疫細胞に影響を与え、宿主の抗腫瘍免疫応答を活性化することが分かっている。プロバイオティクスの補充は、腸内の酪酸産生菌の存在量を増加させ、循環酪酸の増加は肺内皮細胞におけるケモカイン（CCモチーフ）リガンド20の発現をアップレギュレートし、ヘルパーT細胞17を肺にリクルートし、メラノーマの肺転移の発生を抑制することが示されている20。

糞便微生物叢移植（FMT）は、健康な腸内細菌叢を回復させることによって腫瘍患者の免疫療法を改善する可能性のある戦略として登場し、基礎研究と臨床研究の両方で注目されている21。Baruchらは、完全奏効例からFMTを受けた免疫抵抗性転移性黒色腫患者が、プログラム死-1（PD-1）阻害薬治療と併用することで有益な転帰を示すことを示した22。腸内細菌叢と腫瘍免疫療法の有効性の間には複雑な関係があることが確立されているが、その基礎となるメカニズムは完全には解明されていない23。免疫療法に対する反応が異なる患者の糞便微生物叢を調べ、治療経過中の異なる時点で便サンプルを採取した。さらに、メタボローム解析を行い、糞便中の代謝産物の変化を調べた。さらに、免疫療法に対するFMTの影響を調べるために動物モデルを利用した。全体として、本研究の目的は、進行NSCLC患者の免疫療法における糞便微生物叢の役割に関する洞察を提供し、免疫療法の有効性を高める治療戦略としての糞便移植の可能性を探ることである。

方法
患者コホートと臨床的特徴
本研究では、2021年11月から2023年8月までの間にプラチナ製剤ベースの化学療法およびICIによる治療を受けたIIIB-IV期のNSCLC患者41人を登録した。そのうち31例が1次治療、10例が2次治療を受けた。また、PD-1阻害薬＋ベバシズマブと化学療法を受け入れた患者は3人で、全員が上皮成長因子受容体（EGFR）を保有し、6人の患者は腫瘍内にキルステンラット肉腫ウイルス癌遺伝子相同体（KRAS）遺伝子変異があり、残りの患者は遺伝子変異がなかった。ルーチンの血液検査によって決定された白血球（白血球、リンパ球、好中球、単球）の絶対数に基づいて、患者の大部分は免疫療法を受けるのに十分な免疫状態を示した。ICI治療の有効性の評価は、青島大学付属病院の2名の独立した放射線科医が、免疫療法を4サイクル受けた後の患者の画像診断と血液検査の結果をもとに、RECIST 1.1（Response Evaluation Criteria in Solid Tumors version 1.1）に従って行った。患者は、標的病変における客観的奏効に基づいて、奏効群（R、n=21）と非奏効群（NR、n=20）の2群に分けられた。反応者（R）は完全奏効（CR）および部分奏効（PR）を示した患者と定義され、非反応者（NR）は病勢安定（SD）および病勢進行（PD）を示した患者と定義された24。さらに、ベースライン時と免疫療法3ヵ月後に30人の患者から便検体を採取した。本研究は、ヒトを対象とする研究に関するヘルシンキ宣言に従って実施された。すべての検体は青島大学附属病院でインフォームド・コンセントを得ており、本研究はヘルシンキ宣言（QYFY WZLL 27468）に従って施設審査委員会の承認を得た。

便サンプル採取
この研究では、合計41人のNSCLC患者が、印刷された詳細な説明書に従って便を自己採取するよう指示された。各患者には検体を採取するための便サンプル容器が提供された。患者は、採取した便サンプルを採取後2時間以内に検査室に持参するよう指示された。検査室に到着後、検体はさらに処理するまで直ちに-80℃で保存された。

DNA抽出と16S rRNA遺伝子配列決定
E.Z.N.A.土壌DNAキット（Omega Bio-tek社）の説明書に従い、微生物群集の全DNAを抽出した。抽出したDNAの品質は、1%アガロースゲル電気泳動で検出した。DNA の濃度と純度は NanoDrop2000（Thermo Fisher Scientific）で測定した。16S rRNA遺伝子のV3-V4領域を増幅するために、プライマー338F（5′-ACTCCTACGGGAGGCAGCAG-3′）および806R（5′-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3′）をポリメラーゼ連鎖反応（PCR）に使用した。同じサンプルのPCR産物を比較した。正式なPCR試験は、TransGen AP221-02、TransStart Fastpfu DNAポリメラーゼおよび20μL反応系を用いて行った： 5×FastPfuバッファー（4μL）、2.5mM dNTPs（2μL）、フォワードプライマー（0.8μL）、リバースプライマー（0.8μL）、FastPfuポリメラーゼ（0.4μL）、BSA（0.2μL）、鋳型DNA（10ng）およびDdH2Oを20μLに添加した。以下のPCR条件を用いた：初期変性（95℃、3分間）、変性（95℃、30秒間）、アニーリング（55℃、30秒間）、伸長（72℃、30秒間）を25サイクル、最終伸長（72℃、10分間）。PCR産物をAMPure XP Beads（Beckman Coulter）で精製した。精製産物はAxyPrep DNAGel extraction kit (Axygen Biosciences)を用いて2%アガロースゲルから回収した。回収した産物はQuantus fluorometer (Promega)で検出し、定量した。ライブラリー構築にはNEXTFLEX Rapid DNA-Seq Kit（Bioo Scientifi）を用いた。シーケンスにはMiseq（Illumina Inc.）を用い、PE300（ペアエンド300bp）プラットフォームを使用した。オリジナルのシーケンスデータはFastpソフトウェアを用いて品質管理を行い、ペアエンドリードはFlashソフトウェアを用いてマージした。配列の操作的分類単位（OTU）クラスタリングとキメラの除去には、類似度閾値97%のUparseソフトウェアを使用した。OTU代表配列の分類学的アノテーションにはSilva 16S rRNAデータベース（バージョン138）を用い、種レベルの分類学的アノテーション結果を得るためにRDP分類器を信頼度閾値0.7で使用した。

短鎖脂肪酸分析 (SCFA)
本研究では、50 mg の固体試料を 2 mL の粉砕チューブに正確に秤量し、500 μL のメタノール水溶液（CH3OH: H2O, v: v = 4:1）を加えた。この溶液を用いて試料をさらに固定した。ガスクロマトグラフィー質量分析（GC-MS）分析は、Agilent 8890B ガスクロマトグラフィーと Agilent 5977B 質量選択検出器（Majorbio Bio-Pharm Technology Co.） 装置は、イオン化電圧 70 eV の不活性電子衝撃 (EI) イオン化源 (Agilent) を装備した。試料分離にはDB-5MS（40 m×0.25 mm×0.25 μm）キャピラリーカラムを使用し、キャリアガスには99.999%ヘリウムを用い、流速は1 mL/分で一定とした。GCカラムの温度プログラムは、60℃で30秒間保持した後、8℃/分の速度で310℃まで昇温するように設定し、合計ランタイムは6分間とした。サンプルの注入量は1μLで、スプリッティングモード（15:1）で導入し、注入口温度は260℃とした。質量分析では、イオン源温度を230℃に設定し、四重極温度を150℃に設定した。走査モードはフルスキャンモードで、質量走査範囲はm/z 50-500であった。GC/MSの質量分析計検出から得られた生データは、MassHunterワークステーション定量分析ソフトウェア（バージョン10.0.707.0）を用いて前処理した。このソフトウェアは、CSV形式の3次元データマトリックスを生成した。代謝物の同定は、NIST（バージョン2017）、Fiehn（バージョン2013）、MS-DIAL（バージョン2021）などの公開データベースを含むデータベースを検索して行った。

細胞培養
ルイス肺癌（LLC）細胞は、Procell Life Science & Technology Co. Ltd.から入手した。LLC細胞株はDNAフィンガープリント解析を用いて認証され、マイコプラズマ汚染は陰性であった。細胞は、10%(v/v)のウシ胎児血清(FBS)(Gibco, Thermo Fisher Scientific)および1%のペニシリン-ストレプトマイシンを含むダルベッコ改変イーグル培地(DMEM)(Gibco, Thermo Fisher Scientific)で、37℃、5% CO2の加湿雰囲気で培養した。

マウス
特定病原体フリー（SPF）C57Bl/6マウスをShandong Academy of Medical Sciences Laboratoriesから購入した。マウスは年齢と性別を一致させ、青島大学附属研究所の動物施設で独立した通気ケージに収容した。マウスの実験はすべて6週齢のときに行った。マウスはSPF条件に従って群飼いし、滅菌した飼料と水を与えた。本研究で報告した動物実験は、青島大学動物飼育倫理委員会（AHQU-MAL20230331）の承認を得た。

ブランク群（リン酸緩衝生理食塩水[PBS]投与）、PD-1モノクローナル抗体（mAb）（200μg/マウス、クローン：RMP1-14、Bio X Cell）、抗生物質（ATB）＋PD-1群、PD-1＋R群FMT、PD-1＋NR群FMT、PBS＋ATBの6群に分けた。実験のサンプルサイズは、メタゲノム解析とメタボローム解析の両方の要件によって決定された。また、サンプルサイズの検証には資源方程式法を用いた。この方法の計算式によると、E値（Evalue）は動物の総数からグループの総数を引いた値として計算される。この場合、Evalueは(6×6)-6=30となり、20（E-valueの限界）を超える25。腸内細菌叢を枯渇させるため、マウスは飲料水に広域抗生物質カクテル（ABX）を1週間投与された。ABXカクテルはアンピシリン（1 g/L）、ネオマイシン（1 g/L）、メトロニダゾール（0.5 g/L）から構成されていた26。R群とNR群のマウスは抗生物質で治療された後、7日間の糞便移植とLLC接種が行われた。細菌の投与は実験期間中継続した。ドナーの糞便をPBSに溶解し、数回遠心分離して沈殿物と上清を分離し、上清をさらに0.22μmの滅菌ナイロンフィルターでろ過した。FMT＋PD-1群のレシピエントマウスには、1対1の経口投与で上清を投与した。約5×105個のLLC細胞をマウスの右脇腹背部に皮下接種した。腫瘍サイズを終点まで週3回測定し、腫瘍体積を縦×横2×0.5として算出した。腫瘍接種後、腫瘍を有するマウスに特定の日にPBS中の抗PD-1モノクローナル抗体（mAb；クローンRMP1-14、BioXCell）を腹腔内注射した。ブランク群とPBS＋ABT群のマウスにはPBSを注射した。23日目にマウスを犠牲にし、腫瘍を外科的に分離して重量を測定し、さらなる検査のために保存した（図4a）。腫瘍接種前および犠牲時に、異なる群のマウスから糞便サンプルを採取した。さらなる解析のために、マウスの便のRNAおよびDNAの抽出とqPCR解析を行った。

統計解析
統計解析は、SPSS 24.0 software（IBM Corp.）、Microsoft Office Excel 2007（Microsoft Inc.）またはR software version 4.0.3（R Foundation for Statistical Computing）を用いて行った。患者の臨床病理学的特徴と微生物叢組成との関連を評価するために、カイ二乗検定およびノンパラメトリック検定（Mann-Whitney UまたはKruskal-Wallis）を適用した。グループ間の組成の違いを比較するために、パーミュテーショナル多変量分散分析（PERMANOVA）を用いた。線形判別分析（LDA）の効果量（LEfSe）は、腸内細菌叢組成の存在量の差異分析を検討するために実施した。ハザード比および95％信頼区間は、Cox回帰モデルを用いて算出した。検定した結果はすべて両側検定とし、p値が0.05未満の場合は統計的に有意とみなした。

結果
ベースラインの腸内細菌叢の多様性は免疫療法に対する良好な反応と関連する
免疫療法のバイオマーカーとしての腸内細菌叢の役割を調べるために、ICIによる治療を開始した41人の進行NSCLC患者を対象とした研究を行った（図1a）。患者の詳細な臨床情報を表1に示す。このコホートの年齢中央値は65歳であった。奏効率によると、CRとPRの患者は21人（51.2％）で奏効群（R）に分類され、SDとPDの患者は20人（48.8％）で非奏効群（NR）に分類された。合計31人の患者が第一選択免疫療法を受け、10人の患者が第二選択免疫療法を受けた。相関分析の結果、年齢、性別、喫煙の有無、肥満度、病期、組織型、骨転移、PD-L1発現および治療ラインは、このコホートにおける免疫チェックポイント阻害薬（ICB）に対する反応性と関連しない臨床因子であった。これらの患者の便サンプルについて16S rRNA遺伝子の塩基配列決定を行い、合計4098 536塩基配列リードと1 694 221 698塩基リードを得た。R群とNR群のα多様性指標の違いを、図1b-eに示す群間差検定により検討した（Ace、Chao、Coverage、Sobs多様性など）。このうち、Ace、Chao、Sobs指数は微生物の多様性を表し、Coverage指数は微生物試料の真正性を表す。その結果、R群ではNR群に比べ、腸内微生物のα多様性とリッチネスが高いことがわかった（p < 0.05）。また、両群間で腸内微生物の多様性を比較したところ、β多様性に有意差が認められた（p < 0.05）。分類学的解析の結果、バクテロイデーテス（Bacteroidetes）と放線菌（Actinobacteriota）の濃度は、NR群よりもR群で高かった（図1g）。

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図1
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パワーポイント
キャプション
表1. 患者のベースライン臨床病理学的特徴およびICB治療効果との関連。
患者の特徴 合計（n = 41） R NR p値
年齢
≤65 21 (51.2%) 13 (61.9%) 12 (38.1%) 0.395

65 20 (48.8%) 18 (40%) 12 (60%)
性別
男性 33 (80.5%) 15 (71.4%) 18 (90.0%) 0.238
女性 8 (19.5%) 6 (28.6%) 2 (10.0%)
喫煙状況
喫煙者 16 (42.9%) 9 (38.1%) 7 (35.0%) 0.606
非喫煙者 25 (57.1%) 12 (61.9%) 13 (65.0%)
肥満度
高い（≧25） 21 (34.1%) 10 (47.6%) 11 (55.0%) 0.636
低い（25未満） 20 (65.9%) 11 (52.4%) 9 (45.0%)
ステージ
III 14 (34.1%) 7 (33.3%) 7 (35.0%) 0.910
IV 27 (65.9%) 14 (66.7%) 13 (65.0%)
組織型
腺がん 22 (53.7%) 10 (47.6%) 12 (60.0%)
扁平上皮がん 18 (43.9%) 10 (47.6%) 8 (40.0%) 0.510
肉腫様癌 1 (2.4%) 1 (4.8%) 0 (0)
PD-L1
非特定 2 (4.9%) 2 (9.5%) 0 (0) 0.288
陰性（TPS＜1％） 17 (41.5%) 7 (33.3%) 10 (50.0%)
陽性（1％＜PD-L1＜49％） 15 (36.6%) 7 (33.3%) 8 (40.0%)
陽性（PD-L1 50％以上） 7 (17.1%) 5 (23.8%) 2 (10.0%)
骨転移
あり 6 (14.6%) 2 (9.5%) 4 (20.0%) 0.410
なし 35 (85.4%) 19 (90.5%) 16 (80.0%)
治療ライン
1 31 (75.6%) 14 (66.7%) 17 (85.0%) 0.177
2 10 (24.4%) 7 (33.3%) 3 (15.0%)
略語 ICB, 免疫チェックポイント阻害薬; NR, 非応答者; PD-1, プログラム死-1; R, 反応者。
属のレベルでも、2群間で種の構成に違いが認められた（図1h）。Faecalibacterium属（p = 0.000969）、Ruminococcus属（p = 0.04891）、Ruminococcus属（p = 0.01019）、Lachnospiraceae_NK4A136_group属（p = 0.03034）、Lachnospiraceae_NK4A136_group属（p = 0. 03034）、[Eubacterium]_siraeum_group（p = 0.04603）および分類不能_c__Clostridia（p = 0.0008736）は、NR群と比較してR群患者で有意に濃縮されていた（図1i）。効果量の線形判別分析（LEfSe）を用いると、FaecalibacteriumがR群で濃縮されていることも観察された（図1j）。LEfSeの結果はさらに、NR群と比較してR群の糞便中にFaecalibacterium（LDA = 4.466）が多いことを示した（図1k）。また、NSCLC患者の臨床的特徴とFaecalibacteriumの存在量との相関を解析した。R群とNR群の間で有意差のあるFaecalibacteriumの解析に基づいて、腸内細菌叢プロファイルに基づくNSCLCの予後予測モデルを開発した。Faecalibacteriumの解析の結果、受信者動作特性（ROC）曲線における曲線下面積（AUC）は0.8（95％CI：0.66-0.94）であった（図1l）。これらの所見から、腸内細菌叢の高い多様性とFaecalibacteriumの豊富さが、進行NSCLC患者における免疫療法の有効性に重要な役割を果たしている可能性が示唆された。

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図2
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パワーポイント
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腸内細菌叢組成に対する免疫療法の効果
免疫療法後の腸内細菌叢の変化をさらに調べるために、糞便サンプルの塩基配列データを解析した。我々は、進行NSCLC患者30人から採取した糞便サンプルの16S rRNA遺伝子の塩基配列を、免疫療法の前後で決定した。免疫療法が腸内細菌叢に及ぼす影響を観察するために、ICI治療を行った。免疫療法前のサンプルを "B "と定義した。免疫療法後の検体を「A」と定義した。免疫療法後の微生物叢多様性指標のレベルの変化を分析した。Ace、Chao、Sobsの各指数を用いて腸内微生物の多様性を評価した。これらの多様性指数（p < 0.05）が示すように、免疫療法後に腸内微生物の多様性が増加することが観察された（図2a-d）。門レベルでは、ファーミキューテス属、バクテロイデーテス属、プロテオバクテリア属、アクチノバクテリア属、Verrucomicrobia属が糞便サンプル中の主要な細菌群集であることがわかった（図2e）。しかし、門レベルでは、免疫療法の前後で菌種構成に有意差は認められなかった。その後、属レベルで群間差分析を行った。Faecalibacterium（p=0.02813）は属レベルで有意差を示した（図2f,g）。免疫療法後にFaecalibacteriumが増加した（p < 0.05）。

腸内細菌叢はSCFAを介して抗腫瘍の役割を果たす
以上の研究から、免疫療法ではFaecalibacterium属が優勢であることがわかった。Faecalibacteriumは酪酸を産生する主要な細菌群のひとつである27。次に、腸内細菌叢の代謝産物が免疫療法にどのような影響を及ぼすかをさらに検討した。免疫療法後の患者30人の糞便中のSCFAをGC-MSを用いて測定した。R群の腸内代謝産物である酪酸はNR群より有意に高く、p<0.05であった（図3a）。また、他のSCFAについても両群間の違いを分析した。酢酸、ブタン酸、イソ吉草酸およびイソ酪酸の含量は、NR群と比較してR群で有意に高かった（図3b、p＜0.05）。さらに、異なるSCFA間の相関を分析した。プロパン酸と酢酸、ブタン酸と酢酸、イソ吉草酸とブタン酸の間に正の相関が認められた（図3c、p＜0.05）。両群を比較すると、SCFAの含量は全般的にNR群で低く、特にブタン酸、酢酸、ヘキサン酸で低かった（図3d、p＜0.05）。各SCFAのAUC値を算出し、ROC曲線を構築して進行NSCLC患者の予後予測能を評価した。その結果、イソヘキサン酸を除く他の7つのSCFAは、進行NSCLC患者の予後に対して良好な予測値を示した（図3e）。腸内細菌叢とSCFAsの相関分析では、Faecalibacteriumが酪酸と正の相関を示した（図3f）。

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図3
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パワーポイント
キャプション
FMTはLLCマウスの進行を遅らせる
腫瘍増殖に対する腸内細菌叢の影響を調べるため、C57BLマウスの皮下腫瘍モデルを樹立し、腹腔内注射でPD-1を投与した。その後、腸内細菌叢を減少させる抗生物質（ATB）を1週間投与した。NR群とR群の患者の便をLLCレシピエントマウスに経口投与した。合計36匹のマウスを6群に分け、各群6匹ずつとした。各群のマウスにNSCLC患者6名の糞便上清を経口投与し、FMTを行った（図4a）。

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図4
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パワーポイント
キャプション
抗生物質投与後、腸内細菌叢の多様性指標とOTUは有意に減少した。糞便移植は抗生物質によって引き起こされた腸内細菌叢の多様性を回復させた（図4b,c）。FMTとPD-1モノクローナル抗体を併用したマウスでは、腸内細菌叢の多様性が有意に増加した（p < 0.05）。次に、LLCマウスの腫瘍負荷に対するFMTの効果を評価した。その結果、LLCマウス、特にR FMT群の腸内細菌叢は、ある程度腫瘍の進行を遅延させることが示された（図4d）。この研究結果は、マウスの腸内多様性が低いほど腫瘍の進行が速いことを示している。免疫療法は腫瘍の進行を遅らせることができ、FMTは免疫療法の効果をさらに高める。Ki-67 腫瘍細胞数はNR FMT群とR FMT群で減少し、p＜0.05であった（図4e）。FMTはまた、ブランク（PBS）群と比較してPD-L1発現の減少をもたらしたが、その差は有意ではなかったが、p＞0.05であった（図4f）。

大腸内容物の16S rRNAの塩基配列を決定したところ、腸内細菌叢の組成は6群のマウスで異なっていた。マウスの腸内細菌叢の機能予測は、ヒトのサンプルで観察された結果と同様の結果を示した（図4g）。さらに、抗生物質を投与されたマウスでは腸内細菌叢の多様性が著しく減少し、腸内細菌叢が破壊されて腫瘍の発生が促進されることが示された。抗生物質はPD-1阻害剤の治療効果も減弱させた。腸内細菌叢の変化に従ってマウスを分析した結果、R患者からFMTを受けたマウスでは、腸内細菌叢の多様性がベースラインと比較して改善されていることがわかった。しかし、この結果はNR群のFMTと比較すると有意差はなく、p＞0.05であった（図4h）。属レベルでは、臨床検体で観察されたのと同じようにはいかないが、各群間で種の構成に違いが観察された（図4i）。Muribaculaceae とLigilactobacillusは、NR FMT群と比較してR FMT群で有意に濃縮されていた。Escherichia-Shigella, Parabacteroides, Lachnospiraceae_NK4A136_group, Helicobacter, BlautiaはNR FMT群で有意に濃縮されていた。全体として、腸内細菌叢の多様性がPD-1阻害薬治療に対する反応性に影響することが示唆された。患者からのFMTは腸内細菌叢の多様性を改善し、動物モデルにおける腫瘍の進行を遅らせることができる。

考察
NSCLCは肺がんの一種であり、その侵攻性と高い死亡率が特徴である28, 29。NSCLCの発生と進行は、免疫抑制に関連する免疫回避としばしば関連している。免疫療法は進行したNSCLC患者の治療において有望な結果を得ているが、有効なのは一部の腫瘍型に限られ、個人差により免疫に関連した合併症の発生率も高い。主な課題の1つはNSCLCの不均一性であり、これは患者によって免疫療法に対する反応が異なる可能性があることを意味する。この不均一性は、腫瘍遺伝子型、免疫状態、腫瘍微小環境などの様々な要因に起因する。もう一つの課題は、免疫療法に対する抵抗性の発現である。免疫療法は一部のNSCLC患者で有望な結果を示しているが、多くの患者は最終的に治療に対する耐性を獲得し、腫瘍の再発につながる可能性がある。抵抗性のメカニズムを理解し、それを克服する方法を見つけることは、免疫療法の長期予後を改善するために極めて重要である32。ゲノミクスとメタボロミクス技術の進歩により、腫瘍の発生、進展、治療における腸内細菌叢とその代謝産物の役割が明らかになってきた33。現在では、微生物叢が宿主の免疫系とTMEを調節することによって腫瘍免疫療法に影響を与えうることがますます認識されるようになっている34, 35。微生物叢由来の代謝産物は、宿主の免疫と代謝を直接的または間接的に調節し、腫瘍の発生と進行に重要な役割を果たす36。

Sivanらは、ビフィズス菌が樹状細胞（DC）を活性化することで腫瘍の増殖を抑制し、腫瘍特異的CD8 + T細胞のエフェクター機能を高めることを示した。しかし、ビフィズス菌がDCを活性化してCD8 +細胞の抗腫瘍効果を向上させる具体的なメカニズムについては、さらなる研究が必要である21。進行NSCLC、腎臓がん、尿路上皮がん患者のデータを含むRoutyらの研究では、免疫療法の前または直後に抗生物質を投与された患者では、PD-1阻害剤免疫療法による無増悪生存期間と全生存期間が短いことが判明した。腸内細菌叢のショットガンシーケンスから、PD-1阻害薬免疫療法に反応した患者はアッカーマンシアに富んでいることが明らかになり、アッカーマンシアがPD-1阻害薬免疫療法に対する反応を増強する可能性が示唆された。しかし、アッケマンシアがPD-1阻害薬免疫療法を増強する根本的なメカニズムはまだ不明である37。腸内細菌叢の構成に加えて、微生物の代謝産物も重要な役割を果たしている可能性がある38。SCFAは、食物繊維の腸内微生物発酵によって産生される主要な代謝産物である。SCFAは、Gタンパク質共役受容体（GPCR）を直接活性化し、ヒストン脱アセチル化酵素（HDAC）を阻害することができる39, 40。SCFAはまた、様々な免疫細胞の分化と機能を調節することによって腫瘍免疫を制御し、アポトーシスに対する腫瘍細胞の感受性を高め、低酸素誘導因子（HIF）を減少させ、腫瘍細胞の免疫原性を高めて化学療法や免疫療法の効果を改善することができる27, 41。

本研究では、ICI療法を開始した進行NSCLC患者41人を対象に、16S rRNAシーケンスを用いて腸内細菌叢プロファイルの前向き調査を行った。その結果、良好な臨床効果を示した患者では、NRと比較して多様性が高く、腸内細菌叢組成が明瞭であることが示された。Ace指数、Chao指数、Coverage指数、Sobs指数で表されるα多様性指数は、R群で有意に高く、腸内細菌叢の種数が多いことを示していた。Ace、Chao、Sobsはサンプル中の微生物多様性を推定する。カバレッジはサンプル中の微生物の実際の状況を反映している。この観察は、R患者とNR患者の腸内細菌叢の組成の違いと一致した。PCoAによるβ多様性解析でも、ICB治療に対する臨床反応に基づく明確なクラスターが明らかになった。これらの結果は、遺伝的背景や地理的位置にかかわらず、腸内細菌叢の多様性がICB治療に対する良好な反応に関連する共通の因子である可能性を示唆している。多様性に加えて、腸内細菌叢の組成もICI治療に対する良好な反応と関連していた。進行NSCLC患者のコホートで観察された最も頻度の高い属はBacteroides属であり、これはヒトの腸内細菌叢にBacteroides属が多いことを示した先行研究と一致している42。さらに解析を進めると、RとNRの腸内細菌叢組成の違いが明らかになった。R群では、Faecalibacterium、Ruminococcus、Lachnospiraceae_NK4A136_group、[Eubacterium]_siraeum_group、および分類されていない_c__Clostridiaが豊富であった。LEfSeはさらに、NR群と比較してR群の糞便中にFaecalibacteriumが多いことを確認した。免疫療法後の腸内細菌叢の変化をさらに調べるため、糞便サンプルのシークエンスデータを解析した。免疫療法後、Ace、Chao、Sobs指数で表されるα多様性指数が高いことがわかった。興味深いことに、免疫療法後にBlautiaとE. Shigellaが減少したが、その差は有意ではなかった。研究により、健康な人に比べて肺がん患者ではBlautiaの濃度が有意に高いことが示されている。その結果、早期NSCLC群ではBlautiaが顕著な遺伝子レベルのバイオマーカーであることが示された43。研究により、ICI治療を受けた進行NSCLC患者に対するがん悪液質の有害な影響が認められている。腸内細菌叢プロフィールから、E. Shigellaが属レベルで患者の悪液質と高い関連性があることが示された44。このことは、E. ShigellaがNSCLC患者における免疫療法の予後不良と関連する可能性も示唆している45。しかし、肺がん免疫療法における特異的な腸内細菌叢の作用機序を確認するには、さらなる研究データが必要であろう。さらなる解析により、免疫療法前（B）と免疫療法後（A）の腸内細菌叢組成の違いが明らかになった。その結果、免疫療法後にFaecalibacteriumが増加していることが示された。以前の臨床研究では、PD-1およびCTLA-4遮断の有効性に便性細菌が正の相関を示した46。このことは、患者がICI治療に感受性が高いという報告とも一致する。

多くの研究から、酪酸を含むヒト体内のSCFAのほとんどが腸内細菌の代謝に由来することが示されている。フェカリス菌は抗炎症作用を持ち、代謝障害を改善することが知られており、腸内で酪酸を産生する主要な菌である47。この研究では、R群の便中酪酸含量がNR群より有意に高いことが示された。両群を比較すると、SCFAの含量は概してNR群で低かった。腸内細菌叢とSCFAsの相関を解析したところ、糞便細菌は酪酸と正の相関を示した。最近の研究では、Clostridium butyricum MIYAIRIがNSCLCにおけるICIの有効性と楽観的な関連を有することが報告されている49。この結果は、酪酸と免疫療法奏効との間に正の関連を示したが、Clostridium butyricumの有病率に奏効者と非奏効者との間に有意差は認められなかった。1つの可能性は、この研究における数の制限にある。全体として、本研究は、進行NSCLC患者における腸内細菌叢の組成、多様性とICI療法に対する反応性との関連を強調している。特定の細菌分類群およびSCFA、特にFaecalibacteriumと酪酸が奏効例で濃縮されていることは、ICB療法の有効性を増強する潜在的な役割を示唆している。腸内細菌叢の構成が異なる患者において、全身性の抗腫瘍免疫応答が多様であることは予想に難くない。

これらの知見を踏まえて、ICIとFMTを併用することで非応答状態を逆転させることができるかどうかを検討した。腸内細菌叢を調節し、非奏効患者の治療成績を改善するために、ICBとFMTを併用する治療の可能性を探るためには、さらなる研究が必要である。本研究では、R患者3人とNR患者3人の便をLLC腫瘍を持つC57BLマウスに移植してFMTを行った。その結果、NSCLC患者の糞便上清を投与したマウスでは、抗生物質投与後に腸内細菌叢の多様性が回復した。しかし、FMTを行ったマウスでも、多様性はR群とNR群で変わらなかった。我々は、患者由来の腸内細菌叢の一部のみがマウスの腸内にコロニー形成されたと考えた。抗生物質を投与したマウスはPD-1治療に対する反応が悪く、有効群のFMTはPD-1の抗腫瘍効果を増強することが観察された。さらに、抗生物質を投与されたマウスでは腸内細菌叢の多様性が著しく減少し、腸内細菌叢が破壊されて腫瘍の発生が促進された。抗生物質はPD-1阻害剤の治療効果も減弱させた。この所見は、微生物叢の乱れが病気の進行に影響していることを示していた。腫瘍組織を分析したところ、FMTはKi-67発現を効果的に低下させたが、PD-L1発現には有意な影響を及ぼさなかった。しかし、本研究では、FMT投与後、LLCマウスはR FMTとNR FMTの間で病勢進行に有意差を示さなかったことから、R FMTの抗腫瘍効果は限定的であることが示された。大腸内容物の16S rRNAの塩基配列を決定したところ、6群のマウスで腸内細菌叢の組成に違いが認められ、ヒトのサンプルで観察されたのと同様の機能予測が得られた。本研究の結果から、FMTはマウスの腸内細菌叢の多様性を効果的に富化できることが示された。しかし、R群とNR群のFMTでは抗腫瘍効果に統計学的有意差は認められなかった。この知見は、FMTは確かに腸内細菌叢を調節しうるが、その抗腫瘍効果は腸内細菌叢の多様性だけで決まるものではない可能性を示唆している。微生物叢の特異的組成、微生物叢と免疫系との相互作用、宿主の遺伝的背景などの他の因子も、FMTの抗腫瘍効果を決定する上で重要な役割を果たしている可能性がある。とはいえ、今回の知見は、免疫療法におけるFMTの可能性を否定するものではない。今後、FMTの抗腫瘍効果の根底にあるメカニズムをさらに解明し、免疫療法への応用に最適な条件を特定するための研究が必要である。

しかし、本研究にはいくつかの限界があった。第一に、われわれはLLCのマウスモデルを用いたが、直接細胞移植という技術的制約があり、肺がんの解剖学的構造を完全に再現できない可能性がある。それにもかかわらず、われわれの研究は、肺癌と免疫チェックポイント阻害に対する腸内細菌叢の影響を説得力を持って証明したと信じている。第二に、腫瘍の増殖は様々な複雑な要因に影響され、免疫はその一面に過ぎない。動物モデルとヒトとの腸内細菌叢組成の個人差を考慮し、異なる個人における腸内細菌叢の微生物スペクトルをさらに調査すべきである。最後に、サンプルサイズが小さいため、より広範な集団を代表していない可能性があり、研究結果の一般化可能性が制限される。現在のところ、研究は水平的な臨床研究に限られており、臨床研究にはより多くの臨床サンプルが必要である。複雑な腸内細菌叢と免疫系との間には、未発見の潜在的なつながりが数多くあり、その解明が待たれていると考えられる。

結論として、腸内細菌叢とその代謝産物が様々な悪性腫瘍の発症に関与し、腫瘍免疫療法の臨床結果にも影響を及ぼす可能性があることが研究により証明された。腸内細菌叢の多様性とSCFAは、NSCLC免疫療法に対する反応性に有意に関連している。腸内細菌叢の多様性とSCFAsが高いほど免疫療法の効果は高い。糞便性細菌は免疫療法の有効性と相関を示した。腸内細菌叢の代謝産物と免疫系との関係をさらに探求することで、進行NSCLC患者の治療に新たな道が開ける可能性がある。さらに、抗生物質、プロバイオティクス、糞便微生物叢移植（FMT）などの腸内細菌叢を標的とした介入が、代謝産物のがん促進作用またはがん抑制作用に影響を及ぼすかどうかを調べることは、今後の研究にとって重要な分野である。

著者貢献
Shengnan Renがデータ解析を行い、原稿を執筆し、正式な解析を行った。Lingxin Fengがデータ解析を行った。Haoran Liuは臨床サンプルを収集した。Yuke Maoが検証を行った。Zhuang Yuが原稿の執筆と監修を行った。

謝辞
本研究は、山東省自然科学基金会（ZR202102240880）、青島自然科学基金会（23-2-1-189-zyyd-jch）、中国臨床腫瘍学会研究基金会（Y-QL202101-0258およびY-pierrefabre202101-0074）、呉潔平医療基金会（320.6750.2021-02-92）、山東省医師会（YXH2022ZX02020）および中国国家自然科学基金会（82373170）の支援を受けた。

利益相反声明
著者らは、本研究が、潜在的な利益相反と解釈され得る商業的または金銭的関係がない状態で実施されたことを宣言する。

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