アッカーマンシアの補給は卵巣癌の糞便微生物叢移植の腫瘍促進効果を逆転させる

第41巻 第13号 2022年12月27日 111890号
論文紹介
アッカーマンシアの補給は卵巣癌の糞便微生物叢移植の腫瘍促進効果を逆転させる
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ハイライト

OC患者からのFMTはOC担癌マウスにおいて腫瘍の発生を促進する

アッケシソウの補給は、OC FMTマウスの腫瘍の進行を抑制する

アッケシソウの補給は、OC FMT マウスの抗腫瘍免疫機能を強化する。

OC-免疫微小環境におけるCD8+T細胞活性化と腸内環境の関連性

概要
卵巣がんは、早期診断が困難であること、治療に対して鈍感であることから、依然として臨床的な課題である。腸内細菌叢は、免疫調節を通じて複数の癌の進行を調節する。OCと腸内細菌叢の関係については、十分に解明されていない。我々は、OC患者の糞便が良性対照と異なる特性を示すことを見出した。OC患者からの糞便微生物叢をOC担持マウスに移植した後、腫瘍の発生が加速される。さらに、アッケシソウをFMTで補充すると、マウスの腫瘍の進行が有意に抑制される。腫瘍のRNA配列解析から、アッケシソウをFMTで補充した後、T細胞活性化経路がアップレギュレートされることが示された。さらに、酢酸の蓄積はアッケシソウの存在量の上昇を伴い、これはCD8+T細胞のインターフェロンγ（IFNγ）分泌の増強と関連し、またその殺腫瘍特性も示している。本研究は、癌の免疫監視における腸内細菌の重要性を明らかにし、酢酸の蓄積とIFNγ分泌の増加によるCD8+T細胞の細胞傷害性機能とを結びつけている。

グラフィカルな要旨

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キーワード
アッカーマンシア卵巣がん腸内細菌叢移植腸管恒常性免疫微小環境T細胞
研究テーマ
CP:微生物学CP:癌
はじめに
卵巣がんは、世界中の女性の婦人科がん死亡原因の第1位です。1,2 骨盤内腔に深く存在する卵巣と広範囲な転移は、卵巣がんの満足のいく結果をもたらさず、患者、臨床医、政府にとって大きな健康・経済負担となっています。

腸内細菌叢は、様々な悪性腫瘍の発生に影響を及ぼすことから、ますます注目を集めています。3,4 消化器系腫瘍に対する腸内細菌叢の直接的な影響に加えて、腸内細菌叢の異常と遠隔腫瘍進行の間の根本的な相互調節が徐々に確認されています5,6,7,8,9 一方で、異なる異なる癌腫において腸内細菌叢シグネチャーが特徴づけられてきたように、腸内細菌叢組成における変化が癌と関連しています10。一方、チェックポイント阻害免疫療法中に特定の腸内細菌叢を投与すると、遠隔腫瘍の発生が抑制されることが証明されている。12 しかし、特定の微生物叢の単回投与では、期待通りの抗がん効果が必ずしも保証されない。特定の微生物叢の投与に依存することの限界として、この微生物中心のアプローチは、微生物叢が生息する環境に対して宿主がいかに影響するのか、さらに、病状という宿主環境の変化が微生物叢にいかに影響するかを考慮していないことがあげられる。この複雑なクロストークは、腸内細菌叢の重要性とともに、腸管粘液の厚さや腫瘍の微小環境に対するバリア機能によって反映される腸管恒常性にも光を当て、OCの発症、病態、進行、予後の解明につながる可能性がある。

腸内環境の恒常性はがんにとって重要であるが、卵巣という比較的隔離された環境では解剖学的な理由から外部環境との活発なコミュニケーションに欠けるため、OC患者の腸内細菌叢と腸管バリア機能についてはほとんどわかっていない。興味深いことに、腸内細菌叢が遠隔地の腫瘍の発育や腫瘍形成に影響を与えることは、すでに多くの研究で確認されている。例えば、ホルモン受容体陽性（HR+）乳癌では、腸内環境の乱れが循環腫瘍細胞を増加させ、腫瘍排出リンパ節や肺に播種する13。いくつかの腸内細菌（Akkermansiaなど）は、大腸癌免疫微小環境を制御し、腫瘍の進行に影響を与える可能性がある14。また、いくつかのコホートでは、肺がん、メラノーマ、上皮性腫瘍に対するチェックポイント阻害免疫療法の有効性と関連する腸内細菌叢のシグネチャーが同定されています5,6,7,8,9 さらに、腸内細菌叢の健康状態を模した特定の腸内細菌を投与すると、個人において様々な悪性腫瘍のTリンパ球の動員促進に役立つことを証明する文献が増加してきています。したがって、OC の腸内細菌叢シグネチャーの同定は、宿主免疫システムを理解し操作する上でますます重要になる15。

本研究では、糞便微生物叢移植（FMT）を利用して、がん患者の腸内細菌叢が生体内でがんの進行にどのような影響を与えるかを探った。その結果、腸内細菌叢が免疫微小環境の調節に重要な役割を果たし、結核の進行を抑制していることを明らかにしました。さらに、トランスクリプトームとメタボロームを評価し、腸内細菌叢の修正と腸管バリアが、結核の免疫監視に果たす免疫学的反応の可能性を明らかにした。本研究は、腫瘍、腸内細菌叢、免疫環境を統合的に捉え、宿主腫瘍の特徴的な環境を描き出し、今後の腫瘍の生物学的治療法の設計に光を与えるものである。

研究成果
腸内細菌叢の乱れと腫瘍の進行の関係
腸内細菌叢とOCの関係を調べるため、OC患者40名（OC群）と良性疾患患者40名（良性群）の糞便サンプルを16S rRNA遺伝子配列決定により比較した。主に、良性群とOC群の間で、人口統計学的な差は検出できなかった（表S1）。16S rRNAの塩基配列決定では、OC患者と良性対照者の間にα多様性の差は見られなかった（図S1A）。驚くべきことに、我々はβ多様性に有意差を見出し（図S1B）、OC患者と良性対照者の腸内細菌叢の間に食い違いがあることを示唆した。その後の研究により、Verrucomicrobia門が良性の対照群と比較して、OC患者で有意に減少していることが確認された（図S1CおよびS1D）。また、Verrucomicrobia属に属するAkkermansia属がOC群では著しく減少していた（Figure 1A、1B）。腸内細菌叢の線形判別分析（LDA）でも同様の結果が得られ、LDAスコアに関して良性群ではAkkermansia属が4倍濃縮されていることが検出された（図1C）。したがって、アッケマンソウ属の消失は、腸内細菌叢の組成の乱れによって腫瘍の進行に伴うOC患者の特徴であるといえる。

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図1. 腸内細菌叢の乱れは腫瘍の進行に関係する

(A）良性群とOC群における属レベルの細菌の相対的存在量。良性、良性疾患患者（n = 40）、OC、卵巣がん患者（n = 40）。棒グラフの場合、色のついたボックスの高さは、そのグループ内でのその生物の相対的存在量を表し、存在量が1%未満の分類群は "その他 "に表示されている。OC群ではAkkermansia属が減少した。Akkermansia 属は赤色で表示した。

(B)良性グループとOCグループにおける上位10属の存在量。OC群では良性群に比べ、Akkermansia属が有意に減少していた。Akkermansia属は赤色で表示されている。

(C)良性群とOC群における差分属を比較することで、識別バイオマーカーを区別した。LDAスコアが4倍以上の変化を示した識別バイオマーカーを棒グラフで表示し、OC群でAkkermansia属が有意に減少していることを示す。Akkermansia属は赤色で表示されている。

(D）ID8細胞注入前に抗生物質水（ABX、n＝5）で処理したマウスと抗生物質水なし（コントロール、n＝5）のタイムライン。

(E）ID8細胞の腹腔内（i.p.）注入によって形成された腫瘍を有するマウスの生物発光画像で、ID8細胞注入前に抗生物質を投与した場合と投与しなかった場合。

(F）13週目の総光束の対数を示すグラフである。生物発光画像の総フラックス定量は、13週目にABX群がコントロール群に比べ有意に高かった。

(G）腸内細菌叢におけるAkkermansia属の相対的存在量を13週目にコントロールとABXマウスで比較した。ABX群ではAkkermansia属の相対量が顕著に減少していた。

(B), (F), (G)のp値はWilcoxon rank-sum testにより決定した。∗0.01 < p ≤ 0.05; ∗0.001 < p ≤ 0.01; ∗∗p ≤ 0.001。

腸内細菌叢のOC発生制御への寄与を理解するために、我々はマウスID8腹腔内注射モデルにおいて、広域抗生物質（ABXs）投与の有無でOCの進行を調査しに行った。これまでの研究で、腫瘍形成における微生物相の役割は、腫瘍の進行とは異なることが示唆されている16。この2つの可能性を区別するために、発がん前後に腸内細菌相を枯渇させ、Xenogen IVIS Spectrum in vivo生物発光イメージングシステムで腫瘍の進行を分析した（図1DおよびS1E）。これまでのデータ17と同様に、抗生物質の投与時期にかかわらず、13週目に対照群と比較してABX投与群でより多くの腫瘍の進行が観察された（図1E、1F、S1F、S1G）。

次に、ABX投与条件とID8誘導条件における糞便サンプルの微生物叢の変化を解析した。我々の仮説通り、ABX投与後、微生物叢密度は顕著に減少した（図S1H）。ABX投与群のα多様性は対照群のそれよりもはるかに低く、β多様性は両群を有意に区別した（図S1IおよびS1J）。重要なことは、13週目のABX投与マウスでは、Akkermansia属の相対的存在量も劇的に減少していたことである（図1G）。これらのデータを総合すると、腸内細菌叢の乱れ、特にアッケシソウ属の存在量の交替が、OCの進行と密接に関連していることが示唆される。

アッケシソウの補充は、OC FMT マウスの腫瘍の進行を抑制した
OC患者およびABXトリガー腫瘍担持マウスの腸内細菌叢におけるAkkermansia属の消失は、OC進行に伴うAkkermansiaの保護効果によると考えた。以前の研究で、腸内細菌叢のアッカーマンシアは、チェックポイント遮断時の様々な上皮性腫瘍の免疫反応の増強と関連していることが示されている8。このため、担癌マウスにFMTとアッカーマンシアの補充を行った。4週間の抗生物質摂取後、5群のマウスにリン酸緩衝生理食塩水（PBS群）、良性患者からの糞便微生物叢（良性群）、OC患者からの糞便微生物叢（OC群）、OC患者からの糞便微生物叢とアクセルマンシア懸濁液の組み合わせ（OC + Akk群）、およびアクセルマンシア摂食（Akk群）をガバイトにより与えた（Figure 2A）。ルミネセンスで標識した ID8 細胞を、抗生物質治療の開始時に腹腔内注射した。腫瘍の進行は、11、13、15週目にモニターされた。我々の仮説と一致して、OCグループは13週と15週の両方で良性マウスよりも腫瘍の進行が見られた（Figure 2B-2D）。興味深いことに、OC＋Akk群では15週目にOC群よりも腫瘍の進行が大幅に遅くなった。しかし、アッケシソウの給餌（Akk群）はOCの進行を遅らせることはできなかった（図2B〜2D）。これらの興味深い結果は、OC群でマウスが腸内細菌叢を受け取った機会に、アッカーマンシアの潜在的な保護効果について光を当てている。しかし、このデータは、他の上皮性腫瘍で証明されたように、OC 抑制に対するアッカーマンシア単独給餌の治療効果を特定することはできなかった8。

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図2. アッケシソウの摂取はOC FMTマウスの腫瘍の進行を抑制した

(A）ID8搭載マウスに、PBS（PBS群、n＝5）、良性患者由来の糞便微生物叢（良性群、n＝5）、OC患者由来の糞便微生物叢（OC群、n＝5）、OC患者由来の糞便微生物叢とアケルマンシア懸濁液を併用（OC + Akk群、n＝5）、アケルマンシア単独給与（Akk群、n＝5）を与えた場合の時系列データ。

(B）PBS、良性、OC、OC＋Akk、Akk群におけるID8細胞のi.p.注入により形成された腫瘍を有するマウスの生物発光画像。

(C) 13週目の生物発光画像のTotal flux定量は、良性群に比べOC群で有意に高い。Total fluxの対数をグラフに示す。

(D）生物発光画像の総光束量は、15週目にOC群が良性群に比べ有意に高く、OC＋Akk群がOC群に比べ低いことがわかった。総光束の対数をグラフに示す。

(E）PBS群、良性群、OC群、OC＋Akk群、Akk群における門脈レベルの細菌の相対存在量である。棒グラフの場合、色のついたボックスの高さは、そのグループ内でのその生物の相対的な存在量を表し、存在量が1%未満の分類群は "その他 "に表示される。Verrucomicrobia門は、良性グループとOC＋Akkグループで明らかに濃縮されていた。Verrucomicrobia門は赤色で表示されている。

(F) PBS、良性、OC、OC + Akk、Akk群におけるAkkermansia属の相対的存在量。Akkermansia属は、良性群に比べOC群で有意に減少し、OC群に比べOC＋Akk群で濃縮された。

C）、（D）、（F）の多群間比較にはKruskal-Wallis H testを、各2群のポストホック検定にはNemenyi testを使用した。∗0.01 < p ≤ 0.05; ∗0.001 < p ≤ 0.01.

次に、11週と15週の5群の糞便サンプルについて16S rRNA遺伝子塩基配列を決定した。図S2AおよびS2Bに示すように、11週目では5群間でα-diversityおよびβ-diversityに差は見られなかった。FMTまたはアッカーマンシアを4週間経口投与した後、5群のマウスでα-diversityとβ-diversityが有意に区別された（図S2CおよびS2D）。特に、Verrucomicrobia門は、OC群よりも良性群およびOC＋Akk群で高い存在感を示し、Akkermansiaの補充は、OC FMTマウスの微生物叢組成を顕著に変化させた（図2E）。重要なのは、OC群と比較して、OC＋Akk群におけるAkkermansia属の相対存在度が明らかに増加し、これは良性群と同様であったことである（図2F）。しかし、Akk群はOC+Akk群ほど糞便中のAkkermansia量が増加せず、OCの発症に影響を受けていないことが確認された。

アッケシソウの補給は、OC FMTマウスの腸管バリア機能を回復させた。
担癌マウスで観察されたOCの抑制に加えて、FMTとアッケシソウの補給の寄与をさらに理解するために、他の上皮性腫瘍で証明されたアッケシソウの保護効果の可能性を分析することを進めた。我々は、アッカーマンシアの補給が、腸のホメオスタシスを調節する可能性があると考えた。実際、アッカーマン シアは粘液層の厚みを増し、上皮バリアを強化する。18,19 対照的に、腸バリア機能障害は、異なるメカニズムで腫瘍成長を促進することが可能である。アッカーマン シア補充による抗腫瘍効果の基礎的なメカニズムを調べるために、PBS、良性、OC、OC + Akk、および Akk 群のマウスのアッカーマン シアの量（図 S2E）、腸管バリア機能、および腫瘍進行に関して調査した。従って、OC FMTマウスの腸管粘液層は良性群に比べ有意に薄かった（図3Aおよび3B）。OC FMTマウスのバリア機能マーカー（Muc2、Occludin、Tjp1）の発現は良性群に比べかなり低かった（Figure 3A、3C-3E）。OC + Akk群では、腸管粘液層はOC群より著しく厚く（図3Aおよび3B）、Muc2、OccludinおよびTjp1の発現もOC FMTマウスより高かった（図3Aおよび3C-3E）。この結果は、5群の腫瘍の進行とアキレス腱の豊富さの両方と一致した。

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図3. アッケシソウの補給はOC FMTマウスの腸管バリア機能を回復させた

(A）PBS、良性、OC、OC＋Akk、Akk群の大腸で粘液層厚（μm）を測定し、AB-PAS染色により観察した。Muc2は免疫組織化学的に、OccludinとTjp1は免疫蛍光的に5つのグループの可視化された。

(B）5群の粘液層厚の統計グラフである。良性群およびOC＋Akk群のマウスは、OC群よりも粘液層が厚い。

(C) 5群のMuc2発現量の統計グラフ。良性群およびOC＋Akk群では、OC群に比べMuc2の発現が増加していることが確認された。

(D) 5群のOccludin発現量の統計グラフ。PBS群、良性群、OC群、OC＋Akk群、Akk群のOccludinを免疫蛍光法で可視化した。OC群に比べ、良性群およびOC＋Akk群でOccludinの発現が増加していることが観察された。

(E) 5群のTjp1発現量の統計グラフ。PBS群、良性群、OC群、OC＋Akk群、Akk群のTjp1を免疫蛍光法で可視化した。OC群に比べ、良性群およびOC＋Akk群でTjp1の発現の増加が観察された。

多群間比較にはKruskal-Wallis H testを、（B）-（E）の各2群間のポストホック検定にはNemenyi testを使用した。∗∗は0.001＜p≦0.01；＊＊p≦0.001。

重要なことは、腸管粘液の厚さ、および腸管バリア機能マーカーがAkk群で増加しないことを示すデータである。アッカーマンシアの補給は、OC FMTマウスの腸のホメオスタシスを調節することが観察されました。したがって、アッカーマン シアの補給によってもたらされる腸のホメオスタシスは、FMT 存在下のマウスの OC の進行を遅らせることができ た。

アッケシソウの補給は、OC FMT マウスの抗腫瘍免疫機能を強化した。
腫瘍の進行を抑制するアッケシソウの補給の潜在的なメカニズムをさらに調べるために、良性、OC、およびOC + Akk群のマウスの腫瘍組織のRNA配列決定を行った。全体として、OC群では良性群に比べ4,001遺伝子の発現が有意に低下したのに対し、OC＋Akk群ではOC群に比べ2,073遺伝子が有意に上昇しました。合計1,797個の遺伝子が交差していた（図S3A）。これらの遺伝子を解析した結果、最も有意に濃縮されたGene Ontology（GO）パスウェイは、T細胞およびB細胞の活性化および機能に関連するものであった（図4A）。上位のKyoto Encyclopedia of Genes and Genomes（KEGG）パスウェイは、T細胞受容体シグナル伝達経路の参加を確認した（図S3B）。典型的なGOパスウェイの重要な遺伝子も同時にターゲットにされた（図S3C）。要約すると、OC＋Akk群ではOC群と比較して免疫細胞の表面マーカー（CD3e、CD4、CD8）が増加しただけでなく、免疫反応の活性化指標（IFNg、TNF、CD80、CD83）も上昇していることが分かった（図4B）。さらに、遺伝子セットシグネチャーに基づく手法ImmuCellAI22によって24種類の免疫細胞の存在量を予測したところ、細胞傷害性T細胞とCD8+ T細胞がアッカーマンシア補給後に増加することに注目しました（図4C）。これらのデータから、アッカーマン シアの投与は、OC FMT マウスの CD8+ T 細胞の細胞傷害性機能を促進することにより、腫瘍の進行を抑制することが示唆された。

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図4. アッケシソウの補給は抗腫瘍免疫機能を強化した

(A）良性、OC、OC＋Akk群のマウスの腫瘍組織についてRNAシークエンスを行った。OC群では良性群に比べ4,001遺伝子の発現が有意に減少したが、OC＋Akk群ではOC群に比べ2,073遺伝子が有意に増加した。合計1,797遺伝子が交差していた。1,797個の交差する遺伝子のGO濃縮解析の結果、T細胞やB細胞の活性化や機能に関連するGOタームが有意に濃縮されていることが明らかになった。

(B）RNA配列解析により、OC＋Akk群の免疫細胞表面マーカーおよび活性化マーカーの発現量は、OC群より高かった。

(C）良性腫瘍、OC、OC＋Akk群における腫瘍微小環境の免疫細胞量は、RNAシーケンスを用いたImmuCellAIにより予測された。このアルゴリズムにより、細胞傷害性T細胞およびCD8+ T細胞がアッカーマンシア補充後に増加することが示された。データは、平均値±SEMとして示される。

(D）PBS、良性、OC、OC＋Akk、およびAkk群の新鮮な腫瘍組織を採取し、フローサイトメトリーによりCD8＋T細胞におけるIFNγ＋の割合を検出した。OC群のIFNγ+ CD8+T細胞は良性群に比べ有意に減少し、OC+Akk群ではOC群に比べ増加した。

p値は、（C）および（D）においてKruskal-Wallis H検定で決定し、ポストホック検定にNemenyi検定を用いた。∗0.01 < p ≤ 0.05; ∗0.001 < p ≤ 0.01; ∗∗p ≤ 0.001。

RNA配列決定の結果を証明するために、PBS、良性、OC、OC＋Akk、Akk群の新鮮な腫瘍組織を採取し、CD8＋T細胞におけるインターフェロンγ（IFNγ）＋の割合を検出しました。その結果、OC群では良性群に比べIFNγ+ CD8+T細胞が有意に減少し、OC+Akk群ではOC群に比べIFNγ+ CD8+細胞の割合が劇的に高くなった（図4D）。この結果は、5群の腫瘍の進行状況や糞便中のAkkの存在量と一致した。

免疫反応は、腫瘍の負荷の度合いだけでなく、腸内細菌叢の交替にも影響される可能性がある。腸内アッカーマンシアのOCに対する抗腫瘍効果を結論づける前に、腸内アッカーマンシアの存在量の変動が免疫機能に及ぼす単一の効果を評価することが不可欠である。そこで、動物を抗生物質で前処理した後、C57BL/6マウスの1群にOC患者の糞便微生物叢（C57_OC群）を、もう1群にはOC患者の糞便微生物叢とアッカーマンシア懸濁液を組み合わせて投与した（C57_OC + Akk群）。脾臓、リンパ節、末梢血を採取し、エフェクターメモリーT細胞（TEMs；CD45RAlowCD62LlowCD44high）およびセントラルメモリーT細胞（TCMs；CD45RAlowCD62LhighCD44high）の検出を行った。OC微生物叢を経口投与したマウスと比較して、CD4+ TEMおよびCD8+ TEMは、アッカーマンシア補給後の脾臓で有意に高かったが、CD4+ TCMおよびCD8+ TCMでは顕著な差が観察されなかった（図S4A）。一方、我々は、CD4+ TEMおよびCD8+ TEMがリンパ節で有意に高く（図S4B）、CD4+ TEMがアッカーマン シア補充マウスの末梢血で有意に高い（図S4C）ことに気付いた。要約すると、我々のデータは、アッケシソウの補給によって寄与される腸の恒常性が、OC FMTマウスのCD8+ T細胞の殺腫瘍能力を増強し得ることを明らかにした。

アッケシソウの大量摂取に伴う酢酸レベルの上昇は、CD8+ T細胞の殺癌能力の向上に関係していた
アッケシソウの摂取に関連する代謝物を探索するため、C57_OC および C57_OC + Akk 群で、4 週間同時に微生物叢を摂取させ、腸内細菌叢構造と糞便中短鎖脂肪酸（SCFA）濃度を検出した。16S rRNA遺伝子配列解析の結果、両群間でβ多様性にマークの差があり（図S5A）、アッカーマンシア補充後、アッカーマンシアの存在量が有意に高くなった（図S5B）。糞便SCFA測定では、酢酸塩とプロピオン酸塩の濃度がアッカーマンシア補給後に有意に高くなり、特に酢酸塩が14倍以上上昇した（図S5C）。次に、16S rRNA 遺伝子配列の解析によって検出された属の存在量と SCFAs 濃度との相関を解析した。その結果、AkkermansiaはSCFAsと最も相関が高い属であることがわかった（図S5D）。

さらに、糞便SCFA濃度の変化のパターンを観察するために、PBS、良性、OC、OC＋Akk、Akkの各群の糞便SCFA濃度も調べた。予想通り、酢酸塩とプロピオン酸塩の濃度は OC 群で著しく低く、良性群と OC + Akk 群で有意に高くなり（図 5A）、5 群の腫瘍進行と Akkermansia 豊かさに適合していた。T細胞機能に対するSCFAの効果をさらに検証するために、ID8を持つマウスの排出リンパ節からT細胞を分離し、酢酸ナトリウム、プロピオン酸ナトリウム、酪酸ナトリウムで処理したT細胞の抗腫瘍能力を探るために、T細胞媒介癌細胞キリングアッセイを実施した。その結果、酢酸ナトリウムで処理したT細胞は、4つのグループの中で最も高いがん細胞殺傷力を示し、プロピオン酸ナトリウムや酪酸ナトリウムは、T細胞の抗腫瘍能力に大きな影響を及ぼさなかった（図5Bと図5C）。また、酢酸ナトリウム、プロピオン酸ナトリウム、酪酸ナトリウムでそれぞれ処理したCD8+T細胞におけるIFNγ+細胞の割合も検出された。酢酸ナトリウム提示のIFNγ+ CD8+細胞の割合はコントロールより高く、プロピオン酸ナトリウムまたは酪酸ナトリウム提示のIFNγ+ CD8+細胞の割合はコントロールと比較して差がなかった（図5Dおよび図5E）。上清中のIFNγレベルも、酢酸ナトリウムで処理したT細胞で高くなったが、プロピオン酸ナトリウムまたは酪酸ナトリウムで処理したT細胞は、コントロールに比べてIFNγを多く分泌しなかった（図5F）。これらのデータは、アッケシソウの腸内補充がOCの進行を抑制するメカニズムが、酢酸レベルの上昇と強く関連しているという我々のモデルを支持するものであった。

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図5. アッケシソウの大量摂取に伴う酢酸レベルの上昇は、CD8+T細胞のがん細胞殺傷能力の向上に関連していた。

(A）PBS群、良性群、OC群、OC＋Akk群、Akk群の糞便中のSCFAをガスクロマトグラフ-タンデム質量分析（GC-MS/MS）分析によって測定した。酢酸塩、プロピオン酸塩、酪酸塩の濃度は、OC群では良性群より有意に低く、OC＋Akk群ではOC群より高くなった。

(B) T細胞を介した殺腫瘍アッセイ。排出リンパ節のT細胞とID8細胞を異なるSCFA（酢酸ナトリウム、プロピオン酸ナトリウム、酪酸ナトリウム）存在下で8日間共培養し、残った腫瘍細胞をクリスタルバイオレットで染色して写真に撮った。酢酸ナトリウムを提示したT細胞は、コントロールよりも多くの腫瘍細胞を死滅させた。

(C) (B)の腫瘍細胞死滅率の統計グラフである。酢酸ナトリウム提示のT細胞は、コントロールに比べ、有意に多くの腫瘍細胞を死滅させた。

(D）異なるSCFA（酢酸ナトリウム、プロピオン酸ナトリウム、酪酸ナトリウム）の提示におけるIFNγ+ CD8+T細胞を、フローサイトメトリーにより検出した。

(E) (D)の統計グラフ。酢酸ナトリウムの存在下で、コントロールよりもIFNγ+ CD8+細胞の割合が高かった。

(F）酢酸ナトリウム、プロピオン酸ナトリウム、酪酸ナトリウムで処理したT細胞培養液のIFNγ濃度をELISA法により検出した。酢酸ナトリウムで処理したT細胞は、コントロールに比べてより多くのIFNγを分泌した。

p値は、(A), (C), (D), (F)でKruskal-Wallis H testにより決定し、ポストホックテストにはNemenyi testを使用した。∗0.01 < p ≤ 0.05; ∗0.001 < p ≤ 0.01; ∗∗p ≤ 0.001。

酢酸塩の抗腫瘍の役割は、まだin vivoで検証する必要があります。そこで、もう一つの動物実験を計画した。抗生物質を4週間投与した後、2群のマウスに、OC患者の糞便微生物叢（OC群）とOC患者の糞便微生物叢と酢酸ナトリウムの組み合わせ（OC＋酢酸塩群）を投与した（図6A）。ルミネセンスで標識したID8細胞を、抗生物質治療の開始時に腹腔内注射した。腫瘍の進行は、11、13、および15週目にモニターされた。OC + 酢酸塩グループは、13週および15週の両方でOCグループより少ない腫瘍負荷を所有しており（図6B〜6D）、これは酢酸塩補充が効率的にOC進行を減衰させることができることを明示する。

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図6. 酢酸の補給はOC FMTマウスの腫瘍の進行を抑制した。

(A）OC患者の糞便微生物叢（OC群、n＝5）およびOC患者の糞便微生物叢と酢酸塩溶液の組み合わせ（OC＋酢酸塩群、n＝5）を摂取させたID8保有マウスのタイムライン。

(B）OC群およびOC＋酢酸塩群のID8細胞のi.p.注入により形成された腫瘍を持つマウスの生物発光画像。

(C）13週目の生物発光画像の総光束定量は、OC＋酢酸塩群でOC群に比べ有意に低かった。総光束の対数をグラフに示す。

(D）生物発光画像の総光束定量は、15週目にOC＋酢酸塩群でOC群に比べ有意に低下した。総光束の対数をグラフに示す。

(E）OC群およびOC＋酢酸菌群の新鮮な腫瘍組織を採取し、フローサイトメトリーによりCD8＋T細胞におけるIFNγ＋の割合を検出した。

(F) (E)の統計グラフ。OC＋アセテート群におけるIFNγ+ CD8+T細胞は、OC群に比べ有意に増加した。

C）、（D）、（F）において、Wilcoxon rank-sum testにより統計的有意性を判定した。∗0.01 < p ≤ 0.05; ∗0.001 < p ≤ 0.01.

さらに、FMTと酢酸投与のCD8+ T細胞の細胞傷害性への影響を調べるために、2群の新鮮な腫瘍組織を集め、CD8+ T細胞におけるIFNγ+の割合を検出した。フローサイトメトリーにより、OC＋酢酸塩投与群のIFNγ+ CD8+T細胞の割合はOC群に比べ有意に高かった（図6Eおよび図6F）。この結果は、酢酸塩の補充が、腫瘍の微小環境におけるCD8+ T細胞の殺腫瘍能力を効果的に高めることができることをさらに検証するものであった。

考察
本研究において、我々は、腫瘍患者の腸内細菌叢シグネチャを同定した。OC患者を動物疾患モデルとし、修正FMTを実施した。その結果、アッケマンソウの摂取により、腫瘍の進行が抑制され、腸管バリア機能が回復することが確認された。さらに、トランスクリプトームとメタボロームから、アッカーマン シアの補給によって腸内細菌叢の組成を調整すると、抗腫瘍免疫機能が向上し、それは酢酸レベルの上昇に関連していることがわかった。本研究は、腸内細菌叢と免疫監視の観点から、宿主の腫瘍特徴環境を描き出し、今後の腫瘍の生物学的治療法の設計に光を与えるものである。

Akkermansia属の最も重要な種であるAkkermansia muciniphila (A. muciniphila) は、Wageningen大学の科学者によって初めてヒト糞便サンプルから分離された19。かなりの研究で、腸外腫瘍を含む悪性腫瘍の患者において腸内のAkkermansiaが減少することが確認されており23、一定量の腸内Akkermansiaの重要性を示すものであった。今回の結果では、Akkermansia属の存在量は最高ではなかったが、対照群とOC群との間のAkkermansiaの存在量の変化は最も明らかであった。また、Akkermansia属は腸の粘膜に定着し、ヒトの免疫機能と密接に関係していることが証明されている。アッカーマン シアの重要な代謝物の 1 つである SCFA は、腸のバリア機能を変化させることで免疫反応を調節することができる。24 そこで、OC 患者の腸内細菌叢の病態を修正し、健康でバランスのとれた腸内細菌叢組成が OC モデルに与える影響を模倣して検出するため、OC FMT にアッカーマ ンシアを補充することが選択された。しかしながら、Akkermansiaのようないくつかの腸内細菌叢は、健康状態のシグネチャー種として認識されており、腸内恒常性維持、癌抑制、悪性腫瘍の免疫調節に有益な影響を与えるが25、それらの投与は単一治療として健全な結果を保証しない可能性がある12。ここで、我々はまた、アッカーマンシアの補充がOC FMTマウスの腫瘍進行を抑制する一方で、抗生物質治療後のアッカーマンシア単独投与（Akk群）は満足な抗腫瘍効果を発揮できず、Akk群の腸内アッカーマンシア量は明らかに上昇しないという矛盾を見いだした。この矛盾は、宿主の状態と腸内細菌叢の間のクロストークを十分に考慮する必要性をさらに支持し、腸内細菌叢の保護的役割は、特定の種の単独補完ではなく、バランスのとれたコミュニティによってのみ得られる可能性を示唆するものであった。

アッカーマン シアは、通常、粘液層に定着する腸内常在菌である19 。本研究では、良性マウスとOC + Akkマウスで粘液層が厚く、腸管バリアー蛋白の発現が上昇し、腸内アッカーマン シアの量も相対的に多くなっていることが確認された。粘液タンパク質は、粘液層の厚さを維持するための粘液の主要な構成要素である。アッケシソウの最も重要な代謝産物の一つであるSCFAsは、有益な微生物叢と宿主粘液の間の橋渡しの役割を果たした。粘液タンパク質の分解に伴い、SCFAsは宿主上皮細胞が粘液タンパク質を合成・分泌するために不可欠なエネルギー源となる。さらに、SCFAsの蓄積は、宿主のタンパク質沈着の負担を軽減するために、杯細胞を刺激してムチンをより多く生産させる。26,27,28 Akkermansia、SCFAs、粘液タンパク質、および粘液層の間の正のフィードバックループは、粘液層の適時交換とその適切な厚さの維持に寄与している。Balmerらはまた、全身的な酢酸濃度の上昇が、T細胞の解糖を増加させることにより、迅速なメモリーCD8+T細胞応答を後押しすることを示した29。ここでは、腸内アッケシソウの豊度が、酢酸レベルの上昇と強く相関していることを確認した。また、SCFAsはAkkermansiaの唯一の産物ではなく、Akkermansiaは酢酸塩の唯一の供給源でもないことは言及に値します30。31 この結果は、特定の種ではなく、健康でバランスのとれた腸内細菌叢が、実際には OC の治療においてより重要であるという考えを支持するものであった。

我々はさらに、FMT とアッケシソウの補給を行った OC 担保マウスの免疫監視および殺腫瘍能力について調べた。腫瘍組織のRNAシーケンス解析の結果、細胞傷害性T細胞はOC群で抑制され、OC＋Akk群で有意に増加することが明らかになった。そこで、CD8+T細胞の殺腫瘍機能に着目した。CD8+T細胞におけるIFNγ+の割合は、OC群では良性マウスより低く、OC+Akk群ではOCマウスより高いことが確認されました。この結果から、バランスのとれた腸内細菌叢がT細胞の細胞毒性を高めることで、殺腫瘍力を強化していることが確認されました。これまでの研究で、腸内細菌叢と腫瘍微小環境の関係が報告されている。4,32,33 腸内細菌叢と腫瘍免疫学、特に免疫療法の反応性のクロストークも研究されている。8,12,34 今回の結果は、腸内細菌叢を操作することにより、OCの免疫殺害を改善できるという考えを広めるものであった。

全体として、OC 患者は異なる腸内細菌叢のサインを持っており、アッカーマン シアの経口投与はマウスの OC 発生を抑制しました。そのメカニズムにおいて、アッカーマンシアの補給は、腸バリアの完全性を回復し、生体全体の免疫器官を系統的に動員し、腫瘍の微小環境における免疫監視を活性化させた。今回の知見は、OCの免疫微小環境と腸内細菌叢を結びつける視点を提供し、腸内恒常性に関して対応する治療戦略につながる可能性があります。腸内細菌の投与は、アクセスに便利で生物学的に安全であり、腫瘍の免疫監視を促進する能力を有することを考慮すると、アッカーマンシアまたはその類似体は、近い将来、後期腫瘍の臨床試験で検証されることが保証されるかもしれない。

研究の限界
本研究には、いくつかの限界がある。まず、アケルマンシアの補給は、FMTを与えられたマウスにおいてのみOCの進行を抑える働きをするが、単一の治療法ではない。アッカーマン シアの補給が卵巣の進行を抑えることを証明する、より決定的な方法は、異なる量の細菌でモノコロン化した無菌マウスを利用することである。さらに、酢酸塩がOC FMTマウスのOC拡散を遅らせたが、これがアッカーマンシアによるものなのか、それとも他のマイクロバイオームの変化によるものなのかは、明らかにされていない。無菌マウスと自然発症のOCマウスの組み合わせモデルが、前述の懸念に答えるには、より妥当な方法かもしれない。また、CD8+ T細胞がアッカーマンシアの補給に果たす役割も十分に解明されていない。OC免疫環境における腸内細菌叢の調節パラダイムを明らかにするためには、より多くのin vivoモデルを精巧に開発する必要がある。最後に、現在の結論を裏付けるために、より多くの臨床データが期待されており、現在、その収集に努めているところである。

STAR★Methods
主要リソース一覧
試薬またはリソースのソース識別子
抗体
Muc2 (ムチン2) ABclonal #A14659
オクルーディン ABclonal #A2601
Tjp1 (タイトジャンクションタンパク質1) ABclonal #A0659
精製ラット抗マウス CD16/CD32 BD Pharmingen #553141
7-AAD BD ファーマリンゲン #559925
APC-Cy7 抗マウス CD45 BD Pharmingen #557659
FITC 抗マウス CD3ε BD ファーマリンゲン #553061
APC 抗マウス CD4 BD ファーミンゲン #553015
BV480 抗マウス CD8a BD Horizon #566096
BV421 抗マウス CD45RA BD OptiBuild #740022
PE-Cy7 anti-mouse CD62L BD Pharmingen #560516
PE anti-mouse CD44 BD Pharmingen #553134
抗CD3抗体 BioLegend #100340
抗 CD28 バイオレジェンド #102116
FITC 抗マウス CD8a BD Pharmingen #553030
PE anti-mouse IFNγ BioLegend #505807
細菌・ウイルス株
Akkermansia muciniphila ATCC BAA-835
生体試料
糞便サンプル Human PRJNA895557
糞便サンプル マウス PRJNA895557
実験モデル：細胞株
ID8 C57BL/6 マウス K. Roby教授からの寄贈。
(大学解剖学・細胞生物学教室
カンザス大学解剖学・細胞生物学教室
カンザス大学解剖学・細胞生物学教室、アメリカ)
実験モデル 生物／系統
C57BL/6 雌マウス モデル動物研究センター
南京大学モデル動物研究センター
南京大学モデル動物研究センター
オリゴヌクレオチド
338F（5′-ACTCCTACGGGAGGCAGCA-3′） Tsingke N/A
806R (5′-GGACTACHVGGTWTCTAAT-3′) Tsingke N/A
A. muciniphila -特異的プライマーセット (Forward
プライマー）（5′-CAGCACGTGAAGGTGGGAC-3′） Tsingke N／A
A. muciniphila -特異的プライマーセット（Reverse
プライマー）（5′-CCTGCGTTGCTTCAGAT-3′） Tsingke N/A

リソースの有無
リード連絡先
リソースや試薬に関する詳細な情報やリクエストは、リードコンタクトであるGang Chen (tjchengang@hust.edu.cn)に直接お送りください。

材料の利用可能性
本研究では、新たな試薬は作成していない。

実験モデルおよび被験者の詳細
ヒト試料
ヒトを対象とした研究は、華中科技大学同済病院（中国・武漢）の倫理委員会により承認された。すべての参加者は、インフォームドコンセントを読み、署名した。2019年6月から2019年12月まで婦人科入院科で、卵巣がん患者（女性、OC群）から40検体、婦人科良性患者（女性、良性群）から40検体の合計80検体の糞便を入手しました。OC患者は、新たに診断され、手術、化学療法、放射線療法を受けていない患者であった。Control群は、主に卵巣の良性疾患で構成され、同じく新規に診断され、何の治療も受けていない患者であった。過去6ヶ月間に抗生物質、プロバイオティクス、膣内投与薬の使用歴のある患者、または活動性の細菌、真菌、ウイルス、性感染症の患者は本研究から除外された。糞便サンプルは、無菌凍結パイプを用いて採取し、速やかに液体窒素に入れた。

マウス
動物プロトコルは、華中科技大学同済病院（中国・武漢）の倫理委員会の承認を得た。6週齢の雌のC57BL/6マウス（南京大学モデル動物研究センター）を、12/12時間の明暗サイクルの部屋でSPF条件下で飼育・維持した。マウスは実験前に7日間室内で馴化させた。

細胞培養
ID8はC57BL/6由来のマウスOCであり、K. Roby教授（Department of Anatomy and Cell Biology, University of Kansas, U.S.A. ）から贈られたものである。ID8-ルシフェラーゼ細胞は、ルシフェラーゼレポーター遺伝子を過剰発現するレンチウイルスをID8細胞にトランスフェクションすることにより取得したものである。ID8細胞は、10%牛胎児血清（FBS, Thermo Fisher Scientific, #10100147）を添加したDulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM, Thermo Fisher Scientific, #22320030)で維持された。

細菌株
Liu Z教授（Department of Biotechnology, College of Life Science and Technology, Huazhong University of Science and Technology, Wuhan, China）から贈られたAkkermansia muciniphila (ATCC BAA-835) を5 mg/L resazurin (Solarbio, #R8150) と0.25 w/v mucin (Solarbio, #LA0360) を含むBHI (Bahn heart infusion broth)で培養した。 25% w/v ムチン (Sigma-Aldrich, #M2378) を含む37℃，pH 6.5の厳密な嫌気条件下で5日間培養した。この懸濁液を8000rpmで20分間遠心分離し、菌体を回収した。各マウスに1×108 colony-forming units (CFU)を経口投与し、吸光度(O.D.)を0.8に調整した。

メソッドの詳細
FMT実験とアッカーマンシアの経口投与
成体マウス（7週齢）に抗生物質を飲料水（1 g/L アンピシリン、ネオマイシン、メトロニダゾール、0.5 g/L バンコマイシン）で4週間投与した。同時にID8-Luciferase細胞（1×107個）を全マウスの腹腔内に注入し、5群に分けた。Pbs処理（Pbs群、n＝5）、良性疾患患者の糞便細菌懸濁液による処理（良性群、n＝5）、卵巣癌患者の糞便細菌懸濁液による処理（OC群、n＝5）、OC患者の糞便細菌とアッカーマンシア懸濁液を併用（OC＋AKK群、n＝5）、アッカーマンシア単独投与（AKK群、n＝5）であった。すべての糞便細菌処理は、1日おきに1回、経口ガベージによるものであった。腫瘍は、2週間に1度、Xenogen IVIS Spectrum in vivo生物発光イメージングシステムでルシフェラーゼ発現を定量化することにより測定された。動物は最後のイメージング時に犠牲とした。犠牲になる前に、各グループから糞を採取し、すぐに液体窒素に入れ、さらに検出を行った。

免疫機能に対する腸内アッケシソウの存在量の変化の単一効果を本質的に評価するために、我々は腫瘍のないマウスを抗生物質で前処理した。C57BL/6マウスの1群には、OC患者からの糞便微生物叢（C57_OC群、n = 6-7）を、もう1群にはOC患者からの糞便微生物叢とアケルマンシア懸濁液を組み合わせて（C57_OC + Akk群、n = 6-7）、それぞれ経口摂取させた。すべての糞便細菌処理は、1日おきに1回、経口ガベージによるものであった。6週間の腸内処理後、動物を犠牲にしてさらなる調査を行った。

ガベージ用の便を調製するために、卵巣の良性疾患患者から10サンプル、OC患者から10サンプルをランダムに選択し、それぞれ等しい重量で混合した（患者あたり5g）。混合便1gを5mL pbsに懸濁した。細菌懸濁液のO.D.は、経口投与前に0.8に調整した。200μLの懸濁液のアリコートを各マウスへのギャベッジに使用した。

A. muciniphila（ATCC BAA-835）の補充は、マウスを4週間抗生物質で治療し、200μLのpbs懸濁液（O.D.=0.8）を1日おきにゲバージュした。

糞便サンプルDNA抽出と16S rRNA遺伝子配列決定
以下の工程は、Majorbio BioPharm Technology Co. (中国、上海)によって行われた。E.Z.N.A.® Soil DNA Kit (Omega Bio-Tek, Norcross, GA, USA) を用いて、ヒトおよびマウスの糞便サンプルから微生物DNAをメーカーのプロトコルにしたがって抽出した。品質管理にはThermo NanoDrop 2000UV microspectrophotometer (Thermo Scientific, Wilmington, USA) と2%アガロースゲル電気泳動法を用いた。細菌ゲノムDNAは、16S rRNA遺伝子のV3-V4超可変領域に特異的な338F (5′-ACTCCTACGGGAGGCAGCA-3′) と806R (5′-GGACTACHVGGTWTCTAAT-3′) プライマーにより増幅された。増幅産物はMiSeqプラットフォーム（Illumina, San Diego, USA）で配列決定された。配列データは、QIIME（1.9.1）ソフトウェアパッケージを使用して解析した。各16S rRNA遺伝子配列の分類は、Silva 16S rRNAデータベース（silva 128/16s bacteria）に対してRDP Classifierアルゴリズム（http://rdp.cme.msu.edu/）により、信頼度閾値70%で解析した。16S rRNA遺伝子配列は、Uparseで類似度97%のカットオフで操作的分類単位（OTU）にクラスタリングされた。α-多様性と統計データは、Shannon indexに基づいて算出した。β-多様性はBray-Curtis非類似度または非加重UniFrac距離の主座標分析（PCoA）により測定した。細菌量の差は LDA に基づいて算出した。

リアルタイムqPCRによるAkkermansiaの定量化
A. muciniphila のゲノム DNA を American Type Culture Collection (BAA-835) から入手し、Bio-Rad RT-PCR System で qPCR 用の標準曲線を作成した。A. muciniphila -特異的プライマーセットは以下の通りである。

フォワードプライマー：5′-CAGCACGTGAAGGTGGGGAC-3′。

リバースプライマー：5′-CCTGCGTTGGCTTCAGAT-3′。

糞便から全ゲノムDNAを抽出した。各糞試料中のA. muciniphilaの推定総コピー数は、このアッセイを用いて決定した。絶対的な定量化のために、糞便1グラム当たりまたはDNA1マイクログラム当たりのアッカーマンシアコピー数を定量化した。

免疫組織化学および免疫蛍光法
免疫組織化学のために、組織は4％ポリホルムアルデヒドで一晩固定し、パラフィンに包埋した。埋没切片はキシレンで脱パラフィン化した。内因性ペルオキシダーゼは、3％過酸化水素で15分間インキュベートすることによりブロックされた。抗原賦活は、スライドをクエン酸バッファー（10 mM, pH 6.0）中で電子レンジで15分間煮沸することにより行った。スライドをpbs Tween 0.05%ですすぎ、5%ヤギ血清アルブミンで30分間ブロッキングした。スライドを一次抗体（Muc2 (mucin 2), 1:200 from ABclonal, #A14659）と共に4℃で一晩インキュベートし、続いて標識ポリマー-HRPと一緒に室温で1時間インキュベートした。陰性コントロールは、一次抗体なしで同じように処理した。その後、スライドをDAB+ Chromogenでインキュベートし、ヘマトキシリンで対比染色した。マウント後、スライドを顕微鏡で観察し、写真を撮った。

免疫蛍光染色については、同じ手順を使用した。ただし、一次抗体（Occludin, 1:200 from ABclonal, #A2601; Tjp1 (tight junction protein 1), 1:200 from ABclonal, #A0659）とインキュベートした後、スライドをPBSで洗浄し、二次抗体（Cy3コンジュゲートヤギ抗ラビットIgG、1：100；FITCコンジュゲートヤギ抗ラビットIgG、1：100）により、1時間染色した。その後、スライドを4,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI)で染色した。Eclipse C2 ソフトウェア（Nikon, Tokyo, Japan）を搭載した蛍光顕微鏡（NIKON Eclipse Ti）でスライドを観察し、写真を撮影した。画像はImage-Pro Plus 6.0およびImageJを使用して解析した。

アルシアンブルー／過ヨウ素酸シッフ（AB-PAS）染色
大腸パラフィン切片をキシレンで脱パラフィンした後、アルシアンブルー溶液（1 g アルシアンブルー、pH 2.5, 3 mL/L 酢酸、97 mL 蒸留水）と30分間インキュベートした。その後，1%過ヨウ素酸溶液（Sigma-Aldrich）で10分間，さらにSchiff試薬（Sigma-Aldrich）で40分間，ヘマトキシリンで3分間カウンター染色を行った．マウント後、スライドを顕微鏡で観察し、写真を撮った。

RNA配列決定
3 群のマウスの腫瘍組織から Total RNA を抽出した（Benign 群、OC 群、OC+Akk 群）。RNAの濃度と純度はNanodrop 2000で、RNAの完全性は寒天ゲル電気泳動で検出した。オリゴ(dT)入り磁気ビーズでpolyAを「A-T」塩基対化することにより、mRNAをtotal RNAから分離し、トランスクリプトーム情報を解析することができた。逆転写酵素の作用のもと、ランダムヘキサマーを加え、mRNAを鋳型としてcDNAの鎖を逆合成し、その後2本鎖を合成して安定な2本鎖構造を形成させた。A "塩基をつなぎ、15サイクルのPCRにより増幅し、その後2%アガロース電気泳動により目的のバンドを得た。増幅産物はIlluminaプラットフォームで配列決定した（PEライブラリ、読み取り長2×150 bp）。DESeq2パッケージを使用して、差次的発現遺伝子（DEG）を同定した。偽発見率（FDR）調整後のp値<0.05と同時に絶対値logFC>1をDEGs同定の閾値として設定した。良性群と比較したOC群のダウンレギュレーション遺伝子とOC+Akk群のアップレギュレーション遺伝子の交差遺伝子に基づいてベン図がプロットされた。交差DEGの機能解析は、"clusterProfiler" Rパッケージを使って行い、GOおよびKEGGの濃縮パスウェイを同定した。免疫細胞の存在量はImmuCellAI.22によって予測された。

フローサイトメトリー
実験終了時に脾臓、腸間膜リンパ節、末梢血を採取し、stain buffer（BD Pharmingen, #554656）で破砕後、70μmのセルストレーナーで濾過した。脾臓と末梢血のサンプルは溶解する必要があった。100万個の脾臓細胞、リンパ節細胞、または血球を、膜染色前に精製ラット抗マウスCD16/CD32（BD Pharmingen, #553141）と4℃で10分間プレインキュベーションした。その後、細胞をフルオロクロム標識モノクローナル抗体で染色した。7-AAD（BD Pharmingen、#559925）、APC-Cy7 抗マウス CD45（30-F11, BD Pharmingen、#557659）、FITC 抗マウス CD3ε（145-2C11, BD Pharmingen、#553061）、APC 抗マウス CD4（RM4-5, BD Pharmingen、#553015）、BV480 抗マウス CD8a（53-6. 7, BD Horizon, #566096）、BV421 anti-mouse CD45RA（14.8CRUO, BD OptiBuild, #740022）、PE-Cy7 anti-mouse CD62L（MEL-14, BD Pharmingen, #560516）、PE anti-mouse CD44（IM7, BD Pharmingen, #553134）である。細胞はBDサイトメーターで取得し、データはFlowJoソフトウェアで解析した。

7AAD- CD45+ CD3+細胞をゲーティングした後、CD4+を選択し、CD8+およびCD4+CD8+を除外した。その後、TCMは、CD45RAlow、CD62Lhigh、CD44highとして同定された。TEMは、CD45RAlow, CD62Llow, CD44highとして選択された。

T細胞メモリー反応
ID8を装着したマウスからDraining lymph nodeを採取した。排液リンパ節の細胞は、推奨分離培地（pbs, 1mM EDTA, 2% FBS）に再懸濁し、磁気ビーズ分離を行った。T細胞（EasySep™ Mouse T cell Isolation Kit, STEMCELL Technologies, #18103）を濃縮し、10% FBSおよび1% 2 mM/Lグルタミン添加RPMI 1640培地（GIBCO Invitrogen）に再懸濁した。選別されたT細胞の生存率は、トリパンブルー染色により確認した。T細胞は、抗CD3/CD28をコートした12ウェルプレート（抗CD3、5μg/mL、BioLegend、#100340；抗CD28、5μg/mL、BioLegend、#102116）およびIL-2（10 ng/mL、PEPROTECH、#212-12）を補充した培地にプレーティングした。酢酸ナトリウム（5 mM、Sigma-Aldrich、#S5636）、プロピオン酸ナトリウム（5 mM、Sigma-Aldrich、#P5436）、または酪酸ナトリウム（5 mM、Sigma-Aldrich、#303410）は、培地に溶解された。37℃、5% CO2で5日間培養後、Leukocyte Activation Cocktail（BD Pharmingen, #550583）で6時間刺激し、膜状および細胞内染色を実施した。細胞は精製ラット抗マウスCD16/CD32（BD Pharmingen, #553141）と4℃で10分間プレインキュベーションした後、FITC抗マウスCD8a（53-6.7, BD Pharmingen, #553030）と30分間標識した。BD Cytofix/Cytoperm Fixation/Permeabilization Kit (#554714) を用いて細胞を透過処理し、PE anti-mouse IFNγ (XMG1.2, BioLegend, #505807) とともに1時間インキュベーションした。Beckman サイトメーターで細胞を取得し、FlowJo ソフトウェアを用いてデータを分析した。上清を採取し、マウスインターフェロンγELISAキット（BOSTER、＃EK0375）を用いてIFNγを決定するために-20℃で保存した。

T細胞を介した腫瘍細胞死アッセイ
T細胞は、上記のようにCD3抗体（5μg／mL）およびIL-2（10ng／mL）で活性化させた。酢酸ナトリウム（5mM）、プロピオン酸ナトリウム（5mM）、または酪酸ナトリウム（5mM）を培地に溶解させた。12ウェルプレートで腫瘍細胞とT細胞（1：20）を8日間共培養した後、ウェルをpbsで2回洗浄し、T細胞を除去した。残った腫瘍細胞はポリホルムアルデヒド（4%）で固定し、0.5%クリスタルバイオレットで染色し、乾燥後にデジタルスキャナーで撮影した。

糞便中の短鎖脂肪酸の測定
マウスの糞を液体窒素で採取し、6時間保存した後、測定に使用するまで-80℃に移した。糞試料を正確に秤量し（20 mg）、2 mL EP チューブに入れた。リン酸（1 mL, 0.5% v/v）溶液と小さな鋼球をEP管に加えた。この混合物を10秒ずつ3回粉砕し，10分間ボルテックスした後，5分間超音波処理を行った。12,000 rpm で 10 分間遠心分離した後，上清を 0.1 mL 採取し，0.5 mL の MTBE（内部標準を含む）溶液を添加した。混合物を3分間ボルテックスし、5分間超音波処理した後、12,000 rpmで10分間遠心分離した。上清を回収し、GC-MS/MS分析に使用した。GC-MS／MS分析には、DB-5MSカラム（J＆W Scientific、USA）を備えた7000D質量分析計に結合したAgilent 7890Bガスクロマトグラフィーを採用した。オーブン温度は90℃で1分間保持した後，25℃/分の速度で100℃に昇温し，20℃/分の速度で150℃に昇温して0.6分間保持，25℃/分の速度で200℃に昇温し，3分間運転した後，0.5分間の保持を行った。すべてのサンプルはマルチプルリアクションモニタリングモードで分析した。

定量および統計解析
動物実験では、マウスを異なるグループに無作為に振り分けた。2群の比較には両側p値を用いたWilcoxon rank-sum検定、多群の比較にはNemenyi検定に続いてKruskal-Wallis H検定を適用し、ポストホック検定で比較した。RNA配列については、すべての解析はR version 3.6.3 (http://www.R-project.org) とその適切なパッケージで実施された。箱ひげ図と棒グラフの作成には、上記を除き、Rパッケージの "ggplot2 "を使用した。ヒートマップの描画には、"pheatmap" R パッケージを用いた。Venn Diagramの描画にはRパッケージの "VennDiagram "を用いた。ほとんどのデータはGraphPad Prismで解析された。両側p < 0.05を有意とした。

謝辞
本研究は、中国自然科学基金会（81800981、81874106、82073259）および湖北省重点研究開発計画（2020BCA067）の支援を受けて実施したものである。

著者の貢献
Z.W.、C.S.、G.C.は実験の設計を行った。Z.W.、X.Q.、D.H.、J.H.、E.G.、R.X.、W.L.は実験を行った。Z.W.とX.Q.は原稿を執筆した。C.S.とG.C.は、原稿を批判的に修正した。最終原稿は全著者が承認した。

利害関係者の宣言
著者らは、競合する利害関係を宣言していない。

補足情報
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資料S1. 表S1、図S1〜S5。

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資料S2. 論文と補足情報。

データおよびコードの入手方法

本研究のシーケンスデータは、National Center for Biotechnology Information (PRJNA895557) にアップロードされています。

本論文では、オリジナルコードは報告していない。

本論文で報告されたデータの再解析に必要な追加情報は、要求に応じて主席研究員から入手できます。

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