炭酸緩衝液混合液と糞便微生物叢移植はオリゴフルクトース誘発性下痢に対する有望な治療効果を有する。

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オリジナル研究論文
フロント Vet. 科学、2024年4月22日
比較臨床医学
第11巻-2024年｜https://doi.org/10.3389/fvets.2024.1388227
炭酸緩衝液混合液と糞便微生物叢移植はオリゴフルクトース誘発性下痢に対する有望な治療効果を有する。

https://www.frontiersin.org/articles/10.3389/fvets.2024.1388227/full

Maimaiti Tuniyazi Ruibo Tang Xiaoyu Hu Yunhe Fu Naisheng Zhang*.
中国、長春市、吉林大学獣医学院
下痢は馬の一般的な消化器疾患であり、食事誘発性下痢は新たな課題である。本研究の目的は、健康な馬と食事誘発性下痢症の馬における腸内細菌叢の違いを調べ、潜在的な治療アプローチとしての糞便微生物叢移植（FMT）と炭酸緩衝混合物（CBM）の有効性を評価することである。20頭の健康な馬を試験に組み入れ、4群に分けた： コントロール、下痢、CBM、FMTの4群である。オリゴフルクトースを用いて下痢を誘発し、微生物叢分析のために糞便サンプルを採取した。FMTとCBMは、それぞれドナーの糞便と混合粉ミルクを用いて経口投与した。臨床パラメータ、血清レベル、腸組織病理学、および糞便微生物叢プロファイルを評価した。その結果、下痢誘発により腸内細菌叢のバランスが崩れ、多様性と豊富性が低下し、体温上昇や下痢スコアなどの臨床パラメータに影響を与え、糞便pHが低下し、血清LPS、IL-17A、乳酸、総タンパク質の増加などの炎症反応が亢進し、大腸組織に障害を引き起こした。CBMおよびFMT治療は、腸内細菌叢組成を変化させ、下痢型と比較してより健康的なプロフィールへと回復させ、腸内細菌叢組成をより健康的な状態へと回復させ、体温および下痢スコアの低下、糞便pHの上昇などの臨床症状を改善し、血清LPS、IL-17A、乳酸および総タンパク質の増加などの炎症反応を低下させ、組織の損傷を修復した。CBMとFMTのスピアマン相関分析により、宿主パラメータと炎症に関連する特定の細菌分類群が同定された。FMTおよびCBM治療は、オリゴフルクトース誘発性下痢症の管理において有望な治療効果を示した。これらの知見は、馬の下痢の管理と治療に関する貴重な洞察を提供し、最適な治療結果を得るためにCBMとFMTを組み合わせたアプローチの可能性を示唆するものである。

1 はじめに
下痢は馬の一般的かつ重大な消化器疾患であり、馬産業においてかなりの罹患率と経済的損失を伴う（1, 2）。下痢は馬の重篤な疾病の主要な原因であり続け、推定致死率は25.4～35%である(3, 4)。下痢馬の治療における抗生物質治療の効果はしばしば限定的であり、病状を悪化させることさえある。これは、腸内の有益な常在細菌を駆逐することで、病原性細菌種の増殖を助長する環境を作り出すという、予期せぬ結果によるものである。馬の下痢に対する的を絞った効果的な治療法が確立されていないため、臨床医にとっては体液喪失を速やかに回復させ、下痢に伴う全身性の炎症を緩和させることが困難である。これらの要因により合併症の発生率が上昇し、集中治療による長期入院が必要となる。

下痢には多因子性の原因があるが、新たな研究によると、腸内細菌叢のバランスの乱れ、いわゆるディスバイオーシスが下痢の発症に極めて重要な役割を果たしている。実際、腸内細菌叢の構成は宿主と相互作用する微生物の複雑な生態系であり、栄養素の消化・代謝、免疫調節、胃腸の健康維持など様々な生理的プロセスに寄与している(5-7)。腸内細菌叢組成の乱れは、微生物集団の不均衡と潜在的な病原性の過剰増殖を特徴とするディスバイオーシスにつながる可能性があり（8, 9）、これは下痢などの消化管障害と関連している（10）。したがって、馬の下痢の発生および治療における腸内細菌叢の影響を理解することは、効果的な腸内細菌叢操作に基づく管理戦略を開発し、馬の健康を促進するために不可欠である。

オリゴフルクトースは、臨床例で観察される腸内細菌叢の乱れを忠実に模倣し、ウマにコントロール下痢モデルを誘導するために広く用いられてきた（11, 12）。このモデルにより、下痢に伴う腸内細菌叢の変化を制御された方法で調査し、腸内細菌叢を調節するための潜在的介入を評価することができる。

糞便微生物叢移植（FMT）は、抗生物質の使用、病原性の侵入、あるいは食生活の変化などによって乱れた腸内微生物の健全な組成を回復させることを目的とした治療法である（13）。FMTの起源は紀元4世紀まで遡ることができ、2013年にヒトのクロストリジウム・ディフィシル感染症（CDI）の治療法として米国食品医薬品局（FDA）が承認して以来（14）、大きな注目と研究上の関心を集めている（15）。馬の場合、FMTの有効性に関する研究は限られており、結果を発表している研究は数件しかない。これらの研究では、大腸炎や下痢などの特定の腸疾患に対するFMTのプラスの効果を指摘する、さまざまな結果が示されている(16-18)。しかし、これらの研究は症例対照ではなく、健康状態の異なるさまざまな場所の馬を対照としていることに注意することが重要である。逆に、他の研究ではFMTが馬の胃腸障害に明確な影響を与えないことが示されている（19～22）。従って、これらの知見には慎重に対処し、馬の治療におけるFMTの有効性を高めるためのさらなる研究の必要性を認識することが肝要である。

炭酸緩衝混合物（CBM）は、その卓越した緩衝能により、消化管内のpHレベルを効果的に調整することが認められている（23）。腸内のpHレベルは、微生物叢の生態系のバランスを保つ上で極めて重要である(24)。腸内pHの不均衡や乱れは、有害な細菌の増殖を促したり、有益な細菌の増殖を抑制したりする条件を作り出す可能性がある(25)。CBMは、最適なpHレベルを安定させ維持することで、有益な腸内細菌の増殖と活性をより助長する環境を助長することができる（26）。研究では、CBMが腸内細菌叢の構成に影響を及ぼす可能性が強調されている（27）。腸内pHを調節することで、CBMは微生物集団の多様性と存在量に好影響を与える可能性があり、その結果、より健康的な微生物叢プロファイルを促進することができる（28）。その結果、全体的な消化管機能の改善に寄与する可能性がある（29）。

本研究の目的は以下の通りである： 健康なポニー群と食事誘発性下痢ポニー群における腸内細菌叢の違いを調査し、糞便サンプルの16S rRNA遺伝子配列決定法を用いて、下痢に関連する糞便微生物叢の変化を明らかにすること； 馬のオリゴフルクトース誘発性下痢の治療法としてのFMTの有効性と腸内細菌叢への影響を調べること；馬の腸内細菌叢異常症に関連した下痢の治療におけるCBMの役割、消化管内のpHレベルの調節と腸内細菌叢の組成への影響を調べること。

2 材料と方法
2.1 倫理的声明
本申請書は吉林大学倫理委員会（Institutional Animal Care and Use Committee：IACUC）により審査され、動物飼育・使用許可証が承認された。すべての方法は、IACUCの関連ガイドラインおよび規則に従って実施された。

2.2 動物および飼料管理
健康な馬20頭（牡馬10頭、牝馬10頭、3歳、体重：308±26kg）を著者らが馬牧場から購入し、2020年の産駒期に生まれた。出生以来、一貫して管理された条件下で飼育されており、食肉供給を目的としている。本研究の対象となる20頭の馬の選定は、過去の病気や治療、獣医学的臨床検査に関する詳細な情報を含むカルテの徹底的な評価に基づいて行われた。健康状態に問題のない馬、すなわち消化器系に異常がなく、抗生物質や駆虫薬による治療を最近受けておらず、過去3ヶ月以内に長距離輸送を受けていない馬のみを本研究に組み入れた。

食餌は馬の腸内細菌叢組成に大きな影響を与える(30)。選ばれた馬は同じような条件で管理されていたが、我々は高度に制御された摂食環境を確立するための追加措置を実施した。そこで、選んだ馬を隔離し、地元で入手可能な飼料ベースの飼料（表1）を2ヶ月間与えた。各馬には乾物（DM）ベースで体重の2％に相当する維持飼料を毎日与えた（31）。馬は自由に水にアクセスでき、追加の栄養補助食品は投与されなかった。

表1
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表 1. 馬用飼料の化学組成

2.3 下痢の誘発
オリゴフルクトースによる下痢誘発は、我々の以前の研究(9)に記載された手順で行った。簡単に説明すると、2ヶ月間の食餌馴化の後、馬を4つの異なる群に無作為に割り付けた： コントロール（n = 5）、下痢（n = 5）、FMT（n = 5）およびCBM（n = 5）。下痢を誘発する3日前に、Diarrhea群、FMT群、CBM群の馬にオリゴフラクトース1g/kg体重を飼料に混ぜて与え、腸内細菌叢を収容させた。その後、オリゴフルクトース 10g/kg 体重で下痢モデルを誘導した。具体的には、オリゴフルクトースを10Lのぬるま湯に溶かし、経鼻胃管を用いて馬に投与した。糞便サンプルは、グループ間の比較可能性を確保するため、同時に直腸から採取し、微生物相分析まで直ちに-80℃で保存した。糞便pH、体温、下痢スコアリングは4時間間隔で検出した。馬の下痢スコアリングは、以前に確立された0から5までのスケール（18）を用いて行った：0-正常：硬いが湿った球状の糞便で、その形状を保持している；1-軟便：やや軟らかく見え、地面に着くとその形状を失う球状の糞便；2-プリン状一貫性： 3-プディング状の固さ：プディング状の固さを持つが、地面に到達すると広がってしまう。4-水状のふん尿：水状のふん尿で、形成された認識可能な部分がいくつか残っている。簡単な実験スケジュールを図1に示す。

図1
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図1. 図1.本研究のタイムラインの図解。

2.4 糞便微生物叢の移植
先行研究(16, 18-20)に概説された方法論に従い、新鮮な糞便サンプルをコントロールの馬から直腸ごとに採取した。FMT 群の各馬については、下痢の誘発に成功した後（オリゴフルクトース 投与後約 20 時間）、約3 kg の混合ドナーの糞便を 5 L のぬるま湯と十分に混合した。この混合液は、投与前に2段階の濾過工程を経たが、これは所望の微生物成分のみがレシピエント馬に導入され、より大きな粒子状物質が効果的に除去されるようにするために行われた。第一段階として、溶液を目の粗いふるいにかけた。この一次濾過は、投与中に経鼻胃管の閉塞を引き起こす可能性のある大きな粒子を除去する役割を果たした。続いて、溶液は二次濾過を受けた。この段階は、溶液からより小さな、それでも潜在的に有害な微粒子を除去する上で極めて重要であり、それによってスムーズな投与が促進され、レシピエント馬の安全性が確保された。

2.5 炭酸緩衝液混合処理
炭酸緩衝混合液（CBM）の具体的な化学組成は表2に詳述されている。CBM群の各受給ウマについて、下痢の誘発に成功した後（オリゴフルクトース投与後約20時間）、CBMを調製した。これは、必要量の混合物を10 Lのぬるま湯に溶解し、溶液の溶解と均一性を確保することによって行った。その後、調製したCBM溶液を経鼻胃管経由で馬に投与し、直接的かつ効率的な送達を確保した。

表2
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表2. 炭酸緩衝混合液（CBM）の化学組成。

2.6 LPS濃度の検出
血液サンプルをウマの頸静脈から採取し、4℃で30分間、3,000gで遠心分離した。遠心後、上清（血清）を無菌・脱水素ガラス管に注意深く移した。LPSの濃度を測定するために、発色エンドポイントアッセイを利用した。アッセイは、製造元の指示（Chinese Horseshoe Crab Reagent Manufactory Co.

2.7 乳酸、IL-17A、総タンパク質濃度の検出
血液試料を採取し、3,000 g、30 分間、4℃で遠心分離し、血清を採取し、ElISA キット（MLBIO Biotechnology Co.Ltd.、上海、蘇州、中国）を用いて乳酸および IL-17A 濃度を検出した。総タンパク濃度はIDEXX VetAutoread（IDEXX US）を用いて測定し、検出下限は1 g/Lであった。

2.8 安楽死
必要な病理学的評価を行うため、馬は人道的に安楽死させた。安楽死は、キシラジン-ケタミン組成物（IS Abundant Pharmaceutical Co. Ltd., Lanzhou China）を1:5の比 [0.1 mL/kg (9)]で用い、確立されたプロトコールに従って行った。安楽死前投与薬は頸静脈に0.5-1 mL/sの制御速度で静脈内投与した。その後、ペントバルビタールナトリウム（Feilong Pharmaceutical CO., LTD, Heilongjiang China）を0.1 mL/kgの用量で頸静脈から注射した。安楽死の有効性を確認するため、獣医師の専門家が動物の意識障害、痛みに対する感受性の欠如、心拍の欠如を確認した。この確認には、耳の表面を針で刺すテストを行い、痛みや意識を示す反応がないことを確認した。

2.9 腸組織のヘマトキシリン・エオジン染色
本試験で使用した馬は主に食肉生産用であったため、実験終了後、牧場の所有者によって人道的に安楽死させられた。死後、腸組織は1時間以内に速やかに採取された。各馬から10×10×0.5mmの組織サンプル（結腸から採取）を切り離し、55mm四方の断片に分割し、4％ホルマリンで24～72時間保存した。すべての馬の組織サンプルが同じ解剖学的位置から採取されたことを確認するため、標準化された手順に従った。ヘマトキシリン・エオジン（H&E）染色法を採用し、その後標準的な光学顕微鏡で分析した。これらのH&E染色スライドは、腸管病変の検出と形態分析の2つの目的に使用された。すべての視覚的観察は、顕微鏡一体型カメラ（オリンパス、日本）と連動した専用の画像キャプチャソフトウェアを用いてデジタル撮影した。

2.10 全細菌 DNA 抽出およびイルミナ NovaSeq シークエンシング
ウマの糞便サンプル（n = 20、各群5頭）を細菌DNA抽出およびその後の微生物分析に用いた。ウマの糞便サンプルからのDNA抽出は、製造業者のプロトコールに従ってCTAB法を用いて行った。CTAB法は、微量のサンプルからのDNA回収を効果的に可能にし、多様な細菌種からのDNA調製に有効であることが確認されている。ブランクサンプルは無核水で処理した。抽出された全DNAは50μLのElution bufferで溶出され、さらなる分析まで-80℃で保存された。

16S rDNA遺伝子のV3-V4領域の増幅には、プライマーの5′末端にバーコードを付加したプライマーセット314F（5′-CCTACGGNGGCWGCAG-3′）および805R（5′-GACTACHVGGTATCTAATCC-3′）を採用した。プライマーは配列決定用ユニバーサルプライマーにも対応するように設計した。PCR増幅反応は、25ngの鋳型DNA、12.5μLのPCRプレミックス、2.5μLの各プライマー、および容量調整用のPCRグレードの水を含む総容量25μLで行った。原核生物の16S断片を増幅するためのPCR条件は、98℃で30秒間の初期変性、98℃で10秒間の変性、54℃で30秒間のアニーリング、72℃で45秒間の伸長、72℃で10分間の最終伸長を32サイクル繰り返した。増幅産物は2％アガロースゲル電気泳動で確認した。陰性コントロールとして、偽陽性のPCR結果を除外するため、サンプル溶液の代わりに超純水をDNA抽出プロセス全体に含ませた。PCR産物はAMPure XTビーズ（Beckman Coulter Genomics, Danvers, MA, United States）で精製し、Qubit（Invitrogen, United States）で定量した。アンプリコンプールをシーケンス用に調製し、アンプリコンライブラリーのサイズと量をそれぞれAgilent 2100 Bioanalyzer (Agilent, United States)とLibrary Quantification Kit for Illumina (Kapa Biosciences, Woburn, MA, United States)で評価した。ライブラリーはNovaSeq PE250プラットフォームでシーケンスした。

サンプルは、メーカーのガイドラインに従い、イルミナのNovaSeqプラットフォームでシーケンスした。ペアエンドリードは固有のバーコードに基づいてそれぞれのサンプルに関連付けられ、プライマー配列は除去された。ペアエンドリードのマージにはFLASHを使用した。fqtrim (v0.94)で指定されたフィルター条件を用いて生リードに対してクオリティフィルターを行い、高品質のクリーンタグを得た。キメラ配列の除去にはVsearchソフトウェア（v2.3.4）を用いた。DADA2を用いて脱複製を行い、フィーチャーテーブルとフィーチャー配列を得た。α多様性とβ多様性を評価するために、配列をランダムに正規化した。特徴量の正規化には、SILVAデータベース（リリース138）の分類器を採用し、各サンプルの相対的存在量に基づいてスケーリングした。サンプル内の種の多様性を測定するα多様性は、5つの指標を用いて評価した： Chao1、Goods coverage、Observed species、Pielou-e、Shannon、Simpsonである。主成分分析（PCA）、主座標分析（PCoA）、Upgmaクラスター、非計量多次元尺度法（NMDS）を用いて、ウマ糞便サンプルの異なるグループにおける微生物構造を分析した。グループ間で存在量に差を示した細菌分類群を同定するために、線形判別分析効果量（LefSe）を採用した（32）。さらに、糞便微生物叢と宿主パラメータとの関係を、LC-Bio Technologyで実施したピアソン相関分析（Pearson correlation analysis）を用いて検討した。

2.11 統計解析
統計解析にはGraphPad Prism 9 (San Diego, CA, United States)を使用した。臨床日と血中血清日の差は二元配置分散分析（ANOVA）検定を用いて決定し、α多様性はクラスカル・ワリス検定を用いて算出した。p < 0.05を統計的に有意とみなした。統計的有意性は*p < 0.05、***p < 0.01、***p < 0.001、***p < 0.0001で示した。

3 結果
3.1 体温、糞便pHおよび下痢スコアの評価
各群の馬の臨床的特徴を評価するため、異なる時点で体温、糞便pH、下痢スコアを測定した（図2）。体温および下痢スコアは、食餌誘導下痢を起こした馬で有意に上昇し（対照群 vs 下痢群、それぞれ p = 0.0264、p = 0.0023）、糞便 pH は有意に低下した（対照群 vs 下痢群、p < 0.0001）。CBMおよびFMT投与後、体温および下痢スコアは有意に低下した（下痢 vs. CBM、p = 0.0134；下痢 vs. FMT、p = 0.0076）。同時に、糞便pHは有意に上昇し、正常レベルに戻った（下痢 vs. CBM、p < 0.0001；下痢 vs. FMT、p < 0.0001）。

図2
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図2. 各群における体温、糞便pH、下痢スコア。(A)体温、(B)糞便pH、(C)糞便外観、(D)下痢スコア。

3.2 血清レベルの評価
各群の馬の血清中のLPS、IL-17A、乳酸および総タンパク質量を測定した（図3）。その結果、Diarrhea群の馬はControl群と比較してLPS、IL-17A、乳酸、総タンパク質の血清中濃度が有意に上昇し、組織的な炎症反応が認められた（それぞれp = 0.0073, p = 0.0117, p < 0.0001, p = 0.0019）。CBMおよびFMT投与後、炎症指標は、総タンパク質レベル（p = 0.965, p = 0.1989）を除き、Diarrhea群と比較してCBMおよびFMT群で有意に減少した（p = 0.0044, p = 0.0023; p = 0.047, p = 0.0034; p = 0.0121, p = 0.0159）。

図3
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図3. 異なる群における血中血清濃度。(A）LPS濃度；（B）IL-17A濃度；（C）乳酸濃度；および（D）総タンパク質濃度。

3.3 腸管組織の病理組織学的評価
各群のウマの結腸組織の病理組織学的変化を評価した（図 4）。その結果、各群間に明らかな差が認められた。対照群に比べ、下痢群の組織には構造層の損傷、粘膜の炎症、細胞の異常増殖が認められた（p < 0.0001）。CBMとFMTによる治療後、両群とも組織損傷の軽減がみられ、FMT群でより顕著な改善が観察された（p = 0.0039; p < 0.0001）。

図4
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図4. 結腸組織の病理組織学的観察。(A)健康な馬の組織；(B)下痢馬の組織；(C)CBM処理馬の組織；(D)FMT処理馬の組織；および(E)病理組織検査のスコア。

3.4 糞便微生物叢プロファイルの評価
腸内細菌叢組成と馬の様々な健康状態との関係を調べるため、微生物叢分析を実施した。α多様性に関連した結果（補足図S1）、Observed species、Shannon、Simpson、Chao1、Pielou_eはControl群と比較してDiarrhea群で有意に減少していた（p = 0.0003; p < 0.0001; p = 0.0003; p < 0.0001）。しかし、Goods coverageはControl群と比較してDiarrhea群では有意な変化を示さなかった（p = 0.0533）。CBM治療後、Shannon、Simpson、Pielou_eはControl群と比較してDiarrhea群で有意に増加した（p = 0.0003; p = 0.0002; p < 0.0001）が、Observed species、Chao1、Goods coverageは有意な変化を示さなかった（p = 0.2863; p = 0.2870; p = 0.9999）。FMT介入後、Observed species、Shannon、Simpson、Chao1、Pielou_eはControl群と比較してDiarrhea群で有意に増加したが（p = 0.0034; p < 0.0001; p = 0.0001; p = 0.0034; p < 0.0001）、Goods coverageは有意な変化を示さなかった（p = 0.8031）。

β多様性解析（補足図S2）により、PCA（R = 0.5557, p = 0.001）、PCoA（R = 0.6417, p = 0.001）、Upgmaクラスター、NMDSプロット（重み付けなしのUniFrac距離に基づく）では、コントロール群と下痢群に明確な分離が見られ、これら2群は微生物組成が異なることが示された。CBMおよびFMT治療後、腸内細菌叢組成は変化した。しかし、Upgmaクラスター図から、CBM群は下痢群に、FMT群は対照群に類似していることが明らかになった。また、PCA、PCoA、NMDSプロットでは、CBM群がFMT群に比べ広範囲であったことから、下痢腸内細菌叢の組成に対するCBM群とFMT群の影響は異なることが示唆された。

3.4.1 門レベルでの腸内細菌叢の構成
門レベルでは（図5）、下痢誘導後に、ファーミキューテス門、アクチノバクテリウム門、デスルホバクテリウム門が増加し、バクテロイド門、ベルコミクテリウム門、プロテオバクテリウム門、スピロヘータ門、パテシバクテリウム門、プラナクトミクテリウム門、フィブロバクテリウム門、シアノバクテリウム門が減少した。CBM投与後、下痢群に比べ、ファーミキューテス属、アクチノバクテリウム属、パテシバクテリウム属、プラナクトミセテリウム属、シアノバクテリウム属の相対量が減少し、バクテロイーダ属、ベルーコミクロビオータ属、プロテオバクテリウム属、スピロカエトータ属、フィブロバクター属、デスルフォバクター属の相対量が増加した。FMT処理後、ファーミキューテス属、アクチノバクテリウム属、プロテオバクテリウム属、デスルホバクテリウム属の相対量は減少し、バクテロイデス属、ベルーコミクロビオタ属、スピロカエトタ属、パテシバクテリウム属、プラクトミセトタ属、フィブロバクター属の相対量は下痢群に比べて増加した。

図5
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図5. 異なるグループにおける糞便微生物叢の構成（門レベル）。

3.4.2 属レベルでの腸内細菌叢組成
オリゴフルクトースによる下痢では、Streptococcus属、Lactobacillus属、Bifidobacterium属、Sharpea属、Megasphaera属、Bacteroides属、Limosilactobacillus属の相対量が増加し、Lachnospiraceae_unclassified属、Akkermansia属、UCG-002属、Christensenellaceae_R_7_group、 WCHB1-41_unclassified, Ruminococcaceae_unclassified, Rikenellaceae_RC9_gut_group, Lachnospiraceae_UCG-009, NK4A214_group, Lachnospiraceae_AC2044_group, Ruminococcus、 Phascolarctobacterium、Saccharofermentans、Acinetobacter、Treponema、F082_未分類、Eubacterium_coprostanoligenes_group_未分類、Clostridiales_Family_XIV。 Incertae_Sedis_未分類、UCG-005、Lachnospiraceae_XPB1014_group、p-251-o5_未分類、Bacteroidales_BS11_gut_group_未分類、UCG-010_未分類、その他。

図6
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図6. 異なるグループにおける糞便微生物叢の属レベルでの組成。

CBMとFMTは糞便微生物叢の構造に好影響を与えた。特に、Streptococcus属、Lactobacillus属、Bifidobacterium属は減少し、Lachnospiraceae_unclassified、Akkermansia属、UCG-002、Christensenellaceae_R_7_group、Ruminococcaceae_unclassified、Rikenellaceae_RC9_gut_group、Lachnospiraceae_UCG-009、 NK4A214_group, Lachnospiraceae_AC2044_group, Ruminococcus, Phascolarctobacterium, Saccharofermentans, Acinetobacter, Treponema, Eubacterium_coprostanoligenes_group_unclassified、 Clostridiales_Family_XIV_Incertae_Sedis_未分類、UCG-005、Lachnospiraceae_XPB1014_group、p-251-o5_未分類、UCG-010_未分類、その他。さらに解析の結果、WCHB1-41_unclassifiedはFMT群では増加したが、CBM群ではさらに減少し、SharpeaはFMT群では減少したが、CBM群ではさらに増加し、MegasphaeraはFMT群では減少したが、CBM群ではさらに増加した； BacteroidesはFMT群で減少したが、CBM群でさらに増加した；LimosilactobacillusはFMT群で減少したが、CBM群でさらに増加した；Bacteroidales_BS11_gut_group_unclassifiedはFMT群で増加したが、CBM群でさらに減少した。

3.4.3 種レベルでの腸内細菌叢の構成
オリゴフルクトースによる下痢では、Streptococcus_equinus、Lactobacillus_equicursoris、Bifidobacterium_unclassified、Sharpea_unclassified、Megasphaera_unclassified、Limosilactobacillus_unclassified、未培養Bacteroides_sp.およびPhascolarctobacterium_unclassifiedの相対量が増加した（図7）。FMT群では、Streptococcus_equinus、Lactobacillus_equicursoris、Bifidobacterium_unclassified、Sharpea_unclassified、Megasphaera_unclassified、Limosilactobacillus_unclassifiedがDiarrhea群に比べて減少した。CBM投与後、Streptococcus_equinus、Lactobacillus_equicursoris、Bifidobacterium_unclassifiedは減少し、Sharpea_unclassified、Megasphaera_unclassified、Limosilactobacillus_unclassifiedはDiarrhea群に比べCBM群でさらに増加した。

図7
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図7. 異なる群における糞便微生物叢組成を種レベルで示す。

さらにLEfSe解析を行い、各群で変化した細菌分類群を同定した（補足図S3）。その結果、Control群と比較して、Diarrhea群では14分類群が減少、8分類群が濃縮され、27分類群は不変であった。CBM投与後、CBM群ではDiarrhea群と比較して4分類群が減少し、18分類群が増加したが、27分類群は影響を受けなかった。FMT処理後、FMT群では6分類群が減少し、10分類群が増加した。

LEfSe分析から作成したクラドグラムは、門、綱、目、科、属のレベルで分類群間の関係を示した（図8）。その結果、Diarrhea群では、属レベルで有意な識別力を持つバイオマーカーは、Bifidobacterium、Alkalibacterium、Lactobacillaceae_unclassified、Lactobacillus、Streptococcus、Veillonellaであった； CBM群のバイオマーカーは、lsenella、Bacteroides、Muribaculaceae_unclassified、Alloprevotella、Prevotella、Parabacteroides、Erysipelatoclostridium、Sharpea、Solobacteriumであった、 Limosilactobacillus、Clostridium、Roseburia、Monoglobus、Acidaminococcus、Dialister、Megasphaera、Fusobacterium、Limibaculum、Escherichia_Shigella、Acinetobacter、Psychrobacter； FMT群では、バイオマーカーは、コリオバクテリウム科_未分類、エガテラ科_未分類、Bacteroidales_BS11_gut_group_未分類、RF39_未分類、Christensenellaceae_R_7_group、 Christensenellaceae_unclassified, Anaerovorax, Clostridiales_Family_XIV_Incertae_Sedis_unclassified, Lachnospiraceae_unclassified, Ruminococcaceae_unclassified、 Blautia、Eubacterium_hallii_group、 Lachnospiraceae_UCG_009、 Lachnospiraceae_XPB1014_group、 Saccharofermentans、 UCG_002、 UCG_005、 Ruminococcaceae_未分類、 Ruminococcus、 Family_XIII_AD3011_group, Family_XIII_UCG_001, Erysipelotrichaceae_unclassified, Absconditabacteriales_SR1_unclassified, p_1,088_a5_gut_group, and WCHB1_41_unclassified.

図8
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図8. LEfSe 分析から作成されたクラドグラムで、門、綱、目、科、属、種のレベルでの分類群間の関係を示す。

3.4.4 宿主の臨床・血清パラメーターと主要細菌属との相関性
次に、宿主の臨床・血清パラメータとLEfSeによって同定された主要細菌属との関係を、異なるグループごとに解析した（図9）。解析の結果、アルカリバクテリウム属、ラクトバチルス属、ストレプトコッカス属は、LPS、乳酸、総タンパク質、下痢スコア、IL-17Aと有意な正の相関を示し、アルカリバクテリウム属はpH値と有意な負の相関を示した。また、Lachnospiraceae_XPB1014_group、Christensenellaceae_R_7_group、Lachnospiraceae_UCG_009、Alloprevotella、Prevotellaceae_UCG_001、Lachnospiraceae_AC2044_group、Pseudobutyrivibrio、Blautia、p_1088_a5_gut_group、UCG_002はLPSと有意な負の相関を示した、 一方、Oscillibacter、Alloprevotella、Prevotellaceae_UCG_001、Lachnospiraceae_AC2044_groupはpH値と同時に有意な正の相関を示した。

図9
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図9. 細菌属と宿主の臨床パラメーターおよび血清パラメーターとの相関ヒートマップ。

3.4.5 腸内細菌叢群集の予測機能プロファイル
腸内細菌群集の機能プロファイルはPICRUSt2を用いて予測され、その結果、第2層の全サンプルで合計15の遺伝子ファミリーが同定された（補足図S4）。予測されたKEGGパスウェイのうち、ほとんどの配列が遺伝子ファミリーの糖質代謝、アミノ酸代謝、エネルギー代謝、補酵素とビタミンの代謝、酵素ファミリー、細胞運動、代謝、シグナル伝達に割り当てられていた。

腸内細菌機能の意味をさらに探るため、PCAを実施した結果、Control、CBM、FMTの各グループのサンプルは一緒に集まり、Diarrheaグループのサンプルとは分離していた（図10）。この分離はANOSIM分析（R = 0.1793、p = 0.026）でも支持され、異なるグループ間で有意差があることが示唆された。

図10
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図10. 異なるグループにおける腸内細菌機能のPCAプロット。

4 考察
下痢は馬の一般的な健康問題であり、馬の全体的な健康状態や成績に大きな影響を及ぼす可能性がある。下痢は馬に不快感や苦痛を与えるだけでなく、馬主や世話人に経済的・管理的な問題をもたらす可能性があるため、この症状の重要性を認識することは極めて重要である。馬の下痢は様々な要因によって引き起こされる多因子疾患である。これらの要因には、細菌、ウイルス、寄生虫、原虫などの感染因子（34～36）、炎症性腸疾患や大腸炎などの疾患（37、38）、さらに食餌の変化、ストレス、抗菌薬治療（30、39）などの他の要因が含まれる。しかし、これらの様々な要因の中でも、消化管細菌叢の異常は下痢の発症を促す重要な基礎メカニズムとして浮上している(40)。したがって、腸内細菌叢のバランスを回復させることは、馬の下痢を治療するための効果的なアプローチとなりうる。

ウマの下痢に対する潜在的な治療オプションとして腸内細菌叢の操作を探るため、これまでの研究では糞便微生物叢移植（FMT）が検討されてきた。これらの研究では、FMT前の下痢馬では、β多様性が高く、ラクトバチルス属、インテスティニモナス属、ストレプトコッカス属などの存在量が増加していることが確認されている(19)。FMT治療後、馬はα多様性が高く、平均UniFrac距離が低い（ドナーの糞便微生物叢と同様）ことを示し（17、18）、良好な結果を示している。しかし、ある研究ではFMTを実施しても有意な変化は見られなかったと報告している（19）。さらに、馬の下痢治療におけるFMTの非効果性を示した研究もある。ある研究では、馬の遊離糞便水に対するFMTの影響は認められず、腸内細菌叢の変化はこの症状の一因ではない可能性が示唆された（20）。別の研究では、6頭の馬からなる小規模コホートにおいて、FMTによる下痢の管理成功率は67％に過ぎないことが明らかになった（19）。さらに、別の研究では、FMTはメトロニダゾール誘発性腸内細菌叢異常症の予防には効果がないことが判明した（21）。しかし、この研究では移植に使用した便の量が比較的少量（500g）であったため、馬の消化管に有意な変化を引き起こすには不十分であった可能性があることは注目に値する。さらに、111頭の馬を対象とした研究では、そのコホートにおいてFMTの有効性は認められなかったと報告している(22)。しかし、この研究では、著者らはFMTの有効性を評価する際に、統計解析から抗菌薬で治療した馬を除外しなかったことを認めることが重要である。これらの知見は、馬の健康におけるFMTの役割を解明するための継続的研究の重要性を強調するものである。

さらに、乳牛および試験管内試験（41～43）を通じて実施された先行研究とともに、我々の観察から、消化管環境の調節における炭酸水素ナトリウム緩衝液の有益な効果が実証されている。これらの研究は一貫して、炭酸水素ナトリウムが pH レベルを上昇させ、乳酸および生体アミ ン濃度を低下させ、ルーメンアシドーシスを緩和し、乾物摂取量を増加させるなど、有利な特性を示す ことを示している。これらのことから、炭酸水素ナトリウムを主成分とするCBM（表2に示す配合）は、ウマの消化管環境を積極的に調整し、下痢を緩和する可能性があると考えた。

本論文では、オリゴフルクトース誘発下痢モデルを研究の基礎として設定した。これは、臨床現場において、病原体に関連した原因ではなく、主に食事の変化や抗生物質治療に関連した馬の下痢が観察される症例が多かったことに由来する。これらの馬は食肉用であることから、抗生物質の代わりにオリゴフルクトースを使用することにした。さらに現代では、馬のパフォーマンスを向上させるために、高濃度の飼料が与えられることが多い。本研究は、このモデルを対照的に用いることで、馬の下痢に対する様々な治療法を検討し、下痢の管理のみならず、罹患馬に適用される具体的な治療法に関する貴重な知見を得ることを目的としている。この研究を通じて、ウマ集団における下痢への対処と緩和のための効果的な戦略に光を当てることが期待される。

その結果、下痢の誘発は体温、糞便pH、下痢スコアなど馬に悪影響を及ぼすことが示された。これらの傾向は、ウマにおける自然または抗生物質誘発下痢症例（18, 44）で観察されたものと同じであり、オリゴフルクトース誘発モデルはウマの下痢を研究するための貴重な調査ツールとして役立つ可能性が示唆された。この方法は、大腸炎（45-48）、下痢（49、50）、疝痛（51）、蹄葉炎（52）など、ウマに深刻な結果を引き起こす可能性のある抗生物質の使用に伴うリスクを回避することができる。CBMおよびFMT治療後、下痢に関連する臨床症状は両群の馬で有意に改善した。これらの結果は、CBMおよびFMTが馬の下痢を治療するための有望な治療アプローチである可能性を示している。

次に、下痢が馬に与える影響を調べるため、異なるグループ内で血中血清濃度の検査を行った。その結果、下痢を起こした馬では全身性の炎症が顕著に増加していることが明らかになり、血清中のサイトカイン量の上昇によって反映された。具体的には、LPS、IL-17A、総タンパク質、乳酸の濃度が、コントロール群と比較して下痢馬の血清中で有意に高かった。これらの結果は、活発な免疫反応とホメオスタシスバランスの崩壊を示唆しており、下痢が罹患馬の全身で炎症反応を亢進させることを示唆している。可能性のあるアプローチを評価するため、CBMおよびFMT治療の効果を評価した。CBMとFMTの投与後、LPS、IL-17A、乳酸のレベルのかなりの低下が観察された。このことは、CBMとFMTの両方が、馬の下痢に関連する炎症反応を減衰させるための実行可能な戦術として有望であることを示唆している。治療群におけるLPS濃度の有意な減少は、エンドトキシンの放出が少ないことを示している。組織灌流のバイオマーカーである乳酸濃度が治療群で有意に低下したことは、嫌気性代謝経路の活性化を示している(53)。これらは全負担に対する有益な影響を示しているのかもしれない。しかし、CBMおよびFMT治療後の総タンパク質レベルには有意な変化はみられなかった。このことは、これらの介入が炎症反応の特定の側面に効果的に対処する一方で、血清中の総タンパク質濃度には直接的な影響を及ぼさない可能性を示唆している。これらの知見は、下痢、炎症、馬における潜在的な治療介入の間の複雑な相互作用に光を当てるものである。

さらに、大腸組織の病理組織学的検査を行い、各治療群間の違いを明らかにした。下痢群では、対照群と比較して、明らかな構造的損傷、細胞の過剰増殖、炎症粘膜が認められた。CBMとFMTの治療後、CBMとFMTの両群は炎症の軽減を示した。注目すべきは、FMTはCBMと比較して、組織構造の修復、異常な細胞増殖の抑制、腸の恒常性の回復に効果的であったことである。どちらの治療法も抗炎症効果を示したが、FMTは下痢に伴う病理学的変化を回復させる上で優れた有効性を示した。これらの知見は、消化管環境および／または微生物組成を操作することが、ウマの下痢治療に有効なアプローチである可能性をさらに強調するものである。

さらに、本研究では、chao1、観察種、Shannon、Simpson、Goods coverageおよびPielou_eを解析することにより、下痢発生後に糞便細菌群集の豊富性および多様性が有意に減少することを見出した。CBMおよびFMT処理後、腸内細菌叢組成、特にα多様性（Goods-coverageを除く）の点で有意な変化がみられ、FMTはより顕著でインパクトのある効果を示した。β多様性に関しては、コントロール群と下痢群馬の糞便微生物叢組成は有意に異なり、PCA、PCoA、Upgmaクラスター、NMDSプロットのいずれにおいても明確な分離が観察された。FMT治療後、下痢群とFMT群の馬の糞便微生物叢組成の顕著な違いが明らかになった。この区別は、PCA、PCoA、Upgmaクラスター、NMDSなどのさまざまな分析プロットで明確に観察された。さらに、FMT介入により、下痢罹患馬の腸内細菌叢組成が変化し、健常馬の組成に近づいた。対照的に、CBM投与後、CBM群の腸内細菌叢組成は対照群よりもむしろ下痢群に近い類似性を示した。この違いは、Upgmaクラスター図において特に顕著であり、CBMサンプルは下痢サンプルとともにクラスター化した。これらの結果は、FMTが腸内細菌叢の異常を回復させ、より健康的な組成を促進するという点で、CBMよりも優れていることを強く示している。

次に、異なるグループ間の腸内細菌叢の組成の違いを調べた。門レベルでは、ファーミキューテス門、アクチノバクテリウム門、デスルホバクテリウム門、フソバクテリウム門が有意に増加し、バクテロイデーテス門、パテシバクテリウム門、アルマティモナドータ門、シアノバクテリウム門、ベルコミクテリウム門、SAR324_clade（Marine_group_B）、プロテオバクテリウム門、プラナクトミセトータ門がコントロール群と比較して有意に減少した。CBMおよびFMT処理後、ファーミキューテス門、バクテロイーダ門、および放線菌門は、CBMおよびFMTの両群で同様に変化し、Control群に近づいた。一方、Patescibacteria属およびPlanctomycetota属はCBM群でさらに減少し、FMT群で増加した。Proteobacteria属、Desulfobacterota属およびFusobacteriota属はCBM群でさらに増加し、FMT群で減少した。

属レベルでは、Streptococcus属、Lactobacillus属、Bifidobacterium属、Sharpea属、Limosilactobacillus属、Megasphaera属が有意に増加し、Akkermansia属、Lachnospiraceae_UCG-009属は対照群に比べ下痢群で有意に減少した。CBMおよびFMT治療後、下痢を引き起こすStreptococcus属およびLactobacillus属は、Diarrhea群と比較して両群で有意に減少した。しかし、これらの属の相対量は、対照群およびFMT群と比較して、CBM群で高いままであったことは注目に値する。この観察結果は、CBM群の腸内細菌叢組成が下痢群の組成に近いことのもっともらしい説明となる。

菌種レベルでは、Streptococcus_equinus、Lactobacillus_equicursoris、Bifidobacterium_unclassified、Sharpea_unclassified、Megasphaera_unclassified、Limosilactobacillus_unclassifiedがControl群と比較してDiarrhea群で有意に増加した。CBMおよびFMT処理後、Streptococcus_equinus、Lactobacillus_equicursorisおよびBifidobacterium_unclassifiedの相対存在量は、両群とも下痢群に比べて有意に減少したが、CBM群では対照群に比べて高かった。また、Sharpea_unclassified、Megasphaera_unclassified、Limosilactobacillus_unclassifiedはFMT群で有意に減少したが、CBM群ではさらに増加した。

これらの知見は、CBMとFMTが、下痢によって誘発された腸内細菌叢異常の回復において、異なるメカニズムで作用している可能性を示唆している。とはいえ、CBMおよびFMTの両治療はウマの下痢関連症状を効果的に軽減したことから、それらの治療メカニズムには、おそらくメタボローム変化などの新たな因子が関与していることが示唆された。さらに、CBM群とFMT群の両方でpH値の上昇が観察された。このpH上昇は、FMT群では乳酸菌レベルの減少に起因する可能性があり、CBM群では細菌の変化というよりむしろ化学化合物に起因する可能性がある。

我々は、腸内細菌叢の変化と、異なるグループの馬から収集した臨床データおよび血中血清データとの潜在的関連性を評価するため、詳細な調査を実施した。この解析は、LEfSe解析により同定された細菌属を用いたスピアマン相関に基づいて行われた。その結果、細菌属の増加と下痢、特にビフィドバクテリウム（Bifidobacterium）、アルカリバクテリウム（Alkalibacterium）、ラクトバチルス（Lactobacillus）、ストレプトコッカス（Streptococcus）、ヴェイヨネラ（Veillonella）といった主要なバイオマーカー属との間に有意な関連があることが明らかになった。これらの属は、宿主の臨床パラメータの悪化や全身性の炎症反応の激化と正の相関を示した。さらに、CBMおよびFMT治療後の細菌属の変化、特にAlloprevotella、Monoglobus、Acinetobacter、Christensenellaceae_R_7_group、Anaerovorax、Blautia、Lachnospiraceae_UCG_009、Lachnospiraceae_XPB1014_group、およびUCG_002のような注目すべきバイオマーカーは、下痢に関連する臨床症状および宿主の全身性炎症反応と負の相関を示した。このことは、腸内細菌叢が馬のオリゴフルクトースによる下痢の発症と治療の両方に重要な役割を果たしていることを示唆しており、馬の健康という文脈におけるその重要性を強調している。

最後に、PICRUSt2解析を行った。その結果、CBMとFMTの治療により、崩壊した腸内細菌叢の組成が回復するだけでなく、腸内細菌群集の機能的完全性が再活性化することが示唆された。

これらの知見は、CBMおよびFMT治療が、臨床症状の緩和、炎症性サイトカインの抑制、組織損傷の修復、腸内細菌叢の組成およびその機能の回復において、前向きな治療効果を示す有力な証拠となる。特に興味深いのは、下痢を誘発した馬の腸内細菌叢を再確立する能力において、CBM群とFMT群の間に顕著な違いがあることが明らかになったことで、治療メカニズムが異なることが示唆された。正確なメカニズムはまだ完全には解明されていないが、正常な腸内細菌叢組成を再構築するという文脈における糞便微生物叢移植（FMT）の主な目的に関する仮説を提案する。このプロセスには、ニッチからの排除、栄養をめぐる競争の激化、抗菌薬の産生、二次胆汁酸の産生上昇が関与していると考えられている(54)。一方、CBMは有益な細菌株の増殖に有利な環境を作り出し、より健康的な腸内細菌叢プロフィールを促進すると仮定されている。これらの知見に基づき、我々は下痢の馬を治療するために、CBMとFMT治療を併用する包括的なアプローチを提案する。最初にCBMを投与して有益な細菌分類群にとって良好な生存環境を作り、次にFMTを投与して乱れた微生物群集を回復させることで、馬の下痢管理の治療成績を最適化することができる。

5 結論
下痢は馬にとって健康面でもパフォーマンス面でも重大な課題であり、その多因子性ゆえに効果的な介入が必要である。本研究では、FMTおよびCBM療法を用いてバランスのとれた腸内細菌叢を回復させることに焦点を当てた。注目すべきは、どちらの治療法も下痢に関連する臨床症状、炎症、組織損傷の大幅な改善を示したことである。下痢時の腸内細菌叢の組成には明らかな変化が認められ、細菌属の多様性の低下と特異的な変化が特徴的であった。さらに相関分析により、特定の細菌属が全身の炎症反応に関与している可能性と、宿主の臨床パラメータとの関連が強調された。重要なことは、CBMとFMTの両治療により、腸内細菌叢の組成に有意な変化が認められたことである。これらの変化は、両治療群において、宿主の臨床パラメータの改善と炎症の軽減を伴っていた。要約すると、本研究は馬の下痢の管理と治療に関する貴重な知見を提供するものである。CBMおよびFMT療法の有望な結果、および臨床症状を改善し、下痢に関連する腸内細菌叢の形成異常を回復させるそれらの能力は、効果的な介入のための潜在的な道を提供する。

データ利用声明
本研究で発表された原著論文は一般に公開されている。このデータはhttps://www.ncbi.nlm.nih.gov/bioproject/; PRJNA1003028。

倫理声明
この動物実験は吉林大学倫理委員会（Institutional Animal Care and Use Committee：IACUC）の承認を得た。本研究は、現地の法律および機関要件に従って実施された。

著者貢献
MT：執筆-原案、執筆-校閲・編集。RT： データキュレーション、執筆-校閲・編集。XH：方法論、執筆-校閲・編集。YF：プロジェクト管理、執筆-校閲・編集。NZ：概念化、執筆-校閲・編集。

資金提供
著者は、本論文の研究、執筆、および／または発表のために財政的支援を受けたことを表明する。本研究は、吉林省教育部科学研究プロジェクト（番号JJKH20231201KJ）の支援を受けた。

利益相反
著者らは、本研究が利益相反の可能性があると解釈されるような商業的または金銭的関係がない状態で実施されたことを宣言する。

発行者注
本論文で表明された主張はすべて著者個人のものであり、必ずしも所属団体や出版社、編集者、査読者の主張を代表するものではない。本記事で評価される可能性のあるいかなる製品、またはその製造元が主張する可能性のあるいかなる主張も、出版社が保証または承認するものではない。

発行者注
本記事で表明されたすべての主張は、あくまで著者個人のものであり、必ずしもその関連団体、あるいは出版社、編集者、レビュアーの主張を代表するものではない。本論文で評価される可能性のあるいかなる製品、またはその製造元が主張する可能性のあるいかなる主張も、出版社によって保証または支持されるものではない。

補足資料
本論文の補足資料は、https://www.frontiersin.org/articles/10.3389/fvets.2024.1388227/full#supplementary-material。

補足図S1｜異なるグループのウマにおける腸内細菌叢のα多様性。A、観察種（クラスカル・ワリス、P=0.0014）；B、シャノン（クラスカル・ワリス、P=0.00087）；C、シンプソン（クラスカル・ワリス、P=0.0019）；D、チャオ1（クラスカル・ワリス、P=0.0014）；E、グッズカバレッジ（クラスカル・ワリス、P=0.73）；およびF、Pielou_e（クラスカル・ワリス、P=0.0013）。

補足図S2｜異なるグループの馬における腸内細菌叢のβ多様性。A：PCAプロット、B：PCoAプロット、C：Upgmaクラスター・プロット、D：NMDSプロット。

補足図S3｜門、綱、目、科、属、種のレベルでの分類群間の関係を示すLEfSe分析。

補足図S4｜異なるグループのPICRUSt2プロット。

脚注

  1. ^ https://www.omicstudio.cn/

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キーワード：下痢、オリゴフルクトース、腸内細菌叢、CBM、FMT、ウマ

引用 Tuniyazi M, Tang R, Hu X, Fu Y and Zhang N (2024) 炭酸緩衝液混合液と糞便微生物叢移植は、ウマのオリゴフルクトース誘発性下痢に対して有望な治療効果を保持している。Front. Vet. Sci. 11:1388227. doi: 10.3389/fvets.2024.1388227

Received： 19 February 2024; Accepted： 受理：2024年02月19日; 受理：2024年04月05日；
発行：2024年4月22日

編集者

Changwei Qiu, 華中農業大学, 中国
査読者：Yaoqin Shen, Huazhong Agricultural University, China：

Yaoqin Shen, 華中農業大学, 中国
Sarah C. Pearce, 米国農務省, 米国
Copyright © 2024 Tuniyazi, Tang, Hu, Fu and Zhang. これはクリエイティブ・コモンズ表示ライセンス（CC BY）の条件の下で配布されるオープンアクセス記事です。原著者および著作権者のクレジットを明記し、学術的に認められている慣行に従って本誌の原著を引用することを条件に、他のフォーラムでの使用、配布、複製を許可する。これらの条件に従わない使用、配布、複製は許可されない。

*文責 Naisheng Zhang, zhangns0628@hotmail.com

免責事項：本論文で表明されたすべての主張は、あくまで著者個人のものであり、必ずしも所属団体や出版社、編集者、査読者の主張を代表するものではない。本記事で評価される可能性のあるいかなる製品、またはその製造元が主張する可能性のあるいかなる主張も、出版社によって保証または支持されるものではありません。

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