ヒスタミン2受容体拮抗薬と比較して、プロトンポンプ阻害薬は経口から腸への微生物伝達および腸内細菌叢の変化をより強く誘導する：無作為化比較試験

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腸内細菌叢
オリジナル研究
ヒスタミン2受容体拮抗薬と比較して、プロトンポンプ阻害薬は経口から腸への微生物伝達および腸内細菌叢の変化をより強く誘導する：無作為化比較試験

https://gut.bmj.com/content/early/2023/11/22/gutjnl-2023-330168

http://orcid.org/0000-0001-5247-7829Jiaying Zhu1、http://orcid.org/0000-0001-5025-2650Chuqing Sun1、Min Li1、Guoru Hu1、Xing-Ming Zhao2,3,4,5,6、http://orcid.org/0000-0001-5160-4398Wei-Hua Chen1,7,8
Dr Wei-Hua Chen, Key Laboratory of Molecular Biophysics of the Ministry of Education, Key Laboratory of Bioinformatics and Molecular-imaging, Center for Artificial Intelligence Biology, Department of Bioinformatics and Systems Biology, College of Life Science and Technology, Wuhan, China; weihuachen@hust.edu.cn; Dr Xing-Ming Zhao, Institute of Science and Technology for Brain-Inspired Intelligence, Fudan University, Shanghai, China; xmzhao@fudan.edu.cn 宛てにご連絡ください。
要旨
目的 プロトンポンプ阻害薬（PPI）とヒスタミン2受容体拮抗薬（H2RA）が腸内細菌叢に及ぼす影響を縦断的解析により比較することを目的とした。

デザイン 健康なボランティアを無作為に割り付け、PPI（n=23）またはH2RA（n=26）のいずれかを7日間連日投与した。介入前後に口腔（唾液）および糞便サンプルを採取し、メタゲノム次世代シーケンシングを行った。微生物の存在量や増殖率、口腔から腸への伝達など、介入によって誘発された口腔内および腸内マイクロバイオームの変化を分析し、PPI群とH2RA群間の差異を比較した。

結果 いずれの介入も腸内細菌叢を破壊したが、PPIはより顕著な効果を示した。PPIの使用により、口腔から腸への伝播の程度が有意に高くなり、腸内の特定の口腔内微生物の増殖が促進された。その結果、フソバクテリウム・ヌクレアタム（Fusobacterium nucleatum）やストレプトコッカス・アンギノサス（Streptococcus anginosus）のような既知の疾患関連種の同定を含め、腸内に存在する口腔内種の数と総存在量の両方が有意に増加した。全体として、腸内細菌に基づく機械学習分類法は、PPI使用者と非PPI使用者を正確に区別することができ、H2RA使用者と非H2RA使用者のAUROCが0.509であったのとは対照的に、0.924の受信者動作特性曲線下面積（AUROC）を達成した。

結論 本研究により、PPIがH2RAよりも腸内細菌叢および口腔から腸への伝達に大きな影響を及ぼすというエビデンスが得られ、PPIの長期使用に関連する特定の疾患の高リスクの根底にあるメカニズムに光が当てられた。

臨床試験登録番号 ChiCTR2300072310。

データ公開
データは公開のオープンアクセスリポジトリで入手可能である。本試験に関連するデータはすべて論文に含まれるか、補足情報としてアップロードされている。本研究で報告されたシーケンスデータは、China National Center for Bioinformation (CNCB)-National Genomics Data Center (NGDC)のBioProject accession number PRJCA016454で利用可能になっている。その他のデータはすべて、本原稿およびその補足ファイルから入手可能である。本論文で行ったすべての解析を記述したソースコードはオンラインで入手可能である（https://github.com/whchenlab/PPI-vs.-H2RA-effects-on-gut-microbiome）。

http://creativecommons.org/licenses/by-nc/4.0/
本論文は、Creative Commons Attribution Non Commercial (CC BY-NC 4.0)ライセンスに従って配布されたオープンアクセス論文である。このライセンスは、原著作物が適切に引用され、適切なクレジットが付与され、いかなる変更も明記され、使用が非商業的であることを条件として、他者が本著作物を非商業的に配布、リミックス、翻案、構築し、その派生物を異なる条件でライセンスすることを許可する。参照：http://creativecommons.org/licenses/by-nc/4.0/。

https://doi.org/10.1136/gutjnl-2023-330168

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このトピックについて既に知られていること
プロトンポンプ阻害薬（PPI）の長期使用は、特定の病状や微生物叢組成の変化と関連があるかもしれない。とはいえ、薬物、疾患、微生物叢の相互作用の決定的な因果関係は、まだ完全には解明されていない。

ヒスタミン2受容体拮抗薬（H2RA）は、一般にPPIに代わるより安全な薬剤と考えられているが、H2RAの腸内シグネチャーやPPIとの比較に関する研究は限られている。

この研究で追加されたこと
PPIはH2RAと比較して腸内細菌叢の破壊に大きな影響を及ぼし、口腔から腸への伝達をより広範囲に誘導し、腸内の特定の口腔内種の増殖を促進した。

重要なことは、PPIはFusobacterium nucleatumとStreptococcus anginosusを含む既知の疾患関連種の腸内における有病率と存在量を有意に増加させることである。

この研究が研究、診療、政策にどのような影響を与えるか
本研究は、H2RAと比較してPPIの長期使用に関連する特定の疾患のリスクが高くなるメカニズムの根底にある洞察力を提供する。この知見は、医療従事者がこれらの薬剤を処方する際、特に長期使用において患者の健康状態を改善するために、より多くの情報に基づいた決定を下すのに役立つであろう。

はじめに
プロトンポンプ阻害薬（PPI）やヒスタミン-2受容体拮抗薬（H2RA）などの胃酸分泌抑制薬は、消化不良、消化性潰瘍、GORDなどの様々な消化器疾患の管理において、世界中で極めて重要な役割を担っている。 -7 両薬剤とも酸関連疾患に対する有効性は証明されているが、PPIの長期使用は、大腸がん（CRC）やIBDなどの腸疾患、肺炎、クロストリジウム・ディフィシル感染症などの腸管感染症のリスク増加や進行と関連するという顕著な傾向がある5 6 8-10 一方、H2RAはより安全な代替薬であると広く考えられている7 11。

最近、研究者らは、PPIの長期使用は、様々な微生物種の存在量と多様性の変化によって特徴づけられる腸内細菌叢の変化につながる可能性があるとの懸念を示している12-15。腸内細菌叢の組成の乱れは、疾患のリスクを高めたり、既存の健康状態をさらに悪化させたりする可能性がある16。16S rRNA遺伝子の塩基配列決定に基づく研究では、オランダの3つの独立したコホートを用いて、PPIの使用が腸内マイクロバイオームに及ぼす影響を調査した。その結果、PPIの使用は細菌の豊かさの減少と関連しており、腸内細菌の20％が有意な逸脱を示した。これらの所見は、C. difficile感染症に罹患しやすい既知の変化と一致しており、PPI使用者における腸内感染症リスクの上昇を説明できる可能性がある13。さらに、ショットガンメタゲノム解析を用いた2つの大規模コホート研究により、PPIが腸内マイクロバイオームに及ぼす影響が示された。しかし、2つの研究間でPPI使用者において一貫した増加傾向を示したのは、ラクトバチルス属とストレプトコッカス属の2属のみであった17 18。これらの研究の大半が横断的研究であり、研究集団は基礎疾患やポリファーマシーを有する人々で構成されていることが多いことに注意することが重要である。これらの研究の多くは、その影響を軽減するために特別な単変量解析や多変量解析を採用しているが、このことは解析を複雑にする多くの交絡因子をもたらす。とはいえ、このような複雑性を考えると、薬剤の真のマイクロバイオームシグネチャーを区別することは依然として困難である。さらに、H2RAとPPIのマイクロバイオームシグネチャーを比較検討した研究は限られている。

これらの懸念に対処するため、われわれはPPIとH2RAによるマイクロバイオームの変化を比較するため、49人の健常人を対象とした縦断的研究を行った。これらの薬剤がヒトのマイクロバイオームに与える影響を理解することは、胃酸分泌抑制剤とヒトのマイクロバイオータとの複雑な相互作用や、様々な疾患のリスク増大との相関関係をより深く理解することにつながるため、最も重要な意義がある。これらの知見は、治療戦略を最適化することにより、臨床診療や健康管理のための貴重な指針となり、患者が最良の医療結果と全体的な幸福を得られることを保証する。

方法
患者と一般市民の参加
本研究のデザイン、実施、報告、普及計画には、患者および/または一般市民は関与していない。

被験者募集
本研究では、方法と結果の報告における透明性と一貫性を確保するため、Consolidated Standards of Reporting TrialsおよびStrengthening The Organization and Reporting of Microbiome Studies（STORMS）ガイドラインを厳守した19。

参加者の臨床データおよび健康状態、病歴、食習慣、日常生活などの生活習慣データは、自己申告式の質問票により入手した。登録された健常者はすべて以下の基準を満たしていた： (1)18～45歳、(2)19kg/m2≦BMI≦24kg/m2、(3)過去3ヵ月以内に抗生物質、プロバイオティクス、胃酸抑制剤を使用していない、(4)非喫煙、(5)潰瘍性大腸炎、クローン病、急性下痢症などの重度の消化器疾患がない； (6)歯周炎や歯肉炎などの重篤な口腔疾患がないこと、(7)重篤な、進行性の、またはコントロールされていない心疾患、肝疾患、腎疾患、精神疾患の既往歴がないこと、(8)がん、または化学療法、放射線療法、免疫療法などの抗腫瘍治療の既往歴がないこと、(9)薬物またはアルコールの乱用の既往歴がないこと。

合計64名のボランティアが最初に募集され、前述の基準に基づいて質問票の結果を評価した結果、8名が除外された。残りの56人の参加者は、性別、年齢、ベースラインの状態などの主要な特徴のバランスを確保するために、無作為に2つのグループに分けられた：PPIグループ（PPIであるオメプラゾールを服用している参加者、n=28）とH2RAグループ（H2RAであるファモチジンを服用している参加者、n=28）。7人のボランティアは、最初のサンプリングポイントの前に2ヶ月の夏休みを取ったため、試験から脱落し、49人が終了した（PPI群、n=23；H2RA群、n=26）。無作為化はコンピュータで作成した乱数表を用いて行われ、介入を割り当てるまでは隠されていた。実験概要の詳細についてはonline supplemental figure 1を参照のこと。関連するメタデータはオンライン補足表1に記載されている。

補足資料
[gutjnl-2023-330168supp004.pdf]
補足資料
[gutjnl-2023-330168supp003.xlsx]
PPI群とH2RA群の臨床データの違い
収集されたすべての臨床データの差を調べるために統計解析が行われた（オンライン補足表2）。連続変数にはWilcoxon順位和検定を、カテゴリー変数にはχ2検定を用いた。

介入手順およびサンプル収集
登録されたすべての参加者は、0日目（2022年6月12日）にベースラインの唾液と便のサンプルを提供した。その後、PPI群にはオメプラゾール（1日20mg）が7日間投与され、7日目（2022年6月19日）に唾液と便のサンプルが再度提供された。同様に、H2RA群も同様の処置を受けたが、ファモチジン（1日20mg）が投与された。実験全体のデザインは図1Aを参照されたい。

図1
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図1
健常ボランティアにおけるPPIとH2RAによる腸内細菌叢の変化。(A）プロトンポンプ阻害薬（PPI；n=23）群とヒスタミン-2受容体拮抗薬（H2RA；n=26）群の介入とサンプル採取の手順を示す試験フローチャート。(B）PPIおよびH2RA介入前後で有意に変化した腸内微生物分類群（すなわち、属および種）の効果量（Cohenのdで測定）を示すヒートマップ。赤のタイルは薬剤が濃縮された分類群を表し、緑のタイルは薬剤が減少した分類群を表す。紫色のタイルは、拡張ヒト口腔マイクロバイオームデータベース（eHOMD）による口腔内の分類群を示す。隣接する棒グラフは、対応するグループにおける有意に変化した分類群の総数を示す。下の散布図は、上記の分類群の有病率の変化を示している。C）ベースライン時と介入後におけるPPI群とH2RA群の腸内細菌の蓄積量を比較した箱ひげ図。口腔内細菌」は唾液サンプルの10％以上に存在するものと定義した（「方法」のセクションを参照）。連続変数の群間比較にはWilcoxon順位和検定を用いた。NS、有意ではない; *p<0.05; **p<0.01; ***p<0.001; ****p<0.0001。(D）PPI介入前後の腸内細菌プロファイルを区別する機械学習分類器の性能。受信者動作特性曲線下面積（AUROC）を用いて、5倍の3回繰り返しクロスバリデーションで性能を測定した。(E）H2RA分類器の性能。(F）PPI分類器の上位20の最も重要な特徴量（左図）とその存在量（中図）、および介入前後の存在量の倍数変化（右図）。バーまたはボックスの色は、その特徴が濃縮されたグループを表す。緑はベースライン試料での濃縮、赤は介入後の濃縮、黒は濃縮なしを示す。(G)H2RA分類器の上位20特徴量とその濃縮度、介入前後の濃縮度フォルド変化。

唾液サンプルは、早朝、口腔衛生と朝食の前に参加者が自宅で採取した。DNAの分解を防ぐため、2mLの室温安定化試薬キット（Cat.No. CY-98000A、Huachenyang, Shenzhen, China）を用いて、各参加者から採取した2mLの唾液と混合した。便サンプル採取には、唾液サンプル採取と同じ日に、参加者は便サンプル採取キット（Cat.No. CY-98000PS-P1、Huachenyang, Shenzhen, China）を使用した。このキットには2mLの室温安定化試薬も含まれていた。採取した唾液および便検体はすべて、採取後12時間以内に-80℃の冷凍庫に移し、DNA抽出まで保存した。

さらに、本研究はより大規模な無作為化臨床試験（RCT）の一部であることに留意することが重要である。完全な実験計画では、参加者に胃酸抑制剤を投与し、同時にプロバイオティクスを摂取する期間を1週間追加した（8日目から14日目まで）。唾液と糞便のサンプルは14日目と薬剤中止7日後（21日目）に採取された。さらに、プロバイオティクスのみを1週間摂取した対照群も存在した。すべての倫理的手続きは、包括的な実験計画に従って実施された。実験デザインおよびプロトコール全体の詳細については、補足資料1を参照されたい。

補足資料
[gutjnl-2023-330168supp001.pdf]
DNA抽出、ライブラリー構築、ショットガンメタゲノムシーケンス
糞便および唾液サンプル中のDNAは、MagPure Stool DNA KF kit B（Magen社、中国）を用いて、製造元の指示に従って抽出した。各サンプル中のゲノムDNAの濃度と純度は、Qubit dsDNA BR Assay kit（Invitrogen、米国）を用いて測定した。DNAの完全性を評価するために、1%アガロースゲル電気泳動を行った。

その後、1μgのゲノムDNAをCovaris LE220 (Covaris, Inc, USA)を用いて、製造者の指示に従ってランダムに断片化した。断片化されたDNAは、磁気ビーズによって平均200-500 bpのサイズに選択された。選択された断片は、末端修復、3′アデニル化、アダプターライゲーション、PCR増幅を受け、産物は磁気ビーズによって精製された。二本鎖PCR産物を熱変性させ、スプリントオリゴ配列を用いて環状化した。一本鎖サークルDNAは最終ライブラリーとしてフォーマットされ、QCにより適格性が確認された。全ゲノムシークエンシングは、BGI（武漢、中国）のMGISEQ-2000プラットフォームを用い、ペアエンドリード長150bp（PE150）で行った。各唾液サンプルおよび糞便サンプルについて、それぞれ76.4±6.0および38.5±2.7百万ペアの生リード（平均±SD）を得た（オンライン補足表3）。

メタゲノム生データの処理
アダプター配列や低品質配列を含む生データは、SOAPnuke21でパラメータ'-n 0.01 -l 20 -q 0.4 --adaMis 3 --outQualSys 1 -minReadLen 150'でフィルターした。フィルターされたリードペアの品質はFastQC(V.0.11.9)で評価した。その後、Bowtie2（V.2.5.0）22を用いて、ヒトゲノムバージョンGRCh38/hg38に対する宿主DNAコンタミネーションを除去した。低品質塩基、アダプター配列、短いリード、ヒトのコンタミネーションを除去した後、唾液サンプルおよび糞便サンプルあたり、それぞれ合計2,530±1,620万対および3,830±2,800万対のリードが得られた（オンライン補足表3）。得られたデータは「クリーンデータ」と呼ばれ、BioProject IDでChina National Center for Bioinformation-National Genomics Data CenterのGenome Sequence Archive (GSA)に寄託された： PRJCA016454。これらのクリーンデータは、本研究におけるその後の解析に使用された。各サンプルの詳細と対応するGSAアクセッションIDについては、オンライン補足表4を参照のこと。

メタゲノムデータの分類学的プロファイリング
mpa_vJan21_CHOCOPhlAnSGB_202103のマーカー遺伝子データベースを用いて、MetaPhlAn4(V.4.0.3)23で全サンプルのデフォルトパラメータで種レベルのプロファイリングを行った。全サンプルにわたって最大存在量が0.001より大きく、平均存在量が0.0001より大きい種のみが保持された。

介入前と介入後の種（バイオマーカー）の存在量の差分析
介入前と介入後の同一個体から得られた縦断的サンプルを比較することで、有意差のある生物種を同定した。この際、ペアのWilcoxon順位和検定と線形判別分析（LDA）の効果量（LEfSe）24を用い、それぞれStats Rパッケージ（V.4.2.0）の'wilcox.test'関数とmicrobiomeMarker Rパッケージ（V.1.2.2）の'run_lefse'関数25を用いて実施した。Wilcoxon順位和検定でp値が0.05未満、LEfSe分析でLDAスコアが2以上の種が選択された。最終的な差分豊存種リストは、2つの結果の交点によって決定された。ペアサンプルのCohenのdは、effsize Rパッケージ（V.0.8.1）の'cohen.d'関数を用いて計算した26。この効果量指標は、結果を標準化することにより、異なるグループや研究間の比較を可能にする。本研究では、R V.4.2.0を使用した。

図1Cで使用した口腔内細菌
図1Cで使用した口腔内細菌は、唾液サンプルの10％以上で観察された細菌と定義し、これは以前の研究で示唆された閾値である27。唾液サンプルからは合計287種が口腔内細菌とみなされたが、PPI群とH2RA群の腸内サンプルからは19種しか口腔内細菌が検出されなかったため、腸内細菌の累積存在量の算出に使用した。口腔内細菌の詳細なリストとその腸内相対量については、オンライン補足表5を参照のこと。

介入前と介入後のサンプルを識別するための機械学習分類法
モデリングと評価は、SIAMCAT Rパッケージ（V.2.2.0）を用いて行った28。各検体におけるすべての注釈付き生物種の相対量を表す特徴量は、log10変換を伴うzスコア標準化を用いて正規化した。対数による無限大の値を避けるため、すべての値に1e-06の擬似カウントを加えた。さらに、過小評価を防ぐために、すべての特徴のSDの最小分位数を0.1に設定した。各薬剤の介入前と介入後のサンプルがラベル付けされ、ランダムにテストセットとトレーニングセットに分割され、5倍の3回のクロスバリデーションが繰り返された。残りのフォールドは、各テストフォールドのRandomForestモデルを開発するためのトレーニングデータとして使用された。分析を通して特徴選択は行わなかったが、これはSIAMCAT28や最近の研究29による推奨に沿ったものである。

RandomForestモデルは、Figshare（https://figshare.com/articles/dataset/RandomForest_classifiers/23912331）で入手可能である。

細菌株および口腔から腸への伝播の解析
菌株レベルのプロファイリングは、StrainPhlAn 430を用い、カスタムのspecies-level genome bins（SGB）マーカーデータベースを用い、パラメータ「-marker_in_n_samples 1 --sample_with_n_markers 10 --phylophlan_mode accurate --mutation_rates」で行った。口腔から腸への感染の発生を検出するために、すべての口腔サンプルでMetaPhlAn 4によって検出されたすべてのSGBが含まれた。口腔から腸への感染イベントは、同じ時点で採取された同一個体からの唾液と腸サンプルのペアで、系統学的距離が特定のSGBの株同一性閾値以下であるものと定義した（オンライン補足表6）。我々は最終的に、StrainPhlAnが推奨する菌株同一性閾値として0.03を選択したが、より厳しい菌株同一性閾値（例えば0.01）も検討し、我々の研究で得られた知見は依然として頑健であった（オンライン補足図2）。

補足資料
[gutjnl-2023-330168supp005.pdf]
細菌増殖速度の計算
微生物の増殖ダイナミクス（PTR：peak-to-trough ratio）を正確に定量化するため31、コンティグとカバレッジ値を用いて複製起点からのコンティグの相対距離を推定し、メタゲノムサンプル間の細菌増殖速度を比較するマルチサンプルアルゴリズムであるDEMICを採用した32。種の包括的なカバレッジを確保するため、口腔と糞便の両方の部位でMetaPhlAn4によってプロファイリングされたSGBの全ゲノム（http://segatalab.cibio.unitn.it/data/Pasolli_et_al.html から取得）と、本研究で作成したメタゲノム-アセンブルゲノム（MAG）を結合した。さらに、dRep (V.3.4.2)を用いて、デフォルトのパラメータ33で、この結合ゲノムの複製を解除した結果、DEMICの入力となる1186種レベルのユニークなゲノムセットが得られた。最後に、マニュアルに記載されている手順に従ってDEMIC解析を行った。

各個人の唾液サンプルと糞便サンプルは、それぞれ独立に、metaSPAdes（V.3.15.5）を使用し、デフォルトのパラメータでde novoメタゲノム解析を行った34。 .0）35 とmetaWRAP（V.1.3.2）36 を用いてビニングを行った。metaWRAPの'bin_refinement'モジュールのパラメータ（-c 50 -x 10）を用いて精密化を行った結果、糞便サンプルと唾液サンプルからそれぞれ合計14044と8496のゲノムビンが得られた。

本研究で作成したMAG配列データセットは、Figshare (https://figshare.com/projects/Gut_and_Oral_Microbiome_alterations_of_healthy_volunteers_with_proton_pump_inhibitor_and_histamine-2_receptor_antagonist/174960)で入手可能である。

複数の疾患にわたる腸内細菌叢の選択種の濃縮解析
GMrepo（V.2）では、疾患における濃縮度に関する情報を収集するために、口腔から腸への感染で検出された種を検索した37。マーカーは、LDAカットオフを2.37としたLEfSe解析を用いて各コホート内で同定された。口腔から腸への伝播解析で検出された42種のうち、22種がGMrepoで疾患マーカーとして同定された。これらの22種が、同じコホートの対応する対照と比較して、疾患サンプルで濃縮されていることが判明したコホートの数を数えた（オンライン補足表7）。この数から、これらの菌種と疾患との関連性の強さと頑健性を知ることができる。

PPIの腸内細菌シグネチャーの本研究と文献との比較
Forslundらの研究におけるPPIの腸内マイクロバイオームシグネチャー（微生物バイオマーカー）は、データ比較のために彼らの出版物のオンライン補足表6からアクセスした。クリフのデルタの計算は、effsize Rパッケージ（V.0.8.1）の'cliff.delta'関数を用いて行った。

結果
PPIはH2RAよりも有意に腸内細菌叢を破壊する
最初に、PPI群とH2RA群の間で、すべての生活習慣指標と参加者のメタデータの変動を評価したが、統計的に有意な差は認められなかった（オンライン補足表2）。そこで、薬剤投与が腸内細菌叢に及ぼす影響を直接検討した。合計23種（マーカー）が、2つの薬剤投与後の腸内で有意な濃縮を示すことが観察され、その多くは薬剤介入後の腸内サンプルでも有病率の増加を示した（図1B）。さらに、23個のマーカーのうち16個（約70％）は、拡張ヒト口腔マイクロバイオームデータベース（eHOMD；図1B）に記録されているように、口腔マイクロバイオームで典型的に認められたものであった39。

これらのマーカーのうち、PPIとH2RAはそれぞれ20種と7種を誘導し、4種は両薬剤で共有された。共有マーカーはすべてStreptococcus属（S. salivarius、S. parasanguinis、S. sp. A12、S. oralis）に属し、正常な口腔微生物叢の一部であった40 41。さらに、S. parasanguinisを除く4つのマーカーはすべて、PPI群でH2RA群よりも有意に高い効果量（Cohenのd）を示した（オンライン補足表8）。さらに、腸内細菌の総量は両薬剤によって有意に増加した（図1C；オンライン補足表5）。しかし、その増加はH2RA群（0.39％；p=0.13；図1C）よりもPPI群（中央値〜5.29％；p=1.67e-09）の方が有意に高かった。

2つの薬剤による腸内細菌叢の変化の程度をさらに定量化するため、薬剤投与前後に採取したサンプルを分類するRandomForest分類器をグループごとに構築した。データ中の情報を最大限に保持し、個々では重要でなくても他の特徴との組み合わせで重要な役割を果たす可能性のある重要な特徴の取りこぼしを避けるために、特徴選択によって選ばれた特徴ではなく、すべての微生物量を入力としてモデルを訓練した29。我々の分析では、PPI群は、5倍の3回繰り返しクロスバリデーションにおいて、受信者動作特性曲線下面積（AUROC）で0.924という優れた精度を示し、分類器の高い識別力を示した（図1D）。対照的に、H2RA投与群ではAUROCが0.509とかなり低かったことから、H2RA投与によって誘発された腸内細菌叢の変化は、介入前後に採取されたサンプルを正確に区別できるほど実質的なものではないことが示唆された（図1E）。

さらに、相対的な特徴量の重みの中央値に基づいて、各分類器で最も重要な上位20の特徴量を同定した。注目すべきことに、PPIモデルでは、上位の特徴のうち19個が上記で同定したPPIマーカーと重なり、これらのマーカー種がPPI介入前と介入後のサンプルの区別に重要な役割を果たしていることが示唆された（図1F）。しかし、H2RAマーカーとオーバーラップしたのは、H2RAクラシファイアーの上位の特徴のうち6つだけであった。さらに、H2RAトップフィーチャーの存在量倍数変化は、PPI群と比較して2桁低かった（図1G；オンライン補足表9）。これらの知見は、H2RA治療による腸内細菌叢の摂動が比較的軽微であったため、H2RA介入前と介入後のサンプルを区別するH2RA分類器の識別力が低下したことを示唆している。

結論として、我々の知見は、PPIはH2RAと比較して、腸内細菌叢全体の撹乱に対して有意に高い影響を及ぼすことを示している。

PPIとH2RAは口腔微生物叢にほとんど破壊を引き起こさない
薬剤によって誘発された腸内細菌叢の変化が、口腔内細菌叢の変化に一部起因している可能性があるかどうかについては、まだ明らかにされていない。そこで、薬剤投与が口腔マイクロバイオームに及ぼす影響を調べた。注目すべきことに、PPIの介入は口腔内のどの分類群（種および上位分類ランク；オンライン補足図3A）の存在量にも有意な変化を与えなかった。さらに、H2RAで濃縮された4種の口腔内細菌は、いずれも腸内では検出されなかった（オンライン補足図3A）。これらの結果から、薬剤による口腔内マイクロバイオームの変化は、薬剤による腸内マイクロバイオームの変化の原因ではないことが示唆された。このことから、この後の解析では、口腔から腸への伝播を調べる必要がある。

補足資料
[gutjnl-2023-330168supp006.pdf]
PPIはH2RAよりも有意に高い経口-腸管伝達を誘導する
薬物介入前後の経口-腸管感染を定量化するために、Valles-Colomerらの推奨するパイプラインを採用し、StrainPhlAn 4を用いて、本試験でMetaPhlAn 4により同定された582種の中から株レベルで感染の可能性のある種を同定した（方法のセクション；オンライン補足表6を参照）。 30 42 ベースライン時には、合計21の伝播可能な菌種が同定され、そのうちの17（80.95％）が両方の身体部位で流行していた（すなわち、ベースライン時の口腔内および糞便内の両菌種における有病率が10％を超えていた；図2A；オンライン補足表10）ことから、健常な参加者では口腔から腸への伝播が頻繁に起こっていることが示唆された。ベースライン検体中の伝播性菌種の数と総存在量には、2つの薬剤群間で有意差は認められなかった（p>0.05；オンライン補足図4Aおよび表11）。

補足資料
[gutjnl-2023-330168supp007.pdf]
図2
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図2
PPIはH2RAよりも高い経口-経腸移行率を誘導し、腸内移行菌種の増殖を促進する。(A）口腔、腸、またはその両方における有病種と、薬剤介入前後の口腔から腸への伝播。上部のヒートマップは、左から右へ存在量の多い順に並べ替えた種の有病率を示している（両方の部位で流行している種は、腸内の存在量に基づいて並べ替えた）。種は、以前の研究で定義された基準を用いて、糞便サンプルの10％以上、唾液サンプルの10％未満で観察された「糞便」種（n=295、全体の50.69％）、口腔サンプルのみで流行していた「口腔」種（n=268、46.05％）、唾液サンプルと便サンプルの10％以上で流行していた「両方」種（n=19、3.26％）を含む4つのカテゴリーに分けられた。左下のヒートマップは、PPI群とH2RA群において、2つのタイムポイントで経口から腸への感染が検出された全菌種を表示したものである。左から右に並べたボックスプロットは、2群における薬剤投与前後での経口から腸管への移行を示す種の数と総存在量を比較したものである。NSは有意ではない；*p<0.05；**p<0.01；***p<0.001；***p<0.0001。Wilcoxon rank-sum検定。(B）PPIおよびH2RA投与前後の細菌の経口から腸への伝播有病率を示す散布図。左の2つのパネルの緑色の三角形はベースライン時の細菌の経口から腸への伝播有病率を表し、赤色の四角形は介入後の伝播有病率を表す。右のパネルは、2群における介入前後の経口腸管感染有病率の変化をまとめたものである。灰色のラベルは「両方」の菌種を示し、紫色のラベルは（A）で定義した「口腔内」の菌種を示す。赤い星印はFusobacterium nucleatumを強調したもので、先行研究によると大腸がんのマーカーとしてよく研究されている44。 (C) PPI群で細菌増殖速度（ピーク-トラフ比による測定）が有意に異なる菌種を示すボックスプロット。赤いラベルはPPIマーカー（すなわち、PPI使用後の腸内細菌はベースラインと比較して有意に豊富であった）を示す。連続変数の群間比較にはWilcoxon順位和検定を用いた。NS、有意でない；*p<0.05；**p<0.01；***p<0.001；***p<0.0001。H2RA、ヒスタミン2受容体拮抗薬；PPI、プロトンポンプ阻害薬。

PPI使用後は、ベースラインと比較して、伝達性菌種数の有意な増加（中央値9）が観察された（図2A；p=1.02e-04；対の標本に対するWilcoxon順位和検定）。さらに、これらの種の全体的な存在量もPPI使用後に有意に増加した（図2A；p=1.5e-04）。同様のパターンがH2RA使用後にも観察されたが、増加の程度はPPI群と比較して顕著に小さかった（オンライン補足図4B）。

さらに、PPI群とH2RA群の間で、伝播性のある種の有病率の変化を比較した。いずれの群でも少なくとも1検体で経口から腸への感染を示した42種のSGBのうち、37種がPPI使用後に有病率の増加を示したのに対し、H2RA使用後はわずか15種であった。14のSGBが両群で感染有病率の増加を示したが、そのほとんど（12のSGB）はH2RA群よりもPPI群でより高い有病率の増加を示した（図2B；オンライン補足表12）。

PPIによって口腔から腸への感染が有意に高まったことは、同じ参加者の口腔と腸のマイクロバイオーム組成間のBray-Curtis非類似度（BCD）解析によってさらに裏付けられた。ベースライン時のBCDはほぼ1であり、口腔内と腸内細菌叢の組成が異なることが明らかになった（オンライン補足図3B）。しかし、2回の薬剤投与後、同一人物の口腔と腸の微生物組成に有意な変化が認められた。注目すべきは、PPI投与群はH2RA投与群と比較して、薬物使用後のBCDの減少がより顕著であったことである（オンライン補足図3B；ペアサンプルのWilcoxon順位和検定；PPI投与群ではp=4.77e-06；H2RA投与群ではp=0.045）。

驚くべきことに、CRCのマーカーとしてよく研究されているFusobacterium nucleatumが、PPI使用後には参加者の約9%で感染種として同定されたが、H2RA使用後には同定されなかった。F. nucleatumは口腔内に広く存在し、腸に感染すると炎症と免疫回避を促進し、腫瘍増殖に好都合な環境を作り出すことが判明している。また、腸内の免疫細胞や他の細菌とも相互作用し、腫瘍の増殖と転移を促進する免疫抑制環境を促進する43 44。

これらの知見から、PPIはH2RAよりも有意に多くの菌種を経口から腸へ移行させ、その結果、既知のCRC関連マーカーを含むこれらの菌種が腸内でより多く分布することが示された。

PPIは腸内移行菌の増殖を促進する
薬剤の使用が、腸内細菌の増殖を促進または抑制することによって、腸内細菌種の存在量に影響を及ぼす可能性があるかどうかを評価するために、細菌の増殖動態を定量化するPTRという指標を用いた。具体的には、DEMICツールを用いて複製起点からのコンティグの相対距離を推定することで、異なるサンプル間での細菌の増殖速度を正確に評価した31 32。この手法ではシーケンス深度の要求が高いにもかかわらず、1186種のうち355種の増殖速度を定量化することができた（オンライン補足表13）。

PPI使用後、合計5種が有意に増加した成長率（PTR値）を示した。そのうち3種（全体の60％）はPPIが濃縮されたマーカーと重なり、PPIが腸内の感染種の増殖をさらに促進したことを示している（図2C）。注目すべきことに、PPIはStreptococcus thermophilusやStreptococcus rubneriのような非メーカー菌種の増殖も促進する。一方、H2RAの使用はこれらの種の増殖に有意な影響を与えなかった（図2C）。

PPIの使用によって観察されたこれらの効果は、薬剤と微生物叢の直接的な相互作用、あるいは微生物叢内の相互作用に起因する可能性があることに注意することが重要である。

PPI誘発腸内細菌マーカーは複数の疾患リスクと関連する
PPI誘発およびH2RA誘発の経口-腸管伝達種に関連する疾患リスクにアクセスするために、腸内細菌由来の疾患マーカー関係のリポジトリであるGMrepo V.2データベース37を検索した（方法のセクションを参照）。PPIまたはH2RAのいずれかによって誘導された42種の伝達性菌種のうち、22種が26のコホートで収集された疾患集団で有意な濃縮を示し、心血管疾患（CVDs）、クローン病、肝硬変、IBDs、COVID-19、CRCなどの16疾患に対応した（図3；オンライン補足表7）。22種のうち、10種はPPI誘導性で15疾患と関連し、4種はH2RA誘導性で11疾患と関連していた。特筆すべきことに、これらの種のいくつかは、対応する疾患の発生と進行に関与することが検証されている。例えば、S. anginosusは、我々の研究において8つの異なる疾患に濃厚であることが同定され、Streptococcus constellatus（42種の感染性菌種の1つで、PPI使用後に高い感染有病率を示した）およびStreptococcus intermediusとともに、Streptococcus anginosus group（SAG）を構成している。このグループの細菌は、化膿性感染症や悪性腫瘍の発生の原因となる46 47。腸から他の臓器に移動し、肝膿瘍や心内膜炎などの広範な感染症を引き起こすことがある。さらに、8973人の参加者を対象とした横断研究では、S. anginosusとS. oralisが冠動脈カルシウムスコアと強い関連性を示し、CVDのリスクが高いことが明らかになった49。この研究では、PPIマーカーとして検出されたS. parasanguinisやStreptococcus gordoniiを含む他の関連菌種も同定され、私たちの研究でも他のいくつかの疾患と関連している。

図3
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図3
GMrepoデータベースによる、口腔から腸への感染種と疾患リスクとの関連。少なくとも1人の参加者で経口から腸への感染を示した種を示した。ヒートマップは、GMrepoデータベース（「方法」のセクションを参照）によると、対応する生物種が疾患群で濃縮されたプロジェクトの数を示している。ヒートマップの上の棒グラフは、各疾患で濃縮された種の総数を表示します。右側の棒グラフは、対応する生物種が濃縮された疾患の総数を示している。黄色い点はPPIマーカー、青い点はH2RAマーカーを示す。AS、強直性脊椎炎、ASD、自閉症スペクトラム障害、CD、クローン病、CRC、大腸がん、CVD、心血管疾患、H2RA、ヒスタミン2受容体拮抗薬、IBD、炎症性腸疾患； IgG4、免疫グロブリンG4関連疾患、LC、肝硬変、NAFLD、非アルコール性脂肪性肝疾患、PPI、プロトンポンプ阻害薬、RA、関節リウマチ、SSc、全身性硬化症、T2D、2型糖尿病、UC、潰瘍性大腸炎。

これらの結果は、PPIの使用によって誘発される特定種の経口から腸への伝達が、H2RAと比較してより広範な疾患リスクに寄与している可能性を示唆している。これらの伝達種と様々な疾患との間に同定された関連は、疾患感受性を形成する上でPPIによって誘導される腸内細菌叢の変化が潜在的に重要であることを強調している。

考察
主な所見
本研究の目的は、広く使用されている2種類の胃酸分泌抑制薬、PPIとH2RAが腸内細菌叢と経口から腸への感染に及ぼす影響を調査し、比較することである。健康なコホートを用いた縦断的アプローチを採用することで、疾患の状態や個人差などの潜在的交絡因子を軽減し、これらの薬剤が腸内細菌群集に及ぼす影響について確実な知見を得ることができた。

その結果、PPIの使用はH2RAと比較して、腸内細菌叢を破壊する作用がより顕著であることが明らかになった。PPIは経口から腸への感染をより広範囲に誘導し、腸内の経口種の存在を促進した。さらに、薬剤の影響を受けた可能性のある、特定の経口および在来の腸内微生物の増殖速度の増加が観察された。注目すべきことに、これらの感染種のいくつかは様々な疾患に関与しており、PPIによる腸内細菌叢の変化と疾患感受性との間に関連性がある可能性を示している。例えば、CRCのバイオマーカーとして知られるF. nucleatumが、経口から腸管への伝播後にPPI投与群でのみ検出されたことは、疾患リスクの増加におけるF. nucleatumの役割の可能性について懸念を抱かせる。さらに、PPI誘発マーカーはH2RAよりも多くの疾患と関連している。

先行研究との比較
PPIの腸内マイクロバイオームシグネチャー（微生物バイオマーカー）は、ForslundらのMetaCardisコホートのような横断コホートで以前に報告されている17。潜在的な交絡因子に対処するため、彼らは複数の薬剤と危険因子を考慮し、単変量バイオマーカー解析のデコンファウンディングのためのポストホックテストアプローチを採用した。本研究では、Forslundらの結果と我々の結果を比較した（Methodsのセクションを参照）。解析の結果、MetaCardisと我々の研究間のPPIマーカーの重複と相違の両方が明らかになった（図4；オンライン補足表14）。

図4
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図4
本研究で同定された腸内のプロトンポンプ阻害薬（PPI）シグネチャーとMetaCardisコホートのシグネチャーの比較。棒グラフはマイクロバイオームの特徴に対するPPI介入のエフェクトサイズ（クリフデルタ）の大きさと方向を示す。太字の分類群名は、これらの分類群の濃縮方向が両研究で一致していることを表している。

具体的には、21の種レベルのマーカーのうち4つ（前のセクションで言及した20のマーカーと、PPI使用後に枯渇したTuricibacter sanguinisという名前の1つのマーカー）が、MetaCardisコホートのマーカーと重複していた。重複したマーカーには、口腔と腸の両方に共通して存在するStreptococcus属とVeillonella属に属するS. parasanguinis、S. anginosus、S. salivarius、Veillonella parvulaが含まれていた。Rothia属もまた、両試験においてPPI介入群で一貫した濃縮を示した。

しかしながら、Haemophilus属、Lactobacillus属、Actinomyces属のようないくつかの属はMetaCardisコホートにおいてのみ差次的に存在し、Weissella属、Enterobacter属、Klebsiella属のような他の属はPPI群においてのみ差次的に存在した。さらに、MetaCardisのコホートでは、PPI非使用者で濃縮された菌種はBifidobacterium longumであったが、我々の研究では、PPI群でベースライン時に濃縮された菌種はT. sanguinisであった。これらの相違は、縦断的解析と横断的解析、疾患コホートと健常コホートといった研究デザインの相違を反映していると思われる。

本研究の長所と限界
本研究にはいくつかの長所がある。第一に、我々は健康なボランティアのコホートを採用し、疾患や個人差を含む交絡因子の影響を軽減するために縦断的研究を実施した。これにより、真のPPIマイクロバイオームマーカーを同定することができ、他の研究者が患者コホートにおいて疾患関連マーカーを同定する際に、PPIマーカーを除外することを検討する懸念が生じた。第二に、多くの研究は主に口腔または腸のマイクロバイオームに焦点を当てており、口腔内細菌の存在に関する記述はあっても、腸内細菌が口腔内で濃縮される根本的な原因は無視されていることが多い。対照的に、我々の研究は消化管の両端を包括的に扱っており、胃酸分泌抑制剤が口腔から腸への感染過程にどのように寄与しているかに光を当てている。第三に、H2RAがヒトの口腔内および腸内細菌叢に及ぼす影響を調べた研究は少ない。本研究では、これらのマイクロバイオームに対するH2RAによる障害を評価し、症状が軽度であれば、臨床の現場ではPPIよりもH2RAを選択することが可能であることを実証した7 11。最後に、唾液サンプルには宿主DNAがかなり混入しているため、口腔マイクロバイオームのプロファイリングにはショットガンシーケンスではなく、16S rRNA遺伝子シーケンスが採用されている研究が大半であり、腸内に濃縮された細菌が本当に口腔由来であるかどうかを種や株のレベルで判断することは困難であった。本研究では、すべての唾液サンプルに対してショットガンシークエンシングを実施し、菌株レベルでの詳細な解析のための十分なデータを作成した。

この研究にはいくつかの限界もある。しかし、PPIやH2RAの長期にわたる使用や過剰な使用は臨床において一般的であり、長期的なリスクにつながる可能性があることを認識することが重要である。長期にわたる薬効を検討するためには、明確な適応がない限り、長期にわたるRCTを実施するよりも、PPIを服用しなければならない患者を対象とした観察研究や介入研究を検討する方が適切かもしれない。また、PPIとH2RAの標準的用量の胃酸抑制効率が異なることが、観察された違いに寄与している可能性がある51 52。にもかかわらず、臨床的な観点からは、微生物叢への影響を評価する際に、それぞれの胃酸抑制レベルのみに基づいて評価するよりも、これら2つの薬剤の推奨用量を比較する方がより有意義である。第二に、両群間の潜在的交絡因子を最小化するため、本研究の対象年齢を18〜45歳に限定したが、これは高齢者集団に対する本研究結果の一般化可能性を制限する可能性がある。最後に、血液サンプルの採取、トランスクリプトームやメタボローム解析、サンプルの物理的・化学的特性の評価は行っていない。これらのマルチオミクスデータを統合することで、我々の知見をさらに実証できる可能性がある。我々の知見を拡大し、より強固なものにするためには、今後の研究にこれらの側面を取り入れることが不可欠である。

結論として、本研究は、PPIがH2RAよりも腸内細菌叢および口腔から腸への伝達に大きな影響を与えるという証拠を提供し、PPIに関連する特定の疾患の高いリスクの根底にある潜在的なメカニズムを明らかにした。われわれの結果は、PPIの使用に注意する必要性を強調し、H2RAなどの代替治療法を検討することの重要性を強調するものである。しかし、H2RAの長期使用が腸内細菌叢に及ぼす影響とヒトの健康への影響を解明するためには、関連する研究がまだ限られているため、さらなる研究が必要である。

補足資料
[gutjnl-2023-330168supp002.pdf]
データの利用可能性に関する声明
データは公開のオープンアクセスリポジトリで入手可能である。本研究に関連する全てのデータは論文に含まれるか、補足情報としてアップロードされている。本研究で報告されたシーケンスデータは、China National Center for Bioinformation (CNCB)-National Genomics Data Center (NGDC)のBioProject accession number PRJCA016454で利用可能になっている。その他のデータはすべて、本原稿およびその補足ファイルから入手可能である。本論文で行ったすべての解析を記述したソースコードはオンラインで入手可能である（https://github.com/whchenlab/PPI-vs.-H2RA-effects-on-gut-microbiome）。

倫理声明
出版に関する患者の同意
該当なし。

倫理承認
本研究はヒトを対象とし、華中科技大学の臨床試験倫理委員会（決定番号：2021-S305-1）により承認された。本研究のすべての側面および利用可能な代替介入について十分な説明を行った後、すべての参加者から書面によるインフォームド・コンセントを得た。

謝辞
我々は華中科技大学同済医科大学連合病院の臨床医Desheng Hu氏の親切な示唆に感謝したい。本研究にご協力いただいたすべての方々に感謝する。サンプル採取の際に協力してくれたJunan Chen、Na L Gao、Mingyu Wang、Yingjian Wu、Yun Y Li、Huarui Wangに感謝する。

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補足資料
補足データ
このWebのみのファイルは、著者から提供された電子ファイルからBMJ Publishing Groupが作成したものであり、内容の編集は行っていない。

データ補足1
データ補足2
データ補足3
データ補足4
データ補足5
データ補足6
データ補足7
脚注
寄与者 研究のコンセプトとデザイン： W-HC。被験者募集： JZ、CS。無作為割付け配列作成： ML。参加者の割り付け： GH。サンプル収集： JZ、CS、ML、GH。データ収集： データ収集：JZ。データの解析と解釈： W-HC、JZ。原稿作成： JZ。原稿の改訂： W-HC、X-MZ。最終原稿は著者全員が承認した。W-HCは本研究を監督し、保証人である。

資金提供 本研究は、中国国家重点研究開発計画（2019YFA0905600、2020YFA0712403）、NNSF-VR中スウェーデン共同研究計画（82161138017）、中国国家自然科学基金（T2225015、61932008）、上海市科学技術主要プロジェクト（2018SHZDZX01）、Greater Bay Area Institute of Precision Medicine（広州）（助成金番号IPM21C008）の支援を受けた。

競合利益 なし。

患者および公衆の関与 この研究のデザイン、実施、報告、普及計画に患者および/または公衆は関与していない。

証明および査読 委託ではなく、外部査読を受けた。

補足資料 本コンテンツは著者から提供されたものである。BMJ Publishing Group Limited（BMJ）の審査を受けておらず、査読を受けていない可能性がある。また、査読を受けていない可能性もある。議論されている意見や推奨事項はすべて著者のものであり、BMJが承認したものではない。BMJは、本コンテンツに依拠することから生じるすべての責任および義務を否認します。コンテンツに翻訳されたものが含まれる場合、BMJは翻訳の正確性および信頼性（現地の規制、臨床ガイドライン、用語、薬剤名、薬剤の用法用量を含むがこれに限定されない）を保証せず、翻訳および翻案その他から生じる誤りおよび／または脱落について責任を負わない。

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オンライン ISSN: 1468-3288プリント ISSN: 0017-5749
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