糞便微生物叢移植のためのカプセル化ドナー糞便：Glyprotectプロトコル

糞便微生物叢移植（FMT）は、Clostridioides difficile感染症に対して非常に有効な治療法である。FMTの使用は確かなエビデンスに裏付けられているが、その適用方法は様々である。ncapsulatedFMTは、非侵襲的で患者に優しく、拡張可能な適用方法であり、大腸内視鏡検査や経鼻十二指腸チューブによる適用よりも好まれる可能性がある。

目的

グリセロールベースのカプセルを製造するための詳細なプロトコール、Glyprotectプロトコールについて述べる。

設計：

反復的な品質改善法を用いて、標準的な病院の検査室環境において、最小限の処理でドナーの糞便を凍結保存するための再現性のあるプロトコルとしてGlyprotectプロトコルを開発し、検証した。

方法

グリセロールベースのカプセルを製造するための詳細な標準操作手順（必要なすべての材料とトラブルシューティングガイドラインを含む）を説明する。カプセルの完全性をさまざまな温度とpHレベルで試験した。ローサイトメトリーを用いて微生物叢数と投与量の正確性を測定した。

結果

Glyprotectプロトコールは2500以上のカプセルベースのFMT治療に使用されており、欧州の組織および細胞標準に準拠している。Glyprotectプロトコールは、微生物を保存し、残骸と水分を除去することで提供された微生物叢の変調を最小限に抑えるように最適化されており、FMT治療1回あたりに必要なカプセルの数を減らすこともできる。腸内細菌叢は、凍結保護とカプセルの漏出を防ぐためにグリセロールに保存される。各カプセルには650μLの微生物-グリセロール塊が含まれており、平均2.5×108個の非特定細菌が含まれていると推定される。

結論

Glyprotectプロトコールにより、病院や組織施設は標準的な検査室でカプセルを製造することが可能となり、患者のFMTへのアクセスが改善される。このプロトコールは、大腸内視鏡や経鼻空腸チューブによる液体懸濁FMTよりもカプセルFMTの方が時間と費用がかからないため、FMTサービスのスケーラビリティを促進する。

臨床試験登録：

該当なし。

言語要約

糞便微生物叢移植用カプセル化ドナー糞便の製造プロトコール

糞便微生物叢移植（FMT）のためのカプセル化されたドナー糞便の製造方法の詳細な説明を提供する。MTは腸内細菌叢が損なわれている疾患、特にClostridioides difficile感染症に対して非常に有効な治療法である。カプセル化は患者に優しく、非侵襲的であるが、FMTカプセルの製造プロトコールは公表されておらず、再現性もない。本書では、欧州のヒト由来物質に関する現行の規制枠組みのもとでカプセル製剤を製造できるよう、標準的な設備を備えた病院の検査室向けに詳細なガイダンスを提供する。このプロトコールが普及することで、救命治療への患者のアクセスが増加するであろう。

はじめに

腸内細菌叢移植（FMT）は、健康なドナーから患者へ腸内細菌叢を移植し、乱れた腸内細菌叢を是正する治療法である1。90％以上の有効性が実証されたエビデンスにより、FMTは再発性クロストリジオイデス・ディフィシル感染症（rCDI）を管理する上で重要な治療法として確立されている2～4。

ヒト由来物質（SoHO）であるFMTのためのドナーの糞便は、厳格な倫理的および実際的な規制基準によって管理されている6 、7。このため、健康なドナーから提供された糞便の慎重な取り扱いが必要であり、通常、適切な医学的監視の下、血液・組織センター8で行われるのが最善である。FMTの実施には医師の処方が必要であり、医療専門家によって実施されるべきである9。現代医学で初めてFMTが使用されて以来10、FMTは大きく発展してきた。現在、FMTは、大腸内視鏡11、経鼻十二指腸チューブ12、カプセルなどの洗練された方法で投与するためのFMT成分を提供する、よく組織化された便バンクで管理されている。

カプセル化FMTは、rCDIに対する大腸内視鏡ベースのFMTに匹敵する効果率を示しながら、他の投与方法よりも少ない人員15で実施できる、拡張性のある非侵襲的な治療オプションである2,16。カプセル化FMTに関連する利点があるにもかかわらず、多くのFMTセンターでは、拡張性の可能性が低い内視鏡的処置が依然として好まれている17,18。このような好みは、カプセルの製造に関する普遍的に受け入れられたプロトコルが存在しないこと、およびそのようなプロトコルを開発し検証することの本質的な複雑さによって説明されるかもしれない。さらに、現在発表されているカプセルのプロトコールには、調達、加工、バリデーション、品質要件、実施に関する法的要件を満たすものはない。

本論文の目的は、グリセロールで保存されたカプセル化FMTを調製するためのGlyprotectプロトコルと、高い臨床効果率を示す2500以上のカプセル化FMT成分を調製して得られた経験について説明することである19。標準的な設備を備えた検査室向けに調整されたこのプロトコルは、厳格な品質基準と法的要件を遵守した、検証済みで再現可能なプロトコールである。このプロトコールは、SQUIRE 2.0ガイドライン20（補足表7）に従い、品質改善研究として実施されたものである。

ロトコール開発

Glyprotectカプセルは、デンマークのオーフス大学病院（Aarhus University Hospital）の糞便微生物叢移植センター（Centre for Faecal Microbiota Transplantation：CEFTA）で開発された9。2018年に開始された初期のカプセル製造と検証段階は、訓練を受けた技術スタッフにより研究ラボで小規模に実施された。2020年には、製造プロトコルは改良され、規模を拡大するのに十分なテストが行われた。新しいスタッフは、病院施設の標準業務に組み込まれた公的血液センターの枠組みの中で、日常的な便バンク研究室生産を独自に確立するための訓練を受けた8。

図1. 図1. 2014年にCEFTAが開始されて以来、臨床応用に使用されたFMT成分の年間使用量：（a）は治療場所別、（b）は応用方法別。apsule生産は2018年に導入され、組織確立のスケーラビリティを可能にした。

EFTA, Centre for Faecal Microbiota Transplantation; FMT, faecal microbiota transplantation.

ビューアーのペン

現在の体制では、グリプロテクトFMTカプセルはデンマークの公立病院でrCDI患者を治療する日常診療に組み込まれている。FMTに対する需要の高まりを受けて、カプセルの生産はさらに拡大され、生産率は指数関数的に増加している（図1 ）。現在、CEFTAが提供するFMTの約90％がカプセルを使用している。2023年現在、CEFTAは1865のFMT成分を生産・保存しており、その主なものはグリプロテクトカプセル（n= 1766）と、限られた数の液体ベースの懸濁クライオバッグ（n= 99）である（図2 ）。これらから、2023年には合計1094成分が患者の治療に使用された（図1）。

図2. (a) 経口摂取用にカプセル化されたドナー糞便。b）経鼻空腸チューブまたは大腸内視鏡によるFMT用の液体ドナー糞便懸濁液。

ビューアーペン

臨床試験21およびコホート研究19により、Glyprotectプロトコルの臨床効果と安全性が検証され、臨床試験に依存しない臨床実践において90％を超える治癒率が実証されている。n 2022年、各FMTコンポーネントのコストは881.22ユーロであった。

再臨床

ドナー

すべてのドナーは、以前に説明したように23、デンマークのオーフス大学病院の血液バンクで、欧州の組織・細胞基準に従って募集・審査される。標準的な献便ラウンドでは、献便者は30日以内に5回まで糞便を提供する。献便のたびに、献便者は自分が健康であることを確認する（質問票によるスクリーニング）。糞便と血液は、献体ラウンドの最初と最後の献体でスクリーニングされる。ドナーのトイレ訪問からカプセルの凍結までの時間は8時間で、これはカプセルと液体懸濁クライオバッグの両方に適用される。この時間には、実験室への輸送に最大2時間、実験室での処理に最大6時間が含まれる9。

材料

Glyprotectカプセルのプロトコールは、ヒュームカップボードなどの基本的な設備を備えた標準的な実験室に適合する。全ての手順はヒュームカップボード内で行われ、ホモジナイザーとカプセル充填システムが必要で、これらは入手しなければならない。ホモジナイザーにはSmasher®（BioMérieux, Marcy L'Etoile,France）を、カプセル充填には0 ProFiller 1100と00 ProFiller 1100（100-Hole Capsule Machine, by Capsule Connection, LLC, Prescott, AZ）を使用した。図3にGlyprotectプロトコールに必要な機器をまとめ、補足表1に使用したすべての器具を示す。

図3. カプセル化FMTプロトコルに必要な器具。

MT、糞便微生物移植。

ビューアーのペン

濃縮された糞便微生物群は、Lonza社（Capsugel/Lonza, Colmar, France）のサイズ0の酸に安定なENprotectカプセルとサイズ00のVcaps®Plusカプセルに二重にカプセル化されている。

カプセルの保存は、100mLサイズのバケツ（Duma® ; Gerresheimer, Düsseldorf, Germany）に、適合する蓋（Duma® Twist-Off Closure）をつけて行う。蓋には、-80℃での保存中および解凍中の湿度に耐えるように設計された乾燥剤が内蔵されている。

グリプロテクトカプセル調製用ロトコール

標準操作手順

このプロトコールは、微生物組成の意図的な操作を避けつつ、顆粒と液体を除去して腸内細菌叢を濃縮するように設計されています。グリプロテクトカプセル作製の詳細なステップバイステップのプロトコールは表1に概説されており、補足表2は実験室で使用するための印刷しやすいバージョンであり、補足表3は投与量の計算例を示している。図4はプロトコルの重要なステップを示している。

図1. FMT用ドナー糞便のグリセロールベースのカプセル化懸濁液を処理するための標準操作手順。

目的タスク

再調製文書化

ドナーのID

コンポーネントID

食

排便時刻とラボ到着時刻

検査開始および終了時間

処理時間ブリストル便スケール等級

再サンプルトレーサビリティと研究用にサンプルを保管（数）

処理マニュアル（図4に示す方法）

ステップ 1. 糞便の湿重量を測定する

最終的に調製される成分の予想数を見積もる（1成分あたり湿重量45～50gの糞便を使用する）

糞便重量*（調製に移す量）

スパチュラで約50～100gの糞便をミキサーバッグに入れる。

冷たい生理食塩水で1:2.5の割合で希釈する（プレーンブレンダーバッグの最大容量は400mL）。

ステップ 2. Smasher 120秒（通常モード）でホモジナイズする。

すべての糞便が移送され、ホモジナイズされるまで、上記の操作を繰り返す。

を50mLチューブに分注します。

ステップ 3. 遠心分離 1回目の遠心分離：100g、10分間、4℃で遠心する。

難消化性成分を取り除くデカンテーションを行い、第Ⅰ相＋第Ⅱ相（上清）を適当な大きさの容器または水差しに溜める。

第III相（食物繊維と穀類）を分離する。

プールした懸濁液を50mLチューブにリキッド化する。

2回目の遠心分離 800gで10分間、4℃で遠心分離

微生物から生理食塩水を分離する第I相と第II相の最初の部分をデカントして捨てる

第II相＋第III相に85％グリセロールを1：1の割合で添加する。

チューブの数を減らしていく最初にウッドスターラーでよく混ぜ、次にミニシェーカーでボルテックスする。

グリセロール懸濁液を少ないチューブにプールすることにより、チューブの総数を減らす。

3回目の遠心：遠心分離4890g20分、4℃。

水とスラッジを除去し、微生物を分割するデカントし、第I相＋第II相の最初の部分を捨てる

チューブスケールの容量から85%グリセロール0:0.1（10%）を加える。

まずスパチュラでよくかき混ぜ、次にミニシェーカーでボルテックスする。

ステップ 4. ProFiller®1000ハンドヘルプマニュアルに従って、カプセルプロフィラーを操作する。

カプセルプロフィラー#0にエンプロテクト#0カプセルを補充する。

ピペットチップをグリセロールで覆う。

ミニシェーカーでチューブを回転させながら、チューブ内の微生物-グリセロールの塊をチップに吸い上げる。

2×2mLチューブに約650μL注入する（保存用）

カプセルに注入する（1カプセル650μL入り）

Profiller #00カプセルにVcap Plus #00カプセルを再充填する。

充填した#0カプセルを失い、#00カプセルに移し、#00カプセルを閉じる。

ステップ5 カプセル総数を登録する‡。

保存用チューブの数＋破損の可能性があるカプセルを取り出した数を登録する$。

1カプセルあたりの湿糞便重量を測定する（d）除算；製剤への総糞便量（a）／カプセル数（b）＋保存カプセルおよび取り出された可能性のあるカプセル（c）＝d

FMT成分あたりの予想カプセル数を決定する (e) ～50（成分あたりの予想重量45～50g）/1カプセルあたりの湿糞便重量 (d) =eで割る。

正確なカプセル数に調整する (f) 1成分あたりのカプセル数を必要なカプセル数に調整する =f

1カプセルあたりの湿糞便重量（e）×1FMT成分あたりのカプセル数（f）＝gをかける。

リントとラベルに固有の寄付番号と成分番号を記載する。

計算した量のカプセルをラベル付きバケツに分配し、-80℃で保管する。

ステップ6. リーン石鹸水またはウェットティッシュで目に見える汚れを落とす。

プロフィラー、ラック、容器または水差しは、80℃の食器洗浄機で消毒し、90℃で乾燥させる。

ケール、ミニシェーカー、ピペット、微量遠心分離機、スマッシャー、ヒュームカップボード、遠心分離機は、Wipe Clean Chlorineクロスで消毒を開始し、表面を乾燥させる（塩素雲はその後滅菌水で除去できる）。

-d: FMT治療で使用されるFMT成分のカプセル数の計算とともに、製剤のトレーサビリティーとバリデーションのための有標準物質。

成分ごとのカプセル数と投与量を決定するための変数。計算例を補足表3に示す。

MT, faecal microbiota transplantation.

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図4. FMTのためのドナー糞便の処理。

MT、糞便微生物叢移植。

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実験室に搬入された糞便は、処理されるまで2℃～8℃で保存される。提供された糞便は秤量され、Bristol Stool Scale（BSS）に従って便の硬さが評価され、等級付けされる24。標準的な調製では、FMTの1成分あたり45～50gのグレード3～4の粗糞便が使用される。BSSがこの範囲外の糞便または湿重量が45g未満の糞便は廃棄される。ウェット重量が355gを超える献体は、少なくとも2人の訓練を受けた技術者が目視で完全性を検査する。

すべての寄贈品から安全性の高いサンプルが採取され、微生物レベルでのトレーサビリティを確保すると同時に、再検査や調査が可能になります。無菌便の安全性サンプルは、各寄付ごとに2mLのチューブに採取され、-80℃で保管される。

または処理する場合、まず粗便を滅菌生理食塩水で希釈し、Smasher（BioMérieux社製）を使用して、プレーンブレンダーバッグ内でホモジナイズする。ホモジナイズされた糞便は、3段階の遠心分離で、上層相I、中間相II、下層相IIIに分離される（図4）。各相は、液体と微生物の質量が異なる異なる密度特性を示す。最初の遠心分離ステップでは、大きな顆粒や繊維を除去する。第2段階と第3段階は、液体を除去して微生物相を濃縮し、水分含量の低い微生物相に富んだ懸濁液を確保する。リセロールは3回目の遠心分離の前後に添加される。

カプセルの充填は、ステンレス製充填機と自動ピペットを使用し、各カプセルに650μLずつ充填する。またはカプセル化には、二重カプセル化技術を利用している。微生物群濃縮物はまず耐酸性カプセルサイズ0にカプセル化され、次にサイズ00に二次カプセル化される。

手作業によるカプセル充填と二重カプセル化の後、Glyprotectカプセルは計数、登録され、-80℃で保存できるようにラベル付き乾燥剤バケツに移されます。1回のFMT治療で承認されたカプセル（1つのFMTカプセル成分）の範囲は15～30カプセルで、15～30分以内に飲み込まれる。FMTカプセル成分は、湿重量45～50gの糞便に由来する。

洗浄と消毒は標準操作手順の重要な部分であり、交差汚染を避けることを目的としている。洗浄と消毒は、同じドナーのものであろうと、異なる2人のドナーのものであろうと、各処置の前後に行われる2段階のプロセスである。第一段階は、目に見える汚れを落とすことである。第二段階は、適格な食器洗浄機または塩素系ウェットティッシュのような適切な方法を用いた消毒であり、その後70％エタノールを塗布する。

記録、放出、トレーサビリティ

各FMT成分の調製を通して複数のデータを登録・収集することは、製造とカプセル製品を追跡・検証する際に有用である。これにより、データ主導の学習が可能になり、潜在的なトラブルシューティングが容易になります。各ドネーションについて、十分な重量とBSS評点が収集され、各重要工程での測定値が文書化される（補足表2）。各カプセル中の糞便含有量（湿重量として記載）およびFMT成分あたりのカプセル数は、これらの測定値を用いて計算することができる。

すべてのスクリーニング検査が承認されるまで、FMT成分は別の冷凍庫に隔離される。

MT成分の調製、承認後の放出、完全なトレーサビリティーのためのデータは、血液成分に使用されるのと同じシステム、すなわち全国規模の血液バンク登録システムに記録される。このシステムは、規制当局の組織・細胞規格に準拠している。血液成分は、ISBT128コード体系に基づき、固有の献血コードと成分番号でラベル付けされる。成分番号は、ドナーの識別、提供日、当該便提供の成分数とリンクしている（表1）。

カプセルの保管

グリプロテクトカプセルは、成分ごとに計算されたカプセル数に基づいて包装され、乾燥剤入りの蓋付きバケツ（1バケツはFMTカプセル1成分）に分配されます。トレーサビリティを確保するためには、対応する成分番号のバケットラベルが不可欠である。FMTカプセルの入ったバケツは、スクリーニングの結果、成分の放出を進めるか廃棄するかを決定するまで、別の-80℃冷凍庫に隔離される。放出されたバケットは、放出保管用冷凍庫に移され、臨床効果を損なうことなく、提供日から最長2年間-80℃で保管される。

FMTの前日には、解凍時間を短縮し、外側のカプセルにひびが入るリスクを防ぐため、FMT成分を-80℃から-20℃の冷凍庫に移すことをお勧めします。カプセルが-20℃で保存されれば、少なくとも4週間は安定である18。-80℃から直接解凍した後、いくつかのコンポーネントでカプセルのひび割れが観察されたが、-80℃から直接解凍した場合と-20℃を経由して徐々に解凍した場合のひび割れカプセルの数を定量化する正式な研究は行っていない。また、-20℃での長期保存が実際に可能かどうかも検証していない。

完全に解凍されたカプセルは、カプセルの崩壊を防ぐために4時間以内に使用すべきである。

規制基準の遵守

国際的な専門家グループによる技術ガイダンスは、経験交流を通じて品質向上を促進し、標準化する。

腸内細菌叢の採取と処理に関する技術的ガイダンスは、欧州評議会医薬品・医療品質総局（EDQM）が2019年に発行した「ヒトに適用する組織・細胞の品質と安全性に関する手引き」第4版で確立され、最近発行された第5版でさらに詳しく説明されている7。最新版には、液体懸濁液とカプセル化FMTの両方のモノグラフが含まれている。さらに、欧州連合（EU）の血液・組織・細胞規制（Blood, Tissues and Cells regulation）6にSoHOとしてのドナー糞便の統合が提案されており、ドナー糞便と糞便由来製品のヒトへの適用に関する規制領域がさらに明確化されることになる。FMTの使用に関する欧州のネットワークに参加することで、マイクロバイオーム治療の質と安全性をさらに向上させることを目指す25。

バリデーション研究

カプセルの完全性

Glyprotectプロトコールで使用したカプセルは、ENprotect（内側）とVCap Plus（外側；Lonza/Capsugel, Colmar, France）である。グリコールで保存された糞便製剤を経口投与するためのGlyprotectプロトコールとの適合性を確保するため、これらのカプセルを事前に規定された基準に照らして検証した。内側カプセルのENprotectは、酸性条件下でグリセロールと便の混合物を漏らすことなく確実に封じ込める能力を試験した。外側カプセルのVcap Plusは、凍結融解サイクルに対する耐久性、摂取前の表面清浄度、胃酸に対する初期耐性を評価した。

ENprotectカプセルは、室温および-80℃からの解凍後に評価され、仕様要件は4時間後に目に見える漏れがなく、へこみが最小限であることであった（補足表4および補足図1）。ENprotect #0およびVcap Plus #00カプセルの耐酸性試験では、酸性（pH 1.5）、胃液（pH 1.5またはpH 1.0）、水（pH 7）または胃液（pH 6）のさまざまなpH溶液に1カプセルを並行して浸漬した。カプセルは、胃の通過と小腸での溶解をシミュレートして、4時間まで酸および胃液に漏れずに耐え、2時間後に中性pHで溶解することが期待された（補足表5および6、補足図2）。試験されたカプセルは要求された仕様を満たしていた。

微生物群数と投与量の測定

ローサイトメトリーで測定した微生物叢数は、プロトコール開発中のバリデーションマーカーとして機能し、微生物濃度の変化に関する洞察を提供した。4つの異なるドナーからの非処理湿糞便および最終的なグリプロテクトカプセルのサンプルを、フローサイトメトリー用LIVE/DEAD™ BacLight™ Bacterial Viability and Counting Kit（Invitrogen, Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA）のSYTO9（SYTO™9緑色蛍光核酸染色剤のみ）緑色蛍光核酸染色剤（SYTO9）でDNA染色した。各サンプルは二重測定で分析され、多様な濃度で一貫して調整された。その後、プロトコールに従ってSYTO9で染色する前に、サンプルを1:10,000に希釈した。染色したサンプルを15分間インキュベートし、直ちにMACSQuant Analyzer 10（Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, Germany）で488 nmの青色レーザーを用いて分析した。SYTO9のカウントは主に、サイズ評価とフローサイトメトリーの感度に基づく微生物カウントを反映している。まで、SYTO9はすべてのウイルス、真菌、小胞DNAを染色する。サンプルの多様性と複雑性のため、カウントはSYTO9染色のみに基づいており、生存率や特定の微生物の生死比は反映していません。

ドナーの生の糞便の湿重量と粘度は、含水量や残渣によってかなり異なるため、処理前の生の糞便の重量と最終処理後のカプセルあたりの重量に対する微生物密度を反映して、微生物群カウントを定義された体積単位に標準化した。その結果、湿った非加工の糞便では微生物数のばらつきが大きく、加工後はばらつきが小さくなることがわかった。このことは、処理後の微生物数はより同等で、ドナー依存性が低いことを示している（図5）。重複の変動はごくわずかであり、重要ではなかった。すべてのカプセルが650μLまで均等に充填されていると仮定すると、1カプセルには標準化単位あたり2.48×108個の微生物が含まれていると推定される（表2）。

図5. FMTのためにドナーの糞便を処理する前（粗糞便）と処理した後（最終製品）の4人のドナーの微生物叢数の中央値（counts/mL）を示すoxplot。

MT、糞便微生物叢移植。

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できる 2. FMT用カプセル処理中の各工程における微生物叢数および処理中の細菌損失。

ドナー湿潤非処理糞便、1mLあたりの平均菌数×108（CV％）グリプロテクト質量、1mLあたりの平均菌数×108（CV％） 650μLを含むカプセル×108あたりの予想微生物数調製中の微生物損失（％）ドナーA 6.77（1.1）（1.1）（1.1

ドナー A 6.77 (1.3) 5.22 (3.0) 3.40 28

ドナー B 8.08 (2.4) 3.20 (2.3) 2.08 60

ドナーC 15.53 (1.1) 3.27 (0.5) 2.12 79

ドナーD 9.15 (2.9) 3.55 (1.5) 2.31 61

平均値 9.88 3.81 2.48

D 3.89 0.96

各サンプルの0.1g±10%を生理食塩水で希釈し、総重量が10gになるようにした。菌懸濁液は、製造元の指示に従ってSYTO™ 9 Green Fluorescent Nucleic Acid Stainで染色し、フローサイトメトリーで細胞数を測定した。サンプルは二重に分析し、CV%はアッセイ内変動を表す。

Vは変動係数、FMTは糞便微生物移植。

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プロセス全体の標準化は、カプセル製造の堅牢性と再現性を最適化することを目的としている。しかし、ばらつきは存在する。50gの粗ドナー糞便から得られるカプセルの数は、FMTカプセル1成分に相当し、通常15～30カプセルの間で変動するが、この数を超えることもある。この範囲から外れても、自動的に献体を廃棄することにはならない。臨床医とテクニカルスタッフが緊密に協力すれば、範囲外のサイズのFMT成分がFMTに使用されることもある。例えば、低用量に耐えられる患者や、ごくわずかなカプセルしか飲み込めない患者には、カプセルの数が少ないFMTカプセルコンポーネントを使用することができる。FMTカプセル成分の30カプセルという上限は任意であり、30カプセルの臨床効果が観察されたパイロット試験後に選択された。私たちのCDI患者コホートからの分析によると、FMTコンポーネントごとのカプセル数のばらつきや、適用範囲内での異なるプロトコルのバージョンの使用は、臨床結果に影響を及ぼさなかった19。

トラブルシューティング

蓄積された処理経験から、予期せぬ結果を処理し、課題に取り組み、軽微な逸脱を処理するためのいくつかの対策を提案する。表3は、トラブルシューティングと問題解決のためのこれらの提案をまとめたものである。

表3. FMT用カプセル処理中のトラブルシューティング。

問題解決策

献体重量が355gを超える、つまり正常な便量の基準を超えている。セカンドオピニオンで献体を評価する。

献体の外観がBristol Stool Scaleで3-4以内の正常なものであれば、処理を承認する。

各相の区別が難しい 1. 最初の遠心分離後、便中の液体、未消化の食物の残り、特定の食物により、相の体積にばらつきが生じることがある。

. 食物繊維や穀類を除去するもうひとつの分離方法は、ホモジナイズ時にプレーンバッグの代わりにフィルターバッグを使用することで、最初の遠心分離ステップをバイパスすることである。

. 一般的に、2回目の遠心分離後、変動はしばしば第II相に関連する。第II相の現れ方は様々である：

a) 濃く暗い相

b) 「カフェラテ」のように見える。

c）表面がゴツゴツしている

d) 第Ⅰ相と第Ⅱ相の区分が存在しない。

相を区別するルーブルは、各成分の最終的なカプセル数に影響する可能性がある。

カプセルの数は、予想されるカプセルの数、すなわち1成分あたり15～30カプセルから変動する。成分あたりのカプセルの数の変動は避けられず、主に遠心分離中に得られた相で観察された変動に左右される。

45～50gの便から成分を得るには、30カプセル以上が必要。1カプセルあたりの糞便量に30カプセルをかけると、成分あたりの糞便総量が算出される（表1）。

45-50 gの便から作られた成分では、15カプセル未満しか得られない。 12カプセルしか得られないことは珍しくない。12カプセルにとどまることも珍しくないが、これは加工時に除去された食物繊維や穀物の量に起因することがある。カプセル数が12カプセルを下回るようになった場合は、ドナーの献便履歴を確認し、以前の献便と比較して不一致がないかを確認することをお勧めします。

グリセロールと微生物の塊が乾燥して粘度が高く、ピペットチップに吸引できない。グリセロール85％を滴下し、よく混ぜる。そうすることで、カプセルの充填が容易になります。

グリセロールを多めに添加すると、成分あたりの最終的なカプセル数に影響する場合があります。

製造中にカプセルが割れるグリセロールと微生物の塊をカプセル化する際、一部のカプセルが割れることがある。これは主に、カプセルの先端を押し下げてカプセルを閉じるときに起こります。割れたカプセルは交換することができる。

形成されたカプセルは廃棄し、凍結後のサンプルとして含めることができる。

1カプセルあたりの糞便量の計算には、廃棄されたカプセルをすべて含めてください。

解凍後、カプセルのサイズ#00にひびが入る未使用のカプセルに手が届く場合は、ひびが入った#00のカプセルを交換する。

カプセルの交換が不可能な場合は、割れたカプセルを廃棄してその成分がまだ使用できるかどうかを判断し、使用できない場合はその成分を別の成分と交換する。

使用可能かどうかは医師が判断する。

清潔でないカプセル不用意な滴下により清潔でない#0カプセルは、#00カプセルに封入する前にティッシュで拭くことができる。

カールまたは溶解したカプセル使用前にプロフィラーが清潔で完全に乾いていることを確認してください。

グリセロールと微生物の塊が湿っているように見えるが、これは2回目と3回目の遠心分離ステップで液体が十分に除去されていない可能性がある。

MT、糞便微生物移植。

ビューアーにペン

考察

日常診療で大規模に使用されるFMT用の、グリセロールで保護されたドナー腸内細菌叢カプセルを処理するための、詳細かつ操作的で再現可能なプロトコールについて述べる。このカプセルの使用と臨床的有効性は、日常的および実験的な臨床使用19や最近発表された臨床試験21で検証されている。

腸内細菌叢のヒトへの応用は、依然として課題となっている。このプロトコールでは、各FMT成分には50gの粗ドナー糞便から濃縮された腸内細菌叢が含まれており、主に水分と残渣を除去した後、1成分あたり15～30カプセルを得ることができる。出発点は同じであったにもかかわらず、カプセルの数が15から30まで変化したため、廃棄物の量やその後の微生物叢の損失が異なり、顕著なばらつきが観察された。湿った非処理の糞便と比較すると、微生物叢数が最も多い献体は、処理中に微生物叢が最も失われた献体でもあるようだった。粗糞便のばらつきとそれに続く段階はカプセル含量に影響を与えるが、最初に提供された湿重量糞便から最終製品、すなわちグリセロール-微生物塊の塗布まで、微生物の損失は均等であることが観察された。この結果、別々に提供されたカプセルの微生物数が揃うかもしれないが、微生物数の解釈には注意が必要であり、微生物組成を反映しているわけではない。処理中にどの微生物が残り、どの微生物が廃棄されるのか、そしてこのことがFMTの臨床効果にどのような影響を及ぼすのかについて理解を深めるためには、より広範な調査が必要である。

微生物計数のためにサンプリングする際、異なる微生物密度を補正するためにいくつかの試みを行った。食物繊維と未消化の食物は、湿った糞便のばらつきの一因となる可能性があり、ピペッティングに最適な粘度を得るために不可欠なグリセロールの動的添加は、カプセル充填のための懸濁液量のばらつきの一因となり、したがってカプセル数に影響する。グリセロールは最終的な遠心分離段階の前に添加されるため、カプセル中の正確なグリセロール濃度を決定することはできない。最終的には、製品のばらつきを最小限に抑え、標準的なFMT投与単位を確立するために、粗糞の湿重量測定に頼るのではなく、液体と残渣の最初の除去後の微生物数に基づいてFMTの投与量を決定するのが好都合であろう。このアプローチにより、カプセル容量あたりの微生物数に基づいて投与量を決定することが可能になり、FMT投与のより正確な投与量測定が可能になる。

本研究では、新鮮な糞便とFMTカプセルから細菌数を測定することにより、処理中の細菌損失を評価した。その結果、カプセルのバリデーションを改善するための新たな知見が得られた。今後の研究では、FMTカプセル、新鮮な糞便および輸液用懸濁液中の生菌数の計数を含め、カプセルの量と組成に関するより多くのデータを提供する必要がある。また、カプセル処理のさらなる開発と標準化に貢献し、異なる適応症に対するカプセル化FMTと液体懸濁液FMTの臨床効果に関連付けることができるであろう。

適用されるカプセル中の水分含量を最小限に抑えることは、1回の治療に必要なカプセル数を減らし、カプセルの安定性を高めるために極めて重要である。グリセロールで保存されたドナー糞便の使用と遠心分離による水分除去について説明する。さらにプロトコルを最適化すれば、凍結乾燥により水分含量をさらに最小化できる可能性がある。さらに、凍結乾燥に必要な装置は高価であるが、凍結乾燥の方が保存条件の制約が少ないかもしれない。臨床的有効性を向上させるためのベンチマークを設定するために、特に処理中に微生物を保存することを目的とした、追加の改善ステップを調査すべきである。

ドナーの募集、ドナーのスクリーニング、検査室での処理、臨床応用のためのスケーラブルなシステムは、ルーチンおよび実験的適応におけるFMTの需要の増大に対応するために極めて重要である。我々の経験では、この目標を達成するためには、カプセル化されたFMTのプロトコールを実施する必要がある。同時に、このプロトコールを維持しながらも、劇症型C. difficile大腸炎に続発するイレウスのような嚥下困難や腸へのアクセスが悪い患者には、液体懸濁液FMTの利用が不可欠であることに変わりはない。また、FMTの臨床的または実験的適応に応じて、異なる投与量または適用形態を検討する必要があるかもしれない。カプセルと液体懸濁クライオバッグを比較すると、糞便湿重量投与量の増加により、カプセルの微生物数の減少を補うことができる可能性がある。いずれにせよ、FMTサービスを完全に運用するためには、患者の多様なニーズに応えるために、組織施設と臨床サービスとの緊密な連携が必要である3。

結論として、本論文は、標準的な設備を備えた検査施設が、確立された基準に従って、粗糞をカプセル化されたFMTに変換することを可能にする、徹底的かつ運用可能なプロトコルを提供するものである。このプロトコールを実施することで、この治療法に対する患者のアクセスが向上する可能性がある。

謝辞

著者らは、糞便微生物移植センター（CEFTA）における患者治療およびプロトコール開発のために糞便を提供してくれた自発的ドナーに感謝する。また、CEFTAの開発研究室および製造研究室のすべての技術スタッフ、ならびにCEFTAでFMTの適用に携わった臨床スタッフに感謝する。

RCID iDs

ara Ellegaard Paaskehttps://orcid.org/0009-0006-7469-9995

imon Mark Dahl Baunwallhttps://orcid.org/0000-0002-5135-7435

hristian Lodberg Hvashttps://orcid.org/0000-0001-7973-7184

脚注

本研究に糞便を提供したドナーはすべて、オーフス大学病院の血液センターを通じて募集された自発的かつ無報酬の糞便ドナーである。ドナーは、提供された糞便を研究に使用することについて、書面によるインフォームド・コンセントを行った（Central Denmark Region Research Ethics Committees, j.no. 1-10-72-70-22）。本研究は、Central Denmark Regionの研究ディレクトリ（1-16-02-15-23）に登録されている。

患者に関するデータは報告されていない。

著者貢献MetteMejlby Hansen:概念化; データ管理; 形式分析; 調査; 方法論; 資料; ソフトウェア; 原稿執筆; 査読・編集.

ina Rågård：データキュレーション、調査、検証、視覚化、執筆-原案。

iaWinther Andreasen：データキュレーション、形式分析、調査、方法論、リソース、執筆-レビューと編集。

ara Ellegaard Paaske：口頭分析、方法論、検証、執筆-レビューと編集。

フレデリック・ダーラップ 概念化；データキュレーション；資金獲得；リソース；監督；執筆-校閲・編集。

usan Mikkelsen:調査; 方法論; リソース; 執筆 - 査読と編集。

クリスティアン・エリクストラップ 概念化；資金獲得；資源；執筆-校閲・編集。

イモン・マーク・ダール・バウンウォール：資金獲得、調査、方法論、ソフトウェア、監修、検証、執筆-校閲・編集。

Hristian Lodberg Hvas：概念化；資金獲得；調査；方法論；プロジェクト管理；資源；監督；執筆-校閲・編集。

資金提供著者らは、本論文の研究、執筆、および/または出版に関して、以下の資金援助を受けていることを明らかにした： C.L.H.の研究はInnovation Fund Denmark（助成金番号8056-00006B）の助成を受けた。.L.H.は、ノボノルディスク財団から助成を受けている（助成金番号：NNF22OC0074080）。

利益相反著者らは利益相反がないことを宣言する。

データおよび資料の利用可能性著者らは、完全な透明性と再現性を確保するため、本論文の補足資料において、関連するすべてのデータおよび方法の説明をオープンに利用できるように努めた。さらなる情報やデータが必要な場合は、対応する著者にリクエストすることができる。データへのアクセスには、プロジェクトおよび申請者が、該当する場合には地域保健研究倫理委員会およびデンマークデータ保護庁の許可を得る必要がある。

参考文献

. llegretti JR, Mullish BH, Kelly C, et al. The evolution of the use of faecal microbiota transplantation and emerging therapeutic indications. ancet2019; 394: 420-431.

糞便微生物叢移植のためのカプセル化ドナー糞便：Glyprotectプロトコル