炎症性腸疾患における糞便メタボロームとその決定因子の解明

2023年3月27日 23:25

炎症性腸疾患（Inflammatory bowel disease
オリジナル研究
炎症性腸疾患における糞便メタボロームとその決定因子の解明

https://gut.bmj.com/content/early/2023/03/22/gutjnl-2022-328048

http://orcid.org/0000-0003-4691-5583Arnau Vich Vila1,2、
http://orcid.org/0000-0002-1190-0325Shixian Hu1,2,
http://orcid.org/0000-0002-3503-9971Sergio Andreu-Sánchez2,3,
http://orcid.org/0000-0003-3743-1544Valerie Collij1,2,
Bernadien H Jansen1、
http://orcid.org/0000-0002-1862-6699Hannah E Augustijn2、
http://orcid.org/0000-0001-6036-0831Laura A Bolte1、
Renate A A Ruigrok1,2、
ガレブ・アブ・アリ4、
Cosmas Giallourakis4、
ジェシカ・シュナイダー4、
ジョン・パーキンソン4．
アマル・アル・ガラウィ4、
http://orcid.org/0000-0002-4574-0841Alexandra Zhernakova2,
http://orcid.org/0000-0003-2119-0539Ranko Gacesa1,2,
http://orcid.org/0000-0001-5578-1236Jingyuan Fu2,3,
http://orcid.org/0000-0001-7928-7371Rinse K Weersma1
Rinse K Weersma教授（Department of Gastroenterology and Hepatology, University Medical Centre Groningen, Groningen, 9713 GZ, The Netherlands）; r.k.weersma@umcg.nl; Dr. Arnau Vich Vila; arnauvich@gmail.com に対応しています。
アブストラクト
目的炎症性腸疾患（IBD）は、クローン病や潰瘍性大腸炎など、多因子にわたる免疫介在性の腸の炎症性疾患である。糞便中の代謝物の特徴を明らかにし、糞便メタゲノミクス、宿主遺伝学、臨床的特徴を組み合わせることで、IBDにおける代謝の変化を解明することを目的とした。
デザイン IBD患者424名と非IBD対照者255名の便サンプルにおいて、1684種類の糞便代謝物および8種類の短鎖脂肪酸と分岐鎖脂肪酸を測定しました。回帰分析により、症例と対照の代謝物濃度を比較し、代謝物と各参加者のライフスタイル、臨床的特徴、腸内細菌叢の構成との関係を明らかにした。さらに、糞便中の代謝物濃度について、ゲノムワイド関連解析を実施した。
結果 IBD患者の糞便中に差分的に多く含まれる300以上の分子を同定した。スフィンゴ脂質とL-ウロビリンの比率は、IBDと非IBDを識別することができた（AUC=0.85）。また、微生物群集の形成不全を有する患者では胆汁酸プールに変化が見られ、糞便メタボロームと腸内細菌叢の間に強い関連があることがわかった。例えば、Ruminococcus gnavusの存在量は、トリプタミン値と正の相関がありました。さらに、代謝物と食事パターンとの間に158の関連、NAT2付近の多型がコーヒー代謝と強く関連していることがわかった。
結論今回の大規模解析では、食事や手術歴など一般的に見過ごされている交絡因子とは無関係に、IBD患者のメタボロームにおける変化を同定した。マイクロバイオームが糞便中の代謝物に及ぼす影響を考慮すると、本結果は腸の炎症を標的とした将来の介入に道を開くものである。
データの利用可能性に関する声明
データは、合理的な要求があれば入手可能です。糞便代謝物のレベルと細菌分類の存在量を含む表は、原稿に添付されている。本研究で使用したメタゲノム、宿主ゲノム、表現型の生データは、European Genome-Phenome Archiveデータリポジトリから入手可能です： 1000 Inflammatory bowel disease (IBD) cohort (https://www.ebi.ac.uk/ega/datasets/EGAD00001004194), Lifelines DEEP cohort (https://www.ebi.ac.uk/ega/datasets/EGAD00001001991). これには、対応するデータアクセス委員会に趣意書を提出することが含まれる。コードは、https://github.com/GRONINGEN-MICROBIOME-CENTRE/Fecal_Metabolites_IBD で一般に公開されています。
http://creativecommons.org/licenses/by-nc/4.0/
この記事は、クリエイティブ・コモンズ表示非商用 (CC BY-NC 4.0) ライセンスに従って配布されたオープンアクセス記事です。このライセンスは、原著が適切に引用され、適切なクレジットが与えられ、変更が加えられた場合、その使用が非商業的であるという条件で、この作品を非営利的に配布、リミックス、適応、基にし、その派生物を別の条件でライセンスすることを他の人に許可します。参照： http://creativecommons.org/licenses/by-nc/4.0/.
http://dx.doi.org/10.1136/gutjnl-2022-328048
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きちじょう
腸内細菌叢は、宿主の健康に影響を与える代謝器官であるとの認識が高まっています。
蓄積された証拠から、腸内細菌由来の代謝物は、細菌叢と免疫反応の間の重要なメディエーターであることが示唆されています。
炎症性腸疾患（IBD）では、腸内細菌群集の異常が広く研究されていますが、宿主と微生物叢の相互作用の背後にあるメカニズムの解明は依然として複雑で、腸内の代謝活動に対する洞察が必要です。
本研究の成果
IBD患者の腸内代謝は、糖類分解発酵由来の分子が少なく、タンパク質分解発酵由来の代謝物が多いことが特徴である。
腸内細菌叢の組成は、宿主のライフスタイル、遺伝的および臨床的表現型と比較して、糞便中の代謝物含有量を決定する主な要因である。
IBD患者の腸内では、スフィンゴ脂質、エタノールアミン、一次胆汁酸の濃度の上昇と同時に、病原性微生物の増加が見られる。
腸管切除は、腸の胆汁酸および脂質代謝に長期的な影響を与える。
この研究が研究、実践、政策にどのような影響を与えるか
今後、宿主の代謝を調査する研究では、微生物の構成や腸の手術歴などを考慮する必要があります。
糞便メタボロームは、IBDやその他の免疫介在性炎症性疾患のバイオマーカーを同定するための新たな道を提供する。
健康および疾患におけるヒトの代謝に対する腸内細菌叢の寄与を理解することは、将来の食事介入を設計する上で不可欠である。
はじめに
炎症性腸疾患（IBD）のような腸内環境が大きく変化する疾患では、宿主と微生物が共生している状態を明らかにすることが重要ですが、疾患の原因メカニズムはまだほとんど解明されていません。IBDは、潰瘍性大腸炎（UC）とクローン病（CD）という2つの主要なサブタイプからなる消化管の慢性炎症性疾患です1 2。IBDでは、疾患の活動期には、厳格な嫌気性菌の減少、通性嫌気性菌の増殖、腸内の化学環境の変化が特徴的です3。例えば、IBD患者の糞便中には、腸管バリアを保護する短鎖脂肪酸（SCFA）の減少、胆汁酸、スフィンゴ脂質、トリプトファン由来の代謝物の変化が常に報告されています4 5。しかし、人体内の多くの分子が未解明であり、その健康への影響は未知のままです。微生物由来の代謝物を含む低分子のサブセットが免疫反応を制御することが示されていることを考慮すると、これらの代謝物の特性を明らかにし、腸内の濃度を決定する要因を理解することは極めて重要である。
最近の質量分析技術の進歩により、既知の分子や化学的に未注釈の分子を幅広くハイスループットで特性評価および定量化できるようになりました6。このような背景から、糞便代謝物の特性評価は、非侵襲的バイオマーカーや治療標的を発見できる大きな可能性を秘めています。しかし、これまでIBD患者の糞便を対象としたアンターゲットメタボロミクス研究は、サンプル数が少なく、宿主の遺伝、ライフスタイル、食事、臨床特性に関する詳細な情報を欠いていました4 7。
本研究では、IBD患者さんの腸内代謝の変化を明らかにし、糞便代謝物レベルに影響を与える因子を突き止めることを目的としました。本研究で得られた知見は、IBDのバイオマーカーとしての糞便代謝物の可能性を明らかにし、ライフスタイル、遺伝、疾患の影響にもかかわらず、糞便微生物が腸内代謝物のレベルと組成の強力な予測因子であることを示しています。
研究方法
コーホートとメタデータの記述
サンプルは、2つの確立されたコホートから入手した： LifeLines（オランダ北部の人口バイオバンク）8と1000IBD（フローニンゲン大学医療センターのIBD患者コホート）9である。本研究では、255人の非IBD対照者、238人のCD患者、174人のUC患者を対象としました。サンプル収集と保存についてはオンライン補足方法に記載し、コホートの特性はオンライン補足表1および表1に要約しています10 11。
補足資料
[gutjnl-2022-328048supp001.pdf]
補足資料
[gutjnl-2022-328048supp002.xlsx]
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表1
コーホートの説明
メタボローム定量
Metabolon (米国ノースカロライナ州) が実施したメタボロミクス測定により、1684種類の糞便代謝物が検出されました (オンライン補足表2)。8種類の短鎖脂肪酸と分岐鎖脂肪酸の濃度は、タンデム質量分析付き液体クロマトグラフィーを用いて測定されました（オンライン補足表3）。
代謝データの処理
メタボロームデータは組成データセットとして扱われ、centered log-ratioを用いて変換された。代謝物は、その有病率に基づいて3つのカテゴリーに分けられた。最初のグループは、症例と対照の両方でサンプルの70％以上に存在する代謝物から構成されています（x=854）。欠損値はk-Nearest Neighbour Imputationを用いてインピュテーションした12。インピュテーションでは最近傍の数を10に設定し（k=10）、ユークリッド距離を指標とした。2つ目の代謝物群（有病率＜70％および＞20％、x=514）は、バイナリ形質（代謝物の有無）に変換された。希少代謝物（有病率20%未満、x=316）は解析から除外された。
IBDに関連する代謝物の同定
Rのlm関数を用いて線形回帰分析を行い、各代謝物の存在量を疾患群（IBD/CD/UC）と対照群間で比較した。技術的要因（保存時間、糞便の投入グラム数、サンプルバッチ）、宿主の特性（年齢、性別、肥満度（BMI）、1日あたりの排便回数）、腸の完全性（切除の有無：はい／いいえ）、症例とコントロールで有意差があった24の食事パターンを共変数として回帰モデルに含めた（オンライン補足表4）。有病率の低い代謝物（有病率＜70％および20％以上のサンプル）については、ロジスティック回帰を使用して評価した。すべてのp値は、Benjamini-Hochbergを使用して多重検定で調整した。統計的有意性の閾値として、偽発見率（FDR）<0.05が用いられた。
メタボロミクスプロファイルに基づくIBDの予測
CoDaCoRe13（V.0.0.1）を用いて、IBDとそのサブフェノタイプを予測できる代謝物と細菌の存在比を特定した（オンライン補足方法参照）。
代謝物と表現型の関連性
各コホート（コントロール、CD、UC）内で、表現型と代謝物の間の関連性解析を実施した。各表現型と代謝物の組み合わせは、年齢、性別、BMI、1日の排便回数、技術的要因を共変数として含む線形回帰を用いて検証した。
代謝物-表現型の解析結果は、Rパッケージmeta（V.4.8）に実装されたランダム効果モデルを用いてメタアナリシスで結合されました。結果は、meta-FDR<0.05のときに統計的に有意であるとみなされた（オンライン補足方法）。
糞便代謝産物に関するゲノムワイド関連解析
両コホートについて、エクソームシーケンスおよびゲノムアレイデータが利用可能であった（オンライン補足方法参照）。サンプルの70%以上に存在する代謝物については線形回帰を、サンプルの70%以上20%未満に存在する代謝物についてはロジスティック回帰を使用しました。解析はコホートごとに行い、結果は既述のようにメタ解析で統合した14。上記の交絡因子（IBDに関連する代謝物の同定の項を参照）の考慮に加えて、解析には集団遺伝構造を共変数として含めた。本研究で得られた知見の統計的有意性を判断するために、ゲノムワイド有意性（p<5e-08）と、より保守的なカットオフである研究ワイド有意性（p<2.97e-11）という二つの閾値を採用しました。研究全体の有意性の閾値は、ゲノム全体の閾値を代謝物の総数（5.0e-08/1684）で割ることで決定された。
細菌と代謝産物の共起パターン
mmvec V.1.0.616のQIIME15実装を使用して、高頻度代謝物と細菌間の共起確率を推定しました。さらに、細菌とディスバイオシスの相互作用を考慮した回帰モデルを用いて、個々のマイクロバイオームの特徴（分類群、遺伝子クラスター、代謝経路）と代謝物との関連を評価した（オンライン補足方法）。
糞便中マイクロバイオーム機能の存在量差分解析
コントロールとIBDの間で異なるマイクロバイオームの特徴を特定するために、線形回帰分析を使用した。年齢、性別、BMI、1日あたりの平均排便回数、腸管切除歴（あり／なし）、生シーケンス読み取り深度を共変量として回帰モデルに含めた（オンライン補足方法）。
ディスバイオシスと糞便代謝物の関連性
異種微生物叢を有する患者と真正微生物叢を有する患者の間の表現型の違いは、カテゴリー変数と連続変数についてそれぞれχ2またはウィルコクソンランクテストを用いて確立した。また、2つの患者グループ間の糞便代謝物の存在量の差は、線形回帰を用いて検定した。年齢、性別、BMI、腸切除（あり／なし）、回盲弁（あり／なし）、1日あたりの平均排便回数、12食パターンの違い（オンライン補足表5）は、回帰モデルの共変量として追加した。
メタボライトレベルの予測
糞便中の代謝物レベルを予測するため、glmnet Rパッケージ17を用いてL1正則化（lasso）による回帰モデルを実行しました（オンライン補足方法参照）。
結果
IBD患者の糞便代謝物プロファイルは独特である
CD患者238名、UC患者174名、非IBD対照255名の糞便サンプルで代謝物を評価しました（表1）。1サンプルあたり平均1011個の代謝物が検出され、その範囲は784分子から1241分子であった。
代謝物レベルに基づく主座標分析（PCoA）により、IBDサンプルはコントロールと部分的に重なるクラスターに分散していることが示されました（図1A）。PCoAの第1成分は変動の18％を占め、カルニチン、胆汁および脂肪酸のレベルによって駆動され、第2成分はコホート変動の8％を占め、ジペプチドおよびいくつかの未分類代謝物の存在によって駆動された（オンライン補足表6、図1B-D）。
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図1
クローン病および潰瘍性大腸炎患者における糞便中の代謝物変化。(A-D)。メタボローム組成による255の非IBD（黒）、238のCD（紫）、174のUC（緑）および12のIBDU（ピンク）サンプルのクラスタリングを描写する主座標分析。第1主成分は主にコール酸とスベリヒユの濃度（B、D）、第2主成分はフェニルアラニルアラニンの濃度（パネルC）により駆動されている。明暗のカラーグラデーションは、低-高代謝物値を表す。代謝物濃度は、AUC生値の中心化対数比（clr）で表されます。(E). メタボローム経路にグループ化された症例と対照の間の代謝物の違い。わかりやすくするために、3つ以上の代謝物を持つカテゴリーのみを示している（カテゴリーごとの代謝物の数はx軸に示されている）。Y軸は、線形回帰モデル（オンライン補足方法参照）からのt統計値を示す。アスタリスクはCDとUCの間の有意差を示す（FDR<0.05、オンライン補足表7-9）。AUC、曲線下面積、CD、クローン病、FDR、偽発見率、IBD、炎症性腸疾患、IBDU、炎症性腸疾患未分類のもの、UC、潰瘍性大腸炎。
アバンダンス差分解析の結果、CD患者を対照群と比較すると324の関連、UC患者を対照群と比較すると308の関連（FDR<0.05）が明らかになりました（オンライン補足表7、オンライン補足図1A-E）。さらに、有病率の低い代謝物を調べると、胆汁酸、セラミド、ステロイドの代謝産物が、コントロールよりもIBD患者の糞便に多く含まれていることがわかりました（CDとUCにそれぞれ182分子、119分子関連、オンライン補足表7）。
補足資料
[gutjnl-2022-328048supp004.pdf]
両疾患群で顕著なシグナルは、コントロールと比較してビタミンと脂肪酸関連分子の枯渇であった（図1E）。IBD患者では、フェノール化合物であるp-クレゾール硫酸のレベルがより高くなった。インドールプロピオン酸はUCで減少し、トリプタミンとキヌレニンはCDとUCで増加した（FDR<0.05、オンライン補足図1D）。また、IBD患者では、アラキドン酸（20:4n6）の濃度が高く、オメガ6/オメガ3脂肪酸の比率が低かった（オンライン補足表8、オンライン補足図1E）。
また、106種類の代謝物がCDとUCの間で異なる濃度で存在することもわかった。例えば、UC患者では、グラム陰性菌の細胞膜に存在するα-アミノ酸であるジアミノピメレート（DAPA）の濃度が高いことがわかりました。興味深いことに、DAPAを含むペプチドグリカンは、NOD118が介在する免疫反応を引き起こすことがある（オンライン補足図1C、オンライン補足表9）。
UC患者は糞便中のSCFA濃度が最も低い
SCFAsの濃度は免疫調節に不可欠であり、その合成は多糖類の大腸菌発酵に依存している19。人体測定、バッチ、サンプル保存時間などの潜在的交絡効果を補正した後（オンライン補足方法、オンライン補足表4参照）、酢酸、プロピオン酸および酪酸は、コントロールと比較してUC患者で低濃度で見つかった（FDRUC＜0.05）。これらの代謝物には、CDとコントロールの間に有意な差は認められなかった。一方、ヘキサン酸およびバレリック酸の濃度は、両患者群で有意に低かった（オンライン補足図2、オンライン補足表7）。
補足資料
[gutjnl-2022-328048supp005.pdf]
糞便メタボロームプロファイルはIBDサンプルを正しく分類する
IBD患者と非IBD対照者の間で代謝物レベルに大きなばらつきが観察されることから、複数の代謝物を組み合わせることで、便中カルプロテクチン検査の精度を高める可能性を検討しました。バイオマーカー候補を特定するために、機械学習による疾患表現型の予測を行いました（オンライン補足方法参照）。スフィンゴ脂質のラクトシル-N-パルミトイルスフィンゴシン（d18：1/16：0）とL-ウロビリンの比率を含めると、疾患予測因子として年齢、性別、BMI、便中カルプロテクチン値の精度が向上しました（AUCcv=0.85、AUCtest=0.83、p=9.89e-13、図2、オンラインの補足表10）。さらに、これら2つの代謝物の比率は、対照群と比較して長期寛解患者（サンプル採取の前後1年間に再燃の登録なし、n=61、Wilcoxon検定、p=0.0036）で高かったが、我々のコホートの他のIBD患者からのサンプルと比較すると有意ではなかった（Wilcoxon検定, p=5.05e-5, オンライン補足図3A）。細菌量についても同様の結果が得られました（AUCcv=0.86, AUCtest=0.84, p=6.04e-14, online supplemental figure 3B,C）. 代謝物とマイクロバイオームの比率を組み合わせることで、モデル性能は控えめながら有意に向上した（AUCtest=0.85, p=4.34 e-09）。IBD患者において、代謝物は、CDまたはUCサンプル（AUCcv=0.78、AUCtest=0.67）および疾患活性と寛解（AUCcv=0.72、AUCtest=0.60）を正しく分類する力が限られていた（オンラインの補足表10）。
補足資料
[gutjnl-2022-328048supp006.pdf]
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図2
IBDの診断のためのバイオマーカー探索。(A、B）非IBD（グレー）とIBD（緑がUC、紫がCD）のサンプルを識別する可能性が最も高い代謝物の存在量を示す。(C). ボックスプロットは、IBDの潜在的なバイオマーカーの値を描いています。Y軸は、ラクトシル-N-パルミトイルスフィンゴシン（d18：1/16：0）とL-ウロビリンのレベルから構築した比率のログ変換値である。灰色のボックスプロットは、IBDでないコントロールの値を示している。赤のボックスプロットは、IBD患者における値を表す。(D). 患者特性（年齢、性別、BMI）、糞便カルプロテクチンのレベル（このマーカーのレベルが糞便の200μg/gを超える場合、二値特性（はい/いいえ）として表現）、代謝物間の比率に基づく予測モデルのROC曲線（receiver operating characteristic curve）。曲線下面積（AUC）で表される予測値は、テストデータセットで0.83の値に達しました。代謝物の値はclr変換されている。Boxplotは中央値と四分位範囲（25位と75位）を示しています。ウィスカーは1.5IQRの範囲を示す。アスタリスクは、グループ間の有意差を示す（FDR<0.05）。BMI、肥満度、CD、クローン病、FDR、偽発見率、UC、潰瘍性大腸炎。
腸管切除は長期的な代謝の変化と関連する
IBD患者における糞便メタボロームの変化を明らかにした後、どのような生活習慣、食事、臨床要因が糞便メタボロームレベルに寄与しているかを説明することを目的としました。我々は、食習慣、薬物使用、臨床的特徴など229の宿主特性と糞便代謝物との関連性を評価した。条件ごとに（すなわち、CDのみ、UCのみ、コントロールのみ）関連性解析を行い、重複するメタデータの結果をメタ解析で統合した。
CD患者において、回盲弁の切除は、コール酸やいくつかのモノアシルグリセロールを含む212種類の代謝物の存在量の変化と関連していた。大腸切除は、CDでは56分子、UCでは8分子のレベルの変化と関連していた（オンライン補足表11、図3 A-C）。例えば、大腸切除はピリドキサミン（ビタミンB6）の糞便中濃度と負の相関がある。
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図3
糞便中の代謝物量の潜在的な決定要因。(A）各コホートおよびメタ解析（オンライン補足表11）における、表現型と代謝物の間の有意な関連数を示す棒グラフ。3つ以上の関連性を持つ表現型のみを示している。赤ラベルは症例にのみ、青ラベルは対照にのみ利用可能な表現型を示す。(B). コホートごとのAAMU（clr変換されたAUC値として表される）とコーヒー消費量（x軸）の関係を示す相関図。コーヒー消費量は、個人の全体的なカロリー摂取量で調整した1日あたりの推定消費量（グラム／日）で表した（オンライン補足方法参照）。(C). 1-パルミトイルグリセロール（16：0）のレベルを示すボックスプロット。ボックスプロットは、中央値およびIQR（25位および75位）を示す。ウィスカーは1.5IQRの範囲を示す。データ分布は、背景のバイオリンプロットで表現されています。相関プロットの線は線形回帰を示し、影は95%CIを示す。AAMU、5-アセチルアミノ-6-アミノ-3-メチルウラシル、AUC、曲線下面積。
腸の手術（切除と非切除）を統計的に調整した後、疾患の挙動や疾患の重症度の異なるグループ間で代謝物に有意な差は見られませんでした。しかし、いくつかの興味深い傾向が観察されました（p<0.05, FDR>0.05, online supplemental table 12）。CDおよび貫通型疾患の患者は、酪酸レベルが低かった（B1 vs B3）。疾患の重症度（モントリオールSスコア）は、チラミン糞便量と正の相関があった。UC患者では、直腸炎（E1分類）の患者は、結腸に広範な炎症がある患者（E3分類）と比較して、2R-3R-ヒドロキシブチレートのレベルが低く、シチジンのレベルが高かった（オンライン補足図4A、B）。
補足資料
[gutjnl-2022-328048supp007.pdf]
クロモグラニンAは、N-ホルミルメチオニン、コレステロール、二次胆汁酸との正の相関を含む、非IBDコントロールの糞便代謝物との最も多くの相関を示しました。クロモグラニンAは、腸内細菌叢の構成と強い相関を示し、腸の健康のバイオマーカーとなりうることが報告されている10。さらに、カルプロテクチン>200μg/gの参加者は、CDではなくUCで糞便中のシチジンのレベルが低く、スフィンゴシンとセラミドの増加が認められた（図3A、オンライン補足表11）。
さらに、いくつかの代謝物の検出は、本コホートの参加者のライフスタイルの側面を反映していました。代謝物と食事パターンとの間には158の関連性が認められたが（FDRmeta<0.05、オンライン補足表11）、そのうちの約3分の1はコーヒーの摂取に関連しており（n=57）、コーヒー摂取とピコリネートや主要カフェイン代謝物である5-acetylamino-6-amino-3-methyluracil （AAMU）（図3B）のレベルとは正の相関がある（FDRMeta<0.05、オンライン補足表11）。タバコに含まれるアルカロイドであるコチニンは、自己申告の喫煙者の糞便から検出され（FDRmeta=1.31e-06、オンライン補足表13）、オピオイドのトラマドールの主要代謝物であるO-desmethyltramadolは、オピオイドを使っているCD患者数人から検出された（FDR=0.009、オンライン補足表13）。
ライフスタイル、臨床因子と糞便代謝物の間に観察された関連が、腸内細菌叢の変化によるものかどうかを調べるために、調停分析を実施した。その結果、コントロール、UC、CDにおいて、それぞれ119、38、695の媒介作用のエビデンスが観察された。特に、コーヒー摂取と1,3-ジメチルー酸などのいくつかのカフェイン誘導体との関係をローソニバクター・アサッカロリティクスが媒介することを発見した。CD患者では、回盲弁の切除によりFaecalibacterium prausnitziiの存在量が減少し、酪酸を含む抗炎症代謝物のレベルに悪影響を及ぼすことが観察された（オンライン補足表14、オンライン補足図5）。
補足資料
[gutjnl-2022-328048supp008.pdf]
NAT2遺伝子型はコーヒーの代謝に強く関連する
次に、宿主の遺伝と糞便代謝物のレベルとの相関を調べるために、糞便代謝物のゲノムワイド関連解析を実施しました。全体として、遺伝が糞便代謝物レベルに与える影響は、他の研究で報告されている血中代謝物レベルへの遺伝の影響と比較して、比較的小さいことが示された20-22。研究全体の有意水準で、NAT2に近い位置にある遺伝子多型（rs4921913）とAAMUとの間に関連があることがわかった（p meta=1.79e-11）。この遺伝子変異は、1,3-dimethylurateとAAMUの比率に関連すると報告されているSNP（rs35246381、r2>0.8）と連鎖不平衡にある23。予想通り、我々のコホートでもこの所見を再現できた（p IBD=8.46e-09, p controls=4.17e-09, p meta=3.57e-13, figure 4）。AAMUはコーヒー由来の代謝物であり、糞便中の濃度はコーヒー摂取量と相関がある。しかし、この遺伝子と代謝物の関連は、コーヒー摂取量を調整した後も有意であった（p IBD=2.2e-16, p controls=2.0e-09, online supplemental table 15）。
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図4
遺伝子多型と糞便代謝物とのゲノムワイドな関連性。(A）マンハッタンプロットは、NAT2遺伝子近傍に位置する一塩基多型とカフェイン由来の代謝物であるAAMUとの間に強い関連があることを示す。実線の横線は、多重仮説検定で補正した有意閾値を意味する。破線は、古典的なゲノムワイドの有意性閾値を示す。この閾値を超えた代謝物（赤色）は、示唆的な関連と考えられる（オンライン補足表15）。(B）SNPのrs4921913遺伝子型によって層別化した、非IBDコントロールとIBDにおけるAAMUのレベルを示すボックスプロットである。(C) SNP rs4921913とAAMUに対する1,3-dimethylurateの比との関係を示すボックスプロット。この関連は、TwinsUKコホートで以前に記述されている。23 代謝値は、共変量である年齢、性別、BMIおよび技術的交絡因子を回帰するモデルの残差として示されている。ボックスプロットは、中央値とIQR（25位と75位）を示している。ウィスカーは1.5IQRの範囲を示している。データ分布は背景のバイオリンプロットで表現されています。AAMU, 5-acetylamino-6-amino-3-methyluracil; BMI, body mass index; IBD, inflammatory bowel disease.
腸内細菌叢の組成はメタボロームプロファイルと関連している
IBD患者の腸内細菌叢は、しばしば健康な状態（eubiosis）から不健康な状態（dysbiosis）へと移行する3 24。dysbiosisに伴う代謝の変化を理解することは、IBDの病理メカニズムに重要な洞察を与えるかもしれない。
本コホートでは、ディスバイオシスのある参加者は、CD（n=130、χ2検定FDR=2.45e-04）および回盲弁切除（n=76、χ2検定FDR=2.93e-10）を受ける傾向があったが、糞便カルプロテクチン値（カルプロテクチン>200μg/gの人の割合、χ2検定FDR=0.65）では有意差なしとされた。Clostridium boltae、Erysipelatoclostridium ramosum、Ruminococcus gnavusなどの病原体の存在量の有意な増加が観察され、また、dysbioticコミュニティにおける52種の細菌種の存在量の減少が見られた（オンライン補足表5、図5A、B）。
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図5
腸内細菌異常症患者の代謝シグネチャー。(A) サンプルごとのマイクロバイオーム構成に関する主座標分析（ドット）。色は疾患表現型を示す： CD（紫）、UC（緑）、IBD-undetermined（ピンク）、非IBD（黒）。(B) 赤いドットは、非IBDサンプルとの距離の中央値に基づいて、dysbioticと考えられるサンプルを示している。(C）dysbioticとnon-dysbiotic IBDサンプル間の関連解析のp値（y軸）と回帰係数（x軸、正の値はdysbiosisでの濃縮を示す）を示すVolcano plot（オンライン補足表5）。ドットカラーはMetabolonが提供するパスウェイ注釈を示す（オンライン補足表2）。CD、クローン病、IBD、炎症性腸疾患、UC、潰瘍性大腸炎。
微生物群集が共生している場合と共生していない場合のIBDサンプルの代謝物組成を比較すると、202種類の代謝物が濃縮され、258種類の代謝物が枯渇していることが明らかになりました。ディスバイオシスサンプルでは、インドリン-2-オンと3-フェニルプロピオン酸の減少、イミダゾールプロピオン酸、長鎖多価不飽和脂肪酸（PUFA）、第一胆汁酸の増加（FDR <0.05, online supplemental table 5, figure 5C）が確認されました。胆汁酸プールの変化は、ディスバイオティックサンプルにおけるタウリン共役胆汁酸と硫酸化胆汁酸の高い有病率にも反映されていた（FDR<0.05、オンラインの補足表5）。
次に、疾患表現型（非IBD、CD、UC）およびdysbioticの状態（はい／いいえ）で補正しながら、腸内細菌叢と代謝物の相関を調査した（オンライン補足方法参照）。その結果、細菌の有無と代謝物量の間に合計13761の有意な関連、細菌の存在量と代謝物の間に5942の有意な関連を見出した（オンライン補足表16および17、図6A、オンライン補足図6、FDR<0.05）。
補足資料
[gutjnl-2022-328048supp009.pdf]
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図6
代謝物と糞便微生物との共起性。(A) 代謝物（点）と微生物（矢印）の共起の条件付き確率を表す複葉図。点と矢印の先端間の距離は、各代謝物と微生物の共起確率を表す（オンライン補足表21）。オレンジ色のドットは、線形回帰分析でIBD患者からのサンプルに濃縮された代謝物をハイライトしている（オンライン補足表7）。矢印の方向は、微生物が代謝物のレベルと共起する確率を示す。解釈しやすくするため、いくつかの代謝物の名前のみを示し、最大の変動量を説明する上位10種のみを可視化した。(B）糞便メタゲノムにおけるBilophila wadsworthiaの有無で層別したタウリンレベル。(C) トリプタミンレベルとRuminococcus gnavusの存在量との相関関係。この菌の相対量が0でないサンプルだけを示した（n=339）。(D-F）微生物群の代謝能と代謝物量の相関の例として、ヒスチジンとMetaCycヒスチジン分解経路の関係（D）、オレイルエタノールアミドとeutオペロンの関係（E）、コール酸とbaiオペロンの関係（F）を示している。代謝物、細菌、パスウェイの値はclr変換しています。Boxplotは中央値とIQR（25位と75位）を示しています。ヒゲは1.5IQRの範囲を示す。相関プロットの線は線形回帰を示す。影は95％CIを示す。IBDは、炎症性腸疾患。
これらの関連性のうち、1137項目がディスバイオシス状態との有意な交互作用を示し、ディスバイオシスサンプルとユビオティックサンプルで異なる方向性を示す関連性は56項目のみでした。例えば、真正細菌サンプルにおけるRuthenibacterium lactatiformansの検出は、酪酸レベルと負の相関を示したが、真正細菌サンプルではこの相関は正であった。ディスバイオシスとは関係なく、糞便中のAkkermansia municiphilaとOscillibacter spp（CAG 241）の存在は、ジカルボン酸、セバシン酸（C10-DC）とドデカン二酸（C12））の高レベルと関連しており、Bilophila wadsworthiaの存在は、タウリンとN，N，N-trimethyl-アラニルプロリンβインの低レベルと関連していました（図6B、FDR＜0．05）。さらに、F. prausnitziiとヒポキサンチン量、（FDR=1.46e-11）、R. gnavusとトリプタミン（FDR=1.46e-11）（図6C）、さらにイミダゾールプロピオン酸とStreptococcus parasanguinis（FDR=0.007）に強い正の相関が見られることが明らかになりました。
さらに、特定の微生物の代謝経路や遺伝子クラスターの存在量が、代謝プロファイルと関連していることが判明した（図6D-F）。胆汁酸誘導性オペロン（bai operon）の存在量とリトコール酸のレベルとの間には正の相関が見られ（FDR=9.76e-19）、また、コール酸とは負の相関が見られた（FDR=8.90e-06、オンライン補足表18、図6F）。しかし、これらの効果は、dysbioticサンプルにおいてより顕著であった（FDRinteraction dysbiosis<0.05）。一方、パルミトイルエタノールアミドとオレオイルエタノールアミドのレベルの減少は、エタノールアミン利用オペロン（eutオペロン、FDR<0.05、図6E）の存在量の増加に関連していた。さらに、L-ヒスチジン分解経路I（MetaCyc ID: HISDEG-PWY）に関与する遺伝子の存在量が多いほど、IBD患者からのサンプルで増加していることが判明した代謝物であるヒスチジンのレベルが低いことに関連していた（FDR=3.64e-06、オンライン補足表S19、図6D）。
マイクロバイオーム組成は糞便中の代謝物レベルを予測する
最後に、宿主情報、食習慣、糞便微生物群の組み合わせにより、各代謝物の予測可能性を推定した。食事摂取量は37代謝物のレベルを予測し（説明される変動の20%以上）、食事で予測された代謝物のトップ10は、分類されていない分子7つとコーヒー関連代謝物3つでした。一方、細菌量は、リトコール酸（41％、s.d.18％）やジメチルアルギニン（ADMA/SDMA、53％、s.d.4％）などの分子レベルを含む82代謝物の強い予測因子となった（変動の40％超）。食事と参加者の特徴を加えると、マイクロバイオームベースのモデルがわずかに改善された（paired Wilcoxon-test, p <2.2×10-6）（figure 7, online supplemental table 20）。
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図7
メタボライトの予測。微生物量（薄い赤）と細菌パスウェイ（濃い赤）は、代謝物のレベルを予測する最大の可能性を示しています。ボックスプロットは、7種類のデータを用いた8種類のモデルによる代謝物レベルの予測能力を示しています。ドットは代謝物を表し、Y軸の値は、異なる予測因子セットを使用したクロスバリデーションのペナルティ付き回帰法（オンライン補足方法参照）から説明される変動の割合を示しています。各モデルの特徴数は、凡例の括弧内に示されている（オンライン補足表20）。
考察
我々は、IBD患者およびオランダの代表的な人々のサンプルを用いて、糞便中の代謝物の特徴を包括的に調査した。その結果、IBD患者において、300以上の高頻度糞便代謝物のレベルが変化していることが明らかになりました。さらに、食習慣、宿主の遺伝、臨床的特徴、腸内細菌叢の構成に関する広範な情報とアンターゲットメタボロミクスを統合することにより、糞便メタボローム構成の決定要因の可能性を明らかにしました。
IBD患者における糞便代謝物組成の大幅な変化は、p-クレゾール硫酸（FDRIBD=8.29e-06）や3-インドキシル硫酸27-29（FDRIBD=0.04）といった芳香族アミノ酸の代謝に由来する代謝物の増加から明らかなように、糖質発酵からタンパク質分解発酵へのシフト26を示唆しています。(オンライン補足表7)。これらの化合物の蓄積は、慢性腎臓病30や大腸がん31 32などの様々な健康状態に関連している。これらの分子の存在度が高く、SCFAのような糖分解産物のレベルが低いことは、腸内環境が不健康であることを示唆していると考えられる。
CD患者とUC患者の糞便代謝物シグネチャーの重複は、腸内代謝における共通の基礎的変化を示唆しています。UCと有意に関連する代謝物の58%は、CDとも関連することが判明しました。CD患者とUC患者の糞便代謝物プロファイルを比較したところ、106種類の代謝物のレベルに有意な差異が認められました。例えば、胆汁酸プールの変化はCDの特徴であり、SCFAsの濃度の低下はUCの共通の特徴であった。
CDでは、スフィンゴミエリンやセラミドを含むスフィンゴ脂質の糞便中濃度が顕著に上昇することが観察された。スフィンゴ脂質は腸管細胞膜の構成成分であり、セリンからパルミトイルCoAへのデノボ縮合、あるいは内因性・食事性のスフィンゴ脂質の取り込みによって生成される。スフィンゴ脂質は、その構造的役割に加えて、シグナル伝達分子として働き、細胞の分化、アポトーシス、炎症を媒介することができる。
セラミド合成酵素の活性化またはスフィンゴミエリンのセラミドへの分解の増加によるセラミドレベルの上昇は、炎症性転写因子NF-κBを活性化し、COX-2遺伝子発現の誘導を介してプロスタグランジンE2の産生をもたらすことが実験的に示唆されている35。これらの分子は炎症プロセスの制御に重要な役割を果たし、S1Pはリンパ節からのリンパ球の移動を調節する役割を果たすことから、IBDの有望なターゲットとされています36。
宿主が産生するスフィンゴ脂質の炎症促進作用とは逆に、バクテロイデスなどの細菌が産生するスフィンゴ脂質は抗炎症作用を示すことが示されています31。このことは、腸の健康維持における微生物産生分子の重要性と炎症促進分子と抗炎症分子の間の微妙なバランスを強調しています。
スフィンゴ脂質の増加に加えて、CD患者の糞便中には、IBDでない対照群と比較して、N-アシルエタノールアミン（パルミトイルエタノールアミド、リノールエタノールアミド、オレイルエタノールアミド、ステアリルエタノールアミド）のレベルが高いことも報告されている。これらの非定型エンドカンナビノイドの蓄積のメカニズムはまだ解明されていませんが、現在のエビデンスでは、エタノールアミドが炎症時の腸内細菌叢を形成する可能性が示唆されています37。
我々の研究では、IBD患者は、糞便中のアシルカルニチンやアラキドン酸などの長鎖脂肪酸（LCFA）およびPUFAのレベルも高いことを発見した。Smithらによる以前の研究では、パルミトイルカルニチン（C16）をIBDの糞便バイオマーカーとして同定し、腸管内腔におけるアシルカルニチンの蓄積と炎症時の結腸細胞におけるLCFA取り込みの減少を関連付けています38。さらに、PUFAを多く含む食事が腸の炎症を助長することを示す証拠が増えています。オメガ3およびオメガ6PUFAにさらされると、CD患者の腸オルガノイドやグルタチオンペルオキシダーゼ4（GPX4）遺伝子発現が低下したマウスモデルで炎症反応が引き起こされます。
また、IBDの患者さんでは、アミノ酸とその誘導体のレベルが有意に上昇することも確認されました。これらの結果は、新たにIBDと診断された患者さんのコホート（n=78）を対象に実施された先行研究で、いくつかのアミノ酸のレベルがIBDサンプルとコントロールとを高い精度で区別できたことと一致しています39。特に、IBDサンプルではタウリンのレベルが強く上昇していることが分かりました。
大腸の細菌はタウリンを基質として亜硫酸塩を放出し、さらに硫化水素に変換されることが示されています40。この硫化水素の蓄積は、上皮の損傷や大腸炎に関連すると言われています。B. wadsworthiaは硫酸還元菌であり、タウリンを代謝する能力があることが示されている。このことは、我々のコホートにおいてB. wadsworthiaの検出とタウリンレベルとの間に観察された逆関係を説明する可能性を与える。
さらに、IBD患者の糞便には、ヌクレオチド、エンテロラクトン（食事のリグナンを分解して生成される細菌産物）、ビオチン（ビタミンB7）の枯渇が見受けられた。これらの結果は、IBD患者41の腸内細菌の多様性とバイオマスの減少が、繊維の消化やビタミン産生などの必須機能の低下を促している可能性を示唆しています。これらの代謝物の前駆体を食事から摂取することで、微生物による生産を回復させることは、IBDにおける腸内細菌叢の調節障害に対処し、フレアアップを予防するための戦略として役立つ可能性があります。
遺伝とライフスタイルが糞便中の代謝物濃度に与える影響について
IBDの影響とともに、食事や生活習慣は人体内の低分子の存在量を決定する要因となっています。代謝物を食事データ、薬の使用、ライフスタイルの要因と相関させることで、喫煙やコーヒー・紅茶の摂取といった日常的な習慣が、その派生分子と強く相関することがわかりました（オンライン補足表11-13）。これらの関連にもかかわらず、長期的な食習慣と糞便メタボローム組成との関連は中程度であった。我々の予測モデルでは、食事情報を用いて予測できる糞便代謝物は、未分類の代謝物、コーヒーとその誘導体（AAMU、N-methyl pipecolate、theophylline）、エンテロラクトン（リグナン誘導体）を含むわずかなもの（15代謝物、説明分散25%以上、オンライン補足表20）であることがわかった。逆に、最近の研究では、食事摂取が循環代謝物レベルにより大きな影響を与えることが報告されている21。我々は、食事データは食事頻度アンケートに基づいているため、食事摂取が糞便代謝物レベルへの寄与を過小評価していると仮定している。今後の研究では、食物摂取量と糞便中代謝産物および食物-マイクロバイオーム相互作用の関係を探ることを目的とする場合、日々の食事変動を把握するために24時間食事回想法を使用することを考慮すべきです。さらに、食習慣と糞便代謝物の関係を調べる際には、宿主の消化管での吸収速度、代謝、生体内変換の影響を考慮する必要がある。
我々の調停分析では、糞便中代謝物と臨床的および生活習慣的要因の関連性の間の調停者としての腸内細菌叢の役割について統計的証拠を得た。例えば、糞便中のいくつかのコーヒー関連代謝物のレベルは、L. asaccharolyticusの存在量に部分的に依存した。この種は以前からコーヒー摂取と関連していたが42、AAMUや1,3-dimethylruic acidといったコーヒーに含まれる分子を代謝する能力はまだ不明である。しかし、曝露、微生物叢、代謝物の関係は複雑であり、例えば、代謝物が腸内細菌叢の構成を形成したり、細菌が相互摂食代謝ネットワークを構築することがある。
宿主遺伝は糞便中の代謝物量にわずかな影響を及ぼしました。有意基準を満たした唯一の関連は、NAT2遺伝子近傍の一塩基多型とカフェイン代謝産物であるAAMUの間であった（オンライン補足表15）。NAT2はN-アセチルトランスフェラーゼ酵素をコードし、コーヒーやある種の薬物など、いくつかの異種物質を無毒化する。また、TwinsUKバイオバンクの研究でもこの関連性が報告され、宿主遺伝が糞便代謝物に中程度の影響を与え、平均遺伝率は約18％と推定されています。この比較的低い遺伝率は、循環代謝物のレベルに対する宿主遺伝の影響とは対照的です43 44。また、糞便代謝物は主に大腸で起こる微生物変換によって影響を受け、遺伝的影響を隠すことができるという事実によって説明できるかもしれません。さらに、代謝物-ゲノム相関を発見するためには、サンプルサイズが依然として制限要因となっている。実際、より緩やかな有意差（p <5×10-8）を用いた場合、コレステロールとセロトニンの代謝を示唆する200以上の関連性が見出されました。例えば、LRP5Lはセロトニンと、PNLIPRP2は1-palmitoyl-2-linoleoyl-digalactosyl glycerol (16:0/18:2) と関連していた（オンライン補足表15）。LRP5Lは、十二指腸のセロトニンレベルの制御に関与することが発見された低密度リポタンパク質（LDL）受容体ファミリーに属する45。PNLIPRP2と1-palmitoyl-2-linoleoyl-digalactosyl glycerol（コリン誘導体）は、いずれもコレステロール代謝に関連しており、コリンのサプリメントが血中コレステロールの恒常性を保つことを裏付ける46、PNLIPRP2は血液中のLDLレベルと関連していた47。
腸内細菌叢の構成と腸内代謝の関係
マイクロバイオームと代謝物の間に強い関係があることから、メタゲノム配列データを用いて糞便代謝物のレベルを推定することができた（オンライン補足表20）。先行研究23 43 48 49と同様に、よく予測された分子にはプトレシン、ウロビリン、胆汁酸塩、脂肪酸が含まれていた。しかし、これらの予測された分子が本当に微生物代謝の産物であるかどうかを確認するためには、さらなる機能的証拠が必要である。注目すべきは、コントロールでトレーニングし、IBDサンプルでテストしたモデルは、IBDと非IBDの両方のデータセットでトレーニングしたモデルと比較して、低い予測精度を示したことである。このような症例と対照の間の低い交差予測性は、Mullerら49も報告しており、一部の微生物叢と代謝物の関連は、文脈特異的であるか、微生物叢が乱されたときにより明らかになることを示唆している。例えば、IBD患者は、しばしば腸内細菌叢の組成に変化を示し、ディスバイオシスにつながる。このような背景から、本分析では、代謝産物-微生物叢の関連で、ディスバイオシスによって有意な影響を受ける1137の代謝産物を発見しました。
IBDとディスバイオシスを有する患者は、ユビオティックIBDサンプルと比較して、一次および共役胆汁酸レベルの有意な増加を含む202の非常に一般的な代謝物の濃縮を示した（オンライン補足表5）。大腸におけるコール酸の蓄積は、その抗菌作用により腸内生態系に選択圧を与えることが示されています50。このことは、ディスバイオシスにおけるC. boltaeやR. gnavusなどの胆汁耐性菌の拡大を説明することができます。さらに、ある種の細菌の消失は、一次胆汁酸の蓄積にも寄与している可能性がある。このことは、共生試料と比較して、異食試料ではbaiオペロンの存在量が減少し、一次胆汁酸と二次胆汁酸の比率が増加していることから明らかである。さらに、胆汁酸は、代謝の調節、腸管バリアーの維持、宿主の免疫系の調節において極めて重要な役割を担っており51、IBDの治療介入のターゲットとして非常に魅力的であることが示されている。
我々のコホートでは、ディスバイオシスは回腸疾患および回盲弁切除術と関連していた（オンライン補足表5）。例えば、Halfvarsonら24は、回腸で腸の手術を受けた患者は、微生物相が安定せず、より頻繁に好気性状態と嫌気性状態の間を移行することを示しました。栄養吸収における小腸の重要な役割を考えると、この部分の腸管障害が大腸の胆汁酸、アミノ酸、脂質の濃度を持続的に変化させ、微生物組成をdysbioticな状態へと変化させる可能性は十分にあるものと思われる。疾患部位とマイクロバイオーム組成に基づく患者の層別化は、より的を絞った効果的な治療法を発見できる可能性があるため、今後のメタボローム研究および臨床介入において考慮されるべきです。
さらに、本研究で実施したコアバンダンス解析は、細菌とその関連代謝産物の関係性を明らかにするものです。この情報は、IBDを治療するための潜在的な治療標的を特定するための基礎となり得ます。例えば、IBD患者の糞便で減少するF. prausnitziiは、SCFAおよびヒポキサンチンレベルと正の相関があった（オンライン補足表17）。ヒポキサンチンはF. prausnitziiがアデニンの代謝によって生成することができ54、腸の上皮を維持する役割を果たす55。同様に、IBD患者の生物多様性サンプルに多く含まれるR. gnavusは56、トリプタミンのレベルと正の相関があった（オンライン補足表17）。トリプタミンの蓄積は、セロトニン受容体4の活性化を介して腸の運動性を高め、一部の患者が発作時に腸の通過時間が短くなることを説明する可能性があります58。今回の結果と同様に、過敏性腸症候群や下痢の患者においてトリプタミンのレベルが高く、R. gnavusの代謝活性と関連していることが報告されています59）。さらに、S. parasanguinisとイミダゾールプロピオン酸の間に観察された正の相関は、この細菌がヒスチジンを分解する能力によって説明できるかもしれません60。イミダゾールプロピオン酸は、2型糖尿病の発症リスクと関連しており、IBDに関与するmTORC1シグナル伝達経路61 62の活性化を制御しています63。
全体として、共生微生物群集と異種微生物群集の間で代謝物組成が大きく異なること、および代謝物と細菌種の間に強い共起性があることから、糞便メタボロミクスは腸内細菌叢の代謝活動を部分的に反映しているという考え方が支持されます。これらの関係の方向性を決定し、疾患の進行に与える影響を評価するためには、微生物と代謝物の関連性をさらに機能的に検証し、長期的にモニタリングすることが必要です。
IBDの新規バイオマーカーとしての糞便中代謝物
IBDの診断において、現在の侵襲的なゴールドスタンダードである大腸内視鏡検査とは対照的に、我々は糞便代謝物の非侵襲的な疾患診断法としての可能性を実証した。ラクトシル-N-パルミトイル-スフィンゴシン（d18：1/16：0）とL-ウロビリンという2つの代謝物のレベルの比が、我々のコホートではIBDのバイオマーカーとして特定されました（オンライン補足表10）。北米の縦断的コホート3では、スフィンゴ脂質（セラミド（18:1/16:0））とL-ウロビリンの比率が、IBD患者において非IBD対照と比較して一貫して高いことが確認されており、今回の知見を裏付けています（補足図7）。この2つの分子を標的とした糞便測定は、糞便カルプロテクチン検査と組み合わせることで、比較的容易に実施することができる可能性があります。
補足資料
[gutjnl-2022-328048supp010.pdf]
本研究のコホートは、主にIBDの病歴が長期にわたる被験者で構成されていることに留意する必要がある。したがって、新たにIBDと診断された患者さんや、他の消化器疾患の患者さんにおいて、同定されたバイオマーカーの有効性を確認する必要があります。
最後に、アンターゲットメタボロミクスアプローチの限界を認識することも重要である。本研究では、比較的有病率の高いアノテーション分子に焦点を当てましたが、相当数の代謝物が未同定のままであり、その生理的意義は不明です。データセットで検出された代謝物の約3分の1（1684代謝物のうち492代謝物）は、以前に特徴付けられた化合物と関連付けることができず、人体内の分子多様性を完全に特徴付けるためにさらなる努力が必要であることが強調されました。さらに、アンターゲットメタボロミクスは半定量的であるため、糞便中の各代謝物の正常な濃度範囲を確立することには限界があります。
結論として、本研究は、健康状態および腸の炎症という文脈における糞便代謝物の詳細な特徴を示し、既知の疾患関連分子を再現し、疾患の不均質性に関する知識を拡大するものです。さらに、微生物叢、食事と糞便代謝物レベルの間に複数の関連性を突き止め、IBDにおける代謝物ベースまたは微生物叢ベースの介入と治療のさらなる調査のための貴重なリソースになると考えています。
補足資料
[gutjnl-2022-328048supp003.zip]
補足資料
[gutjnl-2022-328048supp011.pdf]
データの利用可能性に関する声明
データは、合理的な要求があれば入手可能です。糞便代謝物のレベルと細菌分類の存在量を含む表は、原稿に添付されている。本研究で使用したメタゲノム、宿主ゲノム、表現型の生データは、European Genome-Phenome Archiveデータリポジトリから入手可能です： 1000 Inflammatory bowel disease (IBD) cohort (https://www.ebi.ac.uk/ega/datasets/EGAD00001004194), Lifelines DEEP cohort (https://www.ebi.ac.uk/ega/datasets/EGAD00001001991). これには、対応するデータアクセス委員会に趣意書を提出することが含まれる。コードは、https://github.com/GRONINGEN-MICROBIOME-CENTRE/Fecal_Metabolites_IBD で一般に公開されています。
倫理に関する記述
掲載に関する患者さんの同意
該当なし
倫理的承認
この研究は、ヒトの参加者を含み、M12.1139652008.338の承認を得ています。参加者は、本研究に参加する前に、インフォームド・コンセントを得た。
謝辞
Kate Mc Intyreの英文校正に感謝する。
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補足資料
補足データ
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データ補足2
データ補足3
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データ補足9
データ補足10
データ補足11
フットノーツ
Twitter @arnauvich、@CollijValerie、@HannahAugustijn、@SashaZhernakova、@RGacesa、@jingyu_fu
SH、SA-S、VCは同等に貢献した。
貢献者 AVVとRKWが研究をデザインした。AVV、SH、SA-S、RG、HEAがデータ解析に貢献した。AVVとSHは原稿を執筆した。BHDJは研究室で試料を扱った。LAB、SH、SA-S、VC、HEA、JF、AZ、AAG、JP、JS、CG、GA-A、RAAARおよびRKWは原稿を批判的に検討した。AVVとRKWは保証人として全体の内容に責任を持つ。
資金提供この研究は、Takeda Development Center Americasから資金提供を受けています。JFは、オランダ心臓財団IN-CONTROL（CVON2018-27）、ERC Consolidator grant（助成協定番号101001678）、NWO-VICI grant VI.C.202.022 およびオランダ政府教育文化科学省から資金提供を受けたNWO Gravitation project (024.003.001) である Netherlands Organ-on-Chip Initiativeから支援を受けています。AZは、オランダ心臓財団IN-CONTROL（CVON2018-27）、ERC Starting Grant 715772、NWO-VIDI grant 016.178.056, ZONMW MEMORABEL grant 733050814、NWO Gravitation grant Exposome-NL (024.004.017) によりサポートを受けています。RKWは、HORIZON-HLTH-2022-STAYHLTH-02-0およびSeerave財団の支援を受けています。
競合利益本試験は、Takeda Development Center Americasから資金提供を受けました。RKWは武田薬品のコンサルタントを務め、武田薬品およびジョンソン・エンド・ジョンソン製薬から無制限の研究助成を受け、AbbVie、MSD、OlympusおよびAstraZenecaから講演料を受け取った。GA-A、CG、JS、JPおよびAAGは、本試験実施時に武田薬品工業の社員であるか、または社員であった。開示事項はない：他のすべての著者は、何も開示することはありません。
患者および一般市民の参加この研究のデザイン、実施、報告、普及計画には、患者および一般市民は関与していない。
証明と査読委託されたものではなく、外部査読を受けたものである。
補足資料この内容は著者から提供されたものである。BMJ Publishing Group Limited（BMJ）の審査を受けておらず、査読を受けていない可能性があります。議論されている意見や推奨事項は、あくまで著者のものであり、BMJが承認したものではありません。BMJは、本コンテンツを信頼することによって生じるすべての責任と義務を否認します。コンテンツに翻訳されたものが含まれる場合、BMJは翻訳の正確性と信頼性（地域の規制、臨床ガイドライン、用語、医薬品名、医薬品用量を含むがこれに限定されない）を保証せず、翻訳と翻案から生じるいかなるエラーおよび/または省略、またはその他の責任を負わない。
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