食品添加物マルトデキストリンは小胞体ストレスによる粘液の枯渇を促進し、腸管炎症を悪化させる

食品添加物マルトデキストリンは小胞体ストレスによる粘液の枯渇を促進し、腸管炎症を悪化させる
フェデリカ・ラウディジ
ダビデ・ディ・フスコ
Vincenzo Dinallo
Thomas Thornton MacDonald
イワン・モンテレオーネ
ジョバンニ・モンテレオーネ
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オープンアクセス公開日:2018年9月11日DOI:https://doi.org/10.1016/j.jcmgh.2018.09.002
プラムX メトリクス

背景とねらい
乳化剤、安定剤、または増量剤などの食品添加物は、西洋の食事に存在し、その消費量は増加している。しかし、食品添加物が腸のホメオスタシスに及ぼす影響についてはほとんど知られていない。本研究では、これらの食品添加物の一部が腸の炎症に及ぼす影響について検討した。
方法
マウスにマルトデキストリン（MDX）、プロピレングリコール、動物性ゼラチンを含む飲料水を与え、デキストラン硫酸ナトリウムまたはインドメタシンを作用させた。並行して、MDX強化食を与えたマウスに、小胞体ストレス阻害剤であるタウロスデオキシコール酸（TUDCA）を投与した。大腸組織について、トランスクリプトーム解析、リアルタイムポリメラーゼ連鎖反応、ムチン2発現、リン酸化p38マイトジェン活性化タンパク質（MAP）キナーゼ定量化、H&E染色を行った。粘膜関連微生物叢の構成は、16SリボソームRNA配列決定によって特徴づけられた。In vitro実験では、マウス腸管陰窩とヒト粘液分泌細胞HT29-メトトレキサート処理細胞株を、TUDCAまたはp38 MAPキナーゼ阻害剤の存在下または非存在下にMDXで刺激した。
結果
MDXを豊富に含む食事は、プロピレングリコールや動物性ゼラチンではなく、両モデルにおいて腸管炎症を増悪させた。MDXの作用機序を解析したところ、小胞体ストレスのセンサーであるinositol requiring protein 1βが杯細胞で発現上昇し、mucin-2の発現が低下したが、粘膜関連微生物叢には有意な変化が見られなかった。マウス腸管陰窩およびHT29-メトトレキサート処理細胞株細胞をMDXで刺激すると、p38 MAPキナーゼ依存的にinositol requiring protein 1βが誘導されることが示された。TUDCAはMDX投与マウスのムチン-2枯渇を抑制し，大腸炎を抑制した．
結論
MDXは腸管上皮細胞のERストレスを増加させ、その下流で粘液産生を低下させ、大腸炎感受性を増強させることがわかった。
図解要約
図 サムネイル fx1
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キーワード
大腸炎
IBD
アンフォールドタンパク質応答
腸管上皮
本論文で使用した略語
ATF（activating transcription factor）、Chop（C/EBP homologous protein）、DSS（dextran sodium sulfate）、ER（endoplasmic reticulum）、Ern-1（endoplasmic reticulum to nucleus signaling 1）、GEL（動物ゼラチン）、Grp78（glucose-regulated protein）。Grp78（グルコース制御タンパク質）、HT29-MTX（HT29-メトトレキサート処理細胞株）、IBD（炎症性腸疾患）、IEC（腸管上皮細胞）、IL（インターロイキン）、IRE（イノシトール要求性酵素）。Lcn-2（リポカリン-2）、LPMC（固有層単核細胞）、MAPK（マイトジェン活性化プロテインキナーゼ）、MDX（マルトデキストリン）、Muc-2（ムチン2）、OTU（運用分類単位）、PBS（リン酸緩衝食塩水）。PCR (polymerase chain reaction), PG (propylene glycol), p-p38 (phosphorylated p38), siRNA (small interfering RNA), TUDCA (tauroursodeoxycholic acid), UPR (unfolded protein response).
概要
炎症性腸疾患（IBD）は、潰瘍性大腸炎およびクローン病という2つの慢性腸疾患を指す用語です。1 IBDの病因は依然として不明ですが、腸内細菌叢の構成成分に対する過剰な腸管免疫反応を引き起こす環境要因と遺伝要因の相互作用によって、病的プロセスが生じることが示唆されています2,3。 3 過去数十年の間に、以前は発症率の低かった地域（例：アジア）において、これらの国々の西洋化が進むと同時に、IBDの発症率が増加しています4, 5, 6, 7 疫学調査では、西洋の食事要因、特に過体重や肥満がIBDの発症に影響することが示されています8, 9 しかし、どの食事要因がIBDの発症に関与しているか、また、これらの要因が腸のホメオスタシスにどのような影響を及ぼすかは依然として不明です。12, 13 実際、脂肪中心の食事を与えたマウスでは、胆汁酸の生産が変化し、Bilophila wadsworthiaの存在量と活動が増加し、その結果、実験大腸炎を悪化させることが示されました12。また、食塩や飽和脂肪酸などの欧米食が粘膜免疫細胞に直接作用し、病原性反応を増強する可能性もある14, 15, 16。
西洋の食事には、食品添加物も多く含まれており、それらは一般に、包装された食品に安定剤、コーティング材、増量剤として添加されている。米国食品医薬品局（FDA）はこれらの食品添加物を安全なものとして認めているが、その使用は動物およびヒトの腸管病変の発生に関連している。19, 20, 21, 22, 23 例えば、合成食品乳化剤のポリソルベート80とカルボキシメチルセルロースはヒト微生物相に直接作用してその炎症誘発能を増大させる19。また、食品加工時に充填剤や増粘剤として一般的に使用される多糖類のマルトデキストリン（MDX）が、微生物の表現型や宿主の抗菌性防御を変化させることも示されている。NickersonとMcDonaldは、MDXが "adherent and invasive E coli "株の細胞接着性を高めることを報告し、in vivo研究では、MDX単独では疾患を誘発しないにもかかわらず、サルモネラの経口感染によりMDX飼育マウスではネコの細菌負荷が増加することが示されている20。
そこで、本研究では、欧米食で使用されている食品添加物が腸のホメオスタシスを乱し、腸の炎症を悪化させるかどうかを検討した。
結果
MDX強化食は腸管炎症を増悪させる
野生型Balb/cマウスにMDX（5％）、プロピレングリコール（0.5％）、動物ゼラチン（GEL）（5 g/L）を飲水で希釈し、食品添加物が腸管炎症を促進・悪化させるかどうかを検討した。これらの化合物は、臨床的、組織学的に腸の炎症を引き起こすことはなく、炎症性サイトカインも変化させなかった（図1A-C）。Lipocalin-2 (Lcn-2) は主に好中球によって産生される分泌タンパク質で、大腸炎を誘発すると糞便中に放出される25。したがって、Lcn-2は腸の炎症に関する高感度で非侵襲性のバイオマーカーであると考えられている。MDX（5％）、PG（0.5％）、GEL（5g/L）投与マウスの便中Lcn-2を測定したところ、コントロールマウスと比較して大きな変化は認められず、これらの添加物投与マウスは大腸炎を起こさないことが確認された（図1D）。しかし、MDX添加マウスはデキストラン硫酸ナトリウム（DSS）投与により、有意に大きな体重減少（図2A）、より顕著な炎症細胞の浸潤、大きな上皮障害（図2BおよびC）を示し、より重症の大腸炎を発症した。また、MDX投与マウスは、PGまたはGEL強化食投与マウスやコントロールマウスと比較して、インターロイキン（IL）1βおよびLcn-2の発現が増加した（図2DおよびE）。MDXがどの程度の濃度で実験的大腸炎を悪化させるかを確認するために、1%から5%のMDX濃度でマウスを飼育したところ、MDXは実験的大腸炎を悪化させた。3%のMDXを与えたマウスは、飲料水を与えたコントロールマウスと比較して、より顕著な炎症浸潤を示したにもかかわらず、腸の炎症に対するMDXの悪影響は、5%の濃度で使用した場合に顕著に現れた（図2FおよびG）。そのため、以降の実験はすべて5%MDXで行った。
図 サムネイル gr1
図1MDX、PGおよびGELは腸の炎症を誘発しない。(A) 野生型マウスを飲料水で希釈した5%MDX、0.5%PG、5g/L GELに45日間暴露、または暴露せずに殺処分した結腸切片の代表的H&E染色図である。図は、3つの独立した実験から得られた9-12匹/群の代表図である。スケールバー 100 μm。(B）パネルAに示したように給餌したマウスから採取した大腸組織の組織学的スコア。データは、3つの独立した実験から9〜12匹／群を用いて作成し、平均±SDとして表現した。群間の差は、1ウェイ分散分析に続いて、ボンフェローニポストホック検定を使用して比較した。(C）パネルAに示したように給餌したマウスから採取した結腸組織におけるTnf-α及びIL1βRNA転写物の発現。データは、3つの独立した実験から9〜12匹／群を用いて作成した。グラフの各点は、1匹のマウスの結腸における特定の転写物のRNA発現を示し、横棒は中央値を示す。グループ間の差は、クラスカル-ウォリス検定を用いて比較した。(D）パネルAで示したように給餌したマウスにおける糞便中のLcn-2タンパク質のレベルを示す散布図。横棒は中央値を示す。mRNA、メッセンジャーRNA、TNF、腫瘍壊死因子。
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図 サムネイル gr2
図2MDX強化食は腸の炎症を悪化させる。(A）野生型マウスに5%MDX、0.5%PG、または5g/L GEL（いずれも飲料水で希釈）を45日間投与し、投与35日目からDSS（飲料水中1.75%）でチャレンジさせた。体重は35日目から死亡（45日目）まで毎日記録した。データは、3つの独立した実験から1グループあたり10-12匹のマウスを用いて作成し、平均±SEMとして表した。群間の差は、1ウェイ分散分析に続いて、ボンフェローニポストホック検定を使用して比較した。DSS vs DSS + MDX, **P ≤ .01。(BおよびC）パネルAに示したようにDSSを単独またはMDX、PG、GELと組み合わせて投与し、45日目に殺したマウスから採取した結腸切片の代表的なH&E染色および組織学的スコア。データは、3つの独立した実験から1群あたり10-12匹のマウスを用いて作成し、平均値±SDで表した。群間の差は、1ウェイ分散分析に続いてボンフェローニポストホックテストを用いて比較した。DSS vs DSS + MDX, **P ≤ .01. (B) スケールバー 100 μm。(DおよびE）IL1βおよびLcn-2 RNA発現を、パネルAに示したように処置し、45日目に殺したマウスから採取した大腸組織でリアルタイムPCRにより評価した。データは、3つの独立した実験から1群あたり10-12匹のマウスを用いて作成した。グラフの各ポイントは、単一のマウスの結腸における特定の転写物のRNA発現を示し、横棒は中央値を示す。群間の差は、クラスカル-ウォリス検定を用いて比較した。DSS + MDX vs DSS, **P ≤ .01。(FおよびG）パネルAに示したように、DSS単独または濃度の増加したMDXとの組み合わせで処理し、45日目に殺したマウスから採取した結腸切片の代表的なH＆E染色および組織学的スコア。データは、2つの独立した実験から1群あたり5匹のマウスを用いて作成し、平均値±SDで表した。群間の差は、1ウェイ分散分析に続いてボンフェローニポストホックテストを用いて比較した。5% DSS + MDX vs DSS, **P ≤ .01. (HおよびI）5％MDXを飲料水で希釈し35日間暴露した後、インドメタシン（5 mg/kg）を単回皮下投与した野生型マウスから採取した回腸切片の代表H＆E染色および組織学的スコア。インドメタシン注射後24時間後にマウスを死亡させ、組織を採取して病理組織学的解析を行った。データは、3つの独立した実験の1グループあたり10-12匹のマウスを用いて作成し、平均値±SDで表した。群間の差は、1ウェイ分散分析に続いてボンフェローニポストホック検定を使用して比較した（*P ≤ .05）。スケールバー。mRNA, メッセンジャーRNA.
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MDX投与マウスの大腸炎が黄砂の取り込み増加によるものであることを除外するために、インドメタシンを単回皮下投与して腸管炎症を誘発する別のモデルを用いた。MDX投与マウスは、コントロールと比較して、より顕著な回腸粘膜傷害を示した（図2HおよびI）。これらのデータは、飲料水中のMDXの摂取が腸の炎症を悪化させることを示唆している。
MDXは腸管上皮細胞における小胞体ストレス応答を活性化する
MDXが腸管障害を増強するメカニズムを明らかにするために，MDX投与マウスから分離した大腸サンプルのマイクロアレイ解析を行った。MDX投与マウスでは、脂質・糖質代謝やタンパク質の糖鎖修飾に関与するいくつかの遺伝子の発現が上昇した（図3A）。また、MDX投与マウスでは、通常、小胞体ストレスと呼ばれる現象で小胞体に未変化タンパク質が蓄積すると活性化する、未変化タンパク質応答（UPR）に関与する分子の転写産物も増加していることがわかった。UPR経路の活性化は、翻訳の減衰、アンフォールドタンパク質のリフォールディング、不可逆的にアンフォールドしたタンパク質の分解を促進し、下流の効果として小胞体機能の回復をもたらす。UPR関連遺伝子の中で、イノシトール要求酵素（IRE）1βタンパク質をコードするErn-2は、最も発現量の差が大きい遺伝子であった（図3A）。大腸サンプルのリアルタイムポリメラーゼ連鎖反応（PCR）測定では、マイクロアレイの結果を確認し、他の2つのIRE1/UPR関連遺伝子であるErn-1とXbp1sの発現が増加した（図3B）。一方、MDXはグルコース制御タンパク質（Grp78）、活性化転写因子6（ATF6）、ATF4、CCAAT/エンハンサー結合タンパク質相同タンパク質（Chop）に有意な変化をもたらさなかった（図3C）ことから、MDXはIRE1依存性のシグナル伝達事象のみを誘導することが示唆された。さらに、大腸試料から分離した腸管上皮細胞（IEC）および固有層単核細胞（LPMCs）のRNA転写物を解析したところ、IRE1β/IRE1αの誘導は腸管上皮区画に限定されることが示された（図3D）。未処理マウスの腸管陰窩をMDXでin vitro刺激すると、Ern-1、Ern-2、Xbp1sのRNA転写が促進された（図3E）。
図3MDXによるErn-1、Ern-2、Xbp1sの発現上昇
図3MDXは腸管上皮細胞においてIRE1依存性UPR経路をアップレギュレートする。(A) 5％MDX存在下または非存在下で45日間、黄砂を含まない飲料水に暴露したマウスから分離した大腸サンプルのマイクロアレイによる発現差、脂質および糖質代謝、タンパク質糖鎖形成、UPR経路に関連する遺伝子のlog2（倍数変化）を示すVolcano plotおよびHeat map。(B) Ern-2、Ern-1、およびXbp1s RNAの発現は、全大腸試料においてリアルタイムPCRで評価した。データは、3つの独立した実験から1群あたり11-12匹のマウスを用いて作成した（*P ≤ .05, **P ≤ .01）。グラフの各ポイントは、1匹のマウスの結腸における特定の転写物のRNA発現を示し、横棒は中央値を示す。グループ間の差は、Mann-Whitney U 検定を用いて比較した。(C）パネルAで示した処理を行ったマウスから単離した大腸サンプルにおけるGrp78、Atf6、Atf4、およびChop RNA転写物を示す散布図である。グラフの各ポイントは、1匹のマウスの結腸における特定の転写物のRNA発現を示し、横棒は中央値または平均値±SDを示す。グループ間の差は、Mann-Whitney U検定または2-tailed Student t検定を用いて比較した。(D）パネルAに示したように処理した3〜4匹のマウスのプールから単離したIECおよびLPMCにおけるErn-2およびErn-1 RNA発現を示す代表的なヒストグラムであり、例は、同様の結果が得られた2つの独立した実験の代表である。(E）未処理マウスの結腸から単離し、MDXの存在下または非存在下で30分間培養した腸陰窩におけるErn-2、Ern-1、およびXbp1s RNA発現を示す散布図である。データは3つの独立した実験から6-7匹のマウスから単離した陰窩を用いて作成した（*P ≤ .05, **P ≤ .01）。左：横棒は中央値を示し、群間の差は両側Mann-Whitney U検定を用いて比較した。中・右：横棒は平均値±SDを示し、群間の差はStudent t testを用いて比較した。 mRNA, messenger RNA; UT, untreated.
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MDX強化食は腸管粘液バリアーを変化させる
IRE1βの発現は、小腸および結腸の杯細胞の小胞体膜に限定されている26。腸粘液層の主要な高分子成分はムチン糖タンパク質であるムチン-2（Muc-2）であり、システインに富む高グリコシル化ドメインを含み、ERおよびゴルジ体で広範囲な翻訳後修飾が必要である27。28 大腸切片の免疫蛍光分析により、MDXはMuc-2の染色性を著しく低下させ、グリコシル化（成熟）Muc-2の発現も低下させた（図4A）。さらに、periodic acid-Schiff/Alcian blue染色により、MDX強化食が粘液量に負の影響を及ぼすことが確認された（図4B）。一方、MDXはMuc-2 RNAの転写を増加させた（図4C）。これは、Muc-2タンパク質分泌の減少に対する代償機構の活性化を反映する所見と考えられる。PGまたはGELを投与されたマウスは、大腸の粘液減少を認めなかった（図4D）。ゾヌリン-1、ゾヌリン-2、クローディン-2、およびクローディン-7のRNA転写物は、MDX曝露後も変化しなかった（図4E）。MDX投与マウスの大腸切片では、腸管上皮のアポトーシス誘導を示すcreaved caspase-3の染色が増強された（図4F）。
図サムネイルgr4
図4MDX強化食は腸管粘膜バリアを変化させる。(A）5％MDX存在下または非存在下で35日間飲料水に暴露したマウスから単離した大腸切片におけるMuc-2（緑）および糖化（成熟）Muc-2（赤）の免疫蛍光分析。核は4′,6-diamidino-2-phenylindole（DAPI）（青）で染色されている。図は4つの別々の実験の代表である。スケールバー：25μm。右図。クリプトあたりのMuc-2発現細胞数。データは、大腸切片あたり4つの異なるフィールドでカウントされた陽性細胞の平均±SDを示し、4つの独立した実験から1グループあたり8匹のマウスを用いて作成された。群間の差はStudent t testを用いて比較した(***P ≤ .001)。(B) パネルAに示した方法で処置したマウスから採取した大腸切片の過ヨウ素酸シッフ (PAS) -アルシアンブルー (AB) 染色。右図。クリプトあたりのアルシアンブルー／過ヨウ素酸シッフ発現細胞数。データは、大腸切片あたり4つの異なるフィールドでカウントされた陽性細胞の平均値±SDを示し、3つの独立した実験から1グループあたり8匹のマウスを用いて作成された。群間の差は、2-tailed Student t testを用いて比較した（***P ≤ .001）。スケールバー。100μm。(C）5％MDX存在下または非存在下で35日間飲料水に暴露したマウスから採取した結腸組織におけるMuc-2 RNA発現を示す散布図である。データは、3つの独立した実験から1グループあたり10匹のマウスを用いて作成した。グラフの各ポイントは、1匹のマウスの結腸における特定の転写産物のRNA発現を示し、横棒は中央値を示す。群間の差は、Mann-Whitney U 検定を用いて比較した（*P ≤ .05）。(D）5％MDX、0.5g/L GEL、または0.5％PGの存在下または非存在下で35日間飲料水に暴露したマウスから分離した結腸切片におけるMuc-2（緑）の免疫蛍光法解析。核はDAPI（青）で染色した。図は3つの実験の代表例である。スケールバー。50 μm。右図。クリプトあたりのMuc-2発現細胞数。データは、結腸切片あたり4つの異なるフィールドでカウントされた陽性細胞の平均±SDを示し、3つの独立した実験から1グループあたり5-7匹のマウスを用いて作成された。群間の差は、両側スチューデントt検定を用いて比較した（***P ≤ .001）。(E）パネルAに示したように処置したマウスから採取した結腸組織におけるゾヌリン-1、ゾヌリン-2、クローディン-2、およびクローディン-7 RNA発現を示す散布図であり、データは、3つの独立した実験から1群あたり10匹のマウスを用いて作成した。グラフの各ポイントは、1匹のマウスの結腸における特定の転写物のRNA発現を示し、横棒は中央値を示す。群間の差は、Mann-Whitney U 検定を用いて比較した（*P ≤ .05）。(F)パネルAで示した方法で処理したマウスの結腸切片で、切断型カスパーゼ3陽性細胞を評価した。スケールバー。100 μm。右図。クリプトあたりの切断型カスパーゼ-3陽性細胞の数。データは、結腸切片あたり4つの異なるフィールドでカウントされた陽性細胞の平均±SDを示し、3つの独立した実験から1グループあたり6〜7匹のマウスを用いて作成された。群間の差は、Student t testを用いて比較した（***P ≤ .001）。Cldn, claudin; mRNA, messenger RNA; ZO, zonula occludens.
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MDXによる小胞体ストレスの誘導はp38 Mitogen-Activated Protein Kinaseを介する
次に、MDXが小胞体ストレスを誘導する経路を検討した。粘液分泌細胞であるHT29-メトトレキサート処理細胞株（HT29-MTX）を3％および5％のMDXで刺激すると、Ern-2 RNA転写物がアップレギュレートされた（図5A）。in vivoの結果と一致させるために、その後のin vitroの研究は5%MDXを用いて行った。細胞外コンパートメントにおけるグルコースなどの溶質の濃度上昇は、高張性の増強と関連していた。高張力ストレスはマイトジェン活性化プロテインキナーゼ（MAPK）シグナル伝達経路を介して感知されるため、29, 30 MDXを介したIRE1β誘導にこの経路が関与しているか検討した。HT29-MTX細胞をMDXで処理すると、リン酸化（p）-p38の発現が時間依存的に増加したが、細胞外シグナル制御キナーゼ1/2とc-Jun N-ターミナルキナーゼの活性化は変化しない（図5B）。p38の薬理学的阻害は、MDX誘発のErn-2 RNAの発現をダウンレギュレートした（図5C）。同様の結果は、p38低分子干渉RNA（siRNA）でトランスフェクトしたMDX処理細胞で見られた（図5D）。マウス大腸切片の免疫蛍光法は、MDXの毎日の摂取が上皮細胞におけるp-p38の発現を増強することを示した（図5E）。
図 サムネイル gr5
図5MDXはP38 MAPKを介してIRE1βの発現を誘導する。(A) MDXはHT29-MTX細胞株でErn-2の発現を誘導する。細胞は未処理のまま（UT）、または濃度の増加したMDXとともに1時間培養した。Ern-2 RNAの転写はreal-time PCRで評価した。データは4回の独立した実験から得られた各群10サンプルの平均値±SDである。グループ間の差は、1ウェイ分散分析に続いてボンフェローニポストホック検定を使用して比較した（**P ≤ .01、*P ≤ .05）。(B）HT29-MTX細胞をUTのまま、または5％MDXで刺激し、p-p38、リン酸化extracellular signal-regulated kinase 1/2 (p-ERK1/2) 、リン酸化c-Jun N-terminal kinase (p-JNK) 、β-アクチン (β-act) の発現をWestern blotにより分析した。同様の結果が得られた4つの代表的な実験のうちの1つを、デンシトメトリー解析とともに示す（下段）。データは平均値±SD。グループ間の差は、1ウェイ分散分析に続いてボンフェローニポストホック検定を使用して比較した（*P ≤ .05, **P ≤ .01, ***P ≤ .001）。(C) MDXを介したp38活性化に対するp38阻害剤（p38i）の効果。HT29-MTX細胞をp38i（10μmol/L）またはジメチルスルホキシド（DMSO）（ビヒクル）存在下または非存在下で1時間MDXで刺激した。p-p38およびp38発現をウェスタンブロットで評価した。同様の結果が得られた4つの代表的な実験のうちの1つを、デンシトメトリー分析（下パネル）とともに示す。データは平均値±SD。グループ間の差は、1ウェイ分散分析に続いてボンフェローニポストホック検定を使用して比較した(***P ≤ .001)。右図 MDXを介したErn-2発現に対するp38iの効果。HT29-MTX細胞をp38i（10μmol/L）またはDMSO（ビヒクル）存在下または非存在下でMDXで1時間刺激し、Ern-2 RNA転写物をリアルタイムPCRで評価した。データは5つの独立した実験の平均±SDである。グループ間の差は、1ウェイ分散分析に続いてボンフェローニポストホック検定を使用して比較した（*P ≤ .05）。(D) MDXによるErn-2発現上昇に対するp38ノックダウンの効果。HT29-MTX細胞をコントロールまたはp38 siRNA（それぞれCTRまたはp38 siRNA）で18時間トランスフェクトし、その後5% MDXで1時間刺激するかしないかした。p-p38、p38およびβ-actin発現の代表的なウェスタンブロットを、デンシトメトリー解析とともに左パネルに示す。データは3回の独立した実験の平均値±SDである。グループ間の差は、両側Student t testを用いて比較した（**P ≤ .001）。右図 Ern-2 RNA転写物の発現をリアルタイムPCRで評価した。データは5つの独立した実験の平均±SDである。群間の差は、1ウェイ分散分析に続いてボンフェローニポストホックテストを用いて比較した（*P≤.05）。(E）45日目に殺したMDX投与マウスおよびコントロールから単離した結腸試料におけるp-p38（緑色）の免疫蛍光法解析。図は、同様の結果が得られた3つの別々の実験の代表的なものである。右図は、結腸切片のフィールドあたりのp-p38発現細胞の数および強度を示す。データは平均値±SDで表され、3つの独立した実験から1群あたり3-5匹のマウスを用いて作成された。mRNA、メッセンジャーRNA；p38 tot、総p38。
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小胞体ストレスの抑制はMDX投与マウスの大腸炎を改善する
MDX投与後のマウスの大腸炎罹患率の上昇がERストレス/UPR経路に依存することを機構的に証明するために、化学シャペロンであるタウルソデオキシコール酸（TUDCA）でERストレスを阻害した。まず、HT29-MTX細胞をTUDCAで前処理すると、MDXによるErn-2 RNAの発現が有意に減少したことから、TUDCAがERストレスを阻害することを確認した（図6A）。次に、MDX投与マウスにTUDCAを投与すると、Ern-2、Ern-1、Xbp1s RNAの発現誘導が減少し、Muc-2の産生が正常化することを示した（図6BおよびC）。これらの実験において、TUDCA投与は21日目に開始された。これは、我々のデータがMDX投与後のこの時点でERストレスの初期兆候を示したからである（個人的な未発表の観察）。最後に、DSS大腸炎の経過に対するTUDCAの調節効果を検証した。TUDCAを投与したマウスは、体重の変化の少なさ、組織学の改善（図6D〜F）、およびIL1βおよびLcn-2の転写の低下（図6GおよびH）によって証明されるように、MDX投与後のDSS大腸炎の著しい減退を示した。
図サムネイルgr6
図6ERストレス阻害は、MDX媒介Ern-2アップレギュレーションを減少させ、MDX飼育マウスの大腸炎を改善する。(A）HT29-MTX細胞をTUDCA（10μmol/L）またはジメチルスルホキシド（ビヒクル）で前処理した後、MDXで1時間刺激した。Ern-2 RNAの転写はリアルタイムPCRで解析した。データは4つの独立した実験の平均値±SDである。群間の差は、両側Student t testを用いて比較した（*P ≤ .05）。(BおよびC）野生型マウスを5％MDX添加飲料水に45日間暴露し、21日目から隔日にTUDCA（250 mg/kg腹腔内）を注射するかしないかした。45日目にマウスを殺し、大腸組織を分離し、(B) Ern-2, Ern-1, Xbp1s RNA転写物および(C) Muc-2タンパク質発現をそれぞれリアルタイムPCRおよび免疫蛍光法により評価した。(B）データは、3つの独立した実験から1グループあたり7-10匹のマウスを用いて作成した。グラフの各点は、1匹のマウスの結腸における特定の転写物のRNA発現を示し、横棒は中央値を示す。群間の差は、Mann-Whitney U 検定を用いて比較した（*P ≤ .05）。(C)写真は、同様の結果が得られた4つの別々の実験の代表的なものである。スケールバー：25μm。(D) 野生型マウスを5%MDX添加飲料水に45日間暴露し、21日目から隔日にTUDCA（250 mg/kg）を腹腔内投与したか否かを判定した。35日目から死亡（45日目）まで大腸炎を誘発するために1.75%DSSに暴露し、体重を1日おきに記録した。データは、3つの独立した実験から1グループあたり8-9匹のマウスを用いて作成し、平均値±SEMとして表した。群間の差は、1ウェイ分散分析に続いてボンフェローニポストホック検定を使用して比較した（**P ≤ .01）。(EおよびF）パネルDに示したように処置し、45日目に殺したマウスの結腸切片の代表的なH＆E染色。 F）散布図は、組織学的スコアを示す。データは、3つの独立した実験から1群あたり8〜9匹のマウスを用いて作成し、平均±SDとして表した。群間の差は、1ウェイ分散分析に続いてボンフェローニポストホックテストを用いて比較した（*P ≤ .05; **P ≤ .01）。(GおよびH）パネルDに示したように処置し、45日目に殺したマウスから採取した結腸組織における（G）IL1βおよび（H）Lcn-2 RNA発現を示す代表的な散布図である。グラフの各点は、単一のマウスの結腸における特定の転写物のRNA発現を示し、横棒は、中央値または平均値±SDを示す。データは、3つの独立した実験から1群あたり8〜9匹のマウスを用いて作成した。グループ間の差は、クラスカル-ワリス検定または1ウェイ分散分析に続いてボンフェローニポストホック検定を使用して比較した（*P ≤ .05）。DAPI, 4′,6-diamidino-2-phenylindole; mRNA, messenger RNA.
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MDX強化食は粘膜関連微生物叢に影響を及ぼさない
大腸サンプルの16S RNAシーケンスによる微生物叢組成の問い合わせでは、MDX投与マウスは、植物門および関連クラスの観点から微生物叢組成に変化を示さず（図7AおよびB）、大腸菌属の頻度はグループ間で低く（0.1％未満）、また、TUDCA投与は微生物叢組成に変化を示さず、大腸菌属の頻度はグループ間で低く（0.1％未満）。TUDCA投与は、微生物叢組成の変化と関連していなかった（図7AおよびB）。
図 サムネイル gr7
図7粘膜関連微生物叢に対するMDXの効果。(AおよびB）野生型マウスを5％MDX添加飲料水に45日間暴露し、21日目から隔日にTUDCA（250 mg/kg腹腔内）を注射するかしないかを決定した。対照マウスは45日間飲料水を摂取した。(A)大腸粘膜関連細菌叢について、各菌種の相対的な存在量を示す。横棒は中央値を示す。データは、2つの独立した実験から、1群あたり4-7匹のマウスを用いて作成した。群間の差は、Kruskal-Wallis検定を用いて比較した（*P ≤ .05）。(B) パネルAで示した方法で処置したマウスの粘膜関連細菌の非重み付けおよび重み付けしたUniFrac距離行列の主座標分析(PCoA)。
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MDX強化食の長期摂取による低グレードの腸管炎症の誘発
ムチン欠損マウスの研究から、持続的な粘液減少が腸の病態を引き起こすことが示唆された。28, 31, 32, 33 そこで、MDX濃縮食の長期摂取が腸の炎症の発生を促進するかどうかを評価した。MDXを10週間摂取させたマウスでは、体重および便の硬さに有意な変化は見られなかった（図8AおよびB）。しかし、そのような動物は、コントロールマウスと比較して、局所的な炎症性浸潤、腺構造の歪み、浮腫、およびIL1β、Lcn-2、およびErn-2の転写物の増加によって特徴付けられる低悪性度の腸の炎症を示した（図8C-E）。予想通り、MDXを投与されたマウスは、Muc-2タンパク質の顕著な減少を有していた（図8F）。
図 サムネイルgr8
図8MDX強化食の長期投与による低グレードの腸管炎症の誘発。野生型マウスを飲料水で希釈した5%MDXに10週間暴露した。(A）体重は死亡（70日目）まで2週間ごとに記録した。データは、3つの独立した実験から1群あたり10-12匹のマウスを用いて作成し、平均±SEMで表した。群間の差は、両側スチューデントt検定を用いて比較した。(B）5％MDXを飲料水で希釈したものを10週間投与したマウスの便の粘度を示す散布図である。データは、3つの独立した実験の1群あたり10〜12匹のマウスを用いて作成し、平均値±SDとして表した。群間の差は、2-tailed Student t testを用いて比較した。(CおよびD）5%MDXを添加した飲料水または添加しない飲料水に10週間暴露した野生型マウスの結腸切片の代表的なH&E染色と組織学的スコア。スケールバー 100 μm。データは3回の独立した実験から1群あたり10-12匹のマウスを用いて作成し、平均値±SDで表した。群間の差は、両側Student t testを用いて比較した（**P ≤ .01）。(E）パネルAに示したように給餌したマウスから採取した結腸組織におけるIL1β、Lcn-2、およびErn2 RNA転写物の発現データ：3つの独立した実験から1群あたり6〜12匹のマウスを用いて作成した。グラフの各点は、1匹のマウスの結腸における特定の転写物のRNA発現を示し、横棒は中央値を示す。群間の差は、Mann-Whitney U 検定を用いて比較した（*P ≤ .05）。(F) MDXを10週間摂取したマウスまたは摂取していないマウスから分離した大腸サンプルにおけるMuc-2（緑色）の免疫蛍光分析。スケールバー：25μm。図は、同様の結果が得られた3つの別々の実験の代表的なものである。右図は、クリプトあたりのMuc-2発現細胞数を示している。データは、結腸切片あたり4つの異なるフィールドでカウントされた陽性細胞の平均±SDを示し、3つの独立した実験から1グループあたり6-7匹のマウスを用いて作成された。群間の差は、両側Student t testを用いて比較した（**P ≤ .01）。(G）パネルAに示したように給餌したマウスにおける15時間空腹時血糖値。データは、2つの独立した実験から1グループあたり4〜5匹のマウスを用いて作成し、平均±SDとして表した。群間の差は、両側Student t testを用いて比較した（***P ≤ .001）。mRNA、メッセンジャーRNA。
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最近の研究では、食品添加物によって誘発される低グレードの炎症が代謝の変化と関連していることが報告されているので、19, 22我々は、長時間のMDX強化食が血糖値を変化させるかどうかを調査した。図8Gに示すように、MDX投与マウスでは、15時間空腹時血糖値がコントロールと比較して高いことが示された（図8G）。
考察
本研究は、欧米食で一般的に使用されている食品添加物が腸内炎症を促進/悪化させるかどうかを確認するために実施された。最初の実験では、MDX、PG、GELという3種類の一般的な食品添加物をそれぞれ45日間毎日摂取しても、明らかな大腸炎は誘発されないことが示された。しかし、PGやGELではなくMDXを与えたマウスは、DSSやインドメタシン投与後に腸の炎症が重症化することが確認された。MDXの濃度（5％）は、乳児用ミルクに含まれる濃度に相当する24が、遠位腸に到達するMDXの量は、マウスに投与された濃度より低い可能性が高い。次に、MDX投与マウスの大腸サンプルのマイクロアレイ解析を行い、そのメカニズムを明らかにしました。MDX投与マウスで最も発現が上昇した遺伝子の中に、上皮細胞におけるERストレス応答の無秩序な活性化を緩和するERストレスのセンサーであるIRE1βをコードするErn-2が含まれていた。実際、IRE1βは腸管上皮細胞や気道粘液細胞に発現しており、Muc-2 RNAのレベルを調節することにより、タンパク質の効率的な折り畳みやムチンの分泌を促進している26, 34。したがって、MDX投与マウスの大腸におけるIRE1βの発現増加は、杯細胞におけるERストレス応答を制限しようとする逆調節機構の活性化を反映していると考えることが妥当であろう。次に、MDXが粘液の産生を変化させるかどうかを検討した。MDX投与マウスでは、Muc-2 RNAの発現は増加していたが、O-linked, glycosylated, mature Muc-2の発現が著しく減少していた。これらの結果は、MDX投与マウスに見られる粘液減少が、杯細胞の発達の欠陥の結果ではなく、Muc-2の成熟／折り畳みと分泌の変化を反映していることを示唆している。また、MDXをマウス腸管小胞および粘液分泌細胞であるHT29-MTXに投与すると、IRE1βの発現が増加することが示された。
MDXはマウスおよびHT29-MTX細胞においてp-p38の発現を増加させたことから、MDX強化食がp38 MAPKを介して腸管上皮細胞のERストレスセンサーIRE1βをトリガーするというモデルが示唆された。さらに、p38 MAPキナーゼ活性を阻害し35、間接的あるいはフィードバック応答機構によりp38リン酸化を部分的に阻害することが知られているSB202190によるp38の薬理学的阻害36、37、38や、特異的siRNAによるp38ノックダウンによりMDXによるIRE1β発現が阻害されることが示された。MDXは他の上皮性タンパク質（defensins, zonulins, claudins）の発現に影響を与えなかったことから、Muc-2量に対するMDXの効果は特異的であると思われる。
小胞体ストレスを抑制する化学シャペロンであるTUDCAをマウスに投与すると，MDXによるErn-2 RNAの過剰発現とMuc-2タンパク質の発現低下が抑制され，DSS誘発大腸炎に対するMDXの有害作用が抑制されたことから，MDXは杯細胞におけるERストレスを誘導することが機能的に関連していることが推察された．TUDCAは、腸内で他の保護機能（例えば、炎症性サイトカイン合成の減少および腸管バリア機能の改善）を発揮することが報告されているため、39, 40我々は、MDXを投与した大腸炎マウスにおけるTUDCAによる腸損傷の予防は、部分的にこの化合物の他の調節効果の可能性に依存している可能性を排除することはできない。
MDXの小胞体ストレス促進作用は、二酸化チタンなどの他の食品添加物が小胞体ストレスとは無関係に酸化ストレスを介して腸管上皮細胞を損傷することが報告されていることから、ユニークであると考えられる42。杯細胞による合成後、Muc-2は内腔に分泌され、機械的ストレス、有害物質、細菌、その他の病原体から上皮を保護する選択的バリアとして働く保護粘液ゲル層を形成する43, 44, 45 実際、Muc-2欠損マウスのように粘液層がない場合、腸内病原体のコロニー形成は野生型動物よりも大きく、容易に起こる。46 さらに、特定の病原体（例えば、Citrobacter rodentium, Entamoeba histolytica）の感染後、Muc-2欠損マウスでは上皮への損傷が大きく、結腸潰瘍が多く見られる。47, 48
MDX強化食では粘膜関連微生物叢の組成は変化せず、MDXの粘液形成に対する負の効果に粘膜のディスバイオーシスが重要な役割を果たすという仮説は否定的であった。我々の結果は、食事性乳化剤が内腔細菌叢の適度な乱れを促進し、その結果、野生型マウスでは低グレードの炎症を引き起こし、免疫制御サイトカインIL10を欠くマウスでは強固な大腸炎を促進し、ヒトでは内腔細菌叢組成に負の影響を与えるという最近発表されたデータとは異なる19, 49 全体として、先に述べた観察結果は、複数の食事成分が腸のホメオスタシスを変化させ、病的状態の開始および進行に寄与する可能性があることを示唆している。このような背景から、粘液バリアの変化やムチンの生合成がIBDの発症や持続に関与していることが提唱されています。特に潰瘍性大腸炎患者の炎症大腸では、杯細胞の減少によるMuc-2の産生・分泌の低下により、粘液層が薄くなっている46。実際、杯細胞ではムチン顆粒が減少し、非グリコシル化Muc-2前駆体で満たされており、このことはMDX暴露マウスで見られたものと類似している。同様に、粘液バリアの量と組成の変化がマウスのIBD様病態を引き起こすという証拠があり、ERストレスによるMuc-2産生の低下が粘液バリアを低下させ、最終的に炎症を誘発するという28。この仮説は、MDX食を長期間与えたマウスで粘液減少が持続すると、低レベル炎症になるという我々の実証によってさらに支持された。
以上のように、MDX強化食は、腸内のMuc-2量を減少させ、大腸菌刺激に対して宿主をより敏感にさせることが明らかになった。これらのデータは、MDXが病原性細菌の腸管上皮への接着を促進することを示す21とともに、MDXを豊富に含む欧米食が腸疾患感受性に寄与するという仮説を支持するものである。
材料および方法
マウス
Balb/c マウス（6-7週齢）は、Charles River Laboratories Italia Srl (Rozzano (MI), Italy) から購入し、University of Rome Tor Vergata (Rome, Italy) の動物施設に収容した。すべての in vivo 実験は、動物実験に関するイタリアの法律に従い、動物倫理委員会の承認を得ている。
食品添加物処理と実験的腸管炎症
MDX（ブドウ糖当量、4.0-7.0；#419672）およびプロピレングリコール（>99.5% Food Chemicals Codex；#W294004） はSigma（イタリア、ミラノ）より購入した。ウシおよびブタの骨からの動物ゼラチンは、Honeywell Fluka (Milan, Italy) (#53028)から購入した。マウスは、MDX（濃度範囲、1％〜5％）、PG（0.5％）およびGEL（5 g/L）を飲料水中で45日間暴露した。水は2日おきに交換した。最後の10日間は、DSS（1.75％、#160110；MP Biomedicals、Santa Ana、CA）を通常の飲料水、またはMDX、PG、またはGELで強化した飲料水で投与した。マウスは毎日体重を測定した。DSS投与10日後にマウスを殺し、組織学、タンパク質およびRNA抽出、IECおよびLPMCの単離のために結腸サンプルを採取した。並行して、MDX強化飼料を摂取したマウスに、対照マウスとともに、250mg／kgのTUDCA（Carbosynth Ltd, Berkshire, UK）を食後21日目から隔日に腹腔内投与した。
追加実験では、マウスをMDX 5%の存在下または非存在下の飲料水に35日間暴露した後、インドメタシン（5 mg/kg, #I7378; Sigma）を皮下注射した。24時間後にマウスを殺し、回腸サンプルを採取し、組織学的解析を行った。
細胞単離と培養
50 細胞は、1% β-メルカプトエタノール添加溶解バッファーに再懸濁し、RNA抽出まで-80℃に保存した。マウスの陰窩を単離するために、新鮮な結腸標本を5mmサイズの断片に切断し、15mmol/L EDTAを含むダルベッコ改変イーグル培地で4℃、1時間インキュベートした。得られた陰窩をMDX 5%で30分間刺激した後、1% β-メルカプトエタノール添加溶解バッファに再懸濁し、RNA抽出まで-80℃で保存した。
粘液分泌性HT29-MTX細胞株は、European Collection of Authenticated Cell Cultures (Public Health England, Porton Down, Salisbury, UK)から入手した。細胞は，10%牛胎児血清，ペニシリン（0.1%）およびストレプトマイシン（0.1%）を添加したダルベッコ改変イーグル培地で培養された．サブコンフルエントな細胞を、濃度の増加したMDX（1%から5%）の存在下で1時間、またはMDX 5%で異なる時点（5分、15分、30分、1時間）で培養した。一部の実験では、HT29-MTX細胞をTUDCA（10μmol／L）またはp38-MAPK阻害剤（S202190；Calbiochem、San Diego、CA）で1時間前処理するか、Lipofectamine 3000試薬（Invitrogen、Carlsbad、CA）を用いてp38またはコントロールsiRNAでトランスフェクト（Santa Cruz Biotechnology、Dallas、TX）した。MDXで刺激した後、細胞を回収し、ペレットを直ちに-80℃でタンパク質抽出のために保存するか、1% β-メルカプトエタノール添加溶解バッファに再懸濁し、RNA抽出まで-80℃で保存した。
トランスクリプトーム解析
RNase-free DNase set (Thermo Fisher Scientific, Monza, Italy) を含む PureLink Purification technology kit を用いて結腸サンプルより Total RNA を抽出した。相補的 DNA が定量されたサンプルは、Consortium for Genomic Technologies (Milan, Italy) の Microarray Unit で、GeneChip (Cogentech, Milan, Italy) Mouse Gene 2.0 ST マイクロアレイへのハイブリダイゼーションにより配列決定が行われた。GeneChip ハイブリダイゼーションで得られた蛍光画像の信号強度を Affymetrix (Santa Clara, CA) 社の Model 3000 Scanner で読み取った。転写産物は、fold change 値が 2 以上であることを基準に選択された。GeneChipアレイ上に存在するすべての転写産物は、Gene Onthologyによって関連するクラスにマッピングされ、MDXと水の比較から得られたfold changeが提供されました。すべてのリストは、NetAffx (Affymetrix) ポータルから提供された最新版の GeneChip Mouse Gene ST 2.0 のアノテーションを使用しています。マイクロアレイのデータセットは、Gene Expression Omnibus databankに寄託されている（accession no. GSE117639; https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/query/acc.cgi?acc=GSE117639)に寄託されている。
リアルタイムPCR
Total RNA は、PureLink Purification technology (Thermo Fisher Scientific) を用いて結腸生検標本および細胞から単離した。一定量のRNA（1μg/サンプル）を相補的なDNAに逆転写した。逆転写は、Oligo(dT)プライマーとM-MLV逆転写酵素（Thermo Fisher Scientific）を用いて実施した。リアルタイムPCRを、マウスIL1β、Lcn-2、腫瘍壊死因子-α、インターフェロン-γ、IL17A、小胞体-核シグナル伝達1（Ern-1）、Ern-2、β-ディフェンシン-1、ゾヌリン-1、クラウディン-7、スプライシングXボックス結合タンパク質1、活性化転写因子6、活性化転写因子4について実施した。活性化転写因子4、およびChopについてはIQ SYBR Green Supermix（Bio-Rad Laboratories, Milan, Italy）を用いて、マウスのゾヌリン-2、クローディン-2、およびヒトErn-2についてはTaqMan Gene Expression Assays（Thermo Fisher Scientific）を用いて測定した。RNA発現は、Delta-Delta Cycle thresholdアルゴリズムを用いて、β-actin遺伝子との相対値で算出した。
酵素結合免疫吸着法による糞便中リポカリン-2の定量化
糞便サンプルを重量化し、0.1% Tween 20を含むリン酸緩衝生理食塩水（PBS）に再懸濁し、最終濃度を100 mg/mLにした。その後、サンプルを20分間ボルテックスし、14,000g、4℃で10分間遠心分離を行った。その後、上清を回収し、分析まで-80℃で保存した。Lcn-2タンパク質レベルは、Duoset murine Lcn-2 enzyme-linked immunosorbent assay kit (R&D Systems, Minneapolis, MN) を用いて定量化し、光学密度は450nmで読み取った。
ウェスタンブロット
細胞を、10 mmol/L HEPES (pH 7.9), 10 mmol/L 塩化カリウム, 0.1 mmol/L EDTA, 0.2 mmol/L エチレングリコール-ビス（β-アミノエチルエーテル）-N，N，N′-四酢酸、および 0.5 mmol/L エチレングリコールを含むバッファ中で氷上に溶解させた。 mmol/Lジチオスレイトール、10mg/mLアプロチニン、10mg/mLロイペチン、1mmol/Lフェニルメチルスルホニルフルオリド、1mmol/L Na3VO4、および1mmol/Lフッ化ナトリウムで補充した5％Nonidet P40で処理した。ライセートは遠心分離により清澄化し、ドデシル硫酸ナトリウム-ポリアクリルアミドゲル電気泳動で分離した。ブロットを、p-p38（1：1000、＃4511S；Cell Signalling Technology、Danvers、MA）、p38（＃sc-7972）、リン酸化細胞外シグナル制御キナーゼ-1／2（＃sc-7383）、リン酸化c-Jun N末端キナーゼ（＃sc-6254）に対する抗体でインキュベートした（1: 500；すべてSanta Cruz Biotechnologyより）、およびβ-アクチン抗体（1：5000、#A544；Sigma）、次いで西洋わさびペルオキシダーゼに結合した二次抗体（1：20，000；Dako、Santa Clara、CA）。
病理組織学的スコアリングと免疫組織化学
結腸および回腸試料の凍結切片を H&E で染色し、上皮の変化と細胞浸潤に基づいて盲検下でスコアリングした51。結腸試料の凍結切片をウサギ抗壊れ目カスパーゼ-3抗体（1:150, #9661S; Cell Signalling Technology）で染色し、陽性細胞は 3,3′-diaminobenzidine tetra hydrochloride (#M4BD534G; Biocare Medical, Pacheco, CA) を用いたMACH4 Universal Horseradish-Peroxidase Polymer kitで視覚化された。
免疫蛍光染色および過ヨウ素酸シッフ-アルシアンブルー染色
結腸の凍結切片を、Muc-2の検出にはメタノール-カルノー固定液（60%メタノール、30%クロロホルム、10%氷酢酸）中に室温で2時間、p-p38染色にはパラフォルムアルデヒド4%中に室温で10分間置いた。その後、切片をPBSで1回洗浄し、0.1% Triton (Segrate (MI), Italy) X-100で20分間透過させた。ブロッキング処置（ウシ血清アルブミン1％、Tween 0. 1％、グリシン2％）を室温で1時間行い、Muc-2に対するウサギ一次抗体（1：100、#sc-15334；Santa Cruz Biotechnology）、p-p38に対するウサギ一次抗体（1：100、#4511S；Cell Signalling Technology）、O結合糖残基（1：500、Dolichos biflorus [horse gram] からのレクチン、#L6533；Sigma）4℃、一晩インキュベーションした。PBSで1回洗浄後、二次抗体ヤギ抗ラビットAlexa 488 (1:2000, #A11008; Invitrogen) とストレプトアビジンAlexa 568 (1:2500, #S11226; Thermo Fisher Scientific) を室温で2時間アプライした。スライドをPBSで1回洗浄し、4′，6-ジアミノ-2-フェニルインドール（＃P36931；Invitrogen）入りプロロングゴールド抗フェード試薬を使ってマウントし、Leica（Wetzlar、ドイツ）アプリケーションスイートのソフトウェア（V4.6.2）付きLeica DMI4000 B顕微鏡によって分析した。杯細胞を可視化するために，結腸サンプルの凍結切片をメタノール-カルノー固定液に室温で2時間入れ，periodic acid-Schiff/Alcian blue stain kit (#04-163802; Bio-Optica, Milan, Italy) で染色を行った．
16S Ribosomal RNA遺伝子配列解析による微生物相の解析
16S Ribosomal RNA 遺伝子配列解析は、Polo d'Innovazione di Genomica, Genetica e Biologia (Siena, Italy) により、結腸生検標本から抽出したゲノム DNA を用いて実施された。ライブラリーは、Illumina (San Diego, CA) 16S Metagenomic Sequencing Library Preparation Guide (part # 15044223 Rev. B) およびNextera XT Index Kit (Illumina) に従って作製した。オーバーハングアダプターを付加した関心領域特異的プライマー（16S V4領域）を用いて、DNAサンプルのテンプレートを増幅するためにPCRを実施した。最初の精製ステップでは、AMPure XP (Beckman Coulter, Brea, CA) ビーズを使用して、遊離プライマーおよびプライマーダイマーから16Sアンプリコンを精製した。2回目のPCRステップでは、Nextera XT Index Kitを使用してデュアルインデックスとイルミナシーケンスアダプターを取り付けた。ライブラリーは、サイズ分布を確認するためにAgilent (Santa Clara, CA) 2100 Bioanalyzerを使用して検証された。インデックスされたDNAライブラリーは4 nmol/Lに正規化され、等量でプールされた。このプールを9pmol/Lの濃度で、20%のPhixコントロールとともにIllumina Flowcell v2にロードした。その後、サンプルをIllumina MiSeq、2×250 bp paired end runを使用して配列決定した。品質管理はFastQCツール（Illumina）を用いて行い、Trimomatic（USADELLAB、Aachen、Germany）ソフトウェアパッケージが使用された。配列決定されたペアエンドリードは、PEARソフトウェア（Prof. Alexandros Stamatakis, Heidelberg, Germany）を用いて元の全長16Sアンプリコンを再構築するためにマージされた。配列類似度が97%以上のアンプリコンはすべてグループ化され、代表的なものが分類学的アノテーションとOTU (Operational Taxonomic Unit) テーブル構築のための入力として選択された。配列は、オープンリファレンスOTUピッキングアルゴリズムを用いて、SILVA分類学データベース（v128）でマッチングを検索した。得られたOTU表は、Biological observation Matrixフォーマット（http://biom-format.org/）でエンコードした。サンプル内のα-多様性は、3種類の指標で調査した。サンプル内のα多様性は、Shannon、Simpson、Fisher α indexの3種類の指標で調べた。サンプルの豊かさは、Chaoおよび系統的多様性推定量によって調査された。β多様性はOTUベースと系統的な手法の両方を用いて定量化した。データセットはSequence Read Archive (accession no. SRP155816, https://www.ncbi.nlm.nih.gov/sra/SRP155816)に寄託されている。
夜間空腹時血糖値測定
マウスに5%MDX添加飲料水を10週間投与した。15時間の絶食後、One touch Verio Flex Glucose Meter (Burnaby, BC, Canada) を用いてベースライン血糖値を測定し、mg/dLで表示した。
統計解析
パラメトリックデータは、2群間の比較には両側Student t検定、多重比較には1元配置分散分析後にBonferroni post hoc検定を用いて分析した。ノンパラメトリックデータは、2群間の比較にはMann-Whitney U検定、多重比較にはKruskal-Wallis検定を用いて解析された。有意性はP値が0.05未満と定義した。
謝辞
V. Iebba（Department of Public Health and Infectious Diseases, Institute Pasteur Cenci Bolognetti Foundation, University of Rome La Sapienza）およびS. Barbaliscia（Department of Experimental Medicine and Surgery, University of Rome Tor Vergata）による微生物叢分析の協力とM. Levrero（内科学科， University of Rome La Sapienza）によるデータの考察に対して謝意を表します．
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記事情報
掲載履歴
オンラインで公開されました。2018年9月11日（木
アクセプトされました。2018年9月4日（木
受理されました。2018年3月6日（木
フットノート
著者貢献 F. Laudisiは、研究のコンセプトとデザイン、技術的・材料的支援、データの取得、データの分析と解釈、原稿の起草、統計解析を担当し、D. Di Fuscoは、データの分析と解釈、データの取得、技術的・材料的支援を担当し、V. Dinallo, A. Di Grazia, I. Marafini, A. Colantoni, A. Ortenzi, M. Mavilio, and F. Guerrieriが技術・材料面でのサポートを、C. Stolfiがデータの解析・解釈、技術・材料面でのサポートを、C. Alteriがデータの解析・解釈、技術・材料面でのサポートを、それぞれ担当した。Alteriがデータの解釈および技術的・材料的支援を、F. Ceccherini-Silbersteinがデータの分析・解釈および原稿の重要な改訂を、M. FedericiおよびT. T. MacDonaldが原稿の重要な改訂を、I. Monteleoneがデータの分析・解釈および原稿の重要な改訂を、Giovanni Monteleoneが研究のコンセプト・設計、データの分析・解釈および原稿の作成・重要な改訂を担当しました。著者全員が全データにアクセスし、最終原稿を確認・承認した。

利益相反 著者らは、利益相反を明らかにしていない。

資金提供 この研究は、文部科学省（Bandiera InterOmics Protocollo PB05 1°）の一部支援を受けて実施されたものである。

身分証明書
DOI: https://doi.org/10.1016/j.jcmgh.2018.09.002

著作権について
© 2019 The Authors. AGA研究所の委託を受け、エルゼビア株式会社が発行。
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図表の概要
図1MDX、PG、GELの腸炎誘発効果
図1MDX、PGおよびGELは腸の炎症を誘発しない。(A) 野生型マウスに5%MDX、0.5%PG、5g/L GELを飲水で希釈し、45日間暴露後、死亡させた結腸切片のH&E染色像の代表。図は、3つの独立した実験から得られた9-12匹/群の代表図である。スケールバー 100 μm。(B）パネルAに示したように給餌したマウスから採取した大腸組織の組織学的スコア。データは、3つの独立した実験から9〜12匹／群を用いて作成し、平均±SDとして表現した。群間の差は、1ウェイ分散分析に続いて、ボンフェローニポストホック検定を使用して比較した。(C）パネルAに示したように給餌したマウスから採取した結腸組織におけるTnf-α及びIL1βRNA転写物の発現。データは、3つの独立した実験から9〜12匹／群を用いて作成した。グラフの各点は、1匹のマウスの結腸における特定の転写物のRNA発現を示し、横棒は中央値を示す。グループ間の差は、クラスカル-ウォリス検定を用いて比較した。(D）パネルAで示したように給餌したマウスにおける糞便中のLcn-2タンパク質のレベルを示す散布図。横棒は中央値を示す。グループ間の差は、クラスカル・ワリス検定を用いて比較した。 mRNA、メッセンジャーRNA；TNF、腫瘍壊死因子（tumor necrosis factor）。
図 サムネイル gr2
図2MDX濃縮食は腸の炎症を悪化させる。(A）野生型マウスに5％MDX、0.5％PG、または5g/L GEL（いずれも飲料水で希釈）を45日間投与し、投与35日目からDSS（飲料水中1.75％）にチャレンジさせた。体重は35日目から死亡（45日目）まで毎日記録した。データは、3つの独立した実験から1グループあたり10-12匹のマウスを用いて作成し、平均±SEMとして表した。群間の差は、1ウェイ分散分析に続いて、ボンフェローニポストホック検定を使用して比較した。DSS vs DSS + MDX, **P ≤ .01。(BおよびC）パネルAに示したようにDSSを単独またはMDX、PG、GELと組み合わせて投与し、45日目に殺したマウスから採取した結腸切片の代表的なH&E染色および組織学的スコア。データは、3つの独立した実験から1群あたり10-12匹のマウスを用いて作成し、平均値±SDで表した。群間の差は、1ウェイ分散分析に続いてボンフェローニポストホックテストを用いて比較した。DSS vs DSS + MDX, **P ≤ .01. (B) スケールバー 100 μm。(DおよびE）IL1βおよびLcn-2 RNA発現を、パネルAに示したように処置し、45日目に殺したマウスから採取した大腸組織でリアルタイムPCRにより評価した。データは、3つの独立した実験から1群あたり10-12匹のマウスを用いて作成した。グラフの各ポイントは、単一のマウスの結腸における特定の転写物のRNA発現を示し、横棒は中央値を示す。群間の差は、クラスカル-ウォリス検定を用いて比較した。DSS + MDX vs DSS, **P ≤ .01。(FおよびG）パネルAに示したように、DSS単独または濃度の増加したMDXとの組み合わせで処理し、45日目に殺したマウスから採取した結腸切片の代表的なH＆E染色および組織学的スコア。データは、2つの独立した実験から1群あたり5匹のマウスを用いて作成し、平均値±SDで表した。群間の差は、1ウェイ分散分析に続いてボンフェローニポストホックテストを用いて比較した。5% DSS + MDX vs DSS, **P ≤ .01. (HおよびI）5％MDXを飲料水で希釈し35日間暴露した後、インドメタシン（5 mg/kg）を単回皮下投与した野生型マウスから採取した回腸切片の代表H＆E染色および組織学的スコア。インドメタシン注射後24時間後にマウスを死亡させ、組織を採取して病理組織学的解析を行った。データは、3つの独立した実験の1グループあたり10-12匹のマウスを用いて作成し、平均値±SDで表した。群間の差は、1ウェイ分散分析に続いてボンフェローニポストホック検定を使用して比較した（*P ≤ .05）。スケールバー。mRNA, メッセンジャーRNA.
図3MDXのアップレギュレーション
図3MDXは腸管上皮細胞においてIRE1依存性UPR経路をアップレギュレートする。(A) 5％MDX存在下または非存在下で45日間、黄砂を含まない飲料水に暴露したマウスから分離した大腸サンプルのマイクロアレイによる脂質および糖質代謝、タンパク質糖鎖形成、UPR経路に関連する遺伝子の発現差、log2（fold change）を示すVolcano plotおよびHeat map。(B) Ern-2、Ern-1、およびXbp1s RNAの発現は、全大腸試料においてリアルタイムPCRで評価した。データは、3つの独立した実験から1群あたり11-12匹のマウスを用いて作成した（*P ≤ .05, **P ≤ .01）。グラフの各ポイントは、1匹のマウスの結腸における特定の転写物のRNA発現を示し、横棒は中央値を示す。グループ間の差は、Mann-Whitney U 検定を用いて比較した。(C）パネルAで示した処理を行ったマウスから単離した大腸サンプルにおけるGrp78、Atf6、Atf4、およびChop RNA転写物を示す散布図である。グラフの各ポイントは、1匹のマウスの結腸における特定の転写物のRNA発現を示し、横棒は中央値または平均値±SDを示す。グループ間の差は、Mann-Whitney U検定または2-tailed Student t検定を用いて比較した。(D）パネルAに示したように処理した3〜4匹のマウスのプールから単離したIECおよびLPMCにおけるErn-2およびErn-1 RNA発現を示す代表的なヒストグラムであり、例は、同様の結果が得られた2つの独立した実験の代表である。(E）未処理マウスの結腸から単離し、MDXの存在下または非存在下で30分間培養した腸陰窩におけるErn-2、Ern-1、およびXbp1s RNA発現を示す散布図である。データは3つの独立した実験から6-7匹のマウスから単離した陰窩を用いて作成した（*P ≤ .05, **P ≤ .01）。左：横棒は中央値を示し、群間の差は両側Mann-Whitney U検定を用いて比較した。中・右：横棒は平均値±SDを示し、群間の差はStudent t testを用いて比較した。 mRNA, messenger RNA; UT, untreated.
図 サムネイル gr4
図4MDX強化食による腸管粘膜バリアの変化。(A) 5%MDX存在下または非存在下で35日間飲料水に暴露したマウスから単離した結腸切片におけるMuc-2（緑）および糖化（成熟）Muc-2（赤）の免疫蛍光分析結果。核は4′,6-diamidino-2-phenylindole（DAPI）（青）で染色されている。図は4つの別々の実験の代表である。スケールバー：25μm。右図。クリプトあたりのMuc-2発現細胞数。データは、大腸切片あたり4つの異なるフィールドでカウントされた陽性細胞の平均±SDを示し、4つの独立した実験から1グループあたり8匹のマウスを用いて作成された。群間の差はStudent t testを用いて比較した(***P ≤ .001)。(B) パネルAに示した方法で処置したマウスから採取した大腸切片の過ヨウ素酸シッフ (PAS) -アルシアンブルー (AB) 染色。右図。クリプトあたりのアルシアンブルー／過ヨウ素酸シッフ発現細胞数。データは、大腸切片あたり4つの異なるフィールドでカウントされた陽性細胞の平均値±SDを示し、3つの独立した実験から1グループあたり8匹のマウスを用いて作成された。群間の差は、2-tailed Student t testを用いて比較した（***P ≤ .001）。スケールバー。100μm。(C）5％MDX存在下または非存在下で35日間飲料水に暴露したマウスから採取した結腸組織におけるMuc-2 RNA発現を示す散布図である。データは、3つの独立した実験から1グループあたり10匹のマウスを用いて作成した。グラフの各ポイントは、1匹のマウスの結腸における特定の転写産物のRNA発現を示し、横棒は中央値を示す。群間の差は、Mann-Whitney U 検定を用いて比較した（*P ≤ .05）。(D）5％MDX、0.5g/L GEL、または0.5％PGの存在下または非存在下で35日間飲料水に暴露したマウスから分離した結腸切片におけるMuc-2（緑）の免疫蛍光法解析。核はDAPI（青）で染色した。図は3つの実験の代表例である。スケールバー。50 μm。右図。クリプトあたりのMuc-2発現細胞数。データは、結腸切片あたり4つの異なるフィールドでカウントされた陽性細胞の平均±SDを示し、3つの独立した実験から1グループあたり5-7匹のマウスを用いて作成された。群間の差は、両側スチューデントt検定を用いて比較した（***P ≤ .001）。(E）パネルAに示したように処置したマウスから採取した結腸組織におけるゾヌリン-1、ゾヌリン-2、クローディン-2、およびクローディン-7 RNA発現を示す散布図であり、データは、3つの独立した実験から1群あたり10匹のマウスを用いて作成した。グラフの各ポイントは、1匹のマウスの結腸における特定の転写物のRNA発現を示し、横棒は中央値を示す。群間の差は、Mann-Whitney U 検定を用いて比較した（*P ≤ .05）。(F)パネルAで示した方法で処理したマウスの結腸切片で、切断型カスパーゼ3陽性細胞を評価した。スケールバー。100 μm。右図。クリプトあたりの切断型カスパーゼ-3陽性細胞の数。データは、結腸切片あたり4つの異なるフィールドでカウントされた陽性細胞の平均±SDを示し、3つの独立した実験から1グループあたり6〜7匹のマウスを用いて作成された。群間の差は、Student t testを用いて比較した（***P ≤ .001）。Cldn, claudin; mRNA, messenger RNA; ZO, zonula occludens.
図 サムネイル gr5
図5MDXはP38 MAPKを介してIRE1βの発現を誘導する。(A) MDXはHT29-MTX細胞株でErn-2の発現を誘導する。細胞は未処理のまま（UT）、または濃度の増加したMDXとともに1時間培養した。Ern-2 RNAの転写はreal-time PCRで評価した。データは4回の独立した実験から得られた各群10サンプルの平均値±SDである。グループ間の差は、1ウェイ分散分析に続いてボンフェローニポストホック検定を使用して比較した（**P ≤ .01、*P ≤ .05）。(B）HT29-MTX細胞をUTのまま、または5％MDXで刺激し、p-p38、リン酸化extracellular signal-regulated kinase 1/2 (p-ERK1/2) 、リン酸化c-Jun N-terminal kinase (p-JNK) 、β-アクチン (β-act) の発現をWestern blotにより分析した。同様の結果が得られた4つの代表的な実験のうちの1つを、デンシトメトリー解析とともに示す（下段）。データは平均値±SD。グループ間の差は、1ウェイ分散分析に続いてボンフェローニポストホック検定を使用して比較した（*P ≤ .05, **P ≤ .01, ***P ≤ .001）。(C) MDXを介したp38活性化に対するp38阻害剤（p38i）の効果。HT29-MTX細胞をp38i（10μmol/L）またはジメチルスルホキシド（DMSO）（ビヒクル）存在下または非存在下で1時間MDXで刺激した。p-p38およびp38発現をウェスタンブロットで評価した。同様の結果が得られた4つの代表的な実験のうちの1つを、デンシトメトリー分析（下パネル）とともに示す。データは平均値±SD。グループ間の差は、1ウェイ分散分析に続いてボンフェローニポストホック検定を使用して比較した(***P ≤ .001)。右図 MDXを介したErn-2発現に対するp38iの効果。HT29-MTX細胞をp38i（10μmol/L）またはDMSO（ビヒクル）存在下または非存在下でMDXで1時間刺激し、Ern-2 RNA転写物をリアルタイムPCRで評価した。データは5つの独立した実験の平均±SDである。グループ間の差は、1ウェイ分散分析に続いてボンフェローニポストホック検定を使用して比較した（*P ≤ .05）。(D) MDXによるErn-2発現上昇に対するp38ノックダウンの効果。HT29-MTX細胞をコントロールまたはp38 siRNA（それぞれCTRまたはp38 siRNA）で18時間トランスフェクトし、その後5% MDXで1時間刺激するかしないかした。p-p38、p38およびβ-actin発現の代表的なウェスタンブロットを、デンシトメトリー解析とともに左パネルに示す。データは3回の独立した実験の平均値±SDである。グループ間の差は、両側Student t testを用いて比較した（**P ≤ .001）。右図 Ern-2 RNA転写物の発現をリアルタイムPCRで評価した。データは5つの独立した実験の平均±SDである。群間の差は、1ウェイ分散分析に続いてボンフェローニポストホックテストを用いて比較した（*P≤.05）。(E）45日目に殺したMDX投与マウスおよびコントロールから単離した結腸試料におけるp-p38（緑色）の免疫蛍光法解析。図は、同様の結果が得られた3つの別々の実験の代表的なものである。右図は、結腸切片のフィールドあたりのp-p38発現細胞の数および強度を示す。データは平均値±SDで表され、3つの独立した実験から1群あたり3-5匹のマウスを用いて作成された。群間の差は、両側スチューデントt検定を用いて比較した（**P ≤ .01）。 mRNA、メッセンジャーRNA；p38 tot、総p38。
図 サムネイル gr6
図6ERストレス阻害はMDXによるErn-2アップレギュレーションを抑制し、MDX投与マウスの大腸炎を改善させる。(A）HT29-MTX細胞をTUDCA（10μmol/L）またはジメチルスルホキシド（ビヒクル）で前処理した後、MDXで1時間刺激した。Ern-2 RNAの転写はリアルタイムPCRで解析した。データは4つの独立した実験の平均値±SDである。群間の差は、両側Student t testを用いて比較した（*P ≤ .05）。(BおよびC）野生型マウスを5％MDX添加飲料水に45日間暴露し、21日目から隔日にTUDCA（250 mg/kg腹腔内）を注射するかしないかした。45日目にマウスを殺し、大腸組織を分離し、(B) Ern-2, Ern-1, Xbp1s RNA転写物および(C) Muc-2タンパク質発現をそれぞれリアルタイムPCRおよび免疫蛍光法により評価した。(B）データは、3つの独立した実験から1グループあたり7-10匹のマウスを用いて作成した。グラフの各点は、1匹のマウスの結腸における特定の転写物のRNA発現を示し、横棒は中央値を示す。群間の差は、Mann-Whitney U 検定を用いて比較した（*P ≤ .05）。(C)写真は、同様の結果が得られた4つの別々の実験の代表的なものである。スケールバー：25μm。(D) 野生型マウスを5%MDX添加飲料水に45日間暴露し、21日目から隔日にTUDCA（250 mg/kg）を腹腔内投与したか否かを判定した。35日目から死亡（45日目）まで大腸炎を誘発するために1.75%DSSに暴露し、体重を1日おきに記録した。データは、3つの独立した実験から1グループあたり8-9匹のマウスを用いて作成し、平均値±SEMとして表した。群間の差は、1ウェイ分散分析に続いてボンフェローニポストホック検定を使用して比較した（**P ≤ .01）。(EおよびF）パネルDに示したように処置し、45日目に殺したマウスの結腸切片の代表的なH＆E染色。 F）散布図は、組織学的スコアを示す。データは、3つの独立した実験から1群あたり8〜9匹のマウスを用いて作成し、平均±SDとして表した。群間の差は、1ウェイ分散分析に続いてボンフェローニポストホックテストを用いて比較した（*P ≤ .05; **P ≤ .01）。(GおよびH）パネルDに示したように処置し、45日目に殺したマウスから採取した結腸組織における（G）IL1βおよび（H）Lcn-2 RNA発現を示す代表的な散布図である。グラフの各点は、単一のマウスの結腸における特定の転写物のRNA発現を示し、横棒は、中央値または平均値±SDを示す。データは、3つの独立した実験から1群あたり8〜9匹のマウスを用いて作成した。グループ間の差は、クラスカル-ワリス検定または1ウェイ分散分析に続いてボンフェローニポストホック検定を使用して比較した（*P ≤ .05）。DAPI, 4′,6-diamidino-2-phenylindole; mRNA, messenger RNA.
図 サムネイル gr7
図7粘膜関連微生物叢に対するMDXの影響。(AおよびB）野生型マウスを5％MDX添加飲料水に45日間暴露し、21日目から隔日にTUDCA（250 mg/kg）を腹腔内投与するかしないかを決定した。対照マウスは45日間飲料水を摂取した。(A)大腸粘膜関連細菌叢について、各菌種の相対的な存在量を示す。横棒は中央値を示す。データは、2つの独立した実験から、1群あたり4-7匹のマウスを用いて作成した。群間の差は、Kruskal-Wallis検定を用いて比較した（*P ≤ .05）。(B) パネルAに示したように処置したマウスの粘膜関連細菌の非重み付けおよび重み付けしたUniFrac距離行列の主座標分析(PCoA)。
図 サムネイルgr8
図8長期間のMDX強化食による低グレードの腸管炎症の誘発。野生型マウスを5%MDX希釈飲料水にて10週間暴露した。(A）体重は死亡（70日目）まで2週間ごとに記録した。データは、3つの独立した実験から1群あたり10-12匹のマウスを用いて作成し、平均±SEMで表した。群間の差は、両側スチューデントt検定を用いて比較した。(B）5％MDXを飲料水で希釈したものを10週間投与したマウスの便の粘度を示す散布図である。データは、3つの独立した実験の1群あたり10〜12匹のマウスを用いて作成し、平均値±SDとして表した。群間の差は、2-tailed Student t testを用いて比較した。(CおよびD）5%MDXを添加した飲料水または添加しない飲料水に10週間暴露した野生型マウスの結腸切片の代表的なH&E染色と組織学的スコア。スケールバー 100 μm。データは3回の独立した実験から1群あたり10-12匹のマウスを用いて作成し、平均値±SDで表した。群間の差は、両側Student t testを用いて比較した（**P ≤ .01）。(E）パネルAに示したように給餌したマウスから採取した結腸組織におけるIL1β、Lcn-2、およびErn2 RNA転写物の発現データ：3つの独立した実験から1群あたり6〜12匹のマウスを用いて作成した。グラフの各点は、1匹のマウスの結腸における特定の転写物のRNA発現を示し、横棒は中央値を示す。群間の差は、Mann-Whitney U 検定を用いて比較した（*P ≤ .05）。(F) MDXを10週間摂取したマウスまたは摂取していないマウスから分離した大腸サンプルにおけるMuc-2（緑色）の免疫蛍光分析。スケールバー：25μm。図は、同様の結果が得られた3つの別々の実験の代表的なものである。右図は、クリプトあたりのMuc-2発現細胞数を示している。データは、結腸切片あたり4つの異なるフィールドでカウントされた陽性細胞の平均±SDを示し、3つの独立した実験から1グループあたり6-7匹のマウスを用いて作成された。群間の差は、両側Student t testを用いて比較した（**P ≤ .01）。(G）パネルAに示したように給餌したマウスにおける15時間空腹時血糖値。データは、2つの独立した実験から1グループあたり4〜5匹のマウスを用いて作成し、平均±SDとして表した。群間の差は、両側スチューデントt検定を用いて比較した（***P ≤ .001）。 mRNA、メッセンジャーRNA。
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