COVID-19陽性者および回復者における抗原提示、免疫反応、T細胞活性化の動態が明らかになった。

哉百名

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ORIGINAL RESEARCH（オリジナル研究）論文
Front. Immunol., 2022年12月02日
Sec. Viral Immunology（ウイルス免疫学
https://doi.org/10.3389/fimmu.2022.1034159
この記事は、Research Topicの一部です。
SARS-CoV-2に対する免疫応答と臨床結果への影響

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シングルセル・マルチオミクスにより、COVID-19陽性者および回復者における抗原提示、免疫反応、T細胞活性化の動態が明らかになった。
Partha Chattopadhyay1,2, Kriti Khare1,2†, Manish Kumar2,3†, Pallavi Mishra1†, Alok Anand4†, Ranjeet Maurya1,2, Rohit Gupta1, Shweta Sahni3, Ayushi Gupta4, Saruchi Wadhwa3, Aanchal Yadav1,2, Priti Devi1,2, Kishore Tardalkar5, Meghnad Joshi5*, Tavpritesh Sethi4* and Rajesh Pandey1,2*
1インド、デリー、CSIR-Institute of Genomics and Integrative Biology (CSIR-IGIB) 免疫学・感染症生物学部門、INGEN-HOPE (INtegrative GENomics of HOst-PathogEn) 研究所
2インド・ガージアバードの科学技術研究アカデミー(AcSIR)
3インド・デリー、CSIR-Institute of Genomics and Integrative Biology (CSIR-IGIB)、インド
4インド・ニューデリー インド・インドラスタ・インスティテュート・オブ・インフォメーションテクノロジー・デリー
5Department of Stem Cells and Regenerative Medicine, Dr. D. Y. Patil Medical College, Hospital and Research Institute, Kolhapur, Maharashtra, India（インド、コラープル、マハラシュトラ州
はじめに COVID-19の免疫学的な状況を説明する多くの努力にもかかわらず、ウイルスの感染症の後遺症、特に回復した患者における後遺症についての理解には、まだギャップがある。このことは、SARS-CoV-2に感染した世界中の人々の数、VOC、再感染、ワクチン接種のブレークスルーを含む変数として理解することが重要であろう。さらに、単一細胞のトランスクリプトームだけでは、疾患の重症度や臨床転帰の違いの根底にある複雑なヒトの宿主免疫の状況を理解するには不十分なことが多い。

方法 シングルセル・マルチオミクス（Whole Transcriptome Analysis + Antibody-seq）と機械学習ベースの解析を組み合わせることにより、COVID-19陽性者、回復者、健常者における細胞および免疫の異質性の機能的側面をより理解することを目的とする。

結果 33人（健常者4人、COVID-19陽性者16人、COVID-19回復者13人）の163,197細胞（データQC後124,726細胞）の単一細胞トランスクリプトームおよび表面マーカー研究に基づき、COVID-19患者ではMHCクラスI介在抗原提示が減少し、MHCクラスII介在抗原提示が異常になるが、回復者では修復されたことが確認された。また、B細胞の成熟過程も陽性者と回復者で障害されていた。重要なことは、健常者のナイーブT細胞のサブセットが回復者に存在しないことであり、これは感染後の炎症段階を示唆していた。COVID-19陽性患者と回復者の両方が、単球とT細胞サブセットにおいてCD40-CD40LGを介した炎症反応を示していた。T細胞、NK細胞、単球を介した免疫、ストレス、抗ウイルス反応の上昇もCOVID-19陽性者と回復者で見られ、COVID-19患者ではT細胞の異常な活性化、炎症反応、T細胞亜型の早い細胞移行が見られた。以上の免疫学的知見をもとにベイジアンネットワークモデルを構築したところ、FOS、CXCL8、IL1β、CST3、PSAP、CD45、CD74がCOVID-19重症度予測因子として有意に同定され、COVID-19の重症度を予測することができた。

考察 結論として、COVID-19回復者は、B細胞の成熟が失われ、過活性化した炎症反応を示し、感染後の段階が阻害されていることが示唆され、COVID-19に関連する動的免疫反応を明らかにするためにさらなる研究が必要であった。本研究は、COVID-19のサブタイプに関連する免疫応答の差異とその動態を明らかにすることを目的とした、初のマルチオミクス研究である。

はじめに
COVID-19のパンデミックは3年目に入り、生命、医療支援、医療インフラ、生活への脅威を与え続けている。さらに、SARS-CoV-2亜型（VOC）が地理的に異なる場所で新たに出現し、効果的なワクチンや投薬が常に必要であることが強調されている。SARS-CoV-2の新しい変異体は、抗体中和の欠如と免疫回避のため、重症化する症状の多様性により、人類の健康にグローバルな脅威を与えている。したがって、異なる集団、特に人口密度の高い地域で研究を行い、免疫反応の違いを理解し解明することが重要である。これにより、COVID-19の発病時における宿主の免疫反応のメカニズム解明が可能になります。これに向けて、単一細胞の分解能で表面マーカー発現とともに全トランスクリプトームを研究することで、COVID-19病態の詳細な機能的洞察を得ることができる。

これまでの証拠から、重症のCOVID-19患者では、重大な免疫調節異常が起こっていることが示唆されている（Su, 2020）。特に、末梢血単核細胞（PBMC）に関する研究では、重症COVID-19患者のIFN-γ産生の減少（1）、高度細胞傷害性エフェクターT細胞サブセットの拡大（2）、CD8+T細胞の消耗マーカープログラム細胞死タンパク質1およびTim-3の発現増加（3）などが明らかにされています。別の研究では、COVID-19で観察されるサイトカインストームの主なメカニズムとして、単球化学誘引物質CCL2とその受容体CCR2、好中球化学誘引物質CXCL8、TNF-αとともに古典的単球を挙げている(4)。また、COVID-19重症患者においては、非典型的単球遺伝子（C1AQ、C1BQ、LSTB1発現）の有意な低下と、それに対応する古典的単球遺伝子（S100A8、S100A9、S100A12発現）の相対的増加が観察されている（5）。COVID-19患者では、IL6RとIL6STの発現が上昇し、炎症性サイトカインの増加が相乗的に促進されることが報告されている。また、COVID-19患者のPBMCでは、いくつかのインターフェロン（IFN）刺激遺伝子（ISG；ISG15、IFI44、IFI44L、RSAD2など）が特異的に上昇し、抗ウイルスおよび免疫調節機能が増強されていました（6）。COVID-19の重症化には、リンパ球減少、免疫細胞の疲弊、血清炎症性サイトカインの上昇が顕著である(1, 7, 8)。また、B細胞サブセットの活性化障害は、重症のCOVID-19患者におけるウイルスクリアランスの遅れを説明する証拠となる(9)。COVID-19患者における免疫反応動態の包括的なアトラスはいくつかの研究によって提供されているが、最近、回復者の免疫レパートリーに焦点を当てた研究がいくつか発表された。ある研究では、好中球の活性化および移動に関連する遺伝子が、感染活動中と比較して回復した個体で低下していることが報告された(10)。また、回復期のCOVID-19患者では、単球を介した免疫応答が正常に回復していることが報告されている(11)。また、別の研究では、重症のCOVID-19感染後の回復者ではT細胞の分化が低下していたが、軽度・中等度のCOVID-19感染後では逆のパターンが見られたと報告している(12)。

以上の研究により、インドを除く全世界のCOVID-19患者における免疫反応のスペクトラムについて、我々の理解が深まった。しかし、ほとんどの研究が健常者とSARS-CoV-2感染者の間の免疫プロファイルを報告していることも事実である。SARS-CoV-2感染後の回復者のシングルセルベースの免疫プロファイルにより、健常者、感染活動中の患者とともに、SARS-CoV-2感染を引き起こす病態生理を理解し調査することも実りあることだと考えています。また、細胞表面マーカーは、細胞の種類を識別するだけでなく、細胞の状態も表すので、トランスクリプトーム反応に加えて、病態生理に関する重要な手がかりとなる。しかし、COVID-19の病態について、活動中のCOVID-19患者と回復した患者の間で、トランスクリプトームだけでなく、細胞表面マーカーも含めて包括的に調査することは、まだ行われていません。本研究では、健常者、COVID-19陽性者、回復者のシングルセルトランスクリプトームとシングルセルAb-seqを初めて同時に実施しました。

その結果、COVID-19陽性者では、MHCクラスIを介した抗原提示の低下とMHCクラスIIを介した抗原提示の機能低下が見られ、その後、回復者ではその機能が回復していることが報告された。また、回復者では、B細胞の成熟過程の喪失、細胞傷害性の低下、抗体応答の低下が認められた。さらに、COVID-19患者では、CD40-CD40リガンド相互作用によって、単球、NK細胞、CD4+ TCM、CD8+ T細胞集団による炎症、免疫、ストレス反応の亢進が確認された。我々は、COVID-19患者におけるT細胞サブタイプ内のより速い細胞移行を観察し、免疫/炎症反応と並行して、T細胞が媒介する正常細胞機能の摂動が見られた。最後に、ベイジアンネットワークモデルを用いて、FOS、CXCL8、IL1β、CST3、PSAP、CD45、CD74をCOVID-19疾患の予測因子として同定しました。本結果は、COVID-19陽性者および回復者における免疫応答の不均一性と複雑性に関する理解を深めるとともに、感染時、感染後、非感染時の免疫応答に関する統合マルチオミクスモデルを提供するものである。

方法と材料
患者コホート、サンプリング、データ収集
サンプル収集
サンプルは、三次医療センター（Dr. D. Y. Patil Medical College, Hospital and Research Institute, Kolhapur, Maharashtra, India）で、施設の倫理監督のもと、qRT-PCR結果に基づいて、健康なボランティア、COVID-19陽性が確認された患者、COVID-19から回復（4週間以内）の患者から収集されました。これらのサンプルは年齢と性別に関してマッチングされ、感染しているSARS-CoV-2亜種はOxford Nanoporeシークエンシングを用いて同定された。COVID-19陽性群では，16人中13人が20B型に感染し，残りの3人は20A型に感染していた．回収群では，13人中11人が20B，残りの2人が20Aに感染していた．COVID-19陽性者と回復者は，重症度に関して一致させた．血液試料はクエン酸ナトリウムを含むBD Vacutainer® CPT™ Cell Preparation Tubeで採取した。末梢血単核細胞（PBMC）は製造元の推奨する方法で全血から分離した（文献番号362761）。PBMCは凍結保存用培地（FBSとDMSOを9：1の割合で混合）にて凍結保存し、さらに使用した。

サンプル処理とライブラリ作成
PBMCは、Domenicoら(13)に従って、BD Rhapsodyシングルセル解析システムで蘇生・処理した。簡単に言うと、サンプルあたり0.2百万個の細胞を採取し、BD™ Single-Cell Multiplexing Kit-Human と40 BD™ AbSeq Ab-Oligos を用いて、製造業者のガイドに従って標識した (Doc ID: 214419 Rev. 2.0)．BD Rhapsody express シングルセル解析システムで、各カートリッジに平均3万個のプール細胞をロードしてシングルセル捕捉を行い、製造元のガイドラインに従ってcDNA合成を行った (Doc ID: 210967 Rev. 1.0). mRNA Whole Transcriptome Analysis (WTA), Ab-Seq, Sample Tagライブラリは、製造元のガイドラインに従って BD Rhapsody™ WTA Amplification kit (Doc ID: 23-21752-00) で調製した。このライブラリーをNovaSeq 6000 S2 reagent kitを用いて、WTAは30000 reads/cell, AbSeqは20000 reads/cell, sample tag libraryは120 reads/cell/Sample Tag, 101 x 2サイクルでシーケンスした。

scRNA-seqデータ処理、クラスタリング、細胞型アノテーション
生シーケンスデータは、bcl2fastqツールを用いてデマルチプレックスし、FASTQ形式に変換した。BD Rhapsody WTA解析パイプラインを使用して、製造元のガイドラインに従ってデータを解析した (Doc ID: 47383 Rev. 9.0) 。再帰的置換エラー補正を行ったカウントマトリックスをSeurat Rパッケージにインポートし、下流の解析と可視化を行った(14)。健康な患者、活動中のCOVID-19患者、および回復した患者（合計163197細胞）すべてのWTAおよびAb-Seqカウントマトリックスを統合して、統合マルチモーダル解析を実施した。品質パラメータを最適化し、2500以上のUMIと20未満のUMIを含む細胞は破棄された。バッチ効果は正規化され、データはSeurat SCTransform V2 (15, 16)を用いて正規化された。最後に、0.4の解像度で教師なしクラスタリングを用いて細胞をクラスタリングし、UMAPアルゴリズムで可視化した(17)。クラスター特異的な遺伝子は、FindAllMarker機能（Wilcoxon rank sum test, Log2 Fold Change cut-off 1.5）を用いて同定された。クラスターは、CellMarker DB、PanglaoDB、Azimuthを組み合わせて手動で、またSVMベースの単一細胞アノテーションツールscpredを用いて自動的に包括的にアノテーションされた。また、同じパイプラインをデータのペアワイズ可視化（健常者 vs COVID-19、COVID-19 vs 回復者、健常者 vs 回復者）にも適用しています。

遺伝子発現の差分解析と遺伝子セットの濃縮解析
クラスタリングされたペアワイズデータ（健常者／COVID-19、COVID-19／回収、健常者／回収）に対して、Seurat FindMarker機能（Wilcoxon rank sum test, Log2FC cut-off 1.5, q value cut-off 0.05）により遺伝子発現の差異解析を行った。クラスタワイズ擬似バルク差分遺伝子発現解析では、サンプルレベルで平均遺伝子発現を取り、その後、DESeq2 r パッケージを用いて3群間で差分遺伝子発現解析を行った（18）。解析にはWald検定を適用し、pheatmap Rパッケージを用いて可視化した。Gene set enrichment analysis (GSEA) は、escape R パッケージを用いて、クラスタとグループの同一性を保ちながら、単一細胞の分解能で実施した。遺伝子セットコレクションは、組み込みのMolecular Signature Databaseを使用して、濃縮を行った。各パスウェイの相対的な濃縮スコアは、dittoSeq Rパッケージ（19）を用いてヒートマップの形で表現された。

シグナル伝達ネットワーク相互作用の推論
CellDesignerを用いてシグナル伝達ネットワーク解析を行い、有意に発現が異なる遺伝子セットのタンパク質とパスウェイの相互作用ネットワークを推論した。P値はBonferroni Methodで補正した。

単一細胞擬似時間軌跡解析
まず、17種類の細胞タイプをすべて含むSeuratオブジェクトからT細胞のサブタイプを抽出した。このデータはPackerら(20)の文献にあるように前処理された。Monocle3(21)のlearn_graph機能を用いて、各パーティション内に主軌跡グラフを構築した。細胞は、最短経路をたどる擬似時間軌道に沿って並べられた。Naive CD4+/CD8+ T細胞は、軌跡を構築する際にルートノードとして定義されました。共発現遺伝子のモジュールを見つけるために、健常者、COVID-19陽性者、回復者の間で差次的に発現した遺伝子を使用した（疑似バルク差次的発現解析）。各モジュールに該当する遺伝子を抽出し、Enrichr (22) を用いてGOエンリッチメントを実施した。統計的に有意な濃縮スコア（p値＜0.05）を持つGO分子機能を選択し、ggplot2 rパッケージを用いて可視化した。

マルチオミックス解析
マルチオミックス解析は、トランスクリプトーム、表面マーカー発現、および臨床情報に対して行われた。各サンプルの細胞数が不均等であることによるバイアスの可能性を避けるため、各グループ、すなわちCOVID-19陽性、健常者、回復者から3つのサンプルをサンプリングし、各サンプルから同数の細胞を選択した。この層別サンプリング手法により、9人の患者から24633個の細胞が得られた。類似ネットワーク融合により、マルチオミクスデータを24633×24633のサイズの単一マトリックスに融合させた。クラスターは、「scRNA-seqデータの処理、クラスタリング、細胞タイプのアノテーション」セクションで前述したように、手動で同定した。

臨床的特徴および統合ベイジアンネットワークモデル
単一細胞RNA発現、表面マーカーおよびSNFクラスターメンバーシップの層別ランダムサンプルのデータは、COVID-19患者の高解像度CT（HRCT）スコアと統合された。健常者と回復者は、活動性肺炎がないことを示すHRCTスコア0を割り当てた。統合モデリング解析は，エンドツーエンドのベイジアンネットワーク学習，推論，ダッシュボード展開のための wiseR (23) パッケージを使用して行った．統合データ中のすべての連続変数は，生物学的解釈可能性を低，中，高とするために k=3 の k-means アルゴリズムを用いて離散化された．データから離散ベイジアンネットワークを学習し、変数間の構造的依存関係を符号化した有向無サイクルグラフを見つけるために、丘登り最適化を用いた。11個のベイジアンネットワーク構造をアンサンブルして平均化し、コンセンサス構造を導出した。このコンセンサス構造は、モンテカルロ・マルコフ連鎖（MCMC）近似推論法を用いて、周辺確率分布と条件付き確率分布でパラメトリックスされた。

結果
健常者、COVID-19、回復者の細胞異質性のスペクトル
SARS-CoV-2感染前、感染中、感染後の免疫反応と細胞の不均一性のスペクトルを理解するために、33人（健常者＝4、COVID-19＝16、回復者＝13）から採取したPBMCをマイクロウェルベースscRNA-seqプラットフォーム（BD Rhapsody Express）で単一細胞トランスクリプトームと標的プロテオーム（40種類の表面マーカー）シーケンスを同時に実施しました。表面タンパク質とRNAの両方について、合計163197個の細胞の塩基配列を決定した（図1A）。オリゴを付着させた抗体の詳細（リストとオリゴ配列）は、補足ファイル1；表S1に掲載されている。データ品質のQC後（Supplementary File 1; Figure S1A）、低品質の細胞を除去した結果、合計124726個の細胞が保持された。Seurat SCTransform v2 (24) を用いてバッチ効果補正と正規化を行い、Louvain algorithm (resolution = 0.4) を用いて次元削減と教師なしクラスタリングを行った。クラスタ特異的な遺伝子は Seurat FindMarker 関数を用いて同定し、クラスタは CellMarker、PanglaoDB、Azimuth、および Support Vector Machine (SVM) ベースの注釈ツール scPred (ROC, sensitivity and specificity は補足ファイル 1; 表 S2 に掲載) を用いて手動注釈を行った (14, 16, 25-27)。3つのグループ全体で合計17のアノテーションされたクラスタが同定された（図1B）。図1Cは、3群間の細胞タイプの頻度を表している（群内の細胞総数に対して正規化）。

図1
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図1 健常者、感染者、回復者のCOVID-19における細胞の異質性。(A）サンプル分布とscRNA-seqの概略的なワークフロー、次に細胞の不均一性と発現差の分析。(B）健常者、COVID-19感染者、回復者の124726個の細胞のUMAPによる可視化。(C）3群にわたる細胞タイプの頻度、細胞総数に対して正規化。(D, E）細胞タイプに特異的な（D）表面マーカーと（E）RNAレベルの発現。カラースケールは相対的な発現を示し、円のサイズはマーカーを発現している細胞のパーセントを示す。(F)3つのグループにおける細胞種特異的なマーカーの発現。(G) 健常者と回収された比較群のUMAPによる視覚化。2群間にバッチ効果はなく、回収された個体に存在しないクラスターがボックスで強調されている。(H) 健常者と回収された比較群のUMAP可視化（細胞タイプ注釈付き）。(I) 機械学習による細胞型アノテーション後の未同定クラスターのUMAP可視化。(J) Naive CD4+ T細胞の新規サブセットと既存のNaive CD4+/CD8+ T細胞の間で差次的に発現された遺伝子のGSEA。

COVID-19患者におけるプロフェッショナルな抗原提示細胞の減少
抗原はタンパク質分解切断を受け、その後、MHCクラスIまたはクラスII分子によってそれぞれCD8+ T細胞およびCD4+ T細胞に提示される。B細胞、マクロファージ、樹状細胞（DC）は、T細胞を介した免疫反応に関与するプロの抗原提示細胞（APCs）である。我々は、COVID-19患者において、B細胞集団が健常者と比較して有意に減少していることを見出した（P-value < 0.00001）。興味深いことに、回復した患者では、健常者と同様ではないものの、これらの細胞数が増加していた。しかし、DC集団は陽性患者で増加し、回復者ではさらに増加した。一方、COVID-19患者では、CD8+ T細胞の減少とCD4+ T細胞集団の増加が観察された。また、COVID-19患者では、ナイーブCD4+/CD8+ T細胞と比較して、活性化CD4+ T細胞の存在量が増加していることが観察された。これらは、COVID-19患者において、MHCクラスIを介した抗原提示は最適でないが、MHCクラスIIを介した抗原提示は増加していることを示唆している。一方、回復した患者では、APCとCD8+T細胞が増加しており、MHCクラスIを介した抗原提示機能の喪失が回復したことを示している可能性がある。

COVID-19に応答した細胞傷害性の増加
単球とNK細胞は、「殺傷機能」と「細胞傷害性」を付与している。感染者ではキラー細胞（ナチュラルキラー細胞またはNK細胞、NK T細胞）が増加し、その後、回復者では減少していることが観察された。また、回復者では増殖中のNK細胞が最も多く、成熟NK細胞の半減期や感染期間と相関していた(28)。回復者で増殖NK細胞が多いことは、感染後のIFN-γ産生の減少を示唆している(29)。一方、CD14+/CD16+の中間型単球は、健常者に多く存在するが、COVID-19患者では著しく減少し、回復者では増加した。このことは、COVID-19患者では単球の活性化が高く、回復者ではその一部が回復していることを示唆している。キラー細胞」集団と単球の増加は、ともにCOVID-19患者における細胞傷害性の増加を示唆するものである。3群間および1対比較群間の細胞タイプの頻度の統計的有意性は、補足ファイル1；表S3として入手可能である。

回復者におけるナイーブCD4+/CD8+ T細胞による免疫応答の低下と炎症反応の増加
表面マーカーと細胞内マーカーの細胞タイプ特異的発現を図1D, Eに示した。図1Fは、細胞タイプアノテーションに用いた細胞タイプ特異的マーカーの発現をグループ間で比較したものである。また、一対の比較（健常者対COVID-19陽性、COVID-19陽性対回復、健常者対回復）で細胞の異質性を見た（図1G；H、補足ファイル1、図S1B〜1E）。驚くべきことに、未同定のクラスターが健常者に明確に存在し、回収者には存在しないことがわかった（図1G, H; 補足ファイル1; 図S1F）。scpredを用いたアノテーションの結果、それはNaïve CD4+ T細胞集団であり、健常者/回復者の既存のNaive CD4+/CD8+ T細胞と比較してMALAT1、BACH2、いくつかのリボソーム蛋白コーディング遺伝子の発現が減少していた（図1I；補遺2参照）。これらの遺伝子の発現の減少は、免疫反応の増加、サイトカイン産生の減少、炎症反応の減少をもたらす（図1J）(30-32)。したがって、このNaïve CD4+ T細胞集団の損失は、回復した個体におけるNaïve CD4+/CD8+ T細胞による免疫応答の低下と炎症応答の増加を示唆している。

回復者におけるB細胞成熟過程の喪失
細胞タイプ間のクロストークとそれに続く免疫機能の制御を理解するために、我々はCellChat Rパッケージ（33）を用いて、細胞間コミュニケーション解析を行った。細胞間コミュニケーション解析の結果、健常者ではClass-switched memory B細胞とActivated CD4+ T細胞の間でCD22-CD45シグナルが確認されたが、COVID-19陽性者や回復者では確認されなかった（補足ファイル1；図S1G-1I）。CD45は、B細胞の成熟と抗体産生に重要なCD22レベルを負に制御していることに注目することが重要である(34)。CD22-CD45の相互作用の欠如は、COVID-19患者におけるB細胞の成熟異常を示している。一方、NK細胞におけるCD99シグナルとCD8+TCMにおけるCADM1シグナルは、COVID-19患者では観察されたが、健常者や回復者では観察されなかった。NK細胞におけるCD99シグナルはIL-6とTNF-αをアップレギュレートすることが知られており（35）、一方、CADM1シグナルは細胞傷害性とIFN-γ分泌を増加させることが知られている（36）。これらのことは、COVID-19 患者における NK および CD8+ T 細胞を介した免疫および炎症反応の上昇を示唆している。

COVID-19患者における適応免疫の悪化は、単球とT細胞に濃縮されたCD40-CD40LGによって媒介される
細胞間コミュニケーション解析で明らかになったCOVID-19患者の免疫・炎症反応は、CD22-CD45相互作用だけでなく、CD40とCD40LGの相互作用によっても調節されていることがわかった。しかし、CD40-CD40LGの相互作用は、我々の細胞間コミュニケーション解析では観察されなかった。CD40-CD40リガンドの発現と相互作用は、適応免疫応答の活性化のみならず、感染による炎症、CD8+T細胞のアポトーシスにも重要である(37)。そこで、群間のCD40-CD40LGの発現を調べた。図2AはCD40-CD40LGの表面レベルの発現を示したもので、COVID-19患者ではCD40-CD40LGの発現が低下し、回復者では特に専門の抗原提示細胞（APC）においてさらに発現の低下が観察された（図2B, C）。このことは、COVID-19の期間中に適応免疫応答が低下し、感染によって引き起こされる炎症とCD8+T細胞のアポトーシスが増加したことを示唆している。

図2
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図2 COVID-19患者におけるCD40-CD40LGを介した炎症反応。(A) COVID-19感染者、健常者、回復者の3群におけるCD40-CD40LGの表面レベルでの発現。カラースケールは相対的な発現を、円の大きさはマーカーを発現している細胞の割合を示す。(B, C）3群間のCD40-CD40LGの細胞種特異的な表面発現量。(D）B細胞およびT細胞におけるFASの表面レベルでの発現。(E, F）3群間でのケモカインおよびケモカインレセプターの表面レベルでの発現。(G-J）全細胞型における（G）サイトカイン、（H）ケモカイン、（I）インターロイキン、（J）TNFレセプター・スーパーファミリーのRNAレベルの発現。(K-M) (K) Activated CD4+ T cells, (L) CD8+ TCM, および (M) monocytes におけるPPIレベルの相互作用ネットワーク. [NSは非有意、*はp値<0.05、***はp値<0.01、***はp値<0.0001を表す]を表している。

続いて、アポトーシス時に発現する死の受容体であるFAS受容体の発現を調べた。CD4+およびCD8+ T細胞集団のすべてで発現の増加が観察された。驚くべきことに、B細胞集団（ナイーブB細胞、クラススイッチメモリーB細胞）でもFASの高い発現が観察され、COVID-19患者における抗原提示と抗体反応の異常を示唆した（図2D）。さらに、ケモカインおよびサイトカイン受容体（CXCR3、CXCR4、CXCR5、CCR4、CCR5、CCR7）の発現が、活動期のCOVID-19および回復期の患者で増加していた（図2E、図F）。並行して、COVID-19患者のCD4+ TCM、Classical monocytes、NK細胞でサイトカイン（CCL3、CCL4、CCL5、CCL7、CCL18、CCL20）の高い発現が観察された（図2G）。ケモカイン（CXCL1、CXCL2、CXCL3、CXCL8、CXCL16）の高い発現も、COVID-19患者のCD4+ TCMとClassical Monocytesで認められた（Figure 2H）。これは、活動的なCOVID-19患者において、CD4+ TCMと単球がサイトカインとケモカインを増加させていることを示している。また、インターロイキン（IL1B、IL15、IL16、およびIL32）は、活動性COVID-19患者において発現が増加していることが判明し、活動性COVID-19中のT細胞および単球を介した炎症性反応が示された（図2I）。

TNF受容体2（TNFR2）としても知られるTNFRSF1Bの発現が、COVID-19活動期に古典的単球とNK細胞で増加していることが観察された（図2J）。TNFR2は、マクロファージやCD8+T細胞における炎症の制御に関与している。B細胞の生存促進受容体であるTNFRSF13Cは、COVID-19の活性化により、クラススイッチメモリーB細胞で発現が増加することが見出された(38)。TNFRSF13Cの欠損は、循環B細胞、血清IgGとIgMが低いが、IgAが高いことを特徴とする(39)。したがって、回復者のクラススイッチメモリーB細胞におけるTNFRSF13Cの発現が非常に低いことは、回復者においてクラススイッチメモリーB細胞が減少しているという我々の以前の所見を支持するものである。また、回復者のIgGやIgM抗体ではなく、IgA抗体の増加も示している。回復者におけるTNFRSF14とTNFRSF17の発現の増加は、炎症反応の亢進を示唆している（図2J）。合わせて、CD40-CD40LGの調節異常は、COVID-19の活動期に単球とT細胞を介した炎症反応の増加を引き起こした。活性化 CD4+ T細胞、CD8+ TEM、古典的単球、NK細胞、CD4+ TCMおよびCD8+ TCMにおける遺伝子の全体の差分発現は、補足ファイル1、2；図S2A〜2Fに表されている。差次的に発現した遺伝子から得られたタンパク質相互作用レベルのネットワークは、活性化CD4+ T細胞におけるTNF-αシグナル、CD8+ TEM細胞におけるIL-6シグナルの上昇を示し、これらはCOVID-19活動中の炎症反応の上昇を示唆する（図2K、L; 補足ファイル1、図 S2G）。

意外なことに、単球とNK細胞でTGF-βシグナルの増加が観察され（図2M；補足ファイル1；図S2H）、これらの細胞のプロウイルスの役割を示していた（40）。その上、CD4+ TCMとCD8+ TCMそれぞれで免疫応答の低下とT細胞の活性化が観察され、免疫応答とT細胞の活性化の異常を示した（補足ファイル1；図S2I、J）。その上、これらはまた、COVID-19患者における抗原提示の調節不全を示す。これらの結果は，COVID-19陽性者におけるCD40-CD40リガンド相互作用を介したサイトカイン応答の亢進とT細胞の異常な活性化を示している．

免疫、ストレスおよび抗ウイルス反応は、T細胞、単球およびNK細胞によって媒介される
細胞タイプに特異的な免疫およびストレス応答ダイナミクスを理解するために、分子シグネチャーデータベース（MSigDB-H）を用いて、Escape R/Bioconductorパッケージによる単一細胞解像度でのGSEAを行った（図3A）(41)。我々は、免疫反応関連経路（TGF-β、IL2-STAT5、IL6-JAK-STAT3、およびTNFαシグナル伝達、補体系活性化、および炎症反応経路）が、活動性COVID-19患者の古典的単球、NK細胞、活性化CD4+ T細胞およびCD4+セントラルメモリーT細胞において発現上昇することを見いだした。TGF-β と IL2 STAT5 シグナル、および補体系活性化経路も、COVID-19 活動中の Class スイッチメモリー B 細胞でアップレギュレートされていた。一方、ストレス応答関連経路（活性酸素経路、インターフェロンαおよびγ応答、PI3K-AKT-mTORシグナル、UPRおよびp53経路）も、COVID-19陽性患者のClass単球、NK細胞、活性化CD4+T細胞、Class-スイッチメモリーB細胞およびCD4+セントラルメモリーT細胞に特に豊富に存在していた。さらに、回復者のプラズマブラストには、2つの主要なストレス応答経路である活性酸素種（ROS）および unfolded protein response（UPR）経路が濃縮されていた。これらのことから、COVID-19の活動期には、T細胞、単球、NK細胞を介した免疫・ストレス反応のアップレギュレーションが起こっていることが示唆される。

図3
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図3 SARS-CoV-2感染時の免疫、ストレスおよび抗ウイルス反応。(A）3つのグループ（COVID-19患者、健常者、回復者）にわたる単一細胞解像度でのG SEA、行のデンドログラムは、免疫およびストレス応答経路を区別する。細胞の種類とグループは、異なる色のバーを使って強調した。データは、各経路の相対的な濃縮スコアとして表現されている。(B, C) (B) ADAM, (C) APOBEC3 遺伝子の発現。(D）COVID-19患者における抗ウイルス遺伝子の発現およびHRCTスコアとの相関。(E)3つのグループにわたるすべての細胞タイプでのIFNファミリー遺伝子の発現。細胞タイプおよびグループは、異なるカラーバーを用いて強調した。(F) 3つのグループにわたる古典的単球とCD4+ TCM間のIFNレセプターのタイプIとタイプIIの累積発現。

抗ウイルス反応のダイナミクスを理解するために、ADAM、APOBEC3およびIFNファミリーメンバーの発現を調べた。その結果、COVID-19患者の古典的単球、中間単球、NK細胞では、APOBEC3A、APOBEC3B、APOBEC3C、APOBEC3D、APOBEC3F、APOBEC3G、APOBEC3Hが健康者あるいは回復者に比べ高発現していることがわかった（図3B）。一方、ADAMファミリーメンバーは、健常者や回復者と比較して、活動性COVID-19のT細胞（Activated CD4+ T cell, CD4+ TCM, CD8+ TCM, CD8+ TEM）において発現が上昇していた（図3C）。これは、SARS-CoV-2感染時のT細胞、単球およびNK細胞を介した抗ウイルス反応のアップレギュレーションを強調するものである。このデータから、COVID-19陽性患者における抗ウイルス反応の増加と病気の重症度との関連も確認された。その結果、抗ウイルス遺伝子（ADAM7、ADAM11、ADAM12、ADAM18、ADAM20、ADAM29を除く）の発現は、COVID-19患者のHRCTスコアと負の相関を示し、抗ウイルス反応の増加と疾患の重症度低下との関連性が示唆された（図3D）。

最後に、I型インターフェロン（IFNα）の受容体であるIFNAR1とIFNAR2が、COVID-19患者のCD4+ TCMと古典的単球で、他の細胞と比較して発現が増加していることを見いだした。II型インターフェロンの受容体であるIFNGR1およびIFNGR2も、CD4+ TCMおよび古典的単球でアップレギュレートされていた（図3E）。しかし、II型IFN受容体の発現は、両方の細胞型においてCOVID-19患者で高く、一方、I型IFN受容体は、回復者のCD4+セントラルメモリーT細胞においてアップレギュレートされていた（図3F）。以上のことから、SARS-CoV-2感染時には、抗ウイルス反応はセントラルメモリーT細胞、単球、NK細胞によって媒介され、炎症性サイトカインの転写はタイプII IFN受容体を介したシグナルの結果、増加することが示唆された。

COVID-19陽性者におけるT細胞の異常な活性化
3群間のT細胞の動態を理解するために、T細胞の活性化と疲弊のマーカーの発現を調べた。CD38、CD69、CD40LGは、COVID-19の感染活動時に高い発現を示し、T細胞集団の活性化段階であることが確認されたが、健康者や回復者は、感染活動時に比べてT細胞が静止段階にあることがわかった（図4A）。また、T細胞の疲弊マーカー、すなわちTIM-3、LAG3、CD152またはCTLA4、CD279またはPD-1の発現が、COVID-19感染活性者と健常者に比べて回復者では高いことが確認された（図4B）。このことは、COVID-19からの回復後、より多くのT細胞の集団が疲弊していることを示す。

図4
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図4 健常者、COVID-19陽性者、回復者のT細胞特異的表面マーカー発現と擬似時間解析。(A) T細胞活性化マーカーの表面マーカーレベルでの発現。(B）表面マーカーレベルでのT細胞疲弊マーカーの発現。(C）TCRαβ鎖とγδ鎖の表面マーカーレベルでの発現。カラースケールは相対的な発現を示し、円のサイズはそのマーカーを発現している細胞のパーセンテージを示す。(D）T細胞サブタイプのUMAPによる可視化。(E）擬似時間に対するT細胞サブタイプのUMAPによる視覚化。(F-H）（F）健常者、（G）COVID-19陽性者、（H）回復者におけるT細胞サブタイプの疑似時間に対する細胞の分布。(I-L）（I）モジュール1、（J）モジュール2、（K）モジュール3、（L）モジュール4からの遺伝子のGO濃縮。

次に、特定のT細胞受容体型の発現を調べた。一般に、T細胞受容体の約95％はαβ鎖を持ち、αβ受容体鎖を持つT細胞は病原体に抗原特異的に応答してサイトカイン産生を誘導し、その後B細胞の成熟と抗体分泌を誘導する。しかし、γδ受容体鎖を持つT細胞のごく一部は、初期の免疫・炎症反応に必須である(42)。驚くべきことに、健常者、活動性COVID-19および回復者の間で、TCRがαβ型からγδ型に徐々にシフトし、回復者ではTCRγδの発現が最も高いことが観察された（図4C）。このように、回復者のT細胞の枯渇とTCRγδの多さは、COVID-19活動時のT細胞応答の異常を示唆している。

3群間のT細胞サブタイプの違いを理解するために、Monocle 3（図4D、E）（43）を用いて、疑似時間に関する細胞軌跡を構築した。3群すべてについて、各細胞タイプの細胞を仮死時間に対してプロットしたところ、仮死時間の中央値に有意差が認められた（図4F-H；Supplement File 1；図S3）。重要なことは、COVID-19患者（CD8+ TEMとCD4+ TCMを除く）においてより低い偽時間が観察され、おそらくある細胞型と/状態から別のものへの移行がより速いことを示していることです。最後に、仮死時間に関する遺伝子の共発現を理解するために、各T細胞サブタイプにおいて、健常者、COVID-19陽性者および回復者で発現が異なっていた遺伝子をクラスター化し、共発現遺伝子の4つのモジュールを同定した。モジュール1、2、4は、細胞の成長と発達に必要なハウスキーピング細胞機能に対して有意なGOの濃縮（p値＜0.05）を示したが、モジュール3は免疫・炎症反応関連分子機能に対して有意な濃縮を示した（図4I-L；補足ファイル4）。これは、従来の免疫・炎症反応を超えて、正常な細胞機能にCOVID-19が影響を及ぼす可能性を示している。

類似性ネットワーク融合と機械学習モデルによって明らかになった特徴的な免疫応答シグネチャー
データの複数の様式とCOVID-19疾患との関連を理解するために、個人の遺伝子発現、表面マーカー発現および臨床の詳細を統合して、類似性ネットワーク融合（SNF）に基づくクラスタリングを行った（図5A）。その結果、樹状細胞はCOVID-19感染者では減少し、回復者では増加していた。これは、感染者では抗原提示に異常があり、その後、感染後にその機能が回復するという当初の結果を再確認するものであった（図5B）。また、感染後、NK T細胞や単球の減少が見られ、回復者では細胞傷害性が低下していることが強調された。さらに、単球のS100A8、TXNIP、MT2A遺伝子の発現は、感染者における炎症反応の上昇を示唆した。また、回復者ではCD69+メモリーT細胞集団が増加していることが確認された。メモリーT細胞集団におけるCD69の高発現は、回復者においてメモリーT細胞集団が組織内に多く滞留していることを示す。これらの結果は、感染者における抗原提示の異常と細胞傷害性の亢進、および感染後のそれらの回復を強調するものである。

図5
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図 5 類似性ネットワーク融合とベイジアンネットワークモデルによるバイオマーカー探索。(A) 個人の遺伝子発現、表面マーカー発現、臨床的詳細に基づく細胞のSNFクラスタリング。(B）健常者、COVID-19陽性者、回復者の間で識別された細胞タイプの分布。(C) 個人のSNFクラスタ、遺伝子発現、表面マーカー発現、およびHRCTスコアを含む臨床データに基づいて構築されたベイジアンネットワークモデル。(D-F) HRCTスコアと(D) FOS, CST3, PSAP, (E) CD74, (F) CD45との関連性を示すベイジアンネットワークモデルからの具体的なハイライト。

我々の研究コホートにおけるCOVID-19と関連するバイオマーカーの探索に向けて、我々はベイジアンネットワークモデルを構築した（図5C）。完全なネットワークはZenodoで公開されています（https://doi.org/10.5281/zenodo.6583269）。重要なのは、HRCTスコア、FOSおよびCXCL8遺伝子の間に強い関連性があることである（図5D）。FOSは、細胞死、アポトーシス、炎症反応を制御することが知られており（44）、MERSおよびSARS-CoV-2感染において最も有意に発現が変動した遺伝子の一つである。CXCL8 は好中球の化学誘引物質であり、感染部位に好中球を集め、IL-8 や他のサイトカインを介した炎症反応を開始させる(45)。また、IL1βとCXCL8との直接的な関連も観察された。IL1βおよびIL6活性の上昇はCOVID-19疾患の特徴であり、その調節異常は疾患の重症度と関連している(46)。したがって、FOS、CXCL8およびIL1βのHRCTスコアとの関連は、COVID-19疾患の強力な予測因子となる。さらに、我々はHRCTスコアと単球のマーカー遺伝子であるCST3との強い関連性を見いだした。単球は、先に示したように、COVID-19患者の炎症反応に関与している。さらに、CST3とS100A9の関連は、単球を介した炎症反応とHRCTスコアとの相関を示し、これは我々の以前の知見を支持するものである。また、我々は、HRCTスコアと、重症COVID-19患者で障害されている抗原提示と男性生殖機能に関与する遺伝子であるPSAPとの間に強い関連を見出した（47, 48）。

我々は、MHC Class-II invariant chainとしても知られるCD74とHRCTスコアの強い関連性を観察した（図5E）。CD74はMHCクラスIIを介した抗原提示に関与しており、COVID-19患者ではこのプロセスがアップレギュレートされている。さらに、CD74は重症のCOVID-19患者で発現が増加していることが知られている(49)。CD74は免疫抑制の役割も持っており、重症のCOVID-19患者でしばしば観察される(50)。最後に、PDE11Aを介したCD45のHRCTスコアとの強い関連性を観察した（図5F）。PDE11Aは炎症反応に関与することが知られており、重症のCOVID-19患者に多く発現している(51)。CD74と同様に、CD45も免疫抑制因子であるため、重症COVID-19患者では発現が亢進している。したがって、CD74とCD45のHRCTスコアとの関連は、COVID-19疾患におけるCD74とCD45の役割の可能性を示唆し、本疾患のバイオマーカーとして使用できる可能性がある。

考察
いくつかの研究により、COVID-19病における免疫系の異常が明らかにされているが（52, 53）、免疫反応の機能不全の背後にあるメカニズムの理解には、まだいくつかの重要なミッシングリンクが存在する。本研究では、33人（健常者、COVID-19活動中、回復者）の1細胞分解能トランスクリプトミクスおよび標的プロテオミクスを用いて、COVID-19病で起こる免疫制御の大きなシフトを明らかにしています。B細胞およびCD8+T細胞集団の減少は、MHCクラスIを介した抗原提示の減少を示唆する一方、DCおよびCD4+T細胞集団のわずかな増加は、COVID-19陽性者におけるMHCクラスIIを介した抗原提示の上昇を示唆している。しかしながら、PPIネットワークによって明らかにされた感染者のCD4+ T細胞による免疫反応の低下は、MHCクラスIIを介した抗原提示が最適でないことを強調するものであった。B細胞表面上のFASの高発現は、COVID-19感染者のB細胞の老化を強調し、MHCクラスIを介した抗原提示の減少という我々の発見をさらに強化するものである。回復したグループでのB細胞とCD8+T細胞集団の増加は、MHCクラスIを介した抗原提示機能の回復を強調するものである。サイトカイン・ケモカイン反応のマスターレギュレーターであるNK細胞や古典的単球集団は感染者で増加し、回復者では減少したが、回復者では増殖したNK細胞が増加したことは興味深かった（図6）。

図6
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図6: 本研究で得られた重要な知見のまとめ。COVID-19患者、回復者、健常者において観察されたT細胞の動態と、機械学習の強みを生かした主要な免疫学的知見が強調されている。

あまり研究されていない細胞集団ではあるが、回復者に増殖中のNK細胞が多いことは、成熟/活性化NK細胞の半減期が7-10日であることから説明でき、その後、望ましいレベルを維持するために増殖が必要となる(28)。NK細胞の活性化はCOVID-19の特徴であり、感染期間の平均は活性化NK細胞の半減期と一致する（54）ことから、感染後、NK細胞プールが回復する過程が浮き彫りになった。さらに、増殖したNK細胞は、感染活動中に増加するIFN-γ産生の逆転を媒介することから（55）、この特定の細胞タイプの重要性が浮き彫りにされた。健常者のナイーブT細胞サブセットは、ナイーブCD4+/CD8+T細胞集団と比較して、高い免疫応答と低い炎症応答能を有している。回復した個体では、このナイーブT細胞サブセットが失われたため、健常者に比べて炎症反応の潜在的な可能性が高くなった。細胞間コミュニケーション解析は、リガンド-受容体相互作用に基づく細胞内および細胞間コミュニケーションを明らかにした。

健常者、感染者、回復者の間で、細胞内、細胞間のコミュニケーションに変化が見られることがわかった。健常者ではB細胞の成熟過程に関与するCD22-CD45のシグナルが感染・回復者では欠落しているのに対し、感染者ではCD99とCADM1のシグナルが感染後欠落していた。このように、回復者ではNK細胞やCD8+T細胞を介した細胞傷害性は回復したものの、B細胞の成熟過程は回復者ではB細胞の存在量が増えているにもかかわらず、依然として障害されていることがわかった。

CD40とCD40リガンドの相互作用は、感染による炎症反応、CD8 T細胞の老化、ウイルス複製の増加など、幅広い免疫学的事象を制御することが知られている(56)。COVID-19陽性群および回復群においてCD40およびCD40LGの発現が徐々に低下していることから、COVID-19感染時に感染誘導性の炎症とCD8+T細胞のアポトーシスが亢進していることが示唆された。実際、感染者ではCD8+T細胞上にFASが高発現し、CD8+T細胞の存在量が減少していることが観察された。興味深いことに、以前の研究でも、重症のCOVID-19病において、高レベルのFAS分子によるT細胞の枯渇が報告されている(57)。CD4+TおよびCD8+T細胞集団ならびにB細胞集団（ナイーブB細胞、クラススイッチメモリーB細胞）におけるFASレセプター（プロアポトーシス分子）の発現上昇から、抗原提示および抗体応答の障害もCOVID-19中に観察された(58)。

一方、感染者ではケモカイン、サイトカイン、インターロイキンが上昇し、その上昇をCD4+ T細胞、CD8+ T細胞、NK細胞、単球が媒介した。興味深いことに、これらの炎症マーカーは、回復した個体では抑制されていることが判明し、感染後の段階を理解することの重要性が浮き彫りになった。細胞種特異的なPPIネットワークは、単球とNK細胞でTGF-βシグナルが上昇していることを明らかにした。TGF-βシグナルは、CD8+T細胞を活性化する一方で、ウイルスの複製を促進するという両刃の剣として作用しており、単球とNK細胞を介したCOVID-19の調節の別の側面を明らかにするものであった。さらに、このことは、感染者においてCD40-CD40リガンド相互作用が減少し、ウイルスの複製が増加することを改めて示すものであった。

我々は、IL6-JAK-STAT3、IL2-STAT5、TGF-β、TNFα、炎症反応経路、および補体系活性化などのいくつかの免疫反応関連シグナル伝達経路が、COVID-19の活動中に古典的単球、NK細胞、活性化CD4+ T細胞、およびCD4+セントラルメモリーT細胞において発現上昇を示したことを見出した。ROS経路、インターフェロンαおよびγ反応、PI3K AKT mTORシグナル、UPR経路およびp53経路などのストレス反応に関与する他の経路も、COVID-19活動中の患者の古典的単球、NK細胞、活性化CD4+T細胞、クラススイッチメモリーB細胞およびCD4+セントラルメモリーT細胞において上昇した。これらの知見は、T細胞、単球、NK細胞を介した免疫経路およびストレス経路のアップレギュレーションを示唆しており、COVID-19患者において複数の免疫応答経路が活性化するという先行研究（59、60）と一致する。

COVID-19疾患活動中の抗ウイルス反応は、古典的単球、NK細胞、T細胞でそれぞれAPOBEC3およびADAMファミリーメンバーの高発現が確認された。APOBEC3およびADAMファミリーメンバーはともに自然免疫を付与することが知られており（61, 62）、したがって、T細胞、NK細胞および単球を介して活動性COVID-19の抗ウイルス反応の増強に関与している可能性がある。CD4+TCMおよび古典的単球におけるII型インターフェロン受容体（IFNAR1およびIFNAR2）の発現増加は、I型インターフェロン受容体（IFNGR1およびIFNGR2）の発現が優勢であった回復期に比べ、活動期COVID-19群ではより顕著であり、それによって活動期COVID-19病期にII型IFN受容体のシグナル伝達を介して炎症性サイトカインの急増が示唆された。

これまでの研究で、COVID-19病期にT細胞の制御異常が報告されているが(63, 64)、本研究でも同様に観察された。リンパ球減少は COVID-19 疾患の重要な特徴であり、回復期の COVID-19 患者でもリンパ球減少の変化が観察されるので、これは特に重要である (65-67)。CD4+およびCD8+ T細胞の急激な減少とT細胞反応の遅延は、より高いCOVID-19重症度と関連しており、我々の所見と同様に、回復した個体では同じように回復することが、限定的だが重要な研究によって強調されている(65)。いくつかの研究では、ヘルパーT細胞（Th1/Th2/Th17）の異常な増加、およびCOVID-19中のウイルスクリアランスの低下と高い疾患重症度との関連も強調されている（68, 69）。COVID-19患者で観察されるリンパ球減少は、T細胞の異常な活性化と疲弊によっても特徴づけられる。我々は、CD38とCD69の発現が、健常者や回復者に比べて活動的なCOVID-19患者で著しく増加していることを見出し、T細胞の反応が活性化していることを示唆した。重症のCOVID-19患者では、疲弊マーカーの高値が報告されているが（70, 71）、回復者ではLAG3、CTLA4、PD-1といったT細胞の疲弊マーカーの発現が上昇していることが観察された。このことから、COVID-19病期にはT細胞が活性化しており、回復後は疲弊したT細胞集団が優勢になることが明らかとなった。さらに、T細胞受容体（TCR）の型を調べたところ、TCRはαβ型からγδ型へと徐々に移行し、回復した個体で最大発現を示すことが確認された。γδ型TCRは特定の抗原に対する初期免疫反応や炎症反応を誘導する役割を担っていることから（72）、回収された個体におけるその存在は、COVID-19発症時のT細胞の異常な乖離した動態を反映しているものと思われる。擬似時間解析により、T細胞サブセットの異なる細胞軌道は、COVID-19患者の間で擬似時間が減少していることを明らかにした。それにより、異常なT細胞活性化を引き起こす原因かもしれないT細胞サブタイプ間の急速な移行が示唆された。また、T細胞サブセットにおいて、健常者、COVID-19陽性者、回復者の間で共発現遺伝子のモジュールに違いが見られ、4モジュール中3モジュールが、COVID-19疾患の様々な影響を示す可能性のある重要なハウスキーピング細胞機能を示している。

最後に、類似性ネットワーク融合に基づくクラスタリングは、COVID-19患者における抗原提示の異常と、回復者における細胞毒性の低下とメモリーT細胞の高い組織滞留という我々の知見を再確認するものであった。ベイジアンネットワークモデルにより、FOS、CXCL8、IL1βがHRCTスコアの重要な予測因子であることが明らかになった。FOS遺伝子はアポトーシスと関連することが知られているが（73）、CXCL8を介した好中球の動員および活性化は、下気道感染の病因となり、過剰産生されると嚢胞性線維症につながる（74）。また、内皮機能障害にも関与していることが疑われている。SARS-CoV-2はアポトーシス経路を誘導することが知られており、この経路は炎症や線維化と複雑に関係し、医学的合併症を引き起こすことが分かっている(75)。したがって、統合モデルを用いた我々の研究において、HRCTスコアの高い患者においてFOS、CXCL8、IL1βのレベルが上昇しているという関連は、この知見を支持するものである。さらに、CST3、S100A9と同時にHRCTスコアとの強い相関も見いだされた。単球マーカーであるCST3とS100A9は、単球を介した炎症性反応を示す（76）。これらのマーカーとHRCTスコアとの関連は、COVID-19疾患の炎症反応に単球が関与していることを示唆するものである。HRCTスコアは、CD74およびCD45とも強い相関があった。CD74とCD45はともに免疫抑制因子であり、重症のCOVID-19患者では上昇することが知られている。したがって，HRCTスコアとの相関は，COVID-19疾患の進行および重症度におけるそれらの役割を示唆していると考えられる。

結論
我々の単一細胞ベースのCOVID-19研究は、COVID-19陽性者および回復者における抗原提示の異常、CD40-CD40LG欠損による免疫/炎症/ストレスおよび抗ウイルス反応の亢進、COVID-19患者におけるより速い細胞移行、FOS、CD45およびCD74などのCOVID-19疾患バイオマーカーを明らかにした。これらの知見は、SARS-CoV-2感染症の治療戦略を明確にするために役立つ可能性のある、複雑な免疫反応の不均一性の理解に役立つと思われる。さらに、本研究は、再感染に関連する可能性のある回復者のCOVID-19後遺症を理解することの重要性を強調している。さらに、COVID-19回復者を対象に、重症度に差のある長期的な追跡調査を行うことにより、回復者の免疫反応動態の解明が進むと考えられる。

データの利用可能性
本研究で発表したデータは、NCBI GEOリポジトリ（アクセッション番号GSE201088）に登録されています。

倫理に関する声明
ヒトを対象とした研究は、CSIR-IGIBの人間倫理委員会のクリアランス（Ref No: CSIR-IGIB/IHEC/2020-21/01）により審査・承認されています。患者/参加者は、この研究に参加する前に、書面によるインフォームドコンセントを提供した。患者・参加者は、本研究への参加に際して、書面による同意を得た。

著者による貢献
PC、解析、調査、データキュレーション、可視化、執筆（原案）。KK、データキュレーションと執筆 - 原案。MK、SW、SS、調査。PM、解析、可視化、執筆（原案）。AA、解析・執筆（原案）。RM, RG, AG, 形式的な解析。AYとPD、データキュレーション。KT, MJ, リソース TS, 正式な分析、可視化、執筆 - レビューと編集、監督。RP は概念化、方法論、監修、執筆 - 査読と編集、資金獲得に貢献した。すべての著者が論文に貢献し、提出されたバージョンを承認した。

資金提供
本研究は、ビル・アンド・メリンダ・ゲイツ財団から資金提供を受けた[助成金番号 - INV-033578 および INV-030592].

謝辞
本研究に参加されたCOVID-19患者、健常者、回復者の皆様に深く感謝いたします。また、本研究に関連する試料を提供してくださったD.Y. Patil Medical College, Hospital and Research Institute, Kolhapur, Maharashtra, Indiaの支援に謝意を表したい。また、Aradhita Baral博士には研究管理者として、資金提供者との調整について、Mohd Faruq博士には実験進行について、それぞれ協力と支援をいただいた。COVID-19のサンプル輸送とサンプル管理については、Anil KumarとNisha Rawatの協力に感謝する。PC、PD、KK、AYは、CSIRの研究員奨励金に感謝する。

利益相反
著者らは、本研究が利益相反の可能性があると解釈される商業的または金銭的関係がない状態で実施されたことを宣言する。

出版社からのコメント
本論文で述べられたすべての主張は、著者個人のものであり、必ずしも所属団体、出版社、編集者、査読者の主張を代表するものではありません。本論文で評価される可能性のある製品，あるいはそのメーカーが行う可能性のある主張は，出版社によって保証または承認されたものではない．

補足資料
本論文の補足資料は、https://www.frontiersin.org/articles/10.3389/fimmu.2022.1034159/full#supplementary-material でオンライン公開されています。

補足ファイル1｜オリゴ結合抗体の詳細（リストとオリゴの配列）。

補足ファイル2｜健常者と回復者の新しいナイーブT細胞サブセットとナイーブCD4+/CD8+T細胞との間の遺伝子発現の差を示す表。

補足ファイル3｜本研究で強調された細胞タイプの擬似バルク差分遺伝子発現。

補足ファイル4｜各モジュールからの遺伝子のGOエンリッチメント解析。

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キーワード COVID-19、シングルセル・マルチオミクス、COVID-19回収個体、免疫反応、ベイジアンネットワークモデル、T細胞活性化

引用元 この論文では、COVID-19陽性者と回復者の抗原提示、免疫反応、T細胞活性化の動態を、シングルセル・マルチオミクスにより明らかにした。Front. Immunol. 13:1034159. doi: 10.3389/fimmu.2022.1034159

Received: 2022年9月1日; Accepted: 2022年11月16日
掲載：2022年12月02日

編集者

エドウィン・ベルケ、ハインリッヒ・ハイネ・デュッセルドルフ大学（ドイツ）、Edwin Bölke
査読者：ケリー・ヌネス、サンパウロ大学、ドイツ

ケリー・ヌネス（ブラジル・サンパウロ大学
Junliang Fu, 陸軍総医院第五医療センター, 中国
Copyright © 2022 Chattopadhyay, Khare, Kumar, Mishra, Anand, Maurya, Gupta, Sahni, Gupta, Wadhwa, Yadav, Devi, Tardalkar, Joshi, Sethi and Pandey. これは、クリエイティブ・コモンズ表示ライセンス（CC BY）の条件の下で配布されるオープンアクセスな記事です。原著者および著作権者のクレジットを表示し、本誌の原著を引用することを条件に、他のフォーラムでの使用、配布、複製が許可されます（一般的な学術慣行に従って）。本規定に従わない使用・配布・複製は認めない。

*Correspondence: Meghnad Joshi, drmeghnadjoshi@gmai.com; Tavpritesh Sethi, tavpriteshsethi@iiitd.ac.in; Rajesh Pandey, rajesh.p@igib.res.in; rajeshp@igib.in

これらの著者はこの作品に等しく貢献しています。

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心筋梗塞の診断バイオマーカーとしてのNR4A2：包括的バイオインフォマティクス解析と実験的検証
Dong Sheng Wei, Jia Jie Qi, Yuxuan Wang, Lu Zheng Li, Guanlin Yang, Xin Yong He and Zhe Zhang（ドン・シェン・ウェイ、ジャ・ジエ・チー、王玉萱、ルー・チェン・リー、ヤン・グアンリン、ヘー・シン、チャン

シングルセル・トランスクリプトミクスによる、ヒトの抗NMDA受容体脳炎に関連する細胞型特異的な免疫制御の解明
Yushu Jiang, Shuhua Dai, Linlin Jia, Lingzhi Qin, Milan Zhang, Huiqin Liu, Xiaojuan Wang, Rui Pang, Jiewen Zhang, Gongxin Peng および Wei Li

oFVIII-FLAGを発現するように操作された自家骨髄由来MSCが成羊に生着し、血漿中のFVIII濃度を効果的に上昇させること
Brady Trevisan, Martin Rodriguez, Hailey Medder, Shannon Lankford, Rebecca Combs, John Owen, Anthony Atala, Christopher D. Porada and Graça Almeida-Porada

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