腸内細菌叢由来のD-セリンは急性腎障害を予防する

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研究論文微生物学腎臓学フリーアクセス｜10.1172/jci.insight.97957

腸内細菌叢由来のD-セリンは急性腎障害を予防する
https://insight.jci.org/articles/view/97957


中出裕介,1 岩田泰典,2,3 古市憲吾,3,4 三田雅史,5 濱瀬健司,6 今野隆一,7 三宅泰斗,3 酒井紀彦,3 北島慎二,3 遠山正,3 篠崎泰之,3 相良晃弘,3 宮川太郎,3 原昭典,3 清水美穂、 3 上川康貴、3 佐藤晃一、3 大島めぐみ、3 米田中川詩織、3 山村雄太、3 金子修一、8 宮本哲也、9 片根真澄、9 本間寛、9 森田英俊、10 須田渉、11 服部正平、12 服部正平、13 和田隆1,3
2018年10月18日掲載 - 詳細はこちら

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要旨
腸内細菌叢由来の代謝産物は、健康と疾患において重要な役割を果たしている。D-アミノ酸とそのL-形態は、異なる機能を持つ腸内細菌叢の代謝産物である。本研究では、ヒトおよび急性腎障害（AKI）マウスにおいて、腸内細菌叢と関連したD-アミノ酸の病態生理学的役割を示した。マウスの腎臓虚血・再灌流モデルにおいて、腸内細菌叢は尿細管傷害を防御した。AKIによって誘発された腸内細菌叢の異常は、D-アミノ酸の代謝の変化に寄与していた。D-アミノ酸のうち、腎臓で検出されたのはD-セリンのみであった。傷害を受けた腎臓では、D-アミノ酸オキシダーゼの活性が低下していた。逆にセリンラセマーゼの活性は上昇した。D-セリンの経口投与は、B6マウスおよびD-セリン欠乏マウスの腎障害を軽減した。D-セリンは低酸素による尿細管障害を抑制し、低酸素後の尿細管細胞増殖を促進した。最後に、循環中のD-セリン濃度は、AKI患者における腎機能の低下と有意な相関があった。これらの結果は、AKIにおける腸内細菌由来のD-セリンの腎保護作用を示し、健康時とAKI時の腸内細菌叢と腎臓の相互作用に光を当て、D-セリンがAKIの新たな治療標的およびバイオマーカーとなる可能性を明らかにした。

はじめに
最近の研究により、腸内細菌叢の異常が、炎症性腸疾患（1）、糖尿病（2）、心血管疾患（3）、腎臓病（4）など、いくつかの疾患と密接に関連していることが明らかになった。現在までに、クロストリジウム・ディフィシル感染症(5)、袋炎(6)、メタボリックシンドローム(7)などの臨床症状において、糞便微生物移植の臨床試験が有効であることが示されている。腸内細菌叢はこれらの疾患において治療的役割を果たす可能性があるが、その正確な役割や基礎となるメカニズムは依然として不明である。

これまでのデータから、健康と疾患の両方における細菌の代謝産物の重要な役割が明らかになっている。腸内細菌叢が産生する短鎖脂肪酸（SCFA）は、制御性T細胞の増殖を促進するなどの抗炎症作用を示した(8)。急性腎障害（AKI）のマウスモデルでは、SCFAは尿細管障害を防御し、腎臓における樹状細胞の蓄積を減少させた(9)。対照的に、慢性腎臓病では腸内細菌叢が尿毒症毒素を産生する(10)。これらの知見は、腸内細菌叢がその代謝産物を介して宿主のホメオスタシスを制御している可能性を示唆している。

最近の進歩により、アミノ酸のキラリティが明らかになってきた。遊離D-アミノ酸とそのL-形態が2次元HPLCで定量された(11)。さらに、マウス腸内のD-アミノ酸が主要な微生物産物であること(12)、中枢神経系(13)、心臓(14)、皮膚(15)において生理的役割を果たすことが報告されている。しかしながら、腸内細菌が関連するD-アミノ酸の腎臓疾患における正確な役割はまだ明らかにされていない。そこで我々は、AKIを発症したヒトおよびAKIモデルマウスにおいて、腸内細菌叢と関連したD-アミノ酸の病態生理学的役割を探索した。

結果
AKIはマウス輸液/再灌流モデルにおいて腸内細菌叢異常を誘導する。AKIが腸内細菌叢に及ぼす影響を評価するため、AKIモデルマウスの虚血/再灌流（I/R）傷害後0、2、10日目の糞便について16S rRNA遺伝子配列解析を行った（図1A）。16Sリードのクラスタリング解析の結果、AKI群の微生物叢は、2日目と10日目に偽手術マウスの微生物叢よりも有意に種濃度が高いことが明らかになった（図1B）。両群の微生物叢全体の構造を比較すると、加重UniFrac主座標分析で明らかに異なるパターンが示された（図1C）。さらに、属レベルの分類学的割り当てでは、I/R損傷後にビフィドバクテリウムとTM7の存在量が減少し、ラクトバチルス、クロストリジウム、ルミノコッカスの存在量が増加した（図1、DおよびE）。

I/RモデルマウスにおけるAKI誘発性腸内細菌異常症図1
マウスI/RモデルにおけるAKI誘発腸内細菌異常症。(A）マウス腎臓におけるI/R傷害のプロトコール。(B）I/R傷害マウスと偽手術マウスの腸内細菌叢の種の豊富さの比較。(C)I/R誘導前と2日目および10日目の細菌群集構造の重み付けUniFrac解析に基づく主座標分析(PCoA)。 (DおよびE)I/R傷害マウスと偽手術マウスのI/R前と2日目および10日目の細菌組成(D)と複数種の存在量(E)の比較。データは平均値±SEMで示した。統計解析はStudentのt検定を用いて行った（BとE）。*p < 0.05、**p < 0.01、***p < 0.001。OTU：操作上の分類単位。

腸内細菌叢はマウスAKIにおける尿細管傷害から保護する。われわれは、AKIの病因に対する腸内細菌叢の寄与を探った。無菌C57BL/6（Gf B6）マウスに、正常C57BL/6（B6）マウスの糞便移植の有無にかかわらず、腎臓I/R障害を誘発した（図2A）。Gf B6マウスは盲腸が肥大していたが、正常B6マウスの糞便を移植すると正常サイズに戻った（図2B）。I/R後2日目の尿細管傷害は、正常B6マウスよりもGf B6マウスの方がひどかった。正常B6マウスでは10日目に尿細管傷害は部分的に改善したが、Gf B6マウスでは尿細管壊死まで進行した（図2、CおよびD）。興味深いことに、正常マウスの糞便を移植すると、Gf B6マウスの腎病理は減弱した（図2、CおよびD）。I/R後のGf B6マウスの腎臓におけるA型肝炎ウイルス細胞受容体1（Havcr1）mRNAの発現増加は、正常B6マウスの糞便移植によっても減少した（図2E）。また、抗生物質の投与により、腸内細菌叢のAKIへの寄与を評価した。B6マウスでは、抗生物質投与（Abx）によって腸内細菌叢が減少し、Gf B6マウスで観察されたのと同様に盲腸の肥大が誘導された（補足図1C；本論文とともにオンラインで入手可能な補足資料；https://doi.org/10.1172/jci.insight.97957DS1）。尿細管傷害を判定するために用いられる急性尿細管壊死スコアは、I/R傷害後10日目に抗生物質無投与マウスよりも抗生物質投与マウスの方が高かった（補足図1、DおよびE）。

腸内細菌叢はAKIモデルマウスの尿細管障害を予防する。
腸内細菌叢はAKIモデルマウスにおいて尿細管傷害を予防する。(A） AKIにおける腸内細菌叢の病態生理学的役割を評価するために、Gf B6マウスを用いた。(B）Gf B6マウスは盲腸の肥大を示したが（矢印）、糞便を移植したGf B6マウス（Gf + Trans、矢印）では正常サイズに戻った。(CおよびD）Gf B6マウスは2日目に重度の尿細管傷害を示し、10日目には修復が損なわれた。これらの変化は、正常なC57BL/6（B6）マウスの糞便移植によって減弱した。スケールバー 50 μm。(E）B6マウスはB6マウスと比較して、I/R後10日目の腎臓組織におけるA型肝炎ウイルス細胞受容体1（Havcr1）のmRNA発現レベルが高い。箱ひげ図は中央値を表す。箱は25パーセンタイルと75パーセンタイルを表し、ひげは最小値と最大値を表す。統計解析は、Tukeyの多重比較検定による1元配置ANOVAを用いて行った（DとE）。*p < 0.05、**p < 0.01。

AKIによって誘発されたdysbiosisは、D/L-アミノ酸のバランスを変化させる。最近の研究で、二次元HPLCで検出されたD-アミノ酸は腸内細菌叢によって産生され、腸粘膜の防御に関与していることが明らかになった(12)。我々は、I/R傷害マウスの糞便、血漿、腎臓、尿中のD/L-アミノ酸プロファイルのバランスが、AKI誘発性ディスバイオシスによって変化するかどうかを調べた。二次元HPLC分析の結果、D-セリン/L-セリン比、D-アルギニン/L-アルギニン比、D-アラニン/L-アラニン比がI/R障害後の糞便中で増加していた（図3A）。意外なことに、腎臓ではD-セリンのみが2次元HPLCで検出された（図3B）。D-セリン/L-セリン比は、I/Rマウスの糞便、血漿、腎臓、尿において、偽手術マウスと比較して増加していた（図3C）。対照的に、D-アスパラギンとD-アスパラギン酸以外のD-アミノ酸はGf B6マウスの糞便からは検出されなかったことから、腸内細菌叢がD-アミノ酸、特にD-セリンの主な供給源であることが示唆された（図3D）。すべての動物群におけるD-アミノ酸とそのL-形態の全体的なレベルを補足図2-6に示す。

AKIによって誘導されたディスバイオーシスは、D/L-アミノ酸のバランスを変化させる。
AKIによるディスバイオーシスはD/L-アミノ酸のバランスを変化させる。(AおよびB）I/Rの有無にかかわらず、B6マウスの糞便からは遊離D-アミノ酸が検出されたが、腎臓からはD-セリンのみが検出された。(C）遊離D-セリンはI/R後の糞便、血漿、腎臓、尿で増加している。(D）I/R前後のGf B6マウスの糞便中には、D-アスパラギンとD-アスパラギン酸以外の遊離D-アミノ酸は検出されない。(E）I/R傷害後の腎臓ではDAO活性が低下している。(F）傷害を受けた腎臓ではSRR活性が上昇している。データは平均値±SEMで示した。統計解析はStudentのt検定を用いて行った（C、E、F）。*p < 0.05、**p < 0.01。UD、検出不能。

これらの結果に基づき、我々は傷害を受けた腎臓におけるD-セリンの代謝に注目した。腸内細菌叢に加えて、腎臓を含む末梢臓器は、D-アミノ酸オキシダーゼ（DAO）とセリンラセマーゼ（SRR）によるD-セリン代謝の宿主部位である。D-セリン(16)を含むD-アミノ酸を分解するDAOの活性は、I/R傷害を受けた腎臓で低下していた（図3E）。逆に、L-セリン(17)からD-セリンを生成するSRRの活性はI/R障害腎で上昇していた（図3F）。

D-セリンはI/R傷害後の尿細管傷害を軽減した。我々は、AKIにおけるD-セリンの病態生理学的機能を探索した。マウスに20mMのD-またはL-セリンを飲水で投与した。L-セリンの経口投与ではL-セリンの血漿中濃度は変化しなかったが、20 mM D-セリンの経口投与ではD-セリンの血漿中濃度が100 nMまで上昇した（図4A）。このことから、D-セリンは消化管から吸収され、I/R障害マウスよりも高い血漿中D-セリン濃度をもたらしたことが示唆された（補足図4）。興味深いことに、20mMのD-セリンを投与すると、I/R障害マウスの5、7、10日目の尿細管傷害が抑制された（図4、BとC）。さらに、腎臓におけるF4/80+細胞の蓄積は、20mM D-セリン投与後、I/R損傷後5日目と7日目に減少した（図4、BとD）。この所見と一致して、D-セリン投与マウスでは、I/R損傷2日後にKi67+尿細管数の増加とHavcr1 mRNA発現レベルの低下が検出された（図4、B、E、G）。さらに、D-セリンの投与は、I/R損傷後7日目と10日目の尿中アルブミン排泄量の減少をもたらした（図4H）。間質性線維症の程度はアザン染色で評価し、アニリンブルーで染色した面積の百分率で示したが、クレアチニンと血中尿素窒素の値は群間で同程度であった（図4、FおよびI）。無処置マウスとD-セリン投与マウスの間で水分摂取量に有意差はなかったことから、水分摂取量だけでは観察された腎保護作用とは関連しないことが示唆された（補足図7）。

D-セリンはI/R後の尿細管傷害を軽減する。
D-セリンはI/R後の尿細管傷害を軽減する。(A）L-セリンの経口投与はL-セリンの血漿中濃度を変化させないが、20mMのD-セリンはD-セリンの血漿中濃度を100nM/mlまで上昇させた。(B）PAS、F4/80+、Ki67+で染色した組織サンプルの代表的な画像を示す。スケールバー： 50 μm。(C）I/R傷害の5、7、10日後にD-セリンを投与すると、ネクローシスと管腔内デブリのグレードが低下し、ブラシボーダー領域のグレードが上昇した。(D）D-セリン投与により、I/R損傷後5日目および7日目におけるF4/80+陽性面積の割合が減少した。(E）I/R障害2日後のKi67+核/フィールド数はD-セリン投与により増加した。(F）アニリンブルーで染色した面積の割合に群間差はない。(G）I/R障害2日後の腎組織におけるHavcr1遺伝子発現は、D-セリン投与群で低下している。(H）尿中アルブミン排泄はD-セリン投与群で保護されている。(I）血清クレアチニン（Cr）および血清血中尿素窒素（BUN）のレベルは、D-セリン投与後、群間で同程度である。データは平均値±SEMで示した。統計解析はStudentのt検定を用いて行った（AおよびC-I）。p < 0.05、***p < 0.01、***p < 0.001。

腎臓におけるD-セリンレベルは、DAOとSRRによって調節されうる(16, 17)。腎内D-セリン代謝の影響を明らかにするために、腎臓のD-セリンレベルが低いSRRノックアウトマウスで腎臓I/R障害を誘発した(17)。さらに、DAOを不活性化する天然型変異体（DAOG181R）を持つマウスで腎I/R傷害を誘発したところ、腎臓のD-セリンレベルが上昇した(16)。I/R傷害後5日目の尿細管傷害と間質線維化の程度は、DAOG181Rマウス、SRRノックアウトマウス、コントロールマウスの間で同等であった（図5）。次に、D-アミノ酸を含まない（DF）食を与えたSRRノックアウトマウスに、Abxを添加した、または添加しない腎I/R傷害を誘発した。SRRノックアウトマウスでは、B6マウスやSRRノックアウトマウスに比べ、Abxを添加したDF食または無添加のDF食を与えた方が、尿細管傷害が悪化し、Ki67+尿細管の数も少なかった（図5、A-C）。興味深いことに、20mMのD-セリンを投与すると、I/R障害後5日目の腎障害が改善した。D-セリンを投与しても、F4/80+細胞の割合、Ki67+尿細管数、間質線維化、I/R傷害による腎機能は変化しなかった（図5、D-F）。

D-セリン投与はI/R後のAKIを予防する。
D-セリン投与はI/R後のAKIを予防する。(A）PASとKi67+で染色した組織サンプルの代表的な画像を示す。スケールバー： 50 μm。(B)SRRノックアウトマウスでは、I/R後5日目にD-セリンを投与することで、Abxを添加したDF飼料を与えたマウスやAbxを添加しないDF飼料を与えたマウスと比較して、ネクローシスや管腔内デブリのグレードが低下し、ブラシボーダー領域のグレードが上昇した。 (C)SRRノックアウトマウスやAbxを添加したDF飼料を与えたマウスやAbxを添加しないDF飼料を与えたマウスでは、Ki67+管腔の数が減少した。F4/80+陽性面積率（D）、アニリンブルー陽性面積率（E）、血清クレアチニン（Cr）または血清血中尿素窒素（BUN）（F）には群間差はない。箱ヒゲプロットは中央値を表す。箱は25パーセンタイルと75パーセンタイルを表し、ひげは最小値と最大値を表す。統計解析は、Tukeyの多重比較検定を用いた1-way ANOVAを用いて行った（B-F）。*p < 0.05, **p < 0.01, ***p < 0.001。

D-セリンは尿細管上皮細胞の損傷を抑制し、低酸素を介した増殖を促進する。D-セリンによる腎保護作用の基礎となるメカニズムを解明するために、D-セリンで刺激した尿細管上皮細胞（TEC）を用いた（図6A）。C-Cモチーフケモカインリガンド2（Ccl2）とHavcr1のmRNA発現レベルは、1-100μMのD-セリンまたは10-1000μMのL-セリン濃度で低酸素曝露したTECにおいて阻害された（図6B）。低酸素曝露後のTECの増殖は、D-セリンによって促進されたが、L-セリンでは促進されなかった（図6C）。

D-セリンは低酸素に応答してTECの損傷を抑制し、増殖を促進する（図6）。
D-セリンは低酸素に応答してTECの損傷を抑制し、増殖を促進する。(A）D-セリンによる腎保護作用を評価するためにTECを用いる。(B）1-100μMの濃度のD-セリンで処理したTECでは、Ccl2とHavcr1のmRNA発現レベルが低下する。(C）D-セリンは低酸素後のTECの増殖を促進する。箱ヒゲプロットは中央値を表す。箱は25パーセンタイルと75パーセンタイルを表し、ひげは最小値と最大値を表す。統計解析は、Tukeyの多重比較検定による1-way ANOVAを用いて行った（BとC）。*p＜0.05、**p＜0.01、***p＜0.001。

D-セリンの腎保護作用が観察されたにもかかわらず、D-セリンには腎毒性があることが報告されている(18-20)。そこで、D-セリンの潜在的な毒性作用について検討した。D-セリンを80mMの用量で経口投与すると、我々のAKIモデルマウスにおいて、I/R損傷後10日目に尿中アルブミン排泄量が増加した（補足図8A）。低酸素後の尿細管増殖は100mMのD-セリンによって抑制された（補足図8B）。

血清D-セリン濃度はAKI患者の腎機能を反映する。我々は、AKI患者におけるD-セリンと腎機能との関連を評価した。D-セリン、D-アスパラギン、D-アラニン、D-プロリン、D-ロイシンがAKI患者の血漿中に検出された。D-セリン/L-セリン比は、AKI患者の血漿中では健常人の血漿中よりも有意に高かった（図7A）。さらに、血清D-セリン濃度は、クレアチニンの増加および推算糸球体濾過量の減少と有意に相関していた（図7B）。

血清D-セリン値はAKI患者の腎機能を反映している。
血清D-セリン濃度はAKI患者の腎機能を反映する。(A）AKI患者の血漿中にはD-セリン、D-アスパラギン、D-アラニン、D-プロリン、D-ロイシンが検出される。これらのうち、D-セリン/L-セリン比は健常人と比較して増加している。データは平均値±SEMで示した。統計解析はStudentのt検定を用いて行った。*P < 0.05. 健常人（n=5）のD-セリン/L-セリン比は0.018±0.005、D-セリン値は2.70±0.48μmであった。AKI患者のD-セリン/L-セリン比は0.075±0.060、D-セリン値は7.77±5.16μmであった。(B）血清D-セリン値は、クレアチニン（Cr）の増加および推算糸球体濾過量（eGFR）の減少と相関している。 C）本研究の結果に基づく、腸由来のD-セリンと腎臓との関係の提案モデル。

考察
本研究により、腸内細菌叢がマウス腎臓I/R傷害モデルにおいて尿細管傷害に対する保護作用を持つことが明らかになった。AKI誘発腸内細菌異常症は、マウスのD-アミノ酸の代謝を変化させた。D-アミノ酸のうち、腎臓で検出されたのはD-セリンのみであった。さらに、I/R傷害後の傷害腎ではDAO活性が低下し、SRR活性が上昇していた。D-セリンの経口投与は、このAKIモデルマウスにおいて保護的であった。さらに、SRRノックアウトマウスでは、Abxを併用したDF食と非併用食が腎障害を悪化させた。しかし、20mMのD-セリンの投与はI/R後5日目の腎障害を改善した。D-セリンはまた、傷害の初期段階における低酸素誘導性尿細管障害を抑制し、低酸素後の尿細管細胞増殖を促進した。最後に、D-セリンはAKI患者における腎機能の低下と相関していた。

蓄積されたデータから、腸内細菌叢が健康と疾病の両方において重要であることが証明されている(1-6)。今回の研究結果は、AKIモデルマウスにおいても腸内細菌叢が中心的な役割を果たしていることを示している。我々の知見を裏付けるように、Gf B6マウスはI/R後に重篤な腎障害を起こすことが報告されている(21)が、腸内細菌叢の減少はI/R障害から腎臓を保護することが報告されている(22)。正確なメカニズムは不明であるが、最近の研究では、微生物の代謝産物が宿主の健康に寄与していることが報告されている。細菌代謝産物の中でもSCFAは、AKI(9)を含むいくつかの疾患モデル(8, 23)において保護作用を有することが報告されている。SCFAに加えて、D-アミノ酸が腸内細菌叢によって代謝され、腸粘膜防御に関与していることが、2次元HPLCを用いて明らかにされている（12）。今回の研究では、I/R傷害後にLactobacillus、Clostridium、Ruminococcusが増加し、BifidobacteriumとTM7が減少した。慢性腎臓病における腸内細菌異常はいくつかの報告で示されているが、AKI時の腸内細菌の変化は依然として不明である（4, 10）。さらに、D-アミノ酸、特にD-セリンの活性化経路との関連はまだ調べられていない。

我々は、AKIの有無にかかわらず正常マウスの糞便からD-アミノ酸を検出したが、Gf B6マウスの糞便からはD-アスパラギンとD-アスパラギンしか検出されなかった。これらの結果から、D-アミノ酸は腎障害の有無にかかわらず腸内細菌叢によって代謝されることが示された。さらに、腎臓ではD-セリンのみが検出され、I/R障害マウスの糞便、血漿、腎臓、尿ではD-セリン/L-セリン比が上昇していた。我々の結果と一致して、Sasabeら(24)は腎臓のI/R障害後のマウスの血清中のD-セリン/L-セリン比の増加を報告している。

D-セリンの投与はI/R障害後のAKIに対して保護的であった。この結果から、D-セリンは尿細管障害を抑制し、尿細管増殖を促進することで、I/R後の腎障害を抑制することが示された。さらに、傷害を受けた腎臓ではDAO活性が低く、SRR活性が高いことが示された。AKIモデルマウスにおけるDAO活性の低下は以前に報告されている(24)。しかし、D-セリンの腎内代謝は、DAOの欠損とともに、I/Rを介した腎障害には寄与していない。DAO活性の変化により傷害を受けた腎臓のD-セリンレベルは維持されるが、このレベルのDAO活性では尿細管傷害を防御するには十分ではないかもしれない。したがって、D-セリンの腸から循環への放出の増加が、傷害を受けた腎臓におけるD-セリンレベルの低下を補い、それによって腎保護がもたらされるのかもしれない。対照的に、SRRノックアウトマウスでは、Abxを含むDF食は腎障害を増強し、Ki67+ TECの減少を伴った。20mMのD-セリンを投与すると、I/R後5日目に腎障害が回復した。しかし、AKIにおけるD-セリン代謝の正確なメカニズムについては、まだ研究されていない。

いくつかの研究で、D-セリンの腎毒性が報告されている(19)。ラットに400-800mg/kgのD-セリンを腹腔内注射すると尿細管障害が誘発されたが(20, 22)、岡田ら(25)は、20mMのD-セリンにより一般制御非抑制性2キナーゼが活性化され、ヒト尿細管細胞の細胞老化を引き起こしたと報告している。これらの研究と一致して、本研究でもD-セリンの細胞毒性が観察された。80mMのD-セリンは腎障害を増強したが、1-100μMのD-セリンはTECの増殖を誘導した。これらの結果は、D-セリンの用量がTECにおける特異的反応と関連していることを強く示唆している。2D HPLCは従来の方法よりも正確な情報を提供することから、D-セリン濃度とin vivoおよびin vitroの組織反応との関連を明らかにするためには、さらなる調査が必要である。

D-セリン/L-セリン比もまた、AKI患者で増加していた。さらに、この比率は腎機能と逆相関していた。血漿中のD-セリンレベルはヒトの慢性腎臓病で評価されたことがあるが(26)、D-アミノ酸レベルはヒトのAKIでは評価されなかった。今回の結果から、D-アミノ酸、特にD-セリンはAKIのバイオマーカーとなりうることが示唆された。本研究ではD-セリンの排泄率を評価していないため、D-セリンレベルが腎機能に影響される可能性が残っている。しかし、I/R障害マウスの糞便、血漿、腎臓、尿中のD-セリン/L-セリン比は偽手術マウスと比較して増加していた（図3C）。飲料水を介して20 mMのD-またはL-セリンを投与したところ、L-セリンの血漿濃度は変化しなかったが、血漿中のD-セリン濃度は100 nMまで上昇した（図4A）。このことから、D-セリンは消化管から吸収され、D-セリンを投与しなかったI/R障害マウスと比較して血漿中のD-セリン濃度が上昇したことが示唆された。さらに、これらの結果は、腸内細菌叢がI/R損傷後の血清D-セリン高値に少なくとも部分的に寄与している可能性を示した。D-セリンを代謝する微生物種を明らかにするためには、さらなる研究が必要である。

本研究は、AKIにおける腸内細菌叢由来のD-セリンの腎保護効果を実証した（図7C）。腸内細菌叢によって産生されるD-アミノ酸の生物学的役割を考えると、今回のデータは、腸内細菌叢と腎臓の相互作用を説明できるメカニズムに光を当て、D-アミノ酸がAKIの潜在的な治療標的およびバイオマーカーであることを示している。

方法
マウス。B6マウスはCLEA Japanから購入した。マウスは金沢大学で飼育された。Gf B6マウスはCLEA Japanより購入した。Gf B6マウスはCLEAジャパンのGfアイソレーターで飼育した。Gf B6であることを確認するために、CLEA Japanで糞便の16S rDNA PCRを処置の前後に行った(27)（補足図9）。前述のように、DAOG181RおよびSRRノックアウトマウス系統を作製し、B6バックグラウンドで維持した(28, 29)。

糞便微生物叢移植はI/R傷害の12週間前に行った。ドナーとなったB6マウスを安楽死させ、小腸、大腸、大腸を無菌下で摘出した。内容物を1mlのPBSで希釈し、200μlを肛門から直腸に投与した。その後、移植したGf B6マウスを正常B6マウスと12週間同居させた。

抗生物質による腸内細菌叢の減少をモデル化するために、B6マウスを1g/lアンピシリンナトリウム塩（カタログA0166；ミリポアシグマ社製）、1g/l硫酸ネオマイシン（カタログ146-08871；和光純薬工業社製）、1g/lメトロニダゾール（カタログM3761；ミリポアシグマ社製）、0. 5g/l塩酸バンコマイシン（カタログ222-01303；和光純薬工業）、および0.5g/l硫酸ゲンタマイシン（カタログG0383；TCI）を、I/R傷害の12週間前から飲料水に添加した。

I/R傷害。麻酔導入後、非外傷性クリップ（夏目製作所）で腎動脈をクランプして虚血を誘発した(30)。40分後、クリップを外した。体温は手術中37.0℃にコントロールした。

腎病理組織検査。腎臓を10％中性緩衝ホルマリンで固定し、パラフィンに包埋した。パラフィン切片を過ヨウ素酸シッフ（PAS）とアザン試薬で染色した。皮質髄質接合部またはブラシボーダー（すなわち、皮質髄質接合部と皮質領域）のPAS染色残屑は、少なくとも10個の異なる腎切片から定量した。急性尿細管壊死スコアは、近位尿細管の拡張、刷子縁の損傷、蛋白質性鋳型の存在、間質の拡大、壊死に基づいて、0から4（0, なし; 1, 軽度; 2, 中等度; 3, 重度; 4, 壊死）で評価した。標本の評価は、マウスの系統と治療条件を盲検化した評価者によって行われた。Ki67とF4/80の染色は、既述のように行った(30, 31)。

マウスTEC株。マウスTEC株mProx24は、菅谷剛氏（聖マリアンナ医科大学、東京、日本）より寄贈された。細胞は、5％ウシ胎児血清と1％ペニシリン／ストレプトマイシンを添加したDMEMで培養した。

RNA単離と定量的リアルタイムPCR。High Pure RNA isolation kit（ロシュ・ダイアグノスティックス）およびISOSPIN cell and tissue RNA（ニッポンジーン）を用いて、培養細胞および腎臓からそれぞれ全RNAを単離した。Villa 7 Real-Time PCR System（Thermo Fisher Scientific）を用いて、iQ SYBR Green Supermix（カタログ170-8885；Bio-Rad）を用いた定量的リアルタイムPCRを行った。以下のプライマーを使用した： Ccl2、5′-CTTCCTCCACCACCATGCA-3′および5′-CCAGCCGCAACTGTGA-3′；Havcr1、5′-AGGAAGACCCACGGCTATTT-3′および5′-TGTCACAGTGCCATTCCAGT-3′（カタログMm00506686；Applied Biosystems TaqMan Gene Expression Assays）。データはΔΔCt法を用いて解析した（32）。

細胞増殖アッセイ。TECの増殖は、Cell Counting Kit-8 (catalog CK04; Dojindo)を用いて、製造者の説明書に従って測定した(33)。

細菌16S rRNAアンプリコン配列決定および解析。マウスおよびヒトの腸内細菌叢の16S rRNA遺伝子配列解析を行った（34, 35）。細菌ゲノム DNA は、酵素溶解法を用いて糞便から単離した。単離したDNA（40 ng）を、ユニバーサルプライマー27Fmod（5′-AGRGTTTGATYMTGGCTCAG-3′）および338R（5′-TGCTGCCTCCCGTAGGAGT-3′）と10bpのバーコードタグ（34）を用いた16S rRNA遺伝子のV1-V2超可変領域のPCRに使用した。サーマルサイクリングは、9700PCRシステム（ライフテクノロジーズジャパン）を用いて、Ex Taqポリメラーゼ（タカラバイオ）を用い、以下のサイクリング条件で行った：96℃で2分間の初期変性；96℃で30秒間の変性、55℃で45秒間のアニーリング、72℃で1分間の伸長を25サイクル；および72℃で最終伸長。すべてのアンプリコンをAMPure XP磁気精製ビーズ（ベックマン・コールター社製）を用いて精製し、Quant-iT PicoGreen dsDNAアッセイキット（ライフ・テクノロジーズ・ジャパン社製）を用いて定量し、454 Genome Sequencer FLX Titaniumプラットフォーム（ロシュ・ダイアグノスティックス社製）で塩基配列を決定した。平均品質値が25未満で、ユニバーサルプライマー配列と正確に一致しないリードはフィルターにかけられ、品質フィルターを通過した3,000リードが各サンプルからランダムに選択され、ダウンストリーム解析に供された。選択されたリードは、品質値に従って降順に並べ替えられ(36)、UCLUSTプログラム(37)バージョン5.2.32 (http://www.drive5.com/)を用いて、96%のペアワイズ同一性カットオフで操作上の分類単位にクラスタ化された。GLSEARCHプログラムを用いて、Ribosomal Database ProjectおよびNCBIゲノムデータベースとの類似性検索を行い、各操作分類単位の分類学的割り当てを決定した。本研究で解析した16S rRNA遺伝子V1-V2領域の配列は、DDBJ/GenBank/EMBLにアクセッションDRA006069で寄託されている。

二次元HPLCによるキラルアミノ酸の定量。D- および L- アミノ酸の濃度は、NANOSPACE SI-2 2D HPLC システム（資生堂）を用いて評価した（11, 38）。NBD-アミノ酸は、KSAARPカラム（内径1.0 mm×500 mm、九州大学と資生堂の共同設計によるODSカラム）と1次元のオンラインフラクションコレクションシステムを用いて単離した。分離されたフラクションは、D-およびL-エナンチオマーを決定するために、ナローボアエナンチオ選択性KSAACSP-001Sカラム（250 mm×1.5 mm内径、25℃、資生堂と共同で調製）からなる二次元目に自動的に移された。2次元目の移動相は、ギ酸を含むMeOHとMeCNの混合溶液であった。NBD-アミノ酸の蛍光検出は470 nmで励起し、530 nmで行った。

化学物質 D-セリン、L-セリン、D-アラニン、フラビンアデニンジヌクレオチド（FAD）二ナトリウム塩n水和物、ピリドキサールリン酸一水和物は和光から購入した。L-(-)-スレオ-3-ヒドロキシアスパラギン酸（L-THA）はTocris Bioscienceから購入した。他のすべての化学物質は、入手可能な最高グレードのものであり、信頼できる商業的供給源から購入した： ホウ酸（和光）、塩化カリウム（和光）、2-メルカプトエタノール（和光）、グリセロール（和光）、トリクロロ酢酸（和光）、2,4-ジニトロフェニルヒドラジン（和光）、ジチオスレイトール（ナカライテスク）、ATP二ナトリウム塩n水和物（和光）、およびMgCl2六水和物（和光）。

マウス腎臓ホモジネートの調製。腎臓を、プロテアーゼ阻害剤(Nacalai Tesque)を含む5容量の冷10mMホウ酸緩衝液(pH 8.5)中、Potter-Elvehjemホモジナイザーでホモジナイズした。ホモジネートを、5 mM 2-メルカプトエタノールと10%(v/v)グリセロールを含む1 lの10 mMホウ酸緩衝液（pH 8.5）に対して、4℃で1日間透析した。緩衝液は透析中に1回交換した。透析ホモジネートを回収し、20,000g、4℃で10分間遠心分離し、透析中に変性したタンパク質をペレット化した。上清を回収し、使用するまで-80℃で保存した。

酵素活性アッセイ。腎臓ホモジネートのタンパク質濃度は、Bio-Rad protein assay kitを用いて、ウシ血清アルブミン（MilliporeSigma）を標準物質として測定した。DAO (EC 1.4.3.3)の触媒活性は、2-オキソ酸産生を測定する比色法を用いて測定した(39)。適当量（0.42-1.3mg）の腎臓ホモジネートを、空気飽和した50mMホウ酸緩衝液（pH8.5）、60μM FAD、Aspergillus niger（MilliporeSigma）由来の33ng/μlカタラーゼ、および20mM D-アラニンを含む反応混合物に、最終容量150μlになるように加えた。反応を停止させるために10μlの100%(w/v)トリクロロ酢酸を加える前に、反応混合物を37℃で30分間インキュベートした。2-オキソ酸生成物を2,4-ジニトロフェニルヒドラジンと反応させ、アミノ酸を含まないブランク混合物に対して445nmの吸光度を測定することにより定量した。

腎臓ホモジネート中のSRRの活性は、L-セリンからD-セリン（またはその逆）の産生がHPLCによる検出限界以下であったため、L-THAからの2-オキソ酸産生を測定する比色法により決定した(40)。SRRはラセマーゼ活性と脱水酵素活性を示す多機能酵素であり、ラセマーゼ活性よりも高く、L-THAで最も高い活性を示す(41)。適当量（0.42-1.3 mg）の腎臓ホモジネートを、空気飽和した50 mMホウ酸緩衝液（pH 8.5）、50 μMピリドキサールリン酸、1 mMジチオスレイトール、1 mM ATP、1 mM MgCl2、および20 mM L-THAを含む反応混合物に、最終容量150 μlになるように加えた。10μlの100%(w/v)トリクロロ酢酸を加えて反応を停止させる前に、反応混合物を37℃で30分または1時間インキュベートした。2-オキソ酸生成物を2, 4-ジニトロフェニルヒドラジンと反応させ、アミノ酸を含まないブランク混合物に対して445 nmの吸光度を測定することにより定量した。

ヒトサンプル AKI患者から血液サンプルを得た。補足表1にAKI患者の臨床的特徴をまとめた。免疫抑制剤および抗生物質による治療を受けていた患者は除外した。すべてのサンプルは2013年から2017年にかけて金沢大学附属病院で採取された。

統計。データは、SPSS Statistics（ver.23、IBM）で求めた平均値±SEMで示した。統計解析は、2群間の比較には両側対応のないStudentのt検定を用い、2群以上の比較にはTukeyの多重比較検定を用いた1-way ANOVAを用いて行った。P値が0.05未満を有意とみなした。

研究の承認 本研究は、金沢大学附属病院倫理委員会の承認（IRB承認1291）を受け、ヘルシンキ宣言に従って実施された。すべての参加者は書面によるインフォームド・コンセントを提供し、いつでも研究から離脱する権利について知らされていた。すべての動物は金沢大学のガイドラインに従って飼育・使用され、実験は研究承認番号AP-153653およびAP-1-1. AP-153653およびAP-163726に基づき実施した。

著者貢献
YN、YI、TWが実験を計画・実施した。KF、T. Miyake、NS、S. Kitajima、TT、YS、AS、T. Miyagawa、AH、MS、YK、KS、MO、SYN、YYが検体の採取と臨床データの解析を行った。MM、KH、RKはHPLCでキラルアニモ酸を定量し、KOマウス（DAOマウス、SRRマウス）を当研究室に贈呈した。MMとKHはHPLCでキラルアミノ酸を定量した。TM、MK、HHはDOAとSRRの活性を評価した。HM、MH、WSは腸内細菌叢のメタゲノム解析を行った。S.Kanekoは重要な修正について助言を与えた。YN、YI、TWが原稿を執筆。TWが監修した。

補足資料
補足データを見る

謝辞
mProx24細胞株を提供してくださった菅谷武志氏に感謝する。また、協力してくれた中根麻衣子と三好百合香に感謝する。本研究は、日本学術振興会科研費16K15326の助成を受けた。

連絡先 金沢大学腎臓・検査医学講座 和田隆 〒920-8641 金沢市宝町13-1 電話：81.76.265.2000 内線2899; Email: twada@m-kanazawa.jp.

脚注
利益相反： 著者らは利益相反が存在しないことを宣言した。

ライセンス この作品はCreative Commons Attribution 4.0 International Licenseの下でライセンスされています。このライセンスのコピーを見るには、http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/。

参考情報 JCI Insight. 2018;3(17):e97957. https://doi.org/10.1172/jci.insight.97957.

参考文献
Tamboli CP, Neut C, Desreumaux P, Colombel JF. 炎症性腸疾患におけるディスバイオシス。腸。2004;53(1):1-4.
経由でこの記事を見る： PubMed CrossRef Googleスカラー
Knip M, Siljander H. 1型糖尿病における腸内細菌叢の役割。Nat Rev Endocrinol. 2016;12(3):154-167.
この記事を経由して表示します： PubMed CrossRef Google Scholar
動脈硬化における腸内細菌叢の役割。Nat Rev Cardiol. 2017;14(2):79-87.
この論文を見る PubMed CrossRef Google Scholar
腸-腎臓軸。Pediatr Nephrol. 2017;32(11):2005–2014.
この記事を見る PubMed CrossRef Google Scholar
Kelly CR, et al.多発性再発性クロストリジウム・ディフィシル感染症の再発に対する糞便微生物叢移植の効果：無作為化試験。Ann Intern Med. 2016;165(9):609-616.
この記事を経由して見る： PubMed CrossRef Google Scholar
Landy J, et al.慢性肛門炎患者における糞便微生物叢移植後の、代謝や免疫学的変化を伴わない微生物叢の変動的変化。Sci Rep.
この記事を経由して表示します： PubMed Google Scholar
Vrieze A, et al.痩せたドナーからの腸内細菌叢の移植はメタボリックシンドロームの人のインスリン感受性を増加させる。Gastroenterology. 2012;143(4):913–6.e7.
この論文を見る PubMed CrossRef Google Scholar
制御性T細胞：制御性T細胞誘導因子の抽出。Nat Rev Immunol. 2013;13(8):546.
この記事を経由して表示します： PubMed Google Scholar
Andrade-Oliveira V, et al. 腸内細菌産物は虚血再灌流によるAKIを予防する。J Am Soc Nephrol. 2015;26(8):1877–1888.
この記事を見る PubMed CrossRef Google Scholar
Briskey D, Tucker P, Johnson DW, Coombes JS. 尿毒症毒素と慢性腎臓病発症における消化管と微生物叢の役割。Clin Exp Nephrol. 2017;21(1):7-15.
この記事を経由して見る PubMed CrossRef Google Scholar
哺乳類および二枚貝におけるN-メチル-D-アスパラギン酸およびその類縁体のエナンチオ選択的二次元高速液体クロマトグラフィー定量. J Chromatogr A. 2012;1269:255-261.
この記事を見る 笹部 淳ほか, 哺乳類と二枚貝におけるD-アスパラギン酸とその類似体.
微生物のd-アミノ酸と宿主のd-アミノ酸オキシダーゼの相互作用がマウス粘膜防御と腸内細菌叢を修飾する。Nat Microbiol. 2016;1(10):16125.
この記事を見る PubMed CrossRef Google Scholar
桐山祐司, 野地秀樹. 神経系と内分泌系におけるD-アミノ酸. Scientifica (Cairo). 2016;2016:6494621.
この記事を見る PubMed Google Scholar
D-グルタミン酸は心臓のミトコンドリアで代謝される。Sci Rep.
この論文を見る PubMed Google Scholar
セリンラセマーゼの局在と皮膚における役割. J Invest Dermatol. 2014;134(6):1618–1626.
この記事を見る PubMed CrossRef Google Scholar
D-amino-acid oxidase欠損変異ラットの脳および末梢における遊離D-セリンおよびD-アラニンの二次元HPLC同時定量. J Chromatogr B Analyt Technol Biomed Life Sci. 2011;879(29):3184-3189.
この記事を見る PubMed CrossRef Google Scholar
セリンラセマーゼ（Srr）ノックアウトマウスの脳および末梢臓器におけるD-セリンレベル. Neurochem Int. 2011;59(6):853-859.
この記事を見る PubMed CrossRef Google Scholar
モンテシノス・ゲバラ C, マニ AR. 末梢組織におけるD-セリンの役割。Eur J Pharmacol. 2016;780:216-223.
この記事を経由して表示します： PubMed CrossRef Google Scholar
D-アミノ酸オキシダーゼはD-セリンによる腎毒性に関与する。Chem Res Toxicol. 2005;18(11):1678–1682.
この記事を見る PubMed CrossRef Google Scholar
D-セリン誘発腎毒性における酸化ストレスの評価。Toxicology. 2007;229(1-2):123–135.
この記事を経由して表示します： PubMed CrossRef Google Scholar
Jang HR, Gandolfo MT, Ko GJ, Satpute S, Racusen L, Rabb H. 実験的虚血再灌流障害後の腎臓の損傷と炎症は、早期の細菌への曝露により変化する。Am J Physiol Renal Physiol. 2009;297(5):F1457-F1465.
この記事を見る PubMed CrossRef Google Scholar
腸内細菌叢の減少は腎虚血再灌流障害を予防する。J Am Soc Nephrol. 2017;28(5):1450–1461.
この記事を経由して見る PubMed CrossRef Google Scholar
Marques FZ, et al.高食物繊維食と酢酸塩補給は腸内細菌叢を変化させ、高血圧マウスにおける高血圧と心不全の発症を予防する。Circulation. 2017;135(10):964–977.
この記事を経由して見る PubMed CrossRef Google Scholar
Sasabe J, et al. 虚血性急性腎障害はマウスの体液中のセリンエナンチオマーのホメオスタシスを擾乱する：セリンエナンチオマー比を用いた腎機能障害の早期検出. PLoS One. 2014;9(1):e86504.
この記事を見る PubMed CrossRef Google Scholar
新規尿毒症毒素D-セリンはGCN2の活性化を介してヒト腎尿細管細胞の老化を誘導する。Sci Rep.
この記事を見る PubMed CrossRef Google Scholar
キラルアミノ酸メタボロミクスによる慢性腎臓病予後の新規バイオマーカー探索. Sci Rep.
この記事を見る PubMed Google Scholar
次亜塩素酸水溶液がラットの緑膿菌感染症の駆除および予防、血清生化学的変数、盲腸内細菌叢に及ぼす影響。Exp Anim. 2015;64(2):191-197.
この記事を経由して見る PubMed CrossRef Google Scholar
セリンラセマーゼおよびD-アミノ酸オキシダーゼ欠損マウスにおけるD-セリン内在量の変化. Amino Acids. 2012;43(5):1919–1931.
この記事を見る PubMed CrossRef Google Scholar
様々なD-アミノ酸オキシダーゼ活性を有するマウスの組織および生理液中のD-セリンおよびD-アラニンの蛍光検出二次元高速液体クロマトグラフィーによる定量. J Chromatogr B Analyt Technol Biomed Life Sci. 2009;877(24):2506-2512.
この記事を見る PubMed CrossRef Google Scholar
マクロファージの異常が腎臓の修復不全を引き起こし、ループス感受性マウスの腎炎を誘発する。J Immunol. 2012;188(9):4568–4580.
この記事を見る PubMed CrossRef Google Scholar
Menke J, et al. CSF-1は腎尿細管上皮細胞に直接シグナルを送り、マウスの修復を仲介する。J Clin Invest. 2009;119(8):2330–2342.
この記事を見る JCI PubMed CrossRef Google Scholar
ダプトマイシン非感受性メチシリン耐性黄色ブドウ球菌における2成分系および細胞壁生合成関連遺伝子のダウンレギュレーションは、ダプトマイシン感受性への復帰と関連していた。Eur J Clin Microbiol Infect Dis. 2017;36(10):1839–1845.
この記事を経由して見る PubMed CrossRef Google Scholar
MRL-Fas lprマウスにおける自己免疫疾患へのCD11b+ GR-1 low細胞の関与。Clin Exp Nephrol. 2010;14(5):411-417.
この記事を見る PubMed CrossRef Google Scholar
プロバイオティクス介入に対する健康成人の腸内細菌叢の頑健性がハイスループット・パイロシーケンスで明らかになった。DNA Res. 2013;20(3):241-253.
この記事を見る PubMed CrossRef Google Scholar
上野正樹、菊地正樹、大島和彦、金SW、森田浩之、服部正明：糞便サンプルからの微生物DNA調製法の評価と改良。デ・ブルーインFJ編『分子微生物生態学ハンドブックII：様々な生息環境におけるメタゲノミクス』（Handbook of Molecular Microbial Ecology II: Metagenomics in Different Habitats. Hoboken, New Jersey： John Wiley & Sons, Inc.
炎症性腸疾患における唾液微生物叢のディスバイオシスと口腔免疫学的バイオマーカーとの関連。DNA Res. 2014;21(1):15-25.
この記事を経由して表示します： PubMed CrossRef Google Scholar
Edgar RC. BLASTよりも桁違いに速い検索とクラスタリング。Bioinformatics. 2010;26(19):2460–2461.
この記事を見る PubMed CrossRef Google Scholar
哺乳類組織および生理食塩液中の親水性アミノ酸エナンチオマーの全自動マイクロ2次元高速液体クロマトグラフィーによる同時定量. J Chromatogr A. 2010;1217(7):1056-1062.
この記事を見る PubMed CrossRef Google Scholar
線虫は機能的なd-アスパラギン酸オキシダーゼをコードする2つの遺伝子を持つ。febs j. 2007;274(1):137-149.
この記事を見る PubMedクロスリーフ Google Scholar
哺乳類セリンラセマーゼのホモログである線虫由来セリンラセマーゼの特性：この酵素はin vivoでのセリンの代謝には重要ではない。Genes Cells. 2016;21(9):966-977.
この記事を見る PubMed CrossRef Google Scholar
マウスセリンラセマーゼの二重基質と反応特異性：高親和性ジカルボン酸基質と阻害剤の同定とβ-エリミナーゼ活性の解析。Biochemistry. 2005;44(39):13091–13100.
この記事を見る PubMed CrossRef Google Scholar
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