市販豚の正常発達期における鼻粘膜の特徴について

2023年4月25日 18:48

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発行：2023年4月24日
市販豚の正常発達期における鼻粘膜の特徴につい

https://veterinaryresearch.biomedcentral.com/articles/10.1186/s13567-023-01164-y

て
ユーチェン・リー
チェンジー・ヤン
...
銭楊
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Veterinary Research 54巻、記事番号：37（2023）この記事を引用する。
1 Altmetric（アルトメトリック
メトリックス詳細
アブストラクト
鼻粘膜は、吸入された病原体に常にさらされており、呼吸器感染症に対する最初の防衛手段である。ここでは、様々な成長段階にある市販豚の鼻粘膜の構造的・組成的特徴を調べた。鼻粘膜の上皮厚、毛細血管数、分泌機能は年齢とともに劇的に増加するが、呼吸器領域の下層のリンパ濾胞は、成長段階を問わずほとんど観察されなかった。鼻粘膜は、上皮、免疫、生物（常在菌）の各バリアから探索された。上皮バリアでは、鼻腔上皮の増殖能とタイトジャンクションタンパク質の発現は出生後高かったが、哺乳期に著しく低下し、離乳期に再び上昇した。免疫バリアでは、新生子豚ではほとんどのパターン認識受容体が非常に低いレベルで発現しており、自然免疫細胞の分布も低かった。哺乳期には、Toll様受容体（TLR）2およびTLR4の発現量の増加が観察されたが、TLR3の発現量は減少した。離乳期から仕上げ期にかけて、TLRの発現量と自然免疫細胞の量は有意に増加した。生物学的バリアでは、新生児子豚では、ファーミキューテス、アクチノバクテリア、プロテオバクテリア、バクテロイデーテスが主要なファイラを構成していた。哺乳期には鼻腔内微生物の多様性が劇的に減少し、潜在的な病原性細菌が増加することが観察された。プロテオバクテリア、バクテロイデーテス、ファーミキューテスが鼻腔微生物叢の中核をなす門として同定され、中でもアクティノバクター、モラクセラ、ベルゲレラの3属は呼吸器系の日和見病原体である可能性がある。これらの特徴は、大規模養豚場における呼吸器感染症予防のための必須資料となる。
はじめに
豚生産の大規模な拡大に伴い、細菌やウイルスなどの病原性微生物に起因する呼吸器疾患がますます深刻化し、世界の養豚産業に多大な損失をもたらしています [1, 2] 。鼻腔は、絶えず外的脅威にさらされる呼吸器への侵入経路です[3, 4]。鼻腔を覆う粘膜層は、潜在的な病原性微生物の侵入を防ぐ最初の防御手段です。したがって、鼻腔粘膜組織のバリア機能を強化することは、豚の呼吸器疾患を予防・制御する最も効果的な方法となり得る[5, 6]。したがって、この目標を達成するためには、鼻腔粘膜の構造的・機能的特性をより深く理解することが不可欠です。
私たちの以前の研究で、バマ・ミニピッグの鼻粘膜の組織学的および免疫細胞学的特性が明らかになりました[7]。ヒトやげっ歯類と同様に、Bama minipigsの鼻腔は、前庭領域、呼吸領域、嗅覚領域という異なる機能特性を持つ3つの領域で構成されています。ミニブタの鼻腔内にはリンパ組織がランダムに分布しているが、複数の自然免疫細胞（CD3+ T細胞、免疫グロブリンA [IgA] +細胞、樹状細胞 [DC]など）の分布は鼻腔内の遠位に増加する。バマミニチュアブタは中国南部のユニークな小規模品種であり、医学研究の動物モデルとして開発が進んでいる[8]。しかし、体格（小さい）や成長性能（遅い）が大きく異なるため、バマミニブタを用いた研究では、市販ブタの鼻粘膜の構造と機能を理解する上で、限られた価値しかない結果が得られています。さらに、商業用豚を対象とした関連研究も不足している。そこで、我々は、Bama minipigsを対象とした研究結果をもとに、市販豚の鼻腔粘膜の構造的・機能的特徴を探ることを目的とした。
鼻腔内の上気道粘膜の構成は、腸管粘膜バリアと類似している。上皮の機械的バリア、免疫的バリア、生物的バリアなどの多層構造を持っています[9]。機械的バリアは、鼻腔粘膜の構造的基盤であり主要な構成要素であり、主に鼻腔上皮細胞で構成され、隣接する上皮細胞間の緊密な結合を有しています［10］。鼻上皮細胞の中でも、粘液を分泌する杯細胞は、鼻上皮を覆う厚い保護粘液層を形成し、上皮のメカニカルバリアに不可欠な付加物として機能することができます [11]。上皮下コンパートメントに戦略的に位置する鼻腔固有層の自然免疫細胞は、粘膜部位における免疫監視に極めて重要である。ブタ鼻粘膜におけるマクロファージ、DC、B細胞、上皮内T細胞（IET）の分布が確認されている [12, 13] 。粘膜に常駐する自然免疫細胞は、迅速な免疫反応を発揮し、鼻粘膜に強力な免疫バリアを形成しています。鼻の免疫バリアの機能は、鼻の上皮細胞や自然免疫細胞が発現するさまざまなパターン認識受容体によって引き起こされ、調整されています [14] 。腸、口腔、上咽頭、膣などの粘膜部位には、関連する常在細菌叢が存在します [15]。
常在細菌叢は、粘膜組織のバリア機能を維持または修復するために必要です。研究により、粘膜の常在細菌叢は複数のレベルで生物学的バリアを形成し、病原性コロニー形成の抑制と鼻粘膜バリア安定化の促進に不可欠な役割を担っていることが示されています[16]。正常な状態では、微生物叢とその代謝産物の両方がこの生物学的バリア機能を保護しています[17]。これらの機能的バリアが一体となって、粘膜免疫バリアの保護的役割の基礎となっています。したがって、鼻粘膜のバリア機能を調べるには、それらの組成と構造的特徴を深く理解することが不可欠である。
粘膜組織の構造、組成、機能は、年齢によって大きく異なります[18, 19]。これらの違いにより、成長段階の異なるブタでは粘膜バリア機能が劇的に変化し、粘膜病原性感染症に対する感受性や免疫反応に影響を与える可能性がある。例えば、新生児期の子豚は、腸管粘膜バリアが未発達であるため、豚流行性下痢症ウイルス、豚デルタコロナウイルス、ロタウイルスによる腸管感染症にかかりやすいとされています[20]。臨床的には、新生児豚の下痢症を予防するための主要な戦略は、受動的に移行した防御抗体を高めるために母体ワクチンを使用することである[21]。呼吸器病原体感染症に対する豚の年齢関連の感受性が似ていることを考慮すると[22]、年齢によって異なる鼻粘膜の特性はさらに調査されるべきである。
我々は、異なる成長段階にある市販豚の鼻腔について系統的な研究を行った。上皮、機械的、免疫的、生物学的バリアの構造および構成的特徴を研究することにより、鼻腔粘膜のバリア特性を探った。鼻粘膜の包括的な知識は、豚の呼吸器系病原体の侵入経路を遮断するのに役立つ効果的な粘膜免疫学的戦略を開発するための貴重な参考資料となるであろう。
材料と方法
抗体・試薬
ZO-1 モノクローナル抗体（1:200, Z01-1A12, Invitrogen, USA）を用いて、タイトジャンクションタンパク質 zonula occludens-1 (ZO-1) の発現を測定しました。鼻の免疫細胞の観察・解析には、ヤギ抗ブタIgA（1:100; A100102P; Bethyl, USA）、ウサギ抗ブタCD3 (1:200; ab16669; Abcam, USA) およびウサギ抗ブタCD163ポリクローナル抗体 (1:1000; 16,646-1-AP; Proteintech, China)を用いた。その他の抗体としては、抗豚増殖細胞核抗原（PCNA）抗体（1:200; ab29; Abcam, USA）、AlexaFluor488コンジュゲートドンキ抗マウスIgG1（1：200; A-21202; Invitrogen, USA）などの間接免疫蛍光測定に使用する二次抗体があった。また、SABC-POD（ウサギまたはヤギIgG）キット（Boster Bioengineering, China）を使用した。過ヨウ素酸シッフ（PAS）染色は、PASキット（Beijing Leagene, China）を用いて、製造者の推奨に従って行った。
動物
新生児（0日齢、体重1.1～1.3kg）、哺乳期（7日齢、体重2.4～4kg）、離乳期（1ヶ月齢、体重8～10kg）、育成期（2ヶ月齢、体重15～20kg）および終齢（6ヶ月齢、体重40～50kg）のDuroc × Landrace × Yorkshire豚は江蘇農業科学院の豚群より得た．この豚群は、豚生殖・呼吸器症候群ウイルス、豚仮死ウイルス、豚流行性下痢ウイルス、豚サーコウイルス2型に対する抗体に対して血清陰性であった。すべての豚は、常に水と餌に自由にアクセスできた。
新生児豚は生後6時間後に犠牲とした。その他の豚は、中国の南京農業大学の実験動物センターに運ばれ、ストレス反応を軽減し、潜在的な病原性感染を避けるために、実験前に少なくとも48時間、高度に衛生的な条件下で飼育されました。豚は、常に水と餌に自由にアクセスできた。子豚には、実験期間中3時間ごとにミルクを与え、体格に応じた栄養・エネルギー要求量（NRC, 2012）を満たす、または上回るトウモロコシ・大豆粕ベースの飼料を与えた。すべての動物実験は、南京農業大学のInstitutional Animal Care and Use Committee（SYXK-2017-0027）の承認を受け、米国国立衛生研究所の動物実験の実施に関するガイドラインに従った。
鼻腔サンプルの収集と調製
各成長段階から5頭の豚を無作為に選択し、ペントバルビタールナトリウム（100mg/kg）で安楽死させた。その後、直ちに鼻腔スワブおよび鼻腔サンプルを採取した。ブタを断頭して無傷の鼻腔を得、下顎、皮膚、脂肪組織、および筋肉組織を除去した。その後、鼻腔を4％パラホルムアルデヒドで25℃、48時間固定した。固定後、鼻腔を1/4、2/5、3/5、4/5の比率に従って4つの断面（I〜IV）に分割した（図1Aに示すパターン図に描かれている）。I断面は前庭部に相当する。断面IIとIIIは、呼吸器領域に対応する。断面IVは嗅覚領域に相当する。離乳豚、育成豚、仕上豚の鼻腔の固定組織を10％EDTA溶液に2週間浸漬し、2週間脱灰した；脱灰溶液は3日ごとに交換された。
図1
異なる年齢のブタにおける鼻呼吸器領域前部のHE染色。A ブタの鼻腔の断面II（呼吸器領域の前部に相当する）の図。B-F 0日齢（B）、7日齢（C）、30日齢（D）、60日齢（E）、180日齢（F）の異なる年齢のブタの鼻前呼吸器領域のHE染色による代表画像。各図の赤枠は上鼻甲介（a）、下鼻甲介（b）を示し、図中右側に該当部位の拡大画像を示す。スケールバー： B-F 2 mm; (a, b) 50 μm.
フルサイズ画像
脱灰のエンドポイントを決定するために、シュウ酸カルシウム試験が用いられた。鼻腔は、飽和シュウ酸アンモニウムを加えても沈殿が生じない場合に脱灰したと判断した。鼻の一部から採取したブロックは、スライドに合わせてトリミングし、順次、勾配アルコール（75％、85％、95％、100％）およびキシレン浴で脱水した。脱水後、組織をパラフィンに包埋し、厚さ6μmの切片に連続的にスライスした。その後、4つの断面（I、II、III、IV）から切片を選び、ヘマトキシリン・エオシン（HE）またはPAS染色を行い、BX51デジタルカメラシステム（オリンパス株式会社、東京、日本）を用いて観察しました。
組織学的解析
組織学的評価のために、HE染色キット（Solarbio, Beijing, China）を用いて切片のHE染色を実施した。固有層内の腺の数は、5つの個々の切片の無作為に選択した5つの視野（10×）でカウントし、カラムプロットに要約された。鼻粘膜の毛細血管と腺の数は、無作為に選んだ5つの切片の視野（10×）でカウントし、カラムプロットにまとめた。鼻粘膜の上皮厚は、ImageJソフトウェアを用いて測定し、5つの個々の切片から5つの視野（40×）を無作為に選択した。カラムプロットにまとめたすべての測定値は、グループごとの平均上皮厚として提供される。鼻呼吸器における鼻濁音面積は、ImageJソフトウェアを用いて測定した；結果は、5つの個々の切片から得られた。鼻粘膜の杯細胞は、過ヨウ素酸シッフ（PAS）染色キット（Solaibio、中国）を用いて染色した。5つの切片の5つの視野（10×）において、PAS陽性細胞（杯細胞）の数をカウントした。バーヒストグラムは、各グループのPAS陽性細胞の定量化を表示する。
免疫組織化学
パラフィン切片を脱脂し、キシレンおよび下降するエタノール濃度でのインキュベーションにより再水和した。抗原検索を行うため、固定した切片をクエン酸緩衝液（pH6；90-95℃）に30分間入れた。内因性ペルオキシダーゼ活性を除去した後（0.5％H2O2）、切片をリン酸緩衝食塩水で再水和し、0.5％Triton/リン酸緩衝食塩水で透過処理し、5％牛血清アルブミンで25℃、2時間ブロッキングした。その後、切片を一次抗体（マウス抗ZO-1抗体、ウサギ抗CD3抗体、ヤギ抗IgA抗体、ウサギ抗CD163抗体）と共に加湿器内で4℃、一晩インキュベートした。シグナル増幅と可視化には、SABC-PODキットを使用した。一次抗体を省略した切片はネガティブコントロールとして使用した。切片は、光学顕微鏡（Olympus CX23；オリンパス株式会社）で40×または10×の倍率で可視化した。統計解析の際には、異なるフィールド（40×または10×；各ブタ組織についてn＝5）を数えた。
免疫蛍光法および共焦点顕微鏡法
増殖を評価するために、組織切片を水洗し、前述したように抗原修復を施した。リン酸緩衝生理食塩水で洗浄後、サンプルを5％ウシ血清アルブミンで25℃、2時間処理し、抗豚PCNA抗体とインキュベートした。抗マウスAlexa 488二次抗体は、一次抗体の標識を可視化するために使用した。陰性コントロールのスライドは、一次抗体を除去する以外は同じように処理した。細胞核は、ジアミヂノ-2-フェニルインドールで5分間インキュベートして染色し、共焦点レーザー顕微鏡（LSM-710; Zeiss, Oberkochen, Germany）下で観察した。
RNA単離と定量的リアルタイムポリメラーゼ連鎖反応
TRIzol試薬（Takara Biotechnology (Dalian, China) Co., Ltd.）を用い、製造者の指示に従って鼻粘膜からtotal RNAを抽出した。cDNAはHiScript™ QRT SuperMix（Vazyme、中国）を用いて製造者の指示に従って逆転写により作成した。標的遺伝子の転写は、SYBR Green qPCR kit (Takara Biotechnology (Dalian, China) Co., Ltd.)を用いた定量リアルタイムポリメラーゼ連鎖反応（PCR）で行い、二重標準曲線法で分析した。定量的リアルタイムPCRに使用したすべてのプライマーは、Additional file 1に記載されている。遺伝子発現レベルは、グリセルアルデヒド3-リン酸デヒドロゲナーゼの発現レベルに対して正規化した。サイトカインRNAの相対レベルは、2-ΔΔCT法を用いて算出した。
DNA抽出と16S rDNA配列決定
製造者のプロトコールに従い、HiPure Soil DNA kit (Magen, Guangzhou, China)を用いて鼻腔スワブ液からDNAを抽出した。ゲノムDNAの品質は、Thermo NanoDrop 2000紫外線分光光度計（Thermo Fisher Scientific Inc.、Waltham, MA, USA）および1％アガロースゲルを用いて決定した。細菌16S rDNA遺伝子のV3-V4超可変領域を、ユニバーサル16S rDNAプライマー（フォワード：5′-GTGCCAGCMGCCGCGG-TAA-3′；リバース：5′-GGACTACHVGGTWTCTAAT-3′）により増幅して5´端にイルミナのアダプター配列でタグをつけた。希釈したゲノムDNAをテンプレートとして、KAPA HiFi HotStart ReadyMix PCR kit high-fidelity enzyme (Kapa Biosystems Inc., Boston, MA, USA) を用いてPCRを実施した。PCR産物は2％アガロースゲル電気泳動で検出し、AxyPrep DNAゲル回収キット（Axygen Scientific Co., Union City, CA, USA）を用いてゲル化により回収した。回収後、NanoDrop 2000紫外線分光光度計（Thermo Fisher Scientific Inc.）と2%アガロースゲル電気泳動でライブラリーの品質チェックを行った。PCR産物は、Illumina HiSeq PE250 (Illumina, San Diego, CA, USA)を用いて配列決定した。
鼻腔内細菌叢の解析
配列はUSEARCH (v7.0.1090)を用いて97%の同一性で操作的分類単位（OTUs）にクラスタリングされた。OTUの相対的な存在量を計算し、様々な分類学的ランク（門、目、クラス、科、属、種）に分類した。OTUと種のアノテーションに基づき、サンプルの種の複雑さとグループ間の種の差異を分析した。異なるグループでのOTUの重複については、R統計ソフト（v3.1.1; R Foundation for Statistical Computing, Vienna, Austria）を用いてOTU Venn Diagramを構築した。OTUの結果に基づいて、サンプルのα-diversity（Chao1値、ACE値、Shannon指数、Simpson指数を含む）およびβ-diversityを評価した。微生物相組成を異なる生物学的分類レベル（門から属まで）で分析した。特定の微生物相の種類を特定するためにヒートマップを構築した。OTU/アンプリコン配列変異体のKyoto Encyclopedia of Genes and Genomesパスウェイ解析はTax4Funを用いて行い、細菌のマイクロバイオーム表現型はBugBaseを用いて分類された。グループ間の機能差は、R統計ソフトを用いたWelchのt検定、Wilcoxonランク検定、Kruskal-Wallis H検定で評価した。シーケンシングは、Gene Denovo Biotechnology Co. (Ltd.（中国・広州市）により実施された。配列データは、アクセッション番号PRJNA815911でNational Center for Biotechnology Information Sequence Read Archiveに寄託された。
統計解析
結果は平均値±標準偏差で示し、SPSS v.17.0 (SPSS Inc., Chicago, IL, USA) を用いて分析した。複数のグループ間の有意差を比較するために、一元配置分散分析を行った。有意差は、P＜0.05のときに報告された。高度に有意な差は、P < 0.01のときに報告された。すべての結果は、特に断りのない限り、少なくとも3つの独立した実験から得られたものである。
結果
様々な成長段階におけるブタ鼻腔の組織学的特徴
新生児期（0日）、哺乳期（7日）、離乳期（30日）、肥育期（60日）、仕上げ期（180日）のすべての成長段階の豚から鼻腔組織サンプルを採取しました。その後、豚の鼻腔の4つの断面を選択し、組織学的構造の検査を実施した。I断面は、前庭部に相当する。IIとIIIの断面は呼吸器系に相当する。断面IVは嗅覚領域に相当する。鼻腔の前庭部は層状扁平上皮で完全に覆われており、侵入してくる病原体に対して構造的・機能的な防御機能を発揮していた（Additional file 2）。年齢が上がるにつれて、層状扁平上皮とその移行層（仮層状柱状繊毛上皮に向かう）はともに著しく肥厚した（Additional file 3）。興味深いことに、仕上げ期のブタでは、上皮のリーテペグが下層の結合組織にまで伸びていた（Additional file 2）。さらに、新生児や哺乳期の子豚と比較して、肥育豚と仕上豚では、前膜断面Iに毛細血管や腺が多く見られた（Additional file 3）。
呼吸器領域の前部の位置は、鼻腔のパターン図に記されていた（図1A）。呼吸器領域の前部では、下鼻甲介のコンチ型に湾曲したタービナロールが形成され、鼻腔の比較的小さな部分を占有していた。この領域では、被覆上皮は徐々に偽層状柱状繊毛上皮に移行するが、上皮の移行特性は年齢層によって異なっていた（図1B-F）。生後30日以上では、上鼻甲介または下鼻甲介の背側螺旋は、全体が偽層状柱状繊毛上皮で覆われていたが（図1D-F）、新生児および哺乳豚では同様の部分が単純柱状上皮で覆われていた（図1BおよびC）。下鼻甲介には上鼻甲介に比べて有意に多くの腺があった。年齢が上がるにつれて、上・下鼻甲介の粘膜固有層にはより多くの粘膜腺と毛細血管が観察された（追加ファイル3）。被覆上皮層の厚さは年齢とともに増加したが、180日齢でわずかに減少（p < 0.05）が観察された（Additional file 3）。
呼吸器領域の後方部（図2A）では、螺旋状の鼻甲介がさらに内側に湾曲し、鼻腔内のほとんどの空間を占めるまでに著しく拡大したため、鼻腔は上、中、下、一般鼻腔に分けられた（図2B-F）。上または下鼻甲介の被膜上皮は、すべての年齢層で偽層状柱状繊毛上皮に変化し、上皮の厚さは年齢とともに増加した（Additional file 3）。呼吸器領域の前部とは対照的に、呼吸器領域の後部の下鼻甲介には、上鼻甲介に比べて有意に少ない腺があった（Additional file 3）。注目すべきは、仕上げブタの呼吸器領域の薄層プロプリアには、減少した数のリンパ濾胞しか見られなかったことである。同時に、他の年齢の市販豚では、リンパ組織はほとんど観察できなかった（Additional file 4）。
図2
異なる年齢のブタにおける鼻呼吸器領域後部のHE染色。A ブタの鼻腔の断面III（呼吸器領域の後部に相当する）の図。B-F 0日齢（B）、7日齢（C）、30日齢（D）、60日齢（E）、180日齢（F）の異なる年齢のブタの鼻呼吸器領域の後部をHE染色した代表的な画像である。各図の赤枠は上鼻甲介（a）、下鼻甲介（b）を示し、対応する部位の拡大画像を図の右側に示す。スケールバー： B-F 2 mm; (a, b) 50 μm.
フルサイズ画像
最後に、嗅覚領域の鼻腔には、中鼻甲介と鼻咽頭肉が保存されていた（Additional file 5）。嗅覚上皮は、鼻中隔と鼻腔の側壁の間にある仮性層状上皮である。中耳甲介と鼻中隔を覆う嗅上皮の厚さも、年齢とともに増加した。下にある毛細血管や腺の数についても同様のパターンが見られた（Additional file 3）。
異なる成長段階における鼻腔の物理的バリアの特徴
鼻の上皮は、粘膜バリアの安定性を維持するための基本的な物理的バリアを提供しています。タイトジャンクションタンパク質は、上皮細胞のアピカルサイドドメインに位置しています。上皮層を密閉し、侵入してくる微生物に対する防御の第一線を構成しています [23] 。成長段階におけるタイトジャンクションの変化を可視化するために、鼻上皮におけるタイトジャンクションタンパク質ZO-1の発現レベルを評価した（図3）。出生後、鼻腔の嗅覚領域と呼吸器領域で高い発現が観察され、その後、哺乳期には急激に発現が減少した。その後、ZO-1の発現は、鼻腔の異なる部位で異なる傾向を示した。呼吸器領域の前部では、フィニッシング期まで発現が低かったが、離乳期には呼吸器領域と嗅覚領域の後部で発現が増加した。
図3
異なる年齢のブタの鼻腔上皮におけるZO-1の発現。A 鼻上皮におけるタイトジャンクションタンパク質ZO-1の免疫組織化学染色。CSIIは呼吸器領域の前部、CSIIIは呼吸器領域の後部、CSIVは嗅覚領域を表す。スケールバー： 100 μm B 4つの断面から無作為に5フィールド（×40）でカウントした各群のZO-1染色結果の統計解析を要約した棒グラフ。すべてのデータは、3つの独立した実験からの平均±SDである。統計的有意性は、一元配置分散分析を用いて得られた。NS no significant, *P < 0.05, **P < 0.01.
フルサイズ画像
上皮の再生は、粘膜損傷後の物理的バリア機能の維持に重要である。PCNAの発現は、上皮細胞増殖の良い指標である[24]。鼻腔上皮におけるPCNAの発現パターンは、呼吸器領域と嗅覚領域で同様の発現が確認された（図4）。出生後、PCNAの高発現が観察されたが、哺乳期には有意に減少した。哺乳期以降、PCNAの発現量は再び増加し、ピークに達した。その後、仕上げ期には発現量が減少し、鼻呼吸器領域の前部で最も顕著な減少が認められた。
図4
異なる年齢のブタの鼻腔上皮におけるPCNAの発現。A 鼻腔上皮におけるPCNAの発現を免疫蛍光法で評価した。CSIIは呼吸器領域の前部、CSIIIは呼吸器領域の後部、CSIVは嗅覚領域を表す。スケールバー： 50 μm B PCNA発現の統計結果。4つの断面から無作為に5フィールド（×20）において、腔内の異なる部分におけるPCNA陽性細胞（緑色）の平均蛍光強度をカウントした。示したすべてのデータは、3つの独立した実験からの平均±SDである。統計的有意性は、一元配置分散分析を用いて求めた。NS no significant, *P < 0.05, **P < 0.01.
フルサイズ画像
ゴブレット細胞は上皮層内に存在し、粘液を産生して鼻腔上皮を覆う保護層を形成しています[25]。PAS染色により、呼吸器領域では嗅覚領域のそれよりも多くの上皮性杯細胞が認められた（図5）。具体的には、加齢に伴い、呼吸器領域と嗅覚領域で杯細胞の数が有意に増加した。しかし、嗅覚領域の杯細胞数は、仕上げの段階で有意に減少していた。
図5
異なる年齢のブタの鼻腔上皮における杯細胞の分布。A 鼻腔上皮のPAS染色の代表的な画像。CSIIは呼吸器領域の前部、CSIIIは呼吸器領域の後部、CSIVは嗅覚領域を表している。スケールバー： 100μm。B PAS染色の定量化分析。4つの断面から無作為に5フィールド（×10）において、腔の異なる部分のPAS陽性細胞（ピンク）の数をカウントした。示したすべてのデータは、3つの独立した実験からの平均±SDである。統計的有意性は、一元配置分散分析を用いて求めた。NS no significant, *P < 0.05, **P < 0.01.
フルサイズ画像
成長段階に応じた鼻腔の免疫バリア特性
受容体によるパターン認識は、粘膜部位における免疫監視において重要である[26]。鼻粘膜において、最も重要な認識分子であるToll様受容体（TLR）のmRNA発現とレチノイン酸誘導遺伝子（RIG）の発現を測定した（図6）。TLRファミリーのうち、TLR2とTLR4の発現は哺乳期に有意に上昇し、TLR3の発現は抑制された。離乳期にはTLR2とTLR9の発現が抑制され、肥育期には再び発現が増加した。出生から肥育期まで、TLR5、TLR6、TLR7、TLR8の発現は安定していたが、仕上げ期にはこれらの分子の発現が有意に上昇した。TLR1の発現も同様の傾向を示したが、その発現は肥育期で増加した。TLR10の発現も肥育期に増加したが、仕上がり期には再び減少し、比較的低いレベルになった（出生時に検出された発現レベルよりも低い）。RIG様受容体であるMDA5とRIG-Iは、成長ステージを通じて逆の発現傾向を示した。MDA5の発現は出生時から肥育期まで低レベルを維持し、仕上がり期で有意に上昇した。RIG-Iは出生後、高い発現量が検出されたが、哺乳期には急激に減少し、仕上がり期まで安定した発現量を維持した。
図6
異なる年齢のブタの鼻粘膜におけるパターン認識受容体（PRRs）の発現。鼻粘膜におけるToll様受容体（TLR）およびRIG-I様受容体（RLR）の転写をRT-qPCRにより検出した。TLRには、細胞表面受容体（TLR1、TLR-2、TLR-4、TLR-5、TLR-6、TLR-10）および細胞内受容体（TLR-3、TLR-7、TLR-8、TLR-9）がある。RLRには、MDA5とRig-Iが含まれる。示したすべてのデータは、3回の独立した実験からの平均±SDである。統計的有意性は、一元配置分散分析を用いて求めた。NS no significance, *P < 0.05, **P < 0.01.
フルサイズ画像
鼻の上皮細胞内に位置するIETは、粘膜バリアの前面で免疫の守護神として機能する[27]。全体として、IETは成長段階を通じて呼吸器領域と嗅覚領域で大幅に増加した。両領域で同様の分布パターンが確認された（図7）。肥育豚と高齢豚では、最も大きなIETの分布が見られた。同時に、新生児や哺乳期の子豚ではIETはほとんど検出されなかった。離乳期には、呼吸器領域でIETの数が有意に増加したが、嗅覚領域では大きな変化はなかった。
図7
成長段階の異なるブタの鼻腔上皮内のCD3+ T細胞の位置。A 鼻腔上皮内のCD3+ T細胞のIHC染色。T細胞特異的なCD3タンパク質は茶色に染色された。CSIIは呼吸器領域の前部、CSIIIは呼吸器領域の後部、CSIVは嗅覚領域を表している。スケールバー： 100 μm。B CD3 + T細胞の定量化解析。鼻腔の異なる部分におけるCD3陽性細胞の数を、4つの断面から無作為に5フィールド（×10）でカウントした。示したすべてのデータは、3つの独立した実験からの平均±SDである。統計的有意性は、一元配置分散分析を用いて求めた。NS no significant, *P < 0.05, **P < 0.01.
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粘膜B細胞は、分泌型IgAの産生を通じて粘膜免疫機能の維持に重要な貢献をする[28]。IETと同様に、IgA+細胞は新生児および哺乳期の子豚の呼吸器および嗅覚領域でほとんど観察されなかったが、年齢とともに有意に増加した（図8）。
図8
成長段階の異なるブタの鼻腔上皮内のIgA+ B細胞の位置。A 鼻腔上皮内のIgA+ B細胞のIHC染色。B細胞特異的なIgAタンパク質は茶色に染色された。CSIIは呼吸器領域の前部、CSIIIは呼吸器領域の後部、CSIVは嗅覚領域を表している。スケールバー： 100μm。B IgA+ B細胞の定量化解析。鼻腔の異なる部分におけるIgA陽性細胞の数は、4つの断面から5つのランダムフィールド（×10）でカウントした。示したすべてのデータは、3つの独立した実験からの平均±SDである。統計的有意性は、一元配置分散分析を用いて求めた。NS no significant, *P < 0.05, **P < 0.01.
フルサイズ画像
マクロファージは自然免疫と適応免疫の橋渡しをする重要な抗原提示細胞であり、粘膜免疫の恒常性維持に極めて重要な役割を担っています。IHCの結果、哺乳期および離乳期の子豚の鼻呼吸器領域には少数のマクロファージしか存在せず、CD163+マクロファージの数は年齢とともに徐々に増加することがわかった。さらに、肥育期から仕上がり期にかけて、粘膜マクロファージ数の有意な増加が観察された（図9）。
図9
異なる成長段階のブタの鼻粘膜におけるCD163 + マクロファージの分布。A 鼻腔粘膜のCD163+マクロファージのIHC染色。マクロファージ特異的なCD163タンパク質は茶色に染色された。スケールバー： 50 μm。B マクロファージの定量化解析。異なる成長段階のブタからの呼吸領域の後部のCD163+マクロファージの数は、4つの断面から5つのランダムフィールド（×10）でカウントされた。示したすべてのデータは、3つの独立した実験からの平均±SDである。統計的有意性は、一元配置分散分析を用いて得られた。NSは有意差なし、***P < 0.001。
フルサイズ画像
成長段階に応じた鼻腔の微生物バリア特性
厳格な品質管理の結果、25個の鼻腔サンプルから541個の183個の配列が得られ、サンプルあたりの平均値は21 647個（範囲：11 080-35 688）であった。配列は22 320 OTUに分類され、各サンプルには平均892 OTU（範囲、506-1299 OTU）が含まれていた。ベン図には、5つの年齢グループ間で共有される252のOTUが表示され、各グループには固有のOTUがあった（追加ファイル6）。新生児豚には585のユニークなOTUがあり、哺乳豚には62のユニークなOTUがあり、離乳豚には207のユニークなOTUがあり、肥育豚には98のユニークなOTUがあり、仕上げ豚には203ユニークなOTUがあった。微生物のα多様性の変化を評価するために、Sobs (observed OTUs) diversity index、Shannon diversity index、Chao1 indexの3つのα多様性指標を使用した（Additional file 6）。3つの多様性推定因子は同じ傾向を示し、年齢が上がるにつれてアルファ多様性の変化が観察された。α多様性の結果から、鼻腔内の微生物の多様性と豊かさは、出生から哺乳期にかけて減少し、その後、徐々に増加し、仕上げ期にはピークに達することが示されました。年齢が微生物のβ多様性に与える影響をさらに検討するため、OTU多様性データの主座標分析を実施した（Additional file 6）。主座標分析のプロットから、7日目、30日目、60日目の微生物組成は、各グループのマイクロバイオームで顕著な違いが観察されたものの、部分的に重なり合ったクラスターを形成していることが示唆されました。
OTUは、31の細菌門と585の属に分類された。門レベルでは、成長段階を通じて、ファーミキューテス、バクテロイデーテス、プロテオバクテリア、およびアクチノバクテリアの総存在量が鼻腔内細菌全体の90％以上を占めた（図10A）。鼻腔内細菌叢の細菌フィラの相対存在量は、年齢が上がるにつれて著しく変化した。出生日の鼻腔領域では、ファーミキューテス門（42.9%）とアクチノバクテリア門（35.4%）が多く、プロテオバクテリア門（14.4%）とバクテロイデス門（3.6%）は相対的に少ない存在である。生後1日から7日目までは、ファーミキューテス（16.8%）とアクチノバクテリア（4.5%）の存在量が著しく減少し、バクテリア（20.2%）とプロテオバクテリア（54.4%）の存在量が著しく増加することが確認されました。その後，哺乳期から仕上げ期にかけて，ファーミキューテスとアクチノバクテリアの存在量は急速に増加，減少，再び増加したが，バクテロイデーテスの存在量は逆の傾向（減少-増加-減少）を示している．アクチノバクテリアの存在量は4つの年齢層で10%未満であった。しかし、プロテオバクテリアの高い存在度（48.2%-55.6%）は、哺乳期から仕上げ期まで安定的に維持された。属レベルでは、5つの優勢な細菌群（存在量の多いものから少ないものまで）は以下の通りであった：新生子豚の鼻腔からは，Rothia，Clostridium sensu stricto 1，Moraxella，Corynebacterium，Streptococcus の5つの細菌群が検出されたが，他の年齢層では傾向が大きく異なっていた（図10B）．Streptococcus属の存在量は、成長段階を通じて安定していた。Rothia、Clostridium-sensu-stricto 1、Corynebacteriumの存在量は哺乳期に大きく減少し、その後の月齢では比較的低い水準で推移した。しかし、Moraxellaは増加し続け、この時期に優勢（23.9%-43.3%）となったが、肥育期にはこの傾向が崩れることが確認された。また、ベルゲイエラは哺乳期と肥育期で多く検出され、マイコプラズマは哺乳期から肥育期にかけて低く検出された。
図10
異なる年齢におけるブタ鼻腔内微生物の分類学的解析。異なる年齢のブタの鼻腔における細菌フィラ（A）および属（B）の相対的な存在量。各時代ごとに上位8クラスを記載し、それ以外のクラスは "Other "または "Unclassified "としてグループ化した。OTUに基づくLEfSe分析により、異なる年齢のブタ鼻腔のマイクロバイオームを特徴付ける。C 線形判別分析（LDA）スコアが3.5以上の指標菌が表示されている。D 異なる年齢の鼻腔内マイクロバイオームにおいて、どの分類群（小さな丸と網掛けで強調表示）が濃縮されているかのLEfSeの結果を表すクラドグラム。E, F Tax4Funを用いて、全年齢層から微生物群集機能を予測した。E グループ間の代表的な微生物機能のヒートマップ。F 異なる年齢グループ間の微生物機能の有意差の比較。P値はWelchのt検定で算出した。
フルサイズ画像
代表的な分類群をさらに裏付けるために、効果量の線形判別分析を行い、グループ間の差分微生物をスクリーニングした。線形判別分析を用いると、スコアが3.5を超える40の判別バイオマーカーが観察された（新生児豚で24、哺乳豚で4、離乳豚で5、仕上げ豚で7）（図10C）。肥育豚ではバイオマーカーは確認されなかった。新生児豚は、Clostridium-sensu-stricto-1およびChristensenellaceae-R-7（いずれもClostridiaのクラス）、Corynebacterium-1（Actinobacteriaのクラス）、Soonwooa（Bacteroidiaのクラス）、JeotgalicoccusおよびAerococcus（いずれもBacilliのクラス）が多く、独特の微生物相であった。しかし、哺乳期の子豚では、Moraxellacea（Gammaproteobacteriaのクラス）とVeillonella（Negativicutesのクラス）という支配的な系統に大きな変化が検出された。離乳後の鼻粘膜は、Neoscardovia属（Actinobacteria属）とFusicatenibacter属（Clostridia属）のコロニーが多く、出生時や離乳期の観察とは異なっていた。仕上げ期豚の鼻腔微生物叢では、Helcococcus属とFamily-XI属（Clostridia属のクラス）およびhorsej-a03（Oligosphaeria属のクラス）が主要な系統であった。
さらに、Tax4Funを用いて、全年齢層の鼻腔内微生物群集の機能プロファイルを予測した。ヒートマップは、各グループ間での特定の機能経路の変化を示している（図10E）。最も予測された代謝経路（糖質代謝、脂質代謝、ゼノバイオティクス生分解・代謝、テルペノイド・ポリケチドの代謝、その他の二次代謝物の生合成など）の活性レベルは出生直後が最も高く、年齢とともに減少した。しかし、一部の予測経路（感染症、細胞増殖・死、シグナル伝達など）では、出生時に最も活性が低く、生後1ヶ月で徐々に活性が高まるという逆の傾向が見られた。さらに、いくつかの強化パスウェイ（特に翻訳、複製、修復、ヌクレオチド代謝）のタンパク質の発現量は、出生時から肥育期にかけて増加したが、仕上げ期には減少した。ウェルチのt検定を用いて、パスウェイの活性がグループ間で有意に異なるかどうかを検証した（図10F）。新生児期の子豚と比較して、哺乳期の子豚の予測代謝経路のいくつかは有意に阻害され、特に、ゼノバイオティクスの生分解および代謝、その他の二次代謝物の生合成、テルペノイドおよびポリケチドの代謝が顕著であった。一方、感染症経路は活性化された。予測された経路のうち、離乳後に影響を受けたのはごくわずかであった。しかし、肥育豚で濃縮された予測パスウェイのほとんどは、代謝、遺伝情報処理、ヒト疾患、生物系に関わる複数のパスウェイを含み、仕上げ豚のそれと大きく異なっていた。
考察
市販豚の鼻腔に関する知識を深めるため、本研究では、異なる成長段階における構造的および機能的な特徴を探った。組織学的解析の結果、鼻粘膜の上皮の厚さおよび固有層内の毛細血管の数は、年齢とともに増加することが明らかになりました。このことから、鼻粘膜は豚の成長・発育過程で数多くの構造的・機能的変化を起こしていることが示唆された。前庭部では、上皮基底層と結合組織との接合部が加齢とともに明瞭になる。特に仕上げ期の豚では、表皮が結合組織の内側に突出することを特徴とするレテペグが観察されるようになった。これらの構造の形成は、接触面積の増加による上皮の栄養供給を確保するだけでなく、上皮の保護と摩擦抵抗の強化にもつながる。呼吸器領域と嗅覚領域の構造も加齢とともに複雑化し、中・下鼻甲介の拡大した螺旋構造が鼻粘膜と外部環境との界面を強化した（Additional file 7）。これらの領域は仮層上皮層で覆われているため、鼻腔内に侵入する病原体の主要なゲートウェイとなる。私たちが以前行ったバーマミニピッグの研究では、これらの領域にいくつかのリンパ濾胞がランダムに分布していることが示されたが、市販の肥育豚ではリンパ組織はほとんど見えない。このことは、市販豚の耐病性がBama minipigsに比べて弱いことの重要な理由であると考えられる[29]。さらに、鼻粘膜の腺や粘液分泌細胞の数が年齢に依存して増加することから、豚の成長過程で鼻腔の分泌機能が継続的に向上することが示された。
鼻腔上皮バリアの調査では、出生後にタイトジャンクションタンパク質が高発現し、哺乳期には著しく減少したが、離乳期には再び増加した。また、鼻上皮細胞の増殖能についても、年齢とともに同様の傾向が見られた。鼻上皮の発達の特徴は、これまでに報告されたブタの腸上皮バリアの発達の特徴とは大きく異なり、出生後にタイトジャンクションタンパク質の発現と増殖能が増加し、離乳後に劇的に減少した [30, 31] ことから、鼻上皮は、腸上皮バリアとは異なることがわかった。これらの結果は、ブタの異なる組織や器官における上皮の発達が独立していることを示し、また、離乳期のストレスは子ブタの生理機能に深刻な影響を与えることが報告されているが、腸上皮バリアよりも鼻上皮バリアへの影響が少ない可能性を示唆している[32]。鼻粘膜の上皮バリア機能の低下は、哺乳期の子豚の呼吸器病原体感染に対する抵抗力を低下させる可能性があり、さらに注意が必要である。さらに、鼻腔上皮細胞の増殖能は肥育・仕上げ期に低下しており、これは成体哺乳類において加齢に伴い上皮細胞の増殖能が低下することを報告した先行研究 [33] と一致する。
鼻の免疫バリアについては、新生児ブタでは鼻粘膜のパターン認識受容体のほとんどが低発現であり、自然免疫細胞はわずかな数しか前膜に分布していないことが明らかになった。これらの観察から、新生児ブタでは鼻の免疫バリアが不完全であることが示唆された。鼻粘膜におけるTLR2およびTLR4の発現は、哺乳期において有意に増加した。TLR2およびTLR4は主に病原性細菌のパターン認識に関与しているため[34]、鼻粘膜におけるこれらの活性化は、授乳期の母豚の乳房皮膚に由来する条件付き病原性細菌の侵入に関連していると考えられる[35]。鼻粘膜におけるTLRの発現と自然免疫細胞数は、離乳期から仕上げ期にかけて有意に増加し、鼻の免疫バリアの発達に重要な時期である可能性が示唆された。肥育期には、ほとんどのパターン認識受容体が高レベルで発現していたものの、TLR3およびTLR4は有意に減少していた。これらの結果は、ブタの腸管粘膜において、年齢が上がるにつれてTLR3の発現レベルが低下することを示した先行研究と一致している[31]。RIG様受容体であるRIG-1とMDA5は、ブタの成長過程で鼻腔粘膜において正反対の発現傾向を示しました。RIG-1の発現は出生後に高く、その後有意に低下し、仕上げ期まで低いレベルで維持された。MDA5の発現は出生時には低値であったが、仕上がり期には有意に上昇した。マウスの腸ではRIG-1とMDA5の発現傾向が正反対であったが、その制御機構についてはさらなる検討が必要である [36] 。パターン認識受容体であるTLR3とRIG-Iは自然界における抗ウイルス反応に重要な役割を果たすため[37]、両者の発現が低下すると、仕上げ期の豚において豚生殖・呼吸器症候群ウイルス、豚仮死ウイルス、豚インフルエンザウイルス、その他の豚呼吸器ウイルスに対する感受性が高くなると考えられる。
常在細菌叢は、鼻粘膜の表面に天然のバリアを形成し、粘膜のメカニカルバリアと免疫機能の完全性の調節と維持に関与している[38]。鼻腔常在細菌叢の群集構造は、乳児期に確立され、年齢とともに変化します[39]。本研究では、新生児子豚の鼻腔では、ファーミキューテス、アクチノバクテリア、プロテオバクテリア、バクテロイデーテスが優勢な門を構成していた。この知見は、乳児の鼻腔微生物相を調査した先行研究および他の商業用豚品種[39, 40]と一致しています。出生から哺乳期にかけて、FirmicutesとActinobacteriaの相対存在量の劇的な減少が観察された。
一方、BacteroidetesとProteobacteriaの存在量は、同時期に増加した。BacteroidetesとProteobacteriaは、潜在的な病原性細菌を複数含むことが知られており、これらの分類群のメンバーは炎症促進作用がある[41, 42]。また、本研究では、BergeyellaとMoraxellaの増加が顕著に観察された。
鼻腔内微生物の分類群多様性は、哺乳期には著しく減少した。鼻腔内のMoraxellaの増加がこの現象に寄与している可能性がある[43]。離乳期から仕上がり期にかけて、プロテオバクテリア門の相対的な存在量は安定していたが、ファーミキューテス門、バクテロイデーテス門、アクチノバクテリア門は豚の加齢とともに動的に変化した。仕上げ期豚では、Proteobacteria、Bacteroidetes、Firmicutesが鼻腔内微生物の中心的な門として同定され、このうちActinobacter、Moraxella、Bergerellaの3属が優勢で、仕上げ期豚の呼吸器感染症を引き起こす日和見病原体となりうることがわかった。
鼻腔内細菌叢の機能解析により、代謝シグナル伝達経路の機能が出生時に有意に増加することが明らかになり、これは新生児豚の鼻腔内のトップバイオマーカーClostridium-sensu-stricto 1と関係があると考えられる。これらの細菌は、体内の炭水化物や脂質などの代謝に関与している[44]。さらに、哺乳期には、感染症機能が著しく上昇することから、バイオマーカーのトップであるMoraxellaが関係していると考えられ、やはり哺乳期の子豚の呼吸器感染症のリスクが示唆される。さらに、離乳期の豚の急激な体重増加は、宿主の糖質・脂質代謝の調節に重要な役割を果たすトップバイオマーカーであるFusicatenibacterと関連している可能性がある[45]。
以上のことから、本研究では、商業用豚の成長期における鼻粘膜の重要な防御機能を構成する、鼻の機械的、免疫的、生物学的バリアの構成的特徴を明らかにした。これらの知見は、商業用豚の鼻腔の組織学的特徴の理解を深めるだけでなく、鼻粘膜免疫に関する今後の研究の理論的基礎を提供するものである。特筆すべきは、鼻腔上皮の増殖とタイトジャンクションタンパク発現の低下、微生物多様性の劇的な低下、鼻腔内の潜在的病原性細菌の増加が哺乳豚で検出され、この時期の呼吸器病原体の感染リスクが高いことが示唆された。
データおよび資料の入手方法
本研究の結果を裏付けるデータは、対応する著者に依頼すれば入手可能である。
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リファレンスのダウンロード
謝辞
本研究は、中国国家重点研究開発計画（助成番号2022YFD1801400）、中国国家自然科学基金（31930109および32002261）、江蘇省自然科学基金（No. BK20200536）、中国農業科学院蘭州獣医研究所獣医病因生物学国家重点実験室（SKLVEB2021KFKT001）、江蘇省高等教育機関優先学術プログラム開発（PAPD）。
著者情報
著者ノート
Yuchen LiとChengjie Yangはこの研究に等しく貢献した。
著者と所属
中国江蘇省南京市南京農業大学獣医学院 MOE動物衛生・食品安全共同国際研究室
Yuchen Li, Chengjie Yang, Yuqi Jiang, Xiuyu Wang, Chen Yuan, Jiaxin Qi & Qian Yang
貢献度
YL、CY、YJはデータの分析、原稿の作成を行い、原稿執筆の主要な貢献者である。CY、YJ、JQは実験に参加した。XWとCYは子豚の飼育とサンプルの採取を行った。YLとQYは研究を計画し、原稿を修正した。最終原稿は著者全員が読み、承認した。
責任著者
Qian Yangに対応します。
倫理に関する宣言
倫理的承認と参加への同意
動物実験は、南京農業大学のInstitutional Animal Care and Use Committeeの承認を得て、National Institutes of Healthの動物実験実施に関するガイドラインに従いました。
競合する利益
著者は、競合する利害関係がないことを宣言する。
追加情報
ハンドリングエディタートム・マクニリー
出版社ノート
シュプリンガー・ネイチャーは、出版された地図や所属機関の管轄権主張に関して、中立を保っています。
補足情報
13567_2023_1164_MOESM1_ESM.docx
追加ファイル1. リアルタイムPCRに使用したプライマー。
追加ファイル2. 異なる成長段階における鼻腔の前庭領域のHE染色。
(A) ブタの鼻腔断面図I（前庭部に相当）。(B-F）0日齢（B）、7日齢（C）、30日齢（D）、60日齢（E）、180日齢（F）の異なる年齢のブタのHE染色した鼻前庭領域の代表画像です。各図の赤枠は下鼻甲介（a）および鼻中隔（b）を示し、対応する部位の拡大画像を図の右側に示す。スケールバー：（B-F）2mm、（a、b）50μm。
追加ファイル3. ブタ鼻腔の4つの断面の組織学的解析。
(A) ブタ鼻腔の4つの領域の上皮の厚さの定量的な分析。鼻腔粘膜の上皮厚をImageJソフトウェアを用いて測定し、5つの個々の断面から5つの視野（40×）を無作為に選択した。カラムプロットにまとめたすべての測定値は、グループごとの平均上皮厚として提供される。(B）ブタ鼻腔の4つの領域の薄層プロプリアにおける腺の数の定量的な分析。腺数は、5つの個別切片の無作為に選択した5つの視野（10×）でカウントし、カラムプロットで要約した。(C）鼻腔の4つの領域における毛細血管の数の定量的な分析。鼻腔粘膜の毛細血管の数は、5つの個々の切片の無作為に選択した5つの視野（10×）でカウントされた。示したすべてのデータは、3つの独立した実験からの平均±SDである。統計的有意性は、一元配置分散分析を用いて得られた。差は異なる文字で示す。グラフの上の文字は、共通する文字を持つ処置が互いに有意差のない統計的有意性を示す。
追加ファイル4. 異なる年齢におけるブタの鼻呼吸器領域におけるリンパ濾胞の分布。
7日齢（A）、60日齢（B）、180日齢（C）など、異なる年齢のブタの鼻呼吸器領域をHE染色した代表的な画像である。各図の赤枠は下鼻甲介の異なる部分（a、b）を示し、対応する部位の拡大画像を図の右側に示す。黒アスタリスクはリンパ濾胞を示す。CSII：呼吸器領域の前部、CSIII：呼吸器領域の後部、スケールバー：（A〜C）2mm、（a、b）200μm。
追加ファイル5. 異なる成長段階における鼻腔の嗅覚領域のHE染色。
(A）ブタ鼻腔断面IV（嗅覚領域に相当）の図。(B-F）0日齢（B）、7日齢（C）、30日齢（D）、60日齢（E）、180日齢（F）の異なる成長段階のブタのHE染色鼻腔嗅覚領域の代表画像。各図の赤枠は中鼻甲介（a）および鼻中隔（b）を示し、対応する部位の拡大画像を図の右側に示す。スケールバー：（B-F）2mm、（a、b）50μm。
追加ファイル6. OTUに基づく群集組成と多様性解析。
(A）異なる年齢層から採取した鼻腔スワブサンプルにおける共有OTUと固有OTUを示すベン図。OTU組成に基づき、異なる年齢層からのサンプルの生物多様性（α多様性）をShannon（B）、Sob（C）、Chao1（D）指数で算出した。異なる年齢層からの細菌群集のベータ多様性は、PCoAプロットに示されている。
追加ファイル7. 鼻呼吸器領域および嗅覚領域における鼻甲介の総面積の定量的解析。
鼻甲介の面積は、ImageJソフトウェアを用いて測定し、5つの個別切片から結果を得た。ヒストグラムは、異なる成長段階における鼻腔の中水晶体または下水晶体の面積の平均±SDを示す。データは、3つの独立した実験の代表である。差は異なる文字で示される。グラフの上の文字は、共通する文字を持つ治療が互いに有意に異ならない統計的有意性を示す。
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Li, Y., Yang, C., Jiang, Y. et al. 業務用豚の正常な発育過程における鼻粘膜の特徴。Vet Res 54, 37 (2023). https://doi.org/10.1186/s13567-023-01164-y
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2022年3月18日受理
2023年3月1日受理
2023年4月24日発行
DOIhttps://doi.org/10.1186/s13567-023-01164-y
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ISSN: 1297-9716
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