シカマウス（Peromyscus maniculatus）の飼育環境と都市環境は異なる腸内細菌叢と関連している

シカマウス（Peromyscus maniculatus）の飼育環境と都市環境は異なる腸内細菌叢と関連している

https://royalsocietypublishing.org/doi/10.1098/rsbl.2022.0547

ジェシカ ディアス
,
ケント・H・レッドフォード
および
アスペン・T・リース
Published:08 March 2023https://doi.org/10.1098/rsbl.2022.0547
要旨
飼育下および都市環境にいる動物は、食餌の変化、ヒト関連細菌への曝露、さらには医療介入の可能性など、ヒトによって形成された進化的に新規な条件に遭遇する。飼育環境と都市環境は、それぞれ独立して腸内微生物の組成と多様性に影響を与えることが実証されているが、一緒に研究されたことはまだない。実験室、動物園、都市、自然の環境で生活するシカマウスの腸内細菌叢の塩基配列を決定することで、（i）飼育下のシカマウスの腸内細菌叢が飼育条件に関わらず同様の組成を持つかどうか、（ii）飼育下と都市のシカマウスの腸内細菌組成が類似しているかどうかを明らかにしようとした。その結果、飼育下におけるシカマウスの腸内細菌叢は、放し飼いのシカマウスの腸内細菌叢とは異なっており、飼育下におけるシカマウスの腸内細菌叢は、個体群の場所、系統、飼育条件にかかわらず、一貫した影響を受けることが明らかとなった。さらに、自由生活している都市部のマウスの腸内微生物組成、多様性、細菌負荷量は、他のすべての環境タイプの腸内微生物組成、多様性、細菌負荷量とは異なっていた。これらの結果から、飼育下および都市化に関連する腸内細菌叢は、ヒトへの曝露増加に対する共通の反応ではなく、むしろ飼育下および都市環境に内在する環境的特徴によって形成される可能性が高いことが示された。

1. はじめに
   食餌、地理的位置、社会的相互作用などの環境要因が腸内細菌叢に影響を与えることはよく知られている（例えば[1-3]）。そのため、さまざまな環境下で生活する動物の腸内細菌叢に明らかな組成の違いがあることが、多くの研究で示されているのは当然のことである。例えば、自然の生息地（ここでは「未開発」の環境）にいる動物は、都市（[4-6]など）、動物園（[7-9]など）、研究所（[10,11]など）といった「開発された」環境とは異なる微生物叢を保有していることが多い。
   これまでの研究では、未開発環境の動物の腸内細菌叢と先進国環境の動物の腸内細菌叢を比較してきたが、複数の種類の先進国環境を直接比較した研究はまだない。このような比較は、腸内細菌叢が環境タイプ間および環境タイプ内でどのように異なるかをよりよく理解し、以前に観察されたパターンを文脈づけるために必要である。例えば、都市 [4]や実験室 [10]の個体群は未開発環境の動物とは異なる微生物叢を持つことが知られているが、都市と実験室の微生物叢が互いにどの程度似ているのか、また同じ環境力が未開発状態からの微生物分岐を促すのかどうかはまだ不明である。
   ここでは、4つの環境タイプ（未開発環境、都市環境、動物園環境、実験室環境）にまたがる6つの個体群から得られたシカマウス（Peromyscus maniculatus）の腸内微生物組成を分析した。シカネズミは北アメリカの大部分をカバーする生息域を持ち、幅広い生態学的柔軟性を示すため、この特殊な比較のための研究種として有意義である[12]。この生息域の多くは未開発の環境であるが、人間の居住地やその周辺にも普通に生息している。またシカマウスは、マイクロバイオームの研究など、生物学的研究のモデル種としてますます価値が高まっている [13] [14]。このユビキタスなげっ歯類の多環境比較を通じて、微生物組成の広範な生態学的パターンを調べ、飼育下および都市部の腸内細菌叢に関する先行研究の文脈を整理することを目指した。

2. 方法
   (a) 対象個体群とサンプル収集
   シカマウス（Peromyscus maniculatus）の糞便サンプルまたは腸内サンプル合計99個を、本研究および他の研究プロジェクトのために2018年から2021年の間に収集した。成体のシカマウスは、4つの環境タイプにまたがる6カ所で、自由生活と飼育下それぞれ2匹ずつサンプリングされた（表1；電子補足資料、図S1）。これらのサンプルは共同研究者から提供されたものであり、個体群によって採集方法に若干の違いがある。いくつかのサンプルは新鮮な糞便サンプルとして採取され、他のサンプルは死後に大腸から解剖された。しかし、サンプルの種類による微生物組成への影響は、主な関心変数（すなわち、環境の種類と状態；表2）に比べて最小であったため、この相違が主な調査結果を混乱させることはないと考えられる。各集団の採取手順に関する詳細は、電子補足資料に記載されている。
   表1.
   サンプル情報。
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   表2.
   環境タイプ、条件（飼育下または放し飼い）、サンプルタイプ（腸内または糞便）別に分析したブレイ・カーティス距離、非加重UniFrac距離、および加重UniFrac距離のPERMANOVA統計結果。p値はすべてホルム補正。
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   (b）DNA抽出、16S rRNA遺伝子増幅および塩基配列決定
   E.Z.N.A. Stool DNA Kit（Omega Bio-Tek；ジョージア州ノークロス）を用い、DNAを50μlの溶出バッファーに溶出する以外は、製造元の指示に従って全サンプルからDNAを抽出した。すべての生物学的サンプルに加え、陽性抽出対照1検体および陰性抽出対照6検体も処理した。
   16S rRNA遺伝子のV4領域の増幅は、Illumina 16S Metagenomic Sequencing Library Preparation Guide [15]のAmplicon PCRワークフローに従い、Nextera調製法で行った。カリフォルニア大学デービス校DNAテクノロジーズコアのMiSeq500でペアエンド250bpリードシーケンスを行った。UN2サンプル以外のすべての集団は1つのMiSeq500レーンでシーケンスし、UN2サンプルは別のランでシーケンスしました。両方のシーケンスランでポジティブコントロール（ZymoBIOMICS Microbial Community DNA Standard; Zymo Research; Irvine, CA）を含み、その組成の忠実性を確認した。Peromyscusサンプル間の比較ではランの影響が見られたが（p = 0.001、PERMANOVA）、同じ環境タイプの個体が非常に類似した微生物組成を示したことから、これらの違いはシーケンスランの違いによるアーチファクトというよりは、主に個体群間の生物学的変異を反映していると考えている（結果参照）。
   (c）定量的PCR
   Bio-Rad CFX-96マシン（Bio-Rad; Hercules, CA）を用いて定量的PCR（qPCR）を行い、CFX Maestroソフトウェアを用いて細菌濃度の定量を行った。抽出した DNA は、515f/806r プライマーと Power SYBR Green PCR マスターミックス（Applied Biosystems; Waltham, MA）を用いて、標準プロトコール[16]に従って PCR 増幅した。細菌負荷量（糞便1gあたりの細菌細胞濃度）は、ZymoBIOMICS Microbial Community Standardからの既知量の細菌のDNA抽出産物から作成した標準曲線に基づき、抽出した糞便材料の重量を調整して算出した。
   (d）データ処理
   配列データはdemultiplexされ、fastq配列はcutadapt（バージョン3.4、Python 3.9.5、[17]）でトリミングされた。dada2 Rパッケージ(バージョン1.16.0, [18])を用いて、配列はquality sequence scoreに基づいてフィルタリングされ、dereplicatedされ、フォワードとリバースアンプリコンペアがマージされた。SILVAデータベースバージョン138.1[19]に従って、アンプリコン配列バリアント（ASV）に分類学を割り当て、抽出およびPCRネガティブコントロールから同定されたコンタミネーションをdecontam Rパッケージ（バージョン1.10.0, [20]）を使用して除去した。葉緑体、ミトコンドリア、非細菌にマップされたASVや、門レベルでマップされなかったASVも除去された。最初に同定された10 583個のASVのうち、8064個が保持された。
   生物学的サンプルのリードカウントの中央値は91 169（±36 925（s.d.）、範囲19 962-226 848）であった。サンプルは、RパッケージGUnifrac（バージョン1.3、[21]）を使用して、19 900リードの深さまでアルファ希釈した。生のシーケンスデータはENAから入手可能である（アクセッション番号PRJEB51510）。
   (e）統計解析
   すべての統計解析は非正規分布を考慮してノンパラメトリックで行い、R（バージョン4.2.0、[22]）で実施した。β多様性の指標と順序はphyloseqパッケージ（バージョン1.36.0、[23]）を使用して計算した。非計量的多次元尺度法（NMDS）の応力値は、収束に達したかどうかにかかわらず、20回試行した後に報告される。加重および非加重UniFracでは収束解が得られたが、Bray-Curtisでは収束解は得られなかった。パーミュテーショナルMANOVA（PERMANOVA）は、veganパッケージ（バージョン2.5-7、[24]）のadonis2関数を用いて実施した。アルファ多様性指標（シャノン指数、ASVリッチネス）は、希薄化ASV表で計算し、ホルム多重仮説補正を用いたクラスカル・ワリス検定を用いてグループ間で比較した。環境タイプ間の微生物群集組成のばらつきは、veganのbetadisper関数とpermutest関数を用いて計算した。地理的距離とβ多様性距離の相関を検定するために、veganのmantel関数を用いてマンテル検定を行った。この検定は、個体群内のゼロ距離をコントロールするため、各個体群から無作為に選んだ1サンプルで行った。細菌負荷は、ホルム多重仮説補正を用いたクラスカル・ワリス検定を用いてグループ間で比較した。グループ間の微生物分類群の存在量の差は、ANCOMBCパッケージ（バージョン1.2.2、[25]）を用いたバイアス補正付きマイクロバイオーム組成分析（ANCOM-BC）を用いて算出した。

3. 結果
   全個体群における腸内全体の組成は、げっ歯類の腸で典型的なように、ファーミキューテス（57.10％平均±7.78 s.d.）とバクテロイデーテス（34.15±8.55）が優勢であった（例えば[26]）。しかし、プロテオバクテリア（Proteobacteria）はごくわずか（1.44 ± 1.99）であった。
   腸内微生物組成は環境タイプ間、および飼育下と自由生活下の間で有意な変動が観察され、環境タイプが変動の最も大きな割合を説明した（図1a、表2）。環境タイプ（p = 0.012、PERMANOVA）および条件（p = 0.012）の結果は統計的に有意であり、使用した非類似度メトリックに頑健であった（加重および非加重のUniFrac結果は表2；電子補足資料、図S2を参照）。自由生活個体群内では、都市部と未開発部の構成が有意に異なっていた（p = 0.001）。さらに、環境タイプ（p = 0.003、並べ替え検定、ホルム補正）、条件（p = 0.003）、サンプルタイプ（p = 0.003）の間で、サンプルの分散が有意に異なることがわかった。個体群間の地理的距離は、Bray-Curtis非類似度とは相関しなかった（p = 0.82、マンテル検定；電子補足資料、図S3）。
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   多様性の指標であるシャノン指数とASVリッチネスは、どちらも環境タイプ間で有意な差があった（p < 0.005、クラスカル・ワリス検定）が、条件やサンプルタイプ別に分析するとどちらも有意な差は見られなかった（p > 0.1）。自由生活する都市集団の平均細菌多様性と濃度は最も低く、濃度は他の環境タイプごとに少なくとも1つの集団より有意に低かった（p＜0.05、ホルム調整ダン検定）。未開発環境のシカマウスの細菌多様性とリッチネスは、飼育下のシカマウスと差がなかった（p > 0.1、図1b）。細菌負荷量も環境タイプ（p < 0.001、Kruskal-Wallis検定、図1c）および飼育条件（p < 0.001）間で有意差があったが、サンプルタイプ（p = 0.1）では差がなかった。2つの集団、都市部と未開発部では、他のすべての集団よりも細菌量が有意に少なかった（p < 0.05、ホルム調整ダン検定）。
   住環境に関連する特定の分類群を同定するために、バイアス補正（ANCOM-BC）を用いた存在量の差検定を次数レベルで実施した。未開発環境と都市環境、飼育動物園環境、飼育実験室環境をペアワイズで比較した（図2）。3つの比較のすべてにおいて、未開発環境のシカマウスはビフィズス菌が濃縮され、Deferribacterales、Desulfovibrionales、Micrococcalesおよび4つのFirmicutesの目数が減少した。都市のシカマウスで濃縮された9つの目のうち、すべての目が少なくとも1つの飼育環境でも濃縮されていた（電子補足資料、図S4）。
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4. 考察
   実験室、動物園、都市環境はすべて、動物が食餌の変化、ストレス、ヒトや建築環境からの細菌への曝露を経験する可能性のある場所であり、腸内細菌叢の構成に影響を与えると予想される要因である。このような共通点があるにもかかわらず、動物園と実験室の飼育下シカマウスの腸内細菌叢は都市部のシカマウスの腸内細菌叢と類似していなかった。すべての環境において、いくつかの細菌群が濃縮されるパターンが観察されたが、最終的にはそれぞれの環境が存在する細菌を独自に形成していた。
   この研究結果は、野生環境と飼育環境におけるシカマウスの腸内細菌叢を比較した唯一の研究［14］を実証し、それを拡大するものである。Schmidtらも同様に、野生と飼育下で飼育されたシカマウスのマイクロバイオーム組成に違いがあり、その中には我々が観察したようなEnterobacteralesの濃縮も含まれていた。しかし、飼育が腸内微生物の多様性に及ぼす影響や、Deferribacterales属やDesulfovibrionales属など他の分類群の存在量については、我々の知見とは異なっていた。我々は個体群レベルで特徴的な微生物特性を発見したが、これは地域の生態学的特性も野生および飼育下のマイクロバイオームを形成する上で重要であることを示している。このような微細な変動は、多くの宿主種に関する文献で示されているように、濃縮された分類群や多様性が増加するか減少するかという点で、飼育による効果が一貫していないという一般的な知見の一因となっている可能性が高い（[27]に総説あり）。
   飼育下の個体群に注目すると、実験室と動物園のシカマウスのサンプルは、腸内微生物の組成と多様性においてほぼ同様であることがわかった。私たちの知る限り、これは他の種では示されていない。私たちがサンプルとした3つの飼育環境は、提供される住居、食事、医療ケアに違いがあり、またシカマウスの飼育期間や元の個体群にも違いがあった。動物園で飼育されている個体群の微生物叢は、同じ動物園で飼育されている都市部の個体群の微生物叢よりも、取り扱いが制限され、より自然な食餌を与えられているにもかかわらず、実験室の個体群の微生物叢にはるかに類似していた。このことは、飼育下で自然環境を模倣しようとしても、飼育下微生物叢への移行を防ぐには十分でない可能性を示唆しており、最近の別の研究［28］とも一致している。飼育下個体群間の微生物叢の差が小さいことは、異なる業者や異なる施設で飼育された実験用マウスがそれぞれ異なる微生物叢を持つという知見と類似している［29］。
   対照的に、都市部のシカマウスは、飼育環境由来のマウスと比較して腸内細菌叢がかなり異なっていた。都市部のマウスは他の環境と比較して、一般的にβ分散性が高く、細菌量が少なく、多様性も低かった（細菌量が少なかった未開発の個体群を除く）。しかし、腸内組成はASVレベルでは非類似であったものの、未発達マウスと比較して、飼育マウスと多くの濃縮された目数を共有していた。これまで都市部のシカマウスの腸内細菌叢を他のマウスと比較した研究はない。他の動物を対象とした研究では、一般的に未発達の動物と都市部の動物ではマイクロバイオーム組成が異なり、都市部の個体群の方が多様性が高いことが分かっている[4]が、やはり都市部と飼育下の動物を比較したデータは不足している。
   都市部のシカマウスの特徴や、飼育下個体群の類似性から、腸内細菌叢に対する地理的な影響よりも環境の種類が優先するという結果が導き出された。哺乳類の腸内微生物組成を形成する上で、地理的位置が大きな役割を果たすことは以前にも示されており[2,30]、飼育下と野生のキツネザルに関する最近の研究[8]のように、環境タイプのシグナルを凌駕することもある。数州離れた未開発の場所に生息する2つの個体群が類似していることから、本研究では地理的要因の影響が限定的であることが確認された。
   腸内細菌叢に影響を与えることが知られているその他の要因（例えば[2,31]）は、我々の研究の限界とサンプリング・メタデータのギャップにより、我々の分析の範囲外である。亜種はマウスの腸内細菌叢に影響を与えることがあるが[32]、常に影響を与えるわけではない[33]。我々はCL1に収容された2つの亜種間で最小限の差異しか観察しなかったが、完全な亜種データがないため、包括的な分析はできなかった。性差の影響を調べるには十分なデータがなかったが（性差が判明している個体群は均等に分布していた）、性差は一般的にげっ歯類のマイクロバイオーム変動のごく一部を説明する[34]。対照的に、季節がマイクロバイオームを形成することはよく知られているが、これは主に季節的な食餌変動によるものと考えられる［35］。ほとんどのサンプルが夏季に採取されたため、季節性がこの結果の形成に関与したとは考えられない。実験室で飼育されている2つの個体群のサンプルは冬に採取されたが、これらのシカマウスは年間を通して一定の餌を摂取しているため、季節による変動は少ないはずである。
   私たちがサンプリングした都市部の個体群は特異的と考えられる可能性があるため、より広範な推論を行うには限界がある。動物園は高度に工業化されたアメリカの主要都市にあり、すべての個体は人間が居住する建物内に捕獲されたが、動物園敷地内の環境暴露は典型的な都市環境を代表するものではない可能性がある。例えば、シカネズミが動物の囲いに出入りできたかどうかは不明である。他の研究では都市部のシカマウスの腸内マイクロバイオーム配列は発表されていないため、今回の結果がどの程度代表的なものであるか評価できない。
   都市部の微生物叢が特異的であることについては、自然食と人工食を組み合わせた食事、屋内外の環境細菌への曝露、都市環境に伴うストレスなど、いくつかの可能性が考えられる［36］。現時点では、これらの要因の潜在的な影響を切り離すことはできない。食餌とストレスの両方が、都市環境や飼育環境において腸内微生物組成に影響を与えることが示されている［36,37］が、これらがシカネズミのシステムにどのように、どの程度影響を与えるかは不明である。
   今回観察された組成や多様性のパターンについて特定の理由を特定することはできないが、都市部の動物の微生物相が飼育動物のそれと似ていないという結果は、野生動物とその微生物に対する人為的影響を調査する今後の研究にとって貴重な出発点となる。さらに、今回の結果は実験動物の限界を浮き彫りにし、マイクロバイオーム研究のモデルとしての動物園動物の限界を新たに浮き彫りにした。マイクロバイオーム研究の結果を、飼育環境を超えて、他の人為的環境まで含めて解釈する際には注意が必要である。

5. 結論
   我々の解析は、複数の異なる開発環境が単一種のげっ歯類の腸内細菌叢にどのような影響を与えるかを比較した初めての結果を提供するものである。我々は、飼育下、都市部、未開発環境のシカマウスの腸内細菌叢がそれぞれ異なることを示した。開発された環境における微生物組成を形成する要因は複雑であり、地理的近接性やヒトとの接触といった環境間の類似性は、特定の「開発された」微生物群集を付与するものではない可能性がある。
   倫理
   放し飼いシカマウスのサンプル採集は、UN1地点についてはピッツバーグ大学IACUC（プロトコル番号18041349）およびペンシルベニア州狩猟委員会（科学研究許可番号43113）、UN2地点についてはノースカロライナ大学グリーンズボロIACUC（プロトコル番号20-008）、FUおよびCZ地点については野生動物保護協会IACUC（プロジェクト番号20:03）の承認を得た。研究室でのサンプリングはハーバード大学（CL1）とサウスカロライナ大学（CL2）のコロニー維持のための常設プロトコルに従った。
   データ入手
   シーケンスデータはENA（アクセッション番号：PRJEB51510）から入手可能。
   著者らの貢献
   J.D.：形式的解析、調査、方法論、可視化、執筆-初稿および執筆-校閲・編集、K.H.R.：概念化、調査、執筆-校閲・編集、A.T.R.：概念化、データキュレーション、調査、方法論、プロジェクト管理、監督、執筆-校閲・編集。
   すべての著者が出版を最終的に承認し、そこで行われた仕事について責任を負うことに同意した。
   利益相反宣言
   利益相反がないことを宣言する。
   資金提供
   本研究は資金提供を受けていない。
   謝辞
   Julie SegreとNick Salafskyに感謝する。Sam Fontaine、Hopi Hoekstra、Christopher Kirby、Kevin Kohl、Bryan MacLean、Pat Thomasの各氏には、本研究のためにサンプルを提供していただいた。また、初期の原稿に意見を寄せてくれたReese研究室のメンバーにも感謝する。また、2名の匿名の査読者からも有益な示唆をいただいた。データ処理と統計解析にはSan Diego Supercomputer Center Triton Shared Computing Cluster (https://doi.org/10.57873/T34W2R)を使用した。
   脚注
   電子補足資料はhttps://doi.org/10.6084/m9.figshare.c.6448680。
   © 2023 The Authors.
   Creative Commons Attribution License http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/。原著者および出典のクレジットを明記することを条件に、無制限の使用を許可する。
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