病原体とプロバイオティクスの陰と陽：Salmonella enterica sv. TyphimuriumとBifidobacterium infantisの共感染における相互作用

哉百名

2024年5月16日 18:10

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オリジナル研究記事
Front. 微生物学、2024年5月15日
Sec.感染病原体と疾患
第15巻 - 2024年｜https://doi.org/10.3389/fmicb.2024.1387498
この論文は次の研究テーマの一部です。
Infectious Agents and Diseaseにおける洞察： 2023
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病原体とプロバイオティクスの陰と陽：Salmonella enterica sv. TyphimuriumとBifidobacterium infantisの共感染における相互作用

https://www.frontiersin.org/journals/microbiology/articles/10.3389/fmicb.2024.1387498/full?utm_source=S-TWT&utm_medium=SNET&utm_campaign=ECO_FCIMB_XXXXXXXX_auto-dlvrit

クレア・ショーClaire Shawバート・C・ワイマーBart C. Weimer
バート・C・ワイマー*リード・ガンリード・ガンプレラック・T・デサイプレラック・T・デサイジグナ・D・シャージグナ・D・シャー
100K病原体ゲノムプロジェクト、カリフォルニア大学デイビス校、カリフォルニア州デイビス、米国、獣医学部、人口健康・生殖学科
プロバイオティック細菌は、抗菌剤耐性腸内病原体を制御するための抗生物質の代替物として提案されている。このアプローチのメカニズムの詳細は、病原体の減少が菌株や生態系に依存すると考えられることもあり、不明な点が多い。ここでは、一般的なプロバイオティクス属であるラクトバチルス（Lactobacillus）およびビフィドバクテリウム（Bifidobacterium）を含む5種類のプロバイオティクス菌株について、サルモネラ・エンテリカ（Salmonella enterica sv. Typhimuriumの上皮細胞への結合を減少させた。ビフィドバクテリウム・ロンガム・サブスピーシーズ・インファンティスは有望な菌株として浮上したが、上皮細胞におけるS. Typhimuriumの感染結果は接種順序に依存しており、ビフィドバクテリウム・ロンガム・サブスピーシーズ・インファンティスは宿主細胞を先行感染や同時感染から救うことができなかった。我々はさらに、遺伝子発現とメタボロミクスによる代謝変化を含むマルチオミクスアプローチを用いて、B. infantis、S. Typhimurium、上皮細胞の間のこの相互作用の根底にある複雑なメカニズムを調べた。B. infantisとのインキュベーションは、上皮細胞においてアポトーシス経路を抑制し、抗炎症カスケードを誘導した。一方、S. Typhimuriumでは、B. infantisとの同時培養により、病原性因子の発現が増加し、嫌気性代謝が誘導され、アルギニン代謝の構成因子が抑制され、代謝プロファイルが変化した。プロバイオティクスと病原体を同時に適用すると、代謝プロファイルは病原体よりもプロバイオティクス単独の代謝プロファイルに近くなることが顕著であり、プロバイオティクス-病原体-宿主の相互作用の調節において代謝が中心的な役割を果たすことを示している。これらのデータを総合すると、上皮細胞、病原体、プロバイオティクス間の低分子を介したクロストークが、プロバイオティクスと病原体の相互作用に特異的な分子メカニズムを一貫して示していることが示唆される。

はじめに
腸内細菌叢は腸内感染に対する防御の第一線を担っている。この不可欠な微生物群集は、腸内病原体が疾患を引き起こす機会を提供する食事や局所的な生態学的要因によっても容易に破壊される（Ducarmon et al.）群集の擾乱後に正常な腸内細菌叢を維持または再確立するためのメカニズムとして提案されているのが、プロバイオティクス細菌の使用である（Gareau et al.）プロバイオティクスの重要な利用法として認められているのは、腸内感染症の制御であり、多剤耐性病原体の増加やそれに伴う有効な抗生物質の減少を考えると、これは特に時宜を得たものである（Patonら、2006；Kulkarniら、2022）。プロバイオティクスの調節のための注目すべき候補のひとつは、多剤耐性の食中毒病原体であるサルモネラ・エンテリカ（Salmonella enterica sv. Typhimuriumである。この病原菌は、世界中で年間8000万件以上の食中毒を引き起こし、乳幼児の死亡率に特に脅威を与えている（Gong et al.）世界的に、腸内病原菌の負担は乳幼児層で特に顕著であることは、小児の疾病発生率を調査した大規模コホート研究（Majowiczら、2010；Kotloffら、2013；Kasumbaら、2021；Kotloff、2022）からも明らかである。現在プロバイオティクス開発の対象集団となっているこのハイリスク乳幼児集団において、サルモネラ菌による下痢は、特に低・中所得国において、治療せずに放置すると重篤で致命的な健康被害をもたらす可能性のある、特に注目すべき問題である（CDC, 2008; Majowicz et al.）多剤耐性株の進化に伴い抗菌薬耐性が増加しているため、腸疾患に対する抗生物質の代替療法を見つけることが急務であり（Nairら、2018；NARMS、2023）、プロバイオティクスはそのような代替療法の1つになると考えられている。

プロバイオティクス生物が腸内感染症を緩和するメカニズムはまだ十分に解明されていないが、現在の文献によれば、プロバイオティクスは免疫刺激剤としての作用、生理活性代謝産物の産生、腸内pHの調節、感染に使用される栄養素の競合、宿主受容体の物理的遮断、またはこれらの活性の組み合わせによって感染症を緩和する可能性が示唆されている（Lebeerら、2008；Iqbalら、2021）。いくつかのプロバイオティクスの免疫調節作用の可能性を支持するものとして、マウスモデルにおけるS. Typhimurium感染に関するある研究では、Lacticaseibacillus caseiプロバイオティクス投与が好中球浸潤と炎症を減少させるだけでなく、腸管内腔におけるS. Typhimurium特異的IgAの放出を増加させることが示された（de LeBlanc Ade et al.）他の研究では、プロバイオティクスの有効性とそのメカニズムが、状況や宿主に特異的であることを示唆する、相反する結果が得られている。サルモネラ症モデルマウスにB. longumを投与した研究では、プロバイオティクスの投与により生存率は上昇したが、病原体の糞便排出には影響がなかった（Silva et al., 2004）。これらの結果を総合すると、分子シグナル伝達は感染パラダイムの一部であり、細菌間の大きなゲノム変異に代表される菌株変異に支配される可能性のある、不明確な生物学的法則を持つことが示唆される（Arboleya et al.）これまでの知見から、プロバイオティクスはサルモネラ症の治療戦略の可能性が示唆されているが、適応性や対象環境への適合性が異なるなど、独自の課題がある（Yuら、2013；Mercer and Arrieta、2023；Thormanら、2023）。腸内細菌のコロニー形成に対して成功する可能性を最大限に高めるためには、プロバイオティクスはその標的環境から隔離された、適切な適合性を有していなければならない。この点を考慮すると、ビフィズス菌は、サルモネラ菌に感受性のある乳児集団におけるプロバイオティクスの選択肢のひとつとなる（Mills et al.）

ビフィズス菌は、大腸菌、ブドウ球菌、レンサ球菌を含む他の常在菌とともに、乳児の腸の初期コロニー形成者の1つである（Muellerら、2015；Secherら、2016；Stewartら、2018）。生後2週間の乳児の糞便微生物叢の約40～60％はビフィドバクテリウム種であるが、粉ミルクで育てられた乳児の中には検出可能なビフィズス菌がいない乳児もいる一方で、母乳で育てられた乳児の便微生物叢には最大90％のビフィズス菌が認められる乳児もいる（di Gioia et al.）このようなビフィズス菌の乳児腸に対する特異性（LoCascioら、2010；Marcobalら、2011；Freseら、2017）と、サルモネラ症を緩和または予防するいくつかの種の能力とが相まって、ビフィズス菌は乳児用プロバイオティクスの有力な候補となっている。ビフィズス菌がどのようにサルモネラ菌を抑制するのか、そのメカニズムを解明することが不可欠である。ビフィズス菌のようなプロバイオティクスの潜在的有効性を理解する上で重要なのは、宿主、病原体、宿主粘膜の腸内マイクロバイオーム間の相互作用について理解を深めることである（Turroni et al.）

多くの研究が、プロバイオティクス、常在菌、または病原体が宿主に及ぼす個々の影響を解明しようとしているが、宿主界面におけるプロバイオティクスと病原体の相互作用は、サルモネラのゲノム変異（Gupta et al、 2019）、ビフィズス菌の株変異（LoCascio et al., 2010; Díaz et al., 2021）、年齢層間の腸内生態系の変異（Voreades et al., 2014; Laforest-Lapointe and Arrieta, 2017）などによって複雑化している。種間コミュニケーション（すなわち、群集クロストーク）が腸内病原体の病原性遺伝子の発現に何らかの制御を及ぼしていることを示唆する文献が着実に増加していることから、こうした相互作用の生化学的およびゲノム学的基盤を明らかにする必要性がさらに強調されている（Kendall and Sperandio, 2007; Shaw et al.）例えば、サルモネラ菌において広く保存されているクオラム応答転写因子sdiAによる化学的シグナル伝達を介して、近隣の腸内微生物が微生物の活動を調節すること（Pritnick et al.、2021年）は、小代謝産物を介した微生物-微生物相互作用が、腸内病原菌の感染プロセスにおいて、またプロバイオティクス相互作用に対する反応においても重要な因子である可能性を示唆している（Thompson et al.、2016年）。

一部のプロバイオティクス細菌は、生理活性代謝産物の産生と制御を介して、宿主の健康へのプラス効果を増強することが示唆されている（Indira et al.）代謝調節もまた、サルモネラ感染の成功を決定する要因である（Ilyasら、2017；Herero-FresnoおよびOlsen、2018）。サルモネラは、病原性獲得のために宿主の代謝を操作することが知られている、代謝的に柔軟な腸内病原体である（Hume et al.）サルモネラ感染制御における代謝の重要性が知られていることを考慮すると、プロバイオティクス投与による宿主-微生物代謝ランドスケープの調節の可能性は、調査すべき特に興味深いメカニズムである。

ここでは、B. infantisを腸管上皮細胞に添加することで、S. Typhimuriumの感染関連代謝応答に影響を与え、宿主細胞への接着と浸潤が抑制されるという仮説を立てた。その後、我々はB. infantisとS. Typhimuriumの関係は、B. infantisがS. Typhimuriumの病原性を減弱させる能力に影響する接種の順序（同時添加、時差添加、共培養）などの複数の要因に依存していた。本研究では、宿主、プロバイオティクス、病原体の遺伝子発現の評価、および低分子代謝物のプロファイリングを通して、プロバイオティクスと病原体の相互作用の複雑さを探求し、最終的にB. infantisの宿主保護効果は、種および状況に依存することを明らかにした。これらのデータを総合すると、プロバイオティクスの効能は狭い環境の存在に依存することが示唆され、したがって、臨床使用に先立って、今回示されたような実験室環境において、より詳細に検討する必要がある。

結果
プロバイオティクス菌株の選択
ビフィドバクテリウム・ロンガム属インファンティス（ATCC 15697）、ラクトバチルス・アシドフィルス（NCFM）、ラクトカセイバシラス・カゼイ（ATCC 334）、ラクトバチルス・ガッセリ（ATCC 33323）、レビラクトバチルス・ブレビス（ATCC 367）の5種類のプロバイオティクス菌について、S. Typhimurium感染時の病原体排除能を試験した。Typhimurium感染時の病原体排除能を、分化大腸上皮細胞（Caco2）を用いて試験した（図1A）。すべての菌株は、サルモネラの付着を有意に（p < 0.045）減少させる能力に差があった。試験した5株のうち、B. infantisはサルモネラの上皮細胞への接着を有意に（p < 0.05）減少させる能力を最も示したので、この減少の根底にある潜在的な分子機構をさらに評価するために選択された。

図1
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図1. S. TyphimuriumによるCaco2細胞への接着と浸潤。(A) サルモネラ菌の宿主結合を阻害する様々な菌株の有効性。はコントロール（サルモネラ菌単独で培養したCaco2細胞）と比較して有意差がある（p≦0.5）。エラーバーは4反復の標準誤差を示す。(B）Caco2細胞へのS. Typhimuriumの相対的接着および浸潤に対するB. infantisの存在の効果。コントロール（Caco2細胞をS. Typhimuriumとインキュベート）；Sal-Pre + Bif（Caco2細胞をS. Typhimuriumと30分間プレインキュベートし、さらにB. infantisと30分間インキュベート）；Bif-Pre + Sal（Caco2細胞をB. infantisと30分間プレインキュベートし、さらにS. Typhimuriumと60分間インキュベート）；Sal+Bif（Caco2細胞をS. TyphimuriumとB. infantisと一緒に60分間インキュベート）；Sal+Bif Incubated（S.TyphimuriumとB. infantisをまず一緒に60分間インキュベートし、その後Caco2細胞と120分間インキュベート）。アルファベットが同じでないものは有意に異なる（p≦0.05）。x軸の％数字は、宿主に関連した細菌全体のうち、細胞内に侵入した（invaded）細菌の割合を示す。エラーバードは3反復の標準誤差を示す。

B. infantisはS. Typhimuriumの大腸上皮細胞への接着を変化させた。
B. infantisがS. Typhimuriumを置換、阻止、凌駕する能力を、in vitroでB. infantisとS. Typhimuriumの両方を分化した大腸上皮細胞に添加する時点と培養時間を変えて試験した（図1B）。サルモネラ菌に感染した上皮細胞にB. infantisを添加しても、病原体が宿主細胞に侵入する能力や感染の拡大を抑制する効果は認められなかったことから、B. infantisはすでに付着しているサルモネラ菌を追い出したり、感染を抑制したりすることはできないと考えられた。対照的に、S. Typhimuriumを添加する前にB. infantisを上皮細胞に添加すると、S. Typhimuriumの付着と浸潤が有意に減少した（p < 0.05）。興味深いことに、S. TyphimuriumとB. infantisを60分間共存させると、S. Typhimuriumによる宿主との会合が他の組み合わせの処理と比較して有意に増加した（p < 0.05）。

B.インファンティスをS.チフス菌の前あるいは同時に添加した場合にのみ宿主を保護するという結果は、S.チフス菌が宿主膜に結合し侵入するのを妨げる物理的排除機構が関与している可能性を示唆している。この一見正反対の結果が、宿主細胞のレセプターに対する病原体と抗生物質の競合に起因するものであるかどうかを調べるために、Caco2細胞におけるサルモネラの接着と浸潤に重要なレセプター（HSP90、PPP1R12A、CTNN1A、ガングリオシドGD3、ガングリオシドGM1）（Desai, 2011）を、B. infantisまたはS. Typhimuriumのいずれかを添加する前に抗体を用いてブロックした（補足図S1）。試験した他のレセプターとは異なり、宿主のガングリオシドGM1をブロックすると、ブロックしていない対照条件と比較して、B. infantisの接着が25％減少した（p = 0.05）（補足図S1）から、B. infantisとS. Typhimuriumはこの特異的な宿主レセプターと競合して結合する可能性がある。注目すべきことに、宿主の炎症カスケードを制御する同じガングリオシドGM1レセプターにS. TyphimuriumとB. infantisが結合すると、上皮細胞における下流の発現パターンは正反対になった（補足図S2）。

オートクラインシグナル伝達ループとアポトーシス経路はB. infantisとの結合によって制御されている。
GM1を含む宿主ガングリオシドレセプターは、炎症反応の重要な調節因子であり、病原体の侵入に対する反応の編成に関与している（Parkら、2023）。IL-6カスケードのようなオートクラインシグナル伝達におけるガングリオシドGM1レセプターの関与と、B. infantisがこのレセプターに親和性を示すことから、B. infantisがヒトの上皮細胞と結合することで、宿主を保護する他のシグナル伝達カスケードが始まると考えられた。B.インファンティスと120分間インキュベートした上皮細胞では、4種類のGCPRリガンド（CXCL1、CXCL2、CXCL3、CCL20）およびIL-6とともに、正統的なGタンパク質共役型受容体経路（GPCR）が有意に誘導された（adj-p≦0.04）（表1；補足表S1）。さらに、リン酸化STAT3の正の転写制御下にあるIL6シグナル下流の遺伝子も誘導された（adj-p≦0.00）（表2）。まとめると、この誘導された遺伝子群は、B. infantisとの結合の結果、上皮細胞におけるオートクラインシグナル伝達ループを刺激した可能性が高い。

表1
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表1. B. infantisおよびS. Typhimuriumに暴露されたCaco2細胞において、差次的に制御されたGO遺伝子セット（adj-p≤0.21）。

表2
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表2. B. infantisに暴露したCaco2細胞において、差次的に制御された（adj-p≦0）転写制御因子トップ10。

宿主のオートクラインシグナル伝達に対するB. infantisの顕著な効果から、感染に関連する他の上皮細胞経路のプロバイオティクスによる調節の可能性を検討した。上皮細胞におけるアポトーシスシグナル伝達経路は、B. infantisを120分間暴露した後（図2）、およびB. infantisとともにS. Typhimuriumを添加した場合（補足図S3）と同様に、細胞死経路の抑制を一般的に示した。これに関連して、B. infantis投与は上皮細胞における全体的な基底カスパーゼ発現を有意に低下させ（adj-p < 0.05）、サルモネラ菌が介在するカスパーゼ活性の上昇を阻止した。遺伝子発現レベルでのカスパーゼ制御のこの観察は、ser473とthr308のAktリン酸化状態の測定によってさらに確認された（補足図S4）。これらのデータを総合すると、宿主のアポトーシスシグナル伝達の制御が、サルモネラ感染の成功とB. infantisが感染経過を変化させる能力を決定する重要な因子であることがわかる。

図2
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図2. 上皮細胞がB. infantisに暴露された際の、発現差のある遺伝子の対数2比（adj-p≦0.1）；カスパーゼ8、9、3/7活性およびAktのリン酸化状態。遺伝子発現データについては、上皮細胞をB. infantisに暴露したときの遺伝子の誘導を赤、抑制を青で示す。

S. チフス菌は宿主におけるB.
上皮細胞をB. infantis単独でインキュベートすると、上皮細胞に対する複数の保護作用が誘導されたが、S. Typhimuriumの存在下でもこれらの同じ経路が誘導され続けるかどうかは不明であった。異なる処理のグローバル遺伝子発現プロファイルを時系列として平均したものを階層的クラスタリングした結果、S. TyphimuriumとB. infantisを同時に感染させた上皮細胞のトランスクリプトームは、S. Typhimurium感染細胞のトランスクリプトームよりも、B. infantis単独処理のトランスクリプトームに類似していることが示された（adj-p < 0.01）（図3A）。S.チフス菌の添加にもかかわらずB.インファンティスが宿主細胞の発現を調節するこの能力は、本研究で調べたすべての遺伝子またはパスウェイで一貫していたわけではない。B. infantis単独で誘導された細胞接合部のGOカテゴリーにアノテーションされた遺伝子は、S. Typhimuriumの存在下では対照的に有意に抑制された（adj-p≦0.13）（表3；補足表S2）。サルモネラがB. infantisの培養による宿主保護効果に勝るということは、遺伝子発現調節を変化させるより多因子的なメカニズムが存在し、プロバイオティクスの相互作用と比較して、病原体が発現調節により大きく寄与することを示唆している。

図3
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図3 （A）Cac02細胞のグローバル遺伝子発現プロファイル間の類似性を可視化したデンドグラム。各クラスターエッジの数字は、1,000回のマルチスケールブートストラップ再サンプリングによって推定された約不偏％p値を表す。(宿主＝微生物なしでインキュベートしたCac02細胞、宿主＋Bif＝B. infantisとインキュベートしたCac02細胞、宿主＋Sal＝S. TyphimuriumとインキュベートしたCac02細胞、宿主＋Bif＋Sal＝B. infantisとS. Typhimuriumを1：1の割合で同時にインキュベートしたCac02細胞。分単位の時間は、遺伝子発現を測定した感染後の時間を表す。(B) すべての宿主微生物相互作用サンプルの低代謝物プロファイルを階層的クラスタリングにより構築したデンドグラム。各クラスターエッジの数字は、1,000 回のマルチスケールブートストラップ再サンプリングによって推定された約不偏％p 値を表す（宿主＝Cac02、Bif＝B. infantis、Sal＝S. Typhimurium）。分単位の時間は、代謝物プロファイルを決定した感染後の時間を表す。「E」は培養上清の細胞外代謝物プロファイルを表し、「I」は共培養の全細胞の細胞内代謝物プロファイルを表す。

表3
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表3. B. infantisに暴露されたCaco2細胞において、差次的に制御されたGO遺伝子セット（adj-p≦0.21）。

S. Typhimurium virulence factors were induced by B. infantis during co-culture
S. TyphimuriumがB. infantisの潜在的な宿主保護機構を無効にする能力を説明する1つのメカニズムは、病原体とプロバイオティクスの共培養に反応してサルモネラの病原性因子が誘導されることである。時系列遺伝子発現実験（30分、60分、120分）（図1B）により、III型分泌系（T3SS）をコードする遺伝子（SPI1 T3SS (adj-p ≤ 0)、SPI2 T3SS (adj-p ≤ 0.04)）、および両T3SSのエフェクター（adj-p < 0.05）が、上皮細胞とは無関係に、B. infantis共存培養条件下で有意に誘導されることが明らかになった（補足図S5）。B. infantisとの共培養でT3SSとその構成部分の発現が増加したことは、B. infantisが環境シグナルを共有することでS. Typhimuriumの病原性を増強したことを示唆している。S. Typhimuriumが局所的な環境を感知するメカニズムのひとつに、2成分系を利用することが挙げられる。サルモネラ菌（Merighi et al., 2009）の病原性に関連する2成分系（QseとSsrAB）は、宿主細胞の存在に関係なく、B. infantisの存在下で誘導された（adj-p≦0.09）（補足表S3, S4）。

B. infantis存在下でT3SSと関連する2成分系の両方が有意に誘導されたことから、このプロバイオティック生物は、サルモネラの病原性を複数の経路で呼び起こすだけでなく、共存培養中の環境的な合図にも反応することが示唆された。これらの環境的手がかりは、サルモネラ菌だけでなくB. infantisの遺伝子発現も変化させた（補足表S5）。興味深いことに、サルモネラ菌が存在すると、B. infantisはinfantis亜種でのみ保存され、分岐したlongum亜種では保存されていない遺伝子を顕著に制御した（補足図S6；補足表S6）。この遺伝子セットの制御は水平的に獲得されたものであり、亜種infantisに特有のものであることから、今回観察されたB. infantisの影響はこの分類群に特異的であることが示唆される。サルモネラの病原性因子とB. infantisの水平獲得遺伝子セットの共同制御は、培養順序の重要性とともに、プロバイオティクス-病原体相互作用の結果には局所環境の変化が不可欠であることを浮き彫りにし、小分子を介した細菌のクロストークが腸内感染において重要であることを浮き彫りにした（表4）。

表4
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表4. B. infantisに暴露されたCaco2細胞において、差次的に制御された経路（adj-p≦0.05）。

小分子は遺伝子発現と細菌結合を媒介する
本研究の結果は、代謝と相互作用の表現型を変化させるS. Typhimurium、B. infantis、および上皮細胞間の細胞挙動の3要素を媒介するクロストークを、複数のメカニズムが仲介していることを一貫して示している。本研究で観察されたS. Typhimurium病原性遺伝子の誘導、宿主レセプターGM1に対する競合、および全遺伝子発現の変化は、S. Typhimurium感染の進行が、宿主レセプター結合に対する単純な細菌の競合よりも複雑な方法で、B. infantisと上皮細胞の両方の活性に影響されることを示している。S. Typhimuriumが感染を成功させ、プロバイオティック細菌の競合を可能にするメカニズムの一つは、多面的な代謝クーデターである。

小分子が上皮細胞への細菌の接着に関連することが多くなってきている（Ghorashi and Kohler, 2020; Lin et al.）タンパク質のグリコシル化による修飾もまた、細菌の結合を媒介する役割を担っている（Barboza et al. 遺伝子発現プロファイルを補完するために、遺伝子発現に用いたのと同じ上皮細胞処理から低分子代謝物を測定した。GC/MSを用いた代謝物プロファイリングでは、binbaseデータベース（Fiehn et al., 2005）を用いて294の化合物ピークが同定され、そのうち110のGC/MSピークに同定が割り当てられた（図3）。細胞内および細胞外低分子の階層的クラスタリング（図3B）は、グローバル遺伝子発現プロファイル（図3A）と同様のパターンに従っており、S. Typhimurium単独感染は、コントロール、B. infantis単独、および混合培養処理とは別にクラスタリングされた。全化合物のlog2ピーク面積に基づく階層的クラスタリングにより、細胞外代謝物について2つのクラスタが、細胞内代謝物についてもう1つのクラスタが存在することが明らかになった（adj-p < 0.01）（図3B）。細胞外代謝物クラスター内では、サルモネラとB. infantisに共感染した上皮細胞は、B. infantis単独で処理した上皮細胞と一緒にクラスター化した（adj-p > 0.0.05）。S. Typhimuriumに感染した上皮細胞は、60分後と120分後にユニークなクラスターを形成し（adj-p < 0.01）、感染進行の軌跡が分岐していることを示した。一般に、S. TyphimuriumとB. infantisを共感染させた上皮細胞の遺伝子発現プロファイルと細胞外メタボロームは、S. TyphimuriumよりもB. infantisで処理した細胞のものに類似していた。

要約すると、遺伝子発現と代謝プロファイルは、B. infantisとの関連によって宿主保護効果が増強されるものの、S. Typhimuriumによってその正の調節が一部上書きされるという、局所的に微妙なプロバイオティクス効果の複雑な図を描いている。この微妙な性質は、B. infantis単独培養とB. infantis/S.Typhimurium併用培養と同様に、局所環境が宿主反応を媒介するという継続的な観察結果を浮き彫りにしている。typhimuriumの組み合わせで培養した場合と比較している。これらの直交する一貫した観察から、S.チフス菌と上皮細胞の存在がB.インファンティスの活性も変化させるに違いないという仮説を立てた。

S.チフス菌感染の経過はB.インファンティスの存在によって変化した。
プロバイオティクスの相互作用に代謝制御が関与している可能性を裏付けるのは、共培養パートナーに反応してサルモネラの代謝が著しく変化したことである。宿主とサルモネラの共培養にB. infantisを加えると、S. Typhimuriumのアルギニン異化遺伝子が抑制された（図4）。この抑制は低分子プロファイルにも反映され、B. infantis添加によりアルギニンとオルニチンが蓄積し、それに対応してプトレシンが枯渇した。対照的に、B. infantis非添加のサルモネラ／上皮細胞共培養では、アルギニンの枯渇が観察された。B. infantisが存在するとアルギニンが蓄積し、一酸化窒素（NO）産生の基質プールが増加することが示唆され、サルモネラの病原性亢進につながるメカニズムが明らかになった（Heithoff et al.） NO代謝の主な経路は、亜硝酸（NO2-）と硝酸塩（NO3-）への段階的酸化である（Lundberg et al.） B. infantisの存在下、サルモネラ菌では硝酸塩および亜硝酸塩の還元に関連する9つの遺伝子が有意に誘導された（adj-p≦0）（図4、「嫌気性代謝」）。B.インファンティスと共培養したサルモネラ菌では、硝酸塩および亜硝酸塩還元酵素の活性に必要な補酵素の合成経路に必要な遺伝子も有意に誘導された（adj-p≦0）（表5、「補酵素の生合成-合成基-および担体-モリブドプテリン」）。サルモネラ菌と共培養した場合、B. infantisが介在する硝酸塩および亜硝酸塩還元酵素の誘導は、上皮細胞の存在下でのみ起こった。サルモネラ菌における硝酸塩および亜硝酸塩還元酵素の誘導は、おそらく一酸化窒素代謝であろう、上皮細胞代謝の下流効果である可能性が高いことを示しているが、細胞三者間の代謝相互作用の複雑さを浮き彫りにし、エネルギー循環を調査することになった。

図4
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図4. Cac02細胞をS. Typhimurium単独またはS. TyphimuriumとB. infantisの共培養で処理したときの、S. Typhimuriumの遺伝子発現強度と選択した小代謝物ピーク面積の対数2比。遺伝子の誘導は、B. infantis非存在下と比較して、B. infantis存在下でサルモネラ菌において遺伝子が誘導されたことを示す。

表5
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表5. S.Typhimuriumを上皮細胞とインキュベートした場合と、上皮細胞およびB. infantisと120分間インキュベートした場合とで、制御された遺伝子セットの差（adj-p≤0.09）。

さらに、B. infantisを宿主/S. Typhimurium共培養にB. infantisを加えると、TCAサイクルをコードするサルモネラ遺伝子が抑制され（adj-p≦0.09）、対照的に嫌気性代謝に必要な遺伝子が誘導された（adj-p≦0）（表5；図4）。ミトコンドリア呼吸鎖機能に必要な遺伝子も、B. infantisの宿主／病原体共培養への添加により、上皮細胞で抑制された（表2、3）。B. infantisの添加により、上皮細胞とS. Typhimuriumの両方で呼吸に必要な遺伝子が抑制された。呼吸の抑制は、プロバイオティクスと病原体の共培養による上皮細胞の少量代謝産物プールにも反映された。S. Typhimuriumと宿主細胞をB. infantisとインキュベートすると、細胞外および細胞内にグルコース、フルクトース、トレハロース、マルトース（adj-p < 0.05）が有意に蓄積した。グルコース-6P、ピルビン酸、クエン酸も同条件で有意に蓄積した（adj-p≦0.01）が、残りのTCA代謝産物（α-ケトグルタル酸、リンゴ酸、フマル酸、コハク酸）には有意な変化はなかったが、明らかな減少が観察された。B. infantisを宿主と病原体の共培養に加えると、解糖およびTCAサイクルを介した炭素フラックスが減少した。一方、サルモネラ菌を上皮細胞に単独で存在させると、解糖に関連する宿主遺伝子が誘導され、各細胞の全体的なエネルギーフラックスに影響を与えた。小代謝物の表現型解析と関連遺伝子の発現を組み合わせることで、宿主、プロバイオティクス、病原体の3者間のクロストークが代謝の共有を促進し、その結果、局所的な状況に依存した形で感染を緩和または悪化させるという、複雑な制御の網が明らかになった。

考察
本研究では、B. infantisがS. Typhimurium感染を抑制する能力をin vitroモデルで検討し、微生物-微生物間および宿主-微生物間の相互作用の根底にある特徴をさらに明らかにした。B.infantisは宿主細胞への接着と浸潤を減少させたが、S.Typhimuriumのこの有意な軽減は、B.infantisをサルモネラの前に添加した場合、あるいはサルモネラと同時に添加した場合にのみ認められた。B. infantisはすでに付着しているS. Typhimuriumを置き換えることができなかったことから、排除の一つの様式は特定の宿主レセプターに対する競合であり、ビフィズス菌がレセプターに早期にアクセスすることでサルモネラの付着が効果的に阻止されるのかもしれない。

本研究のプロバイオティクスと病原体のペアは、宿主のガングリオシドGM1レセプターに対する親和性を共有しているが、サルモネラ菌が一般的に利用する他の既知の細菌レセプターには親和性を示さない。B.インファンティスとGM1レセプターとの相互作用が観察されたことは、B.インファンティスと母乳の共進化と関連している可能性がある（Underwood et al.）種を超えた乳にはガングリオシド結合モチーフが含まれており（Cacho and Lawrence, 2017; Tan et al., 2020）、B. infantisは母乳中の複雑なオリゴ糖（HMO）を消費する遺伝的能力を備えているため、乳成分との物理的相互作用はB. infantisにとって進化的に有利である（Lawson et al.）宿主レセプターとの関連では、B. infantisによる腸管上皮のGM1レセプターへの結合は免疫系へのシグナルとして機能する可能性があり（Kimata, 1994; Mou et al., 2022）、ビフィズス菌のこのような免疫刺激作用は他の文献でも十分に報告されている（Ruiz et al., 2005; Henrick et al.）宿主ガングリオシドGM1は、他のガングリオシドレセプターと並んで、多方向性で抗炎症性のIL6を含むインターロイキンの発現を調節する（Mouら、2022）。プロバイオティクスと病原体の上皮細胞への接着による株特異的効果をさらに裏付けるものとして、サルモネラ菌におけるこれまでの研究から、宿主腸上皮が株レベルの変異を認識でき、そのような認識が下流の発現に影響を及ぼすことが示されている（Salerno-Gonçalves et al.）本研究で見られたように、IL6発現はB. infantis単独存在下で上皮細胞に誘導され、宿主保護メカニズムを増強した。サルモネラ菌の添加は、B. infantisの免疫調節活性を弱めるようであることから、B. infantisによる宿主の調節は、今回観察されたIL6/NFkB発現パターンで示されたように、腸内病原体の及ぼす圧力によって上書きされる選択的効果である可能性が示唆される。

サルモネラ菌がB. infantisの免疫調節特性を阻害する能力を裏付けるように、B. infantis単独で上皮細胞をインキュベートすると、NFkB関連サイトカインの転写が誘導された： IL6、CXCL1、CXCL2、CXCL3、CCL20である。対照的に、サルモネラ菌をモデルに加えると、これらのサイトカインの遺伝子は抑制された。サルモネラは、膨大な数のエフェクター分子を宿主細胞質に直接分泌することによって、これらのサイトカインを産生する経路を含む宿主のシグナル伝達を妨害する（Agbor and McCormick, 2011）。これらの分泌型エフェクターの一つであるAvrAは、IkBαの脱ユビキチン化によってNFkBの活性化を阻害する（Ye et al.） IkBαの脱ユビキチン化は、IL6を含むNFkB経路の標的遺伝子の抑制につながり、この傾向は本研究でも以前Yeら（2007年）でも観察された。本研究におけるNFkB関連サイトカイン遺伝子の抑制は、サルモネラ菌がB. infantisを介したNFkBの誘導を阻害したことを示しており、おそらくB. infantis存在下で誘導されたAvrA活性を介したものと考えられる。

サルモネラはB. infantisとの相互作用による宿主のサイトカイン誘導をある程度抑制することができたが、本研究で得られた活性酸素産生、細胞呼吸、ミトコンドリア生合成に関する宿主の遺伝子発現データから、B. infantisが腸内感染を軽減するために他の宿主活性を調節している可能性が明らかになった。B.インファンティスは、上皮細胞におけるミトコンドリアの機能不全と関連する代謝産物である活性酸素の調節を通して、サルモネラの病原性を部分的に軽減した。様々な病原体が、宿主のミトコンドリア機能不全を引き起こすことで細胞死を誘導することができる（Rudelら、2010；Ashidaら、2011；Leeら、2015；Ashidaら、2021）。私たちのグループの他の研究でも、サルモネラ感染時のカスパーゼ9およびカスパーゼ3/7活性化の上昇と、活性酸素の産生、呼吸、ミトコンドリア生合成に関与する遺伝子の誘導が相関しており（Shahら、2014）、カスパーゼ8およびカスパーゼ9活性は過剰な活性酸素に応答して上昇することが示されている（Fink and Cookson, 2007; Manら、2013; Shahら、2014; Hefeleら、2018）。これまでの研究で、腸内でミトコンドリアが活性酸素を産生することで、サルモネラ菌が選択的に優位に立てることが示されている。活性酸素は内腔の硫黄化合物と反応してテトラチオン酸を形成し、サルモネラ菌が呼吸に利用できるため、発酵性の腸内微生物に対して競争優位に立てるからである（Winter et al.、2010）。本研究の結果から、B. infantisは好気呼吸や電子伝達鎖の機能に必要な宿主遺伝子や経路を抑制することで、腸内での活性酸素産生を阻害している可能性が示唆された。このようなメカニズムが、今回観察されたビフィズス菌を介したサルモネラ菌に対する抵抗性に寄与している可能性があり、また以前にマウスでも見られた（Shuら、2000；HuangとHuang、2021）。

上記で詳述した宿主産生活性酸素の利用から明らかなように、S. Typhimuriumは腸内腔の代謝環境に応答し、それを制御する（Dasら、2010；AgborおよびMcCormick、2011；Gartら、2016；Herero-FresnoおよびOlsen、2018）。S. Typhimuriumによる腸内代謝環境の操作は、混雑した消化管内微生物ランドスケープにおいて、この病原体に競争上の優位性をもたらす（Taylor and Winter, 2020）。興味深いことに、代謝プロファイルのクラスタリングと特定の代謝産物におけるより具体的な変化から、宿主、病原体、プロバイオティクスの間には、代謝を介した3方向のクロストークが存在した。

Bifidobacteria infantisはS. Typhimuriumによるアルギニンの異化を阻害し、アルギニンの蓄積をもたらし、宿主のNO産生を増加させた（Wuら、2021年）。宿主のNO産生の増加は、NO代謝の産物である硝酸塩および亜硝酸塩の呼吸に必要なサルモネラ遺伝子の著しい誘導によって裏付けられている。ビフィズス菌によるサルモネラ菌のアルギニン代謝の緩和は、宿主のNO産生を促進し、次いでサルモネラ菌が硝酸塩および亜硝酸塩呼吸経路を利用するよう誘導する。ここで観察されたプロバイオティクスと病原体の間のクロストークは、プレバイオティクスの存在によってS. Typhimuriumの病原体力が変化しないか、あるいはわずかに増加したように見えた共培養条件から得られた観察結果を説明し始める。

本研究で観察されたプロバイオティクスと病原体の複雑な相互作用は、遺伝子発現を伴うNO代謝の調節によって証明され、少量代謝物プロファイルによって裏付けられたように、局所的な代謝環境に依存していた。S. Typhimurium感染上皮細胞の細胞外メタボロームは、B. infantis処理細胞またはB. infantisとS. Typhimurium同時感染細胞の細胞外メタボロームとは著しく異なっており、B. infantisによる局所代謝制御がプロバイオティクスの有効性またはその欠如の中心である可能性が示唆された。ビフィドバクテリウム・インファンティスは宿主細胞の代謝環境を変化させることができ、代謝プロファイルの階層的クラスタリングによって示されるように、S. Typhimuriumの存在下でもこの代謝制御の一部を維持することができた。このようなデータは、代謝制御がプロバイオティクスの宿主保護効果を増強する1つの経路であることを支持すると同時に、このような保護メカニズムが病原性代謝能力に大きく依存していることを示唆しており、遺伝子発現の変化、タンパク質の変化、および代謝産物が局所環境を調節することをさらに実証している。

結論として、B. infantisは大腸細胞モデルにおいて、宿主ガングリオシドGM1レセプターの物理的競合、カスパーゼ活性の調節を介した宿主細胞死経路の抑制、病原性に影響を与えるエネルギーバランスと酸化還元条件を変化させる代謝シフトを通じて、サルモネラ菌に対する防御効果を発揮した。本研究の結果は、B. infantisがサルモネラ菌感染に直面しても、すべてではないが、いくつかのプロバイオティック特性を保持していることを示唆しているが、腸内細菌叢の複雑さを加えて、これらのin-vitro観察を確認するためには、動物モデルでのフォローアップ研究が必要である。我々のモデルでは、これらの宿主保護活性は培養順序に依存していた。B. infantisは、サルモネラの後に添加しても、同時に添加しても、カスパーゼ活性を抑制できなかったからである。注目すべきことに、サルモネラの病原性に対するビフィズス菌添加の混合効果は、細菌と宿主の代謝の調節にまで及んでいた。プロバイオティクスの共培養は、サルモネラ菌によるアルギニン異化の抑制をもたらし、宿主のNO産生を促進し、最終的に病原体が宿主産生の硝酸塩と亜硝酸塩を効率的に利用するように遺伝子発現を制御することにつながった。ビフィズス菌が病原体と宿主の両方の代謝活性を変化させるという発見は、プロバイオティクスのメカニズムがニュアンスに富み、文脈に左右されることを裏付けている。これらの知見がこの組み合わせに特有のものなのか、それともプロバイオティクスと病原体の相互作用全体により広く見られる現象なのかを理解するためには、このプロバイオティクスと病原体の組み合わせや他の組み合わせに関するメカニズム研究をさらに進めることが重要である。

材料と方法
細胞培養と細菌株
大腸上皮（Caco2）細胞はATCC（HTB-37、Manassas、VA）から入手し、ATCCのプロトコルに従って培養した。アッセイに用いた細胞はすべて継代番号22-30のものであった。簡単に説明すると、細胞はT75または96ウェルプレートに105/cm2の密度でプレーティングした。細胞は、16.6%ウシ胎児血清（FBS）（HyClone Laboratories, Logan, UT）、非必須アミノ酸（Thermo Scientific, Rockford, IL）、10 mM MOPS（Sigma,セントルイス, MO）、10 mM TES（Sigma）、15 mM HEPES（Sigma）、2 mM NaH2PO4（Sigma）を添加したDMEM/High Modified（Thermo Scientific, Rockford, IL）で維持した。細胞はコンフルエンス14日後に分化したとみなし（Ouwehand and Salminen, 2003）、接着アッセイ、カスパーゼアッセイ、遺伝子発現に用いた。細菌細胞はSupplementary Table S7に記載したように増殖させた。

接着と浸潤の測定
上皮細胞へのサルモネラ菌の結合を阻害する特定細菌の能力を、以前に記載されたように、特定細菌存在下での腸管上皮細胞関連サルモネラ菌量の変化を測定することによって試験した（Heら、2013；Shahら、2014；Parkら、2016；Chenら、2017）。全宿主関連サルモネラ菌量は、以下に記載するようにqPCRにより決定した。宿主に侵入したサルモネラ総量は、ゲンタマイシン保護アッセイ（Arabyan et al.

上皮細胞を96ウェルプレートで前述のように培養した（Heら、2013；Shahら、2014；Parkら、2016；Chenら、2017）。菌は2回継代後、接着アッセイに使用した。細菌細胞は14時間増殖後、培地2mLから回収し、等容量のPBSで2回洗浄した後、1X非必須アミノ酸、10mM MOPS、10mM TES、15mM HEPES、2mM NaH2PO4で修飾したDMEM/Highに～108cfu/mLで再懸濁したが、FBSは添加しなかった。上皮細胞は、サルモネラ単独、またはサルモネラと他の細菌を50μLの最終容量で、1:1000のMOI（感染多重度）で感染させた。サルモネラと他の細菌の比率は1：1で、上皮と60分間インキュベートした。細菌細胞懸濁液を吸引し、Caco2単層を200μLのTyrode's（140mM NaCl、5mM KCl、1mM CaCl2、1mM MgCl2、10mM グルコース、10mM ピルビン酸ナトリウム、10mM HEPES、pH 7.4）で3回洗浄し、単層から付着していない細菌細胞を除去した。DNA 抽出バッファー（AEX Chemunex、フランス）（50μL）を用いて単層と宿主に付着した細菌を溶解し、37℃で15分間、次いで95℃で15分間インキュベートした。得られた細胞溶解液を用いて、Caco2細胞に関連する細菌数を測定した（Desai et al.）定量分析は、CFX 96 Real Time System（BioRad, Hercules, CA）を用いたqPCRで行った。反応は、1μLの細胞溶解液、100nMのPCRプライマー、iQ SYBR Green Supermix（BioRad, Hercules CA）を含む最終容量25μLで、製造元の指示に従って行った。増幅に使用したプライマーはSupplementary Table S9に示した。反応パラメーターは、95℃で5分間の変性ステップ、95℃で15秒間、56℃で30秒間、72℃で30秒間、それぞれ40サイクルの変性、アニーリング、伸長、72℃で1分間の最終伸長からなる。生成物は、50℃から95℃まで、転移速度0.2℃/秒のメルトカーブ解析を用いて確認した。CT Vs Log10 cfuの標準曲線を用いて、各ウェルに存在する細菌細胞数とCaco2細胞数を推定し、Caco2あたりの細菌数を算出した。データは、サルモネラ菌のみでインキュベートした対照ウェルとの相対値で平均正規化した。実験は4反復で行った。処理による平均値の差は、Dunnettの多重比較検定を用いたコントロールとの平均値比較の後、一元配置分散分析により検定した。

侵入および付着した細菌の総量は、以前に記載されたゲンタマイシン保護アッセイを用いて決定した（Chen et al.）感染細胞を5% CO2、37℃で60分間インキュベートした。培養後、培地を吸引し、細胞をTyrode's bufferで3回洗浄した。100μg/mLのゲンタマイシンと共に37℃、5% CO2で2時間インキュベートし、Caco2細胞内または外部に付着した細菌を死滅させることで、侵入した細菌を推定した。全宿主関連細菌を測定するため、細胞は抗生物質無添加の細胞培養培地とインキュベートした。細胞を再びTyrode's bufferで3回洗浄し、0.01% tritonで溶解した。上皮細胞溶解液中の細菌量は、連続希釈液をLB寒天培地にプレーティングすることにより測定した。実験は4反復で行った。付着細菌の数は、宿主に付着した細菌の総数（A）の平均値から侵入細菌（B）の平均値を差し引くことにより列挙し、誤差（ΔZ）は（ΔZ）2＝（ΔA）2＋（ΔB）2として計算した。処理による平均値の差は、一元配置分散分析（one way ANOVA）で検定した。ANOVA後、Tukey-Kramer法により平均値を比較した。

カスパーゼアッセイ
Caco2細胞は、前述のように96ウェルプレートで培養し、細菌を感染させる前にリン酸緩衝生理食塩水（PBS）で洗浄した。Caco2細胞は、Bifidobacterium longum spp. infantis ATCC 15697、Salmonella sv. Typhimurium LT2 ATCC 700720のいずれか、あるいは両方の菌に同時に感染させた。50μLの容量で細菌処理（MOI 1:1000）を加えた後、細胞を37℃、5% CO2でインキュベートした。8時間後、カスパーゼ8、9および3/7活性を、Caspase-Gloアッセイキット（Promega, Madison, WI）を用いて、製造元の説明書に従って正確に測定した。カスパーゼ活性による生物発光は、DTX 880 Multimode Detector（Beckman Coulter, Brea, CA）を用いて測定した。処理による平均値の差は、一元配置分散分析（one way ANOVA）で検定した。ANOVA後、Tukey-Kramerの方法で平均値を比較した。

遺伝子発現のための上皮細胞への感染
ヒト大腸上皮細胞（Caco2）を前述のようにT75で培養し、細菌感染前に24時間血清飢餓状態にした。Caco2細胞は、Bifidobacterium longum spp. infantis ATCC 15697、Salmonella sv. Typhimurium LT2 ATCC 700720のいずれか、あるいは両菌を最終容量10mL中、1:1000のMOIで同時に感染させた。Caco2細胞の非存在下でも、3つの細菌処理法をまったく同じ条件でインキュベートした。感染させた細胞はすべて、37℃、5% CO2でインキュベートした。感染後30分、60分、120分で、付着していない細菌を含む培地を吸引し、10mLのTRIzol LS試薬（Invitrogen, Carlsbad, CA）を細胞に加えた。これをピペットで静かに混合した後、7200×gで5分間遠心し、細菌をペレット化した。TRIzol LS上清を清潔なチューブに保存し、Caco2細胞からのRNA抽出のためにさらに処理した。細菌ペレットを2mLの新鮮なTRIzol LSに再懸濁し、穏やかに混合し、宿主関連細菌からのRNA抽出のためにさらに処理した。

細菌RNA抽出と遺伝子発現
宿主関連細菌を含むTRIzol LS懸濁液を7200×gで5分間遠心した。残りのTRIzol LS上清は、後で使用するために清潔なチューブに保存した。TEバッファー（10 mM Trisおよび1 mM EDTA、pH 8）中の50 mg/mLのリゾチーム（Sigma）および200 U/mLのmutanolysin（Sigma）を含む溶解酵素カクテル1 mLを、遠心分離によって得られた細菌ペレットに添加した。溶液を穏やかに混合し、37℃で1時間インキュベートした後、7200×gで5分間遠心分離した。上清を捨て、ペレットを8U/mLのプロテイナーゼK（Fermentas, Glen Burnie, MD）を含む250μLのプロテイナーゼK緩衝液（100mM Tris-HCl, 5mM EDTA, 200mM NaCl, 0.2% SDS, pH8）に懸濁した。これを55℃で1時間、断続的に攪拌しながらインキュベートした。これにあらかじめ保存しておいたTRIzol LSを加え、穏やかに混合した。RNAはTRIzol LSから製造者の推奨に従って正確に単離した。RNA濃度、A260/280およびA260/230をNanoDrop（Thermo scientific, Waltham, MA）で測定し、RNA濃度が少なくとも0.5μg/μlで、比率が≧1.8である場合にのみ、サンプルをさらに処理した。RNAサンプルは2,100 Bioanalyzer (Agilent Technologies, Santa Clara, CA)で完全性を分析した。

トータルRNA（20μL中10μg）は、400UのSuperscriptase II/10μg RNAを用い、ランダムヘキサマーとSuperscriptase II（Invitrogen,Carlsbad,CA）を用いて、製造者の推奨に従って正確にcDNAに逆転写した。cDNA合成後、酵素を熱失活させ、RNA鋳型を80UのRNaseH（Epicentre, Madison, WI）を用いて37℃で20分間分解した。反応混合物は、Qiaquick-PCR精製キット（Qiagen, Valencia, CA）を用いて、製造者の指示に従って正確に洗浄した。精製したcDNAを、合計100μLのヌクレアーゼフリー水（Ambion, Austin, TX）で2回カラムから溶出した。

cDNAはDNaseI（Promega, Madison, WI）を用いて、製造者の推奨に従って、0.6UのDNAseI/μg cDNAを37℃で20分間かけて断片化した。断片化されたcDNAは、GeneChip DNA Labeling reagent (Affymetrix, Santa Clara, CA)とTerminal Transferase enzyme (TdT) (New England Biolabs, Ipswich, MA)を用いて、メーカーの推奨に従って、2μLのGeneChip標識試薬と3μLのTdT/μg cDNAを用いて37℃で60分間標識した。サンプルはハイブリダイゼーションの前に98℃で10分間変性させ、その後4℃で5分間冷却した。

標識cDNAを、Bifidobacterium longum ssp. infantis ATCC 15697 (LoCascio et al., 2010)およびSalmonella enterica subsp. Typhimurium LT2 ATCC 700720。Salmonellaアレイには9,852プローブセットが含まれ、そのうち4,735プローブセットはS. Typhimuriumに対して設計された。各プローブセットには、それぞれ25ヌクレオチド長の11個のプローブが含まれていた。BifidobacteriaチップについてはLoCascio et al. B. infantisとS. Typhimuriumの純粋培養から抽出したサンプルには標識cDNAのアリコート（500 ng）、B. infantisとS. Typhimuriumの共培養から抽出したサンプルには標識cDNAのアリコート（1000 ng）、B. infantisとS. sv. Typhimuriumの共培養から抽出したサンプルには標識cDNAのアリコート（2000 ng）。TyphimuriumとCaco-2の共培養から抽出したサンプルには2000 ngの標識cDNAを、B. infantis、S. Typhimurium、Caco2の共培養から抽出したサンプルには2500 ngの標識cDNAを、それぞれのチップにハイブリダイズさせた。合計24チップのサルモネラ菌チップを処理し（2反復×3時点（30分、60分、120分）×4処理）、8チップのビフィズス菌チップを処理した（2反復×1時点（120分）×4処理）。

マイクロアレイデータの正規化と微生物チップの統計解析
生データ（.celファイル）は、RMA-MS（Stevens et al.、2008）を用いて、バックグランド補正、分位正規化、要約を行った。正規化されたlog2変換強度行列は、さらなる統計解析に使用された。差次的に制御された遺伝子を検出するために、サルモネラ菌チップのデータは、時間要約法として "signed area "を用いた対にならない時間経過解析として解析され、一方、ビフィズス菌チップのデータは、Significance Analysis of Microarrays (SAM) (Tusher et al., 2001)を用いて、T統計量を用いた2クラスの対にならないデータとして解析された。すべての遺伝子はSAMの出力からスコア(d)に基づいてランク付けされた。このランク付けされた遺伝子リストをGene Set Enrichment Analysisソフトウェア（GSEA）（Mootha et al. ビフィズス菌の遺伝子セットは、KEGG (Kanehisa et al., 2002)、Cluster of Orthologous Groups of proteins (COGs) (Tatusov et al., 1997)、Carbohydrate Active Enzyme Database CAZY (Park et al., 2010)、およびLoCascio et al. (2010)によって同定された遺伝子のアノテーションに基づいて定義された。B. infantisにおける推定水平転移遺伝子はIntegrated microbial genomes system (IMG) (Markowitz et al., 2010)を用いて同定した。タンパク質局在に基づく遺伝子セットは、CoBaltDB (Goudenège et al., 2010)のアノテーションに基づいて作成された。サルモネラ菌の遺伝子セットは、Comprehensive Microbial Resource (CMR) (Peterson et al., 2001)、Cluster of Orthologous Groups of proteins (COGs) (Tatusov et al., 1997)、Virulence Fact、 1997), Virulence Factors of pathogenic bacteria DataBase (VFDB) (Chen et al., 2003; Yang et al., 2008), Carbohydrate Active Enzyme Database (CAZY) (Park et al., 2010), BioCyc (Caspi et al., 2008). サルモネラの推定水平転移遺伝子に基づく遺伝子セットは、Horizontal Gene Transfer Database (HGT-DB) (Garcia-Vallve et al., 2003)からの予測値を用いて定義した。タンパク質局在に基づく遺伝子セットは、CoBaltDB (Goudenège et al., 2010)からの予測値を用いて作成した。

Caco-2 RNA抽出と遺伝子発現
細菌をペレット化した後に得られたTRIzol LS（Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA）上清を液体窒素中で2回凍結融解した。750μLのTRIzol LSサンプルに250μLの水を加えた。これをさらにRNA抽出のために、製造元の説明書通りに正確に処理した。RNA濃度、A260/280およびA260/230をNanoDrop（Thermo scientific, Waltham, MA）で測定し、RNA濃度が少なくとも0.5μg/μlで、比率が≧1.8である場合にのみ、サンプルをさらに処理した。RNAサンプルは2,100 Bioanalyzer (Agilent Technologies, Santa Clara, CA)で完全性を分析した。cDNAの合成、ビオチン標識cRNAの合成、断片化、精製は、1サイクルcDNA合成キット（Affymetrix社、カリフォルニア州サンタクララ）を用いて、製造元の指示に従って正確に行った。標識され断片化された 10 μg の cRNA を、Center for Integrated BioSystems (Utah State University, Logan, UT) において、製造者の推奨に従って Affymetrix HGU133Plus2 GeneChips にハイブリダイズさせた。

HGU133Plus2チップのマイクロアレイデータの正規化と統計解析
生データ（.celファイル）をバックグラウンド補正し、分位正規化し、RMA（Irizarry et al.） RMAで正規化されたデータは、PANPアルゴリズム（Warren et al. 少なくとも1つのサンプルで存在と判定されたプローブセットはさらなる統計解析に含まれ、そうでないものは除外された。得られた正規化、フィルター処理、log2 変換した強度行列を、Significance Analysis of Microarrays (SAM) (Tusher et al., 2001)を用いて、時間要約法として "signed-area "を用いて、2 クラスの対にならない時間経過データとして解析した。すべての遺伝子はSAMから得られたスコア(d)に基づいてランク付けされた。このあらかじめ順位付けされた遺伝子リストは、Gene Set Enrichment Analysisソフトウェア（GSEA）（Subramanian et al. 遺伝子セットはGene Ontologyアノテーション、KEGGアノテーション、Biocartaアノテーション、TRANSFACアノテーションに基づいており、Molecular Signaturesデータベース（Subramanian et al.、2005）からダウンロードした。Ingenuity pathway analysis (IPA)を用いて発現データを正規パスウェイにマッピングした。正規化データに基づく全サンプルのマルチスケールブートストラップ（1,000回）による階層的クラスタリングは、PVCLUST（Suzuki and Shimodaira, 2006）を用いて行った。

ウェスタンブロット
標的タンパク質の相対量は、ウェスタンブロットのデンシトメトリー解析により定量した。Caco2細胞を培養し、遺伝子発現のために感染させたものと全く同様に感染させた。T75の細胞をフラスコから掻き取り、1mLのプロテアーゼ／ホスファターゼ阻害剤カクテル（30mM HEPES、1mM EDTA、50mMピロリン酸ナトリウム、100mMフッ化ナトリウム、10mMオルトバナジン酸塩、1Rocheプロテアーゼ阻害剤カクテル錠剤／50mL溶媒）に懸濁し、ビーズビーターを用いて全速力で30秒ずつ3パルス、氷上で1分間間欠的にインキュベートしながら溶解した。細胞溶解液は-70℃で保存し、さらに分析を行った。50μgのタンパク質を1X SDSサンプルバッファーで希釈し、サンプルを95℃で10分間加熱し、12,000 X gで10分間遠心した。このサンプルを、Criterion電気泳動システム（Bio-rad Laboratories, Hercules, CA）を用いて、ゲルあたり45 mAmpの定電流で、プレキャストした10% Tris-HClポリアクリルイミドゲル（Bio-rad Laboratories, Hercules, CA）上で分解した。分離されたタンパク質は、Trans-Blotセミドライ電気泳動セル（Bio-rad Laboratories, Hercules, CA）を用いて、メーカーの推奨に従ってPVDF膜（Bio-rad Laboratories, Hercules, CA）に移された。転写終了後、Pierce® Fast Western Blot Kit（Thermo Fisher Scientific, IL, USA）を用いて、p-Akt 473（#9271）およびp-Akt 308（#9275）の存在について、製造元の推奨に従ってプローブした。全てのタンパク質の一次抗体はCell Signaling Tech. (マサチューセッツ州ボストン）から購入した。ブロットはKodak Image Station 2000R（Carestream Health, Rochester, NY）を用いて画像化した。ブロットの濃度分析はImage J (Abramoff et al., 2004)を用いて行った。処理による平均値の差は、反復測定による二元配置分散分析で検定した。

小代謝物プロファイリング
感染実験から回収した細胞外上清と細胞内溶解液（50μL）を等容量の氷冷メタノールで抽出し、-20℃で60分間インキュベートした。得られた沈殿を、20,000 X gで10分間遠心分離することにより、サンプルから分離した。上清は、室温でスピードバックを用いて蒸発乾固した。全サンプルの代謝物プロファイルは、UC Davis Genome Center (Davis, CA)でGC-MSを用いて、前述したように決定した(Fiehn et al., 2008)。簡単に説明すると、乾燥サンプルをN-メチル-N-（トリメチルシリル）-トリフルオロアセトアミド（Sigma, St. サンプルは、Leco ChromaTOF ソフトウェアバージョン 2.32 を使用して制御された Agilent 6,890 ガスクロマトグラフで、前述のように分析された (Fiehn et al., 2008)。GC/MSのピークは、BinBaseデータベース（Fiehn et al., 2005）を用いて、マススペクトルと保持指標に基づいて注釈付けされた。ピーク面積は、それぞれについて同定されたすべての化合物の面積の合計を計算することで正規化し、続いてサンプルに関連するすべてのデータを対応する代謝物の合計で割りました。得られたデータには、小数点以下の桁数を除いた値を得るために一定の係数を乗じ、ピーク強度を対数変換して不均一分散性を除去した (Fiehn et al., 2008)。正規化データに基づいて、全サンプルのマルチスケールブートストラップ（1,000 回）による階層的クラスタリングを PVCLUST（Suzuki and Shimodaira, 2006）を用いて行った。

データの利用可能性
発現データはGEOリポジトリのアクセッション番号GSE266880に掲載されている。

倫理声明
市販の樹立細胞株のみを使用したため、ヒトを対象とした研究に関しては、現地の法律および施設要件に従った倫理的承認は不要であった。

著者貢献
CS： CS：データ管理、形式的解析、可視化、執筆（原案）、執筆（校閲・編集）。BW：概念化、形式的解析、資金獲得、調査、方法論、プロジェクト管理、資源、ソフトウェア、監督、検証、執筆-原案、執筆-校閲・編集。RG: 概念化、データキュレーション、形式分析、調査、方法論、検証、視覚化、執筆-原案、執筆-校閲・編集。PD: 概念化、データキュレーション、形式分析、調査、方法論、ソフトウェア、検証、視覚化、執筆-原案、執筆-校閲・編集。JS：概念化、データキュレーション、形式分析、調査、方法論、ソフトウェア、検証、視覚化、執筆-原案、執筆-校閲・編集。

資金提供
著者は、本論文の研究、執筆、および／または出版に関して、金銭的支援を受けていないことを宣言する。

謝辞
最初のメタボロミクス実験に協力してくれたOliver FiehnとKristie Cloosに感謝する。

利益相反
著者らは、本研究が利益相反の可能性があると解釈される商業的または金銭的関係がない状態で実施されたことを宣言する。

著者は投稿時にFrontiers誌の編集委員であったことを申告した。このことは、査読プロセスおよび最終的な決定には影響しなかった。

発行者注
本論文で表明された主張はすべて著者個人のものであり、必ずしも所属団体や出版社、編集者、査読者の主張を代表するものではない。本論文で評価される可能性のあるいかなる製品、またはそのメーカーが主張する可能性のある主張も、出版社によって保証または支持されるものではない。

補足資料
本論文の補足資料は、https://www.frontiersin.org/articles/10.3389/fmicb.2024.1387498/full#supplementary-material。

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キーワード：プロバイオティクス、アルギニン、一酸化窒素、宿主-微生物会合、サルモネラ菌、ビフィズス菌

引用 Shaw C, Weimer BC, Gann R, Desai PT and Shah JD (2024) 病原菌とプロバイオティクスの陰と陽：Salmonella enterica sv. TyphimuriumとBifidobacterium infantisの共感染における相互作用。Front. Microbiol. 15:1387498.

受理された： 17 February 2024; Accepted： 2024年4月12日；
発行：2024年5月15日

編集者

Axel Cloeckaert, フランス国立農業・消費・環境研究所（INRAE）, フランス
査読者

Vasco Ariston De Carvalho Azevedo（ミナスジェライス連邦大学、ブラジル
コリーナ＝ディアナ・セアパ（メキシコ国立自治大学、メキシコ
Alex Galanis, デモクリトス大学（ギリシャ
Copyright © 2024 Shaw, Weimer, Gann, Desai and Shah. 本記事は、クリエイティブ・コモンズ表示ライセンス（CC BY）の条件の下で配布されるオープンアクセス記事です。原著者および著作権者のクレジットを明記し、学術的に認められている慣行に従って本誌の原著を引用することを条件に、他のフォーラムでの使用、配布、複製を許可する。これらの条件に従わない使用、配布、複製は許可されない。

*文責バート・C・ワイマー、bcweimer@ucdavis.edu

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