アトランティックサーモン（Salmo salar）の海水への移行に伴う塩分濃度の変化と腸内細菌の増加

哉百名


アトランティックサーモン（Salmo salar）の海水への移行に伴う塩分濃度の変化と腸内細菌の増加

https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC9865641/


María F. Morales-Rivera、Diego Valenzuela-Miranda、Valentina Valenzuela-Muñoz、[...], and Valentina Valenzuela-Muñoz

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補足資料
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要旨
宿主の生理的履歴と環境はマイクロバイオーム構造を決定する。その意味で、パー・スモルト変換後のサケの海水への移行戦略は、アトランティックサーモンの腸内細菌叢に影響を与える可能性がある。そこで本研究では、3つの処理条件下で海水への移行を行う際のアトランティックサーモン腸内細菌叢の多様性と存在量、およびメタゲノム機能予測について探索することを目的とした。1群は緩やかな塩分変化（GSC）、もう1群は塩分ショック（SS）、3群は海水（SW）移行の前に機能性飼料（FD）を摂取させた。微生物プロファイルは、Nanopore プラットフォームを用いた full-16S rRNA 遺伝子シークエンスにより評価した。さらに、PICRUSt2 を用いてメタゲノム機能予測を行った。その結果、塩分濃度の変化がアトランティックサーモン腸内細菌叢の豊かさ、多様性、および分類学的構成に影響を与えることが示された。また、GSCとFDがアトランティックサーモン稚魚の微生物相の多様性を増加させることが明らかになり、海水移動中の腸内細菌群集と魚の健康との間に正の相関があることが示唆された。この知見は、スモルト魚の生産におけるマイクロバイオームの調査に応用でき、アトランティックサーモンの海水輸送のパフォーマンスを向上させることができる。

キーワード アトランティックサーモン、パースモルト化、海水淡水化、腸内細菌叢、ナノポアシーケンス

  1. はじめに
    魚類の健康と福祉は，その微生物相に大きく影響されるということが，過去数年の間にコンセンサスとなっ てきた[1]．海産魚のマイクロバイオータは、腸の発達、代謝、免疫反応に極めて重要な役割を果たす。微生物相がどのように変化しているかを理解することは，宿主と微生物の相互作用や宿主の健康への影響を理解する上で重要である [2]．そのため、養殖生産における健康な生物と福祉を促進するために、海産魚の腸内細菌叢を形成する因子を理解することに、さまざまな研究努力が注がれています[3]。

魚類微生物群集は、主にシーケンサー技術に基づく分子的手法によって探索されてきました。ここでは、16S rRNA 遺伝子の V1 から V9 までの超可変領域のシークエンスを用いて、海洋環境の微生物多様性を研究している[4,5,6,7]。魚類の微生物相を評価するために、どの領域を使用すべきかについてのコンセンサスは得られていない。したがって、微生物相の同定に16S rRNA遺伝子の異なる領域を使用する研究を見つけることが可能である[8,9,10]。しかし、超可変領域の塩基配列部分が分類学的多様性の推定に影響を与える可能性があることが知られている[11,12,13]。また、異なる16S rRNA領域だけでは、正確な富栄養度推定やより高度な分類学的分類には不十分であることが観察されている[14,15]。近年、Nanopore技術（Oxford Nanopore Technologies, Oxford, UK）を用いた16S rRNAの全塩基配列の決定が、微生物相を種やより高い分類レベルで同定するための最適なツールとして提案されている[16, 17, 18, 19]。

微生物叢の構造は、宿主の生理歴、食事、生態的要因、環境など、多様な要因によって変調をきたす可能性がある[20,21,22]。環境要因については，塩分濃度の変化が魚類の腸内細菌叢の構造や多様性に影響を与えることが証明されている[23,24]．水生魚では，SWへの移行が魚類飲水量の増加を誘発する [2,25]。これらの適応は、腸内の浸透圧変化を安定化させ、腸内細菌叢を構成する細菌群に変化をもたらす [2,10,26,27] 。

チリでは、アトランティックサーモン（Salmo salar）が養殖場のサケ科魚類の優先種であり、生産量の72％を占めている [28]。パー・スモルト・トランスフォーメーション、すなわちスモルト化の間、アトランティックサーモンは、魚がFWからSWに変化することを可能にする分子的・生理的変化を必要とする[25,29]。自然条件下では、サケ科魚類はスモルト化の際に河川から海への塩分勾配を通過する [30]。しかし、生産的なシステムでは、スモルトがFWからSWに直接移動することが多く、サケの微生物相と健康における塩分濃度の直接的な変化の影響を考慮しないまま、スモルトの移動が行われている。SWの移動の1週間後と4週間後にFWの段階と比較すると、SWの皮膚微生物相の多様性と豊かさがより大きいことが報告されている[8]。Wangら[10]は、アトランティックサーモンの腸内細菌叢が、FWの魚とSW移行の2週間後の魚の間で高い差があることを報告した。彼らの結果のうち、FWに関連するLactobacillus属とPhotobacterium属、SWで22週間後にLactobacillus属とMycoplasma属が高い頻度で観察された。さらに、再循環型養殖システム[31]では、SW後1週間で腸内細菌の豊富さが減少することが観察されている[9]。さらに、アトランティックサーモンでは、SW移動中の微生物群集の変化が魚の免疫系を誘導し、感染症発生を可能にすることが報告されている[31]。そのため、スモルト化時のサケ類のパフォーマンスと健康を向上させるための機能性飼料が開発されている[32]。

以前、我々は、緩やかな塩分変化にさらされたアトランティックサーモン腸と塩分ショックの間のトランスクリプトームの変動を報告しました[33]。この研究では、緩やかな塩分変化にさらされたサケの腸組織では、サリ ティショックにさらされた魚と比較して、多くの転写産物が差次的に発現していることが報告されまし た。さらに、Gen Ontology（GO）エンリッチメント解析により、代謝過程、イオン膜貫通輸送、免疫反応に関連する遺伝子が多く存在することが示された。このように、スモルト化戦略の違いによるアトランティックサーモン腸内細菌叢の変化を示唆することが可能である。そこで本研究では、16S rRNA遺伝子ナノポアシーケンスを用いて、スモルトの腸内細菌叢の豊富さと存在量を属・種レベルで明らかにすることを目的とした。我々は、異なる塩分条件と飼料中の機能性成分の使用により、パースモルトの移動中にマイクロバイオームコミュニティが変調をきたす可能性があると仮定している。これらの知見は、スモルトの生産、サケの養殖における動物の健康と福祉の向上のための新たな戦略をサポートすることができます。

  1. 材料と方法
    2.1. 実験デザイン
    本研究で用いたアトランティックサーモン腸内サンプルは、当グループが以前に報告したアッセイから採取したものである[33]。簡単に言えば、淡水（FW）スモルト（60 ± 6.2 g）を商業農場（Hendrix Genetics Aquaculture, Villarrica, Chile）から入手し、Universidad de Concepción, Dichato, Chileにある海洋生物学ステーションに輸送した。魚は紫外線処理したシングルパスフロースルータンクシステム（500 L、30匹/タンク）で、12：12時間の明暗サイクル、溶存酸素レベル8.5 mg/L、pH = 8.0で維持し、毎日カーギルの普通食を与えた。1ヶ月の馴化後、FW（対照群）試料を採取した。その後、魚は3連で3つの実験群に分けられた。最初のグループは、3連の水槽あたり30匹のスモルトで、FWの塩分濃度をSWまで上昇させ、漸進的塩分変化（GSC）にさらすこととした。勾配は3塩分点に設定し，1週間に10PSUずつ変化させ，1ヶ月間続けた。各塩分点での1週間の馴化後，腸内試料を採取した。一方，1水槽あたり30尾のスモルトを3連にした別のグループは，GSCグループと同じ日に塩分ショック（SS）とFWから32 PSUへの移動にさらされた。この2群にはCargillの通常飼料を与えた。第3のグループは、水槽あたり30匹のスモルトを3連で飼育し、SuperSmolt Feed Only, Stim社の機能性飼料（FD）を1ヶ月間与え（未承諾試験）、他のグループと同時に32PSUに移した。32 PSUでの1週間の馴化後、各群の魚の腸内サンプルを採取した。さらに、VEHICE社（チリ）により実施された免疫組織化学分析により、SW移行のためのサケの状態を評価した。また、ATPase-αおよびATPase-βのRT-qPCR発現解析は、比較ΔΔCt相対発現解析により決定した。プライマーおよびqPCR条件は、当グループが以前に記載したものと同様である[33]。動物実験は、コンセプシオン大学倫理委員会が承認したガイドラインに基づいて実施した。実験デザインは、動物実験に関する3R（Three Rs）ガイドラインを考慮した。

2.2. DNA抽出とFull-16S rRNAの増幅
魚の腸管消化物を除去した後、腸管組織を十分にミンチし、1 mLの溶解バッファー（10 mM Tris-HCl, 400 mM NaCl, 100 mM EDTA, 0.4% SDS, 20 mg/mL Protease K, pH 8.0 を5 μL）と混合し、その後十分にボルテックスして37℃で2時間インキュベートした。1.4 mm のセラミック球を用いた振動ミル（MM200, Retsch）で 24 Hz、5 分間ホモジナイズした後、フェノール：クロロホルム：イソアミル法でホモジナイズした。DNAの完全性は、抽出後の1%アガロースゲル電気泳動で評価した。DNA濃度はNanodrop分光光度計で測定した。実験グループあたり5個体を最終濃度100 ng/µLになるようにプールした。プライマー27 F 5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′ および1492 R 5′-GGTTACCTTGTTACGACTT-3′ を用いて、完全16S rRNA遺伝子を増幅した[34]。増幅には、15μLのTaq DNA polymerase LongAmp（New England Biolabs, Ipswich, MA, USA）を用い、以下の条件下で行った。95 ℃で1分間，95 ℃，56 ℃で30秒間，65 ℃で1分間のサイクルを25回行い，最終的に65 ℃で5分間伸長した。PCR結果の評価には、1.2%のアガロースゲルを用いた電気泳動を行った。

2.3. Nanoporeライブラリーの合成と塩基配列の決定
Nanoporeでは、5個体のプールの完全な16S rRNA PCR産物を用いて、各実験グループごとに3回に分けてライブラリーを実施した。PCR産物は、Agencourt AMPure XP beads (Beckman Coulter, Brea, CA, USA) を用いて、サンプル：ビーズ＝1：2の割合で精製した。サンプルをマグネットスタンドに入れ、70%エタノール（新しく調製したもの）で洗浄した。ビーズを分子生物学グレードの水で再懸濁した。精製したアンプリコンをQubit 4 fluorometer (Thermo Scientific, Waltham, MA, USA) で定量し、16S Barcoding Kit (SQK-RAB204, Oxford Nanopore Technologies) で1次元配列決定戦略の製造者の指示に従ってライブラリー合成のテンプレートとして使用した。簡単に言うと、精製した16Sアンプリコンをバーコードと混合し、LongAmp Taq Polymerase (New England Biolabs) を用いて、最終反応量を50 uLとして、前段で説明したようにPCRを行った。PCR産物をHulaMixer (Thermo Scientific)で室温で5分間インキュベートし、Agencourt AMPure XPビーズで洗浄した。精製産物を10 uLの溶出バッファー（10 mM Tris-HCl pH8.0 with 50 mM NaCl）で溶出した。ライブラリーの最終濃度は、Qubit 4 fluorometer (Thermo Scientific) を用いて測定し、ライブラリーは、High Sensitivity D5000 ScreenTape (Agilent, Santa Clara, CA, USA) を用いて、製造者の指示に従い、TapeStation Bioanalyzer 2100 (Agilent) でテストされた。Oxford Nanopore Technologiesの方法論に従って、ライブラリーをマルチプレックスモードでプールし、フローセルMK1 Spot-ON FLO-MIN107-R9に配列決定した。内部コントロールとして、微生物モックコミュニティ（Zymo Biomics Microbial Community Standard）のDNAを抽出し、同じ記述の手順に従ってシーケンスし、観察された分類群の存在量を期待される存在量と比較した。シーケンス効率は、ソフトウェアMinKNOW 2.0 (Oxford Nanopore Technologies)を通してモニターした。

2.4. バイオインフォマティクス解析
生成されたfast5ファイルは、Guppy（version 3.2.2, Oxford Nanopore Technologies, Oxford, UK）を用いてベースコールし、Q-score ≥ 7の配列のみを保持するフィルタステップ（quality filter）を適用した。脱多重化、プライマー、バーコードのトリミングは、Porechop V0.2.4 [35]を用いて行いました。BLASTNは、NanoCLUSTパイプラインでクリーンアップされた配列16S NCBI分類データベースをアライメントした[36]。これには、配列サイズ1400-1800 bp、Q-score ≥ 9によるフィルタリングが含まれます。アルファ多様性の推定にはSimpsonの1-DとShannon indexを、均等性の推定にはPielouのindexを使用した。微生物群集構造は、分類群相対量データに基づくBray-Curtis非類似度を用いて解析し、多変量教師なしデータ探索として主座標分析（PCoA）を実施した。すべての指標とPCoAは、Rの「Vegan」パッケージ[37]を用いて算出した。腸内細菌叢の変動は、R統計ソフトウェア[38]で、系統、目、属の相対的存在度をプロットすることによって探索した。PICRUSt2 ソフトウェアを使用して、完全な16S rRNA 配列から得られた V3-V4 領域を使用してメタゲノム機能を予測した[39]。これらの領域は、我々のシークエンスデータとCLCプログラムのV3-V4用ユニバーサルプライマー[26]とのアライメントにより同定されたものである。パスウェイレベルは MetaCyc データベース[40]を用いて構築した。相対的存在量プロットは R を用いて作成した。パスウェイの寄与の有意差の検定には STAMP 2.1.3 プログラムを用いた[41]。Benjamini-Hochberg の偽発見率で補正したカイ二乗検定を適用した。グラフ作成には、割合の違いを判断するために、相対的存在度が0.5以上のデータを使用した。

  1. 結果
    3.1. アトランティックサーモンの実験性能
    GSC、SS、FD の各条件で行ったアトランティックサーモンの免疫組織化学分析では、クロライド細胞の移動が認められ、SW移 植に適した条件であることがわかった（図 S2）。さらに、ATPase-αおよびATPase-βサブユニットのRT-qPCR検査により、この状況が検証された（図S3）。実験群では、死亡率は観察されなかった。

3.2. Full-16Sシークエンスデータレポート
Nanoporeシーケンスでは、Guppyでフィルタリングした5,867,910リードを生成し、二次メタゲノム解析用に処理しました。脱多重化、トリミング、品質、サイズフィルタリング後、46.18%のリードがNanoCLUSTで分類されました。模擬コミュニティを含む合計96,160リードが分類され、各条件の平均値は13,308であった。分類されなかった細菌はすべて研究から除外され、分類された分類群のみが多様性と分類学の研究に含まれました（Table S1, S2）。

3.3. 腸内細菌群集の構造
希薄化曲線から、すべてのサンプルがプラトーに達しており、分類学的分類に十分な配列数であることが示された。しかし、10PSU-GSCと20PSU-GSCのグループのみが10,000リード以上であった（図S4）。全グループの魚類腸内細菌叢のBray-Curtis非類似度は、0.67-0.65の値を示した。勾配を含むFWからSWへの移動は、高い非類似度（0.68-0.91）を示す。最も高い非類似度は、最初の塩分濃度の変化で観察される（10PSU-GSC: 0.91）。FWから32PSUへの変化のみに着目すると，32PSU-GSC（0.67）が最も小さな非類似度を示し，32PSU-SSと32PSU-FDは同様の非類似度（0.88-0.85）を示していることが観察された。一般に、最も低い非類似度は、GSC群（10PSU-GSC、20PSU-GSC）と32PSU-SS群および32PSU-FD群の間であった（表S3）。Bray-Curtis非類似度を用いた主座標分析（PCoA）では、4つのクラスタが示された。1つは、10PSU-GSCと20PSU-GSCをグループ化したものである（図1A）。第二のクラスターは、32PSU-SSと32PSU-FDをグループ化したものである。第3のクラスターはFW試料をグループ化し、第4のクラスターは32PSU-GSCを独立に分布させたものであった。Simpson (1-D) とShannon指数（図1B,C）によると、最も細菌多様性が高かったのはグループ10PSU-GSCの個体で、最も分布の少ないグループはFWであった。Pielouの指数によると、最も均一性の低いグループは20PSU-GSCの腸内魚であった（図1D）。SWで1週間後に得られたサンプルに関連し、Simpsonの指数とShannonの指数は、32PSU-FDの魚で高い細菌多様性を示した（図1B,C）。一方、Pielouの指数は、32PSU-SSのグループでより均一性を示した（図1D）。

図1
図1
アトランティックサーモン腸内細菌叢の塩分処理間における多様性指数。FW：淡水前処理群、GSC：10PSU、20PSU、32PSU群での緩やかな塩分変化、32PSU-SS：32PSU群での塩分ショック、32PSU-FD：塩分...
3.4. 3.4. SW輸送中のアトランティックサーモン腸内細菌叢の組成
全実験群で腸内細菌叢が10門確認され（図2A）、89％がProteobacteria門に確認された。また、Bacteroidetes、Firmicutes、Actinobacteriaの各系統が腸内細菌叢に多く含まれた。FWの腸内試料は、Armatimonadetesが存在する唯一の試料であった。一方、10PSU-GSC群の腸内細菌叢にはAcidobacteria, Fusobacteria, Verrucomicobiaが存在し（図2A）、20PSU-GSC群の腸内細菌叢にはCyanobacteria門が区別された。さらに、32PSU-SS群の腸内細菌叢には、ProteobacteriaとBacterioidetesという門の細菌のみが存在した。最後に、32PSU-FD群の微生物叢にはThermotogae門の存在が顕著であった（図2A）。

図2
図2
アトランティックサーモン腸内細菌叢組成の相対的存在量。FW：淡水前処理群、GSC：10 PSU、20 PSU、32 PSUでの段階的塩分変化群、32PSU-SS 32 PSUでの塩分ショック群、32PSU-FD：...での塩分ショック群。
上位25属の微生物相の相対存在比は，10PSU-GSC群を除くすべての分析試料でEscherichia-Shigella属（Enterobacterales）が優勢であった。このグループでは、種の分布はより均質であった（図2B）。特に、FW、10 PSU、20 PSUサンプルの腸内細菌叢は、32 PSUの腸内細菌叢よりも多くの細菌属の多様性を示していた。興味深いことに、32 PSUのすべてのグループのサンプルの微生物叢は、ビブリオ属の存在を示し、32 PSU-SSグループで最も高い存在感を示した（図2B）。

最後に、すべての実験グループにおいて、コアとなる微生物相が観察された。このコアは、フラボバクテリア目、エンテロバクター目、モラクセラ目、シュードモナド目から構成されていた（図3A）。属別に解析すると、腸内コア微生物叢ではEscherichia-Shigella属が最も多く、次いでAcinetobacter属とPseudomonas属が多かった（Figure 3B）。

図3
図3
全実験群におけるアトランティックサーモン腸内コア微生物叢の正規化相対存在度のヒートマップ。FW：淡水前処理群；GSC：10 PSU、20 PSU、32 PSU群での段階的塩分変化；32 PSU-SS塩分 ...
3.5. アトランティックサーモン腸内細菌叢で同定された細菌種
NanoCLUSTによって生成された70種のクラスタは、Yarzaら[14]が定義した同一性の98.7%の閾値を超え、全クラスタの17.7%に相当するのみであった。Acinetobacter johnsoniiは、すべての実験グループの腸内細菌叢で同定された唯一の種である（表S4）。また、Pseudomonas migulaeやShigella flexneriなど、FWに提示され、塩分濃度の緩やかな変化にさらされた魚の腸内細菌叢に維持されている種が観察された。さらに、32PSU-GSCの腸内細菌叢にはAliivibrio wodanis, Methylobacterium brachiatum, Microbacterium mangrove, Micrococcus luteus, Sphingobium yanoikuyaeといった種が含まれていた。

NanoCLUST解析により、46の病原性細菌のクラスタが分類されました。しかし、平均同一性と相対存在度がそれぞれ98.7%と0.2を超えるのは5つだけでした（表S4）。すべてのデータセットで同定されたこれらの病原性グループのクラスタは、Acinetobacter johnsonii、Aliivibrio wodanis、Flavobacterium succinicans、およびProvidencia rettgeriの種であった。興味深いことに、Acinetobacter johnsonii種は、すべての実験魚群の腸内細菌叢に存在していた（表S4）。

3.6. 海水移入後の腸内細菌叢
また、海水温化1週間後の魚群間における微生物叢の存在量と豊富さを評価した。各実験魚群の腸内細菌叢では、Proteobacteria門が最も豊富であった。さらに、この門は、属レベルで最も高い富を示した。特に、Vibrio属、Pseudomonas属、Escherichia-Shigella属、Acinetobacter属は、すべてのグループの32PSUの微生物叢に存在した（図4）。32PSU-GSC群の腸内細菌叢は、Firmicutes門、特にBacillales属とLactobacillales属がより豊富であった。また、32PSU-SS群では、Vibrio属が最も多く、45%に達していた。32PSU-FD では、Bacteroidetes 系の属がより多く存在し、豊富であった。また、このグループは32PSUで他のグループと比較して、Ralstonia属とPelomonas属を中心としたProteobacteria門の高いリッチネスを示した（図4）。最後に、32PSU-FD群は微生物相にThermotogae属が存在する唯一のグループである。

図4
図4
海水群における腸内アトランティックサーモン微生物相組成の属レベルでの相対的存在感。32PSU-GSC：32PSU群での緩やかな塩分変化，32PSU-SS：32PSU群での塩分ショック，32PSU-FD：32PSU群での塩分ショックは以前 ...
3.7. アトランティックサーモン腸内細菌叢における機能解析
PICRUSt2ソフトウェア[39]を用いて、アトランティックサーモン腸内細菌叢における338の機能的パスウェイを同定した。そのうち48本がレベル2であり，大半は生合成に関連するものである（図5A，表S5）．異なる SW 処理を比較するために，塩分条件間で効果量 > 0.5 および p < 0.05 のパスウェイを STAMP で得た（図 5B-D）。最も豊富なパスウェイは、ビタミンの生合成、アミノ酸、ヌクレオシドおよびヌクレオチド、脂肪酸、脂 質に関連するものであった（図 5A）。FWグループでより豊富な5つのパスウェイは、レベル2の記述で二次代謝産物分解、クエン酸サイクル（TCAサイクル）、C1化合物の利用および同化、ヌクレオシドおよびヌクレオチドの生合成に注釈されていた。32 PSU-GSC グループでより多く存在する上位 5 パスウェイのうち、TCA サイクルはレベル 2 の記述として特定された。32 PSU-SS では、二次代謝産物分解、TCA サイクルがレベル 2 記述で多く、32 PSU-FD では、二次代謝産物分解、ヌクレオシド・ヌクレオチド生合成、TCA サイクルがレベル 2 記述で多く見られた（表 S5）。

図5
図5
代謝経路の相対的存在比（レベル2）。FW：淡水前処理群、GSC：10 PSU、20 PSU、32 PSUでの緩やかな塩分変化群、32 PSU-SS 32 PSUでの塩分ショック群、32 PSU-FD：32 PSUでの塩分ショック群 ......。
また，FWとSWの比較では，同様の経路が確認された。特に、SWと比較して、FWメタゲノムでは、TCAサイクル、脂肪酸・脂質生合成、ヌクレオシド・ヌクレオチド生合成、アミノ酸生合成の存在比が高いことが示された。機能解析の結果、32 PSU のサンプル間でメタゲノム解析のポテンシャルに大きな差があることがわかった。例えば、32 PSU-GSCと32 PSU-SSの間では、Aromatic Compound DegradationとTCAサイクルが32 PSU-GSCグループで有意に高かった（図5B）。32 PSU-GSCと32 PSU-FDの比較解析から、12のパスウェイの存在量に差が見られ、アミノ酸生合成、脂肪酸と脂質の生合成、アミノ酸分解などのパスウェイが32 PSU-FDグループで高い存在量を示したことが強調されている（図5C）。

  1. 4.考察
    魚類微生物相は、サケの性能に関連した役割を果たし、特に飼料、魚の生理学、および環境から影響を受ける可能性がある。スモルト化の間，アトランティックサーモンは，淡水（FW）から海水への環境変化にさらされる [42]。このように，彼らの微生物相の多様性は変化し，海水魚の性能に影響を与える可能性がある．ここでは、16S rRNAのフルシーケンスを用いて、異なる戦略の下でのSWトランスファー中のアトランティックサーモン腸内細菌叢の変動を評価した。また、塩分濃度の緩やかな変化（GSC）による海水魚への移行が、業界で行われているような塩分ショック（SS）にさらされた魚と比較して、微生物叢の存在量と多様性に違いを示すかどうかを検討した。

FWとSWのアトランティックサーモンのコア腸内細菌叢には、合計19のOTUが報告されている[20]。これらのOTUのうち、著者らは、Lactobacillus、Lactococus、Streptococcus、Escherichia/Shigella、Pseudomonas、およびMycoplasmaの存在を報告した。さらに、Dehlerら[26]は、水槽および湖環境条件下におけるFWのアトランティックサーモン前泳ぎのコア微生物叢にEscherichia/Shigellaが存在することを報告している。さらに、Lorgen-Ritchieら[9]は、FW/SWアトランティックサーモン腸のコア微生物叢におけるPseudomonas sp.の存在を記述している。興味深いことに、本研究では、Pseudomonas、Escherichia/Shigella、Acinetobacterからなる微生物のコアが同定された。アトランティックサーモン腸内細菌叢におけるアシネトバクター菌の存在は、これまで報告されていない。しかし、FWアトランティックサーモンでは、皮膚微生物叢にAcinetobacterが高濃度で存在することが報告されている[8]。腸内コア微生物叢で見つかった低い多様性は、環境微生物叢を減少させることができる実験室条件下で研究が行われたことに起因すると示唆される。

以前、海中ケージにおけるアトランティックサーモンの腸内細菌叢が、FWの腸内細菌叢と比較して高い種の豊かさを持つことが報告されている[10]。さらに、RASシステムにおけるアトランティックサーモンのFW腸内細菌叢では、SWへのサケ腸内細菌叢の移植と比較して、細菌多様性が増加することが報告されている[9]。本研究では、細菌多様性解析の結果、10PSU-GSC群のサケ腸内細菌叢が、評価した腸内試料の中で最も高い細菌多様性を示すことが明らかとなった。このことは、サケがFWから10PSU-GSCに徐々に適応することで、プレスモールの腸内細菌叢の多様性が促進されることを示唆している。興味深いことに、1週間海水中で評価した腸内試料のうち、GCSに曝露した群およびFDを給餌した群は、塩分ショックによりSWに移行した群に比べ、より高い細菌多様性を示していた。特に、緩やかな塩分変化によりSWに移行したアトランティックサーモンのトランスクリプトーム解析では、ソリティー・ショックにさらされたサケと比較して、免疫関連遺伝子の発現が増加していることが報告された[33]。このように，GSCに暴露された魚の微生物相の多様性の増加は，健康な魚と関連することが示唆される可能性がある。一般に，腸内細菌叢の多様性が低いことは，腸内細菌循環異常のマーカーであり，ヒトの様々な疾患との関連が指摘されている[43]．さて、魚類では、病気っぽいティラピア（眼球外反、皮膚出血、皮膚病変、壊死）は、健康な魚に比べて多様性指数が低いことが分かっている[44]。

アトランティックサーモンの腸内細菌叢に提示される系統のうち、これまでの研究では、ProteobacteriaとFirmicutesの系統が淡水で優勢であることが報告されている[9,10,21]。さらに、海水ではProteobacteria門の優位性が高いことが報告されている[9]。さらに、アトランティックサーモンの腸内では、SWで20週間飼育した後、Firmicutesの存在が増加することが観察されている[10]。さらに、Proteobacteria門は、海水中で8ヶ月後に存在量が減少することが示されている[10]。本研究では、すべての腸内試料において、Proteobacteriaが最も豊富であった。また，10PSUと20PSUに暴露した魚の腸内では，FirmicutesとBacteroidetesの門がより多く存在した。さらに、Firmicutes門は、FWとSWの間で同定されたアトランティックサーモンの腸内コア微生物叢に記載されている[26]。ここで、GSC群の腸内細菌叢は、FWからすべての塩分点までFirmicutesを示した。また、FD群の腸内細菌叢はFirmicutes門を呈していた。このことから、FDとGSCはFirmicutesの定着を刺激することが示唆された。さらに、昆虫粉、ガラクトマンナンオリゴ糖、プレバイオティクスなどのサケ養殖における機能性成分の使用は、Firmicutesの現存量を増加させる[3,10]。注目すべきは，塩分ショックにさらされた魚の腸内細菌叢には，Firmicutes門が存在しないことである．同様に，野生のサケでは，Firmicutes門は，パール，スモルト，回帰成魚などのFWに関連した段階で観察される[45]。このように，塩分濃度の緩やかな変化と機能的な食性が，Firmicutes門の存在を可能にしている。

ビブリオ属は、32 PSUで1週間後に、主に塩分ショックにさらされた魚の腸内細菌叢に同定された。この属の種は、海洋生態系に豊富に存在する[46,47]。例えば、エビ、軟体動物、アワビなどの腸内にはビブリオ属の種が報告されている[47]。さらに、ビブリオ属は魚類における病原性と関連している[48]。さらに、SW移入4週間後に、アトランティックサーモンスモルトの腸内細菌叢にビブリオ属が存在することが報告されている[9]。さらに、対照水槽と湖の環境におけるアトランティックサーモンの腸内細菌叢の比較研究では、コア微生物叢にアリビブリオが存在することが示された [20]。

注目すべきは、ラクトバチルス属がアトランティックサーモンの腸内細菌叢でより豊富に存在することが報告されていることである [9,10,26] 。さらに、FWおよびSWにおけるアトランティックサーモンの腸内コア微生物叢にLactobacillusが存在することが報告されている[26]。さらに、RASシステムにおいて、アトランティックサーモンのFWの腸内コア微生物叢の中にLactobacillus属の存在が確認された[9]。本研究では、分析した腸内細菌叢にLactobacillus属は存在しなかった。しかし、32PSU-GSCの腸内細菌叢からは、Lactobacillales目に属するStreptococcus thermophilusが同定された。我々は、本研究でLactobacillus属が検出されなかったのは、使用したDNA抽出方法の結果であると仮定している[49]。また、16Sライブラリー調製に用いたTaq Polymeraseが、Lactobacillus属の検出に不利であったという説明もできる[50]。

ナノポアシーケンスによる16S rRNAの完全なシーケンスの利点は、微生物叢のメタゲノムを推定することができることである。本研究では、16SからV3-V4領域を用いて、機能解析を行った。しかし、本研究で得られたアトランティックサーモン腸内細菌叢は、他の研究と比較していくつかの相違点が見られた。例えば、サケのFW微生物叢では、Carbohydrate Metabolisms、TCA cycle、Lipid Biosynthesis、Fatty Acid Biosynthesis、Oxidative phosphorylationに関連した機能の割合が高いことが報告されている[26]。しかし，SWでは，魚類微生物相はCarbohydrate Metabolism，Amino Sugar and Nucleotide Sugar Metabolism，Glycolysis/Gluconeogenesisといった経路に高い濃縮度を示した．さらに、Lorgen-Ritchieらによって、FWとSWにおけるアトランティックサーモン腸内細菌叢の代謝過程の違いが報告された[9]。本研究では、SW群の腸内細菌叢は、糖質分解、細胞構造、二次代謝産物分解に関連する経路の相対的存在度が高いことが示された。特に、FWとSWの微生物叢のメタゲノム解析では、TCAサイクル、脂肪酸と脂質の生合成、ヌクレオシドとヌクレオチドの生合成、アミノ酸の生合成の比率が高いことが示された。一般に、腸内魚類のメタゲノム機能研究では、Amino Acid Biosynthesisが際立っている[51]。さらに、バリン、ロイシン、イソロイシンは魚類にとって必須代謝物である[52]。32 PSU-FDの魚類腸内細菌叢は、アミノ酸生合成の濃度が最も高いことを示した。また、32PSU-SSの魚類腸内細菌叢は、予想に反して2位であった。しかし、必須アミノ酸の分解経路に着目すると、GSCよりもFDおよびSS処理でより有利であることがわかった。芳香族化合物分解は、処理間で最も大きな差がある経路である。芳香族アミノ酸、植物成分、薬剤、添加物、着色料、汚染物質などは、腸内の芳香族化合物の供給源の一部である[53]。したがって，FDとGSCは，芳香族化合物を炭素源として利用し，魚の腸内に存在する細菌から毒素を排除する上で，SSよりも有利であると考えられる．

飼料中の機能性成分に関する研究中に蓄積された知見に関しては、必須脂肪酸、ヌクレオチド、酵母細胞壁、プレバイオティクスなどの機能性成分が、腸内魚類微生物叢の調節に関連しているという強い証拠が存在する[10,54]。例えば，機能性成分を添加したアトランティックサーモンを海水中で44週間飼育すると，通常の餌を与えたサケと比較して，プロテオバクテリアとマイコプラズマが多く存在することが観察されている[10]．さらに、機能性成分を摂取したスズキ（Dicentrarchus Labrax）の微生物相の多様性に高い差があることが報告されている[54]。さらに、FIを用いたシーバスの給餌は、Vibrionalesなどの潜在的な病原性細菌を減少させる[54]。注目すべきは、本研究で得られた結果で、FDを給餌した魚は、他の実験グループよりも高い細菌属の豊富さを示したことである。さらに、32 PSUでFDを給餌したアトランティックサーモンは、他の実験グループと比較して、ビブリオ属の存在量が少なかった。このように、機能性成分は魚の免疫系を改善するほか、魚の微生物叢の存在量や豊富さにも影響を与えることがわかった。

本結果は、スモルトの状態を判断するためのサケの微生物相研究の可能性を示している。また、塩分濃度の緩やかな変化により、サケの微生物叢が増加し、健康状態が改善することが実証された。アトランティックサーモンの移植を実施する際、徐々に海水にさらすことで、移植の成功率を高めることができると考えられる。現在、サケ産業は、海水への曝露を減らす戦略として、海水へ移す前にRAS条件下での魚の時間を増やしている[55]。このように、産業界はRASシステムで徐々に塩分濃度を変化させることを実施し、海水でのサケのパフォーマンスを向上させることができる。

  1. 5.結論
    多様性指数の違いは、FWからSWへの移行期間中のアトランティックサーモンの腸内細菌叢の変化を示している。塩分濃度の緩やかな変化にさらされたアトランティックサーモンの腸内細菌叢では、豊かさと多様性指数がより顕著であった。プロテオバクテリアはすべての群で優勢であったが、すべての条件下で下位分類群に変動がみられた。Escherichia/ShigellaはSW微生物叢の一部として高濃度で検出された。また、処理区間での分類学的な差異にもかかわらず、分析した代謝経路のうち有意な差異を示した割合は低く、その多くは生合成に関連するものであった。最後に、本研究は、スモルト化時に緩やかな塩分変化にさらされたアトランティックサーモンの腸内細菌叢を評価した最初の研究であり、このSWへの移行方法が魚の微生物叢の多様性を高め、その結果、健康状態を向上させることを示している。

補足資料
以下の補足資料は、https://www.mdpi.com/article/10.3390/microorganisms11010076/s1；図S1：実験デザイン；図S2：鰓フィラメント上皮における塩化物細胞の局在；図S3：鰓フィラメント上皮における塩化物細胞の局在；でダウンロードできる。ATPase-αおよびATPase-βサブユニットのRT-qPCR解析；図S4: 希釈曲線、図S5：模擬コミュニティ組成、表S1：配列データレポート、表S2：完全なNanoCLUST分類クラスタ、表S3：R with Vegan Packageで計算した腸サンプルのブレイ・カーティス類似度、表S4：腸サンプルのブレイ・カーティス類似度、表S5：腸サンプルのブレイ・カーティス類似度。NanoCLUSTによるクラスタの種レベルでの平均同一性パーセント。16S rRNA遺伝子の全塩基配列に基づく同一性パーセントが98.7以上、相対的存在量が0.2％以上の種; Table S5: PICRUSt2によって推定された淡水（FW）と異なる海水処理における完全代謝MetaCycパスウェイ存在量.

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助成金について
本研究は、ANID-ChileからPostdoctoral grant FONDECYT (3190320), grants FONDAP (15110027), FONDECYT (1210852), FONDECYT (11220307), Postdoctoral grant FONDECYT (3200600) を通じて資金提供されたものである。

執筆協力
構想、M.F.M.-R., D.V.-M., G.N.-A., V.V.-M.; データキュレーション、M.F.M.-R.; 形式分析、M.F.M.-R.; 資金獲得、D.V. -M., C.G.-M., D.V.-A., V.V.-M. M., C.G.-E., and V.V.-M.; 調査、M.F.M.-R., B.P.B., and V.V.-M.; 方法論、M.F.M.-R., D.V.-M., G.N.-A, B.P.B., C.G.-E., and V.V.-M.、プロジェクト管理、V.V.-M.、リソース、C.G.-E.、スーパービジョン、C.G.-E. and V.V.-M., Visualization, M.F.M.-R. 執筆-原案, M.F.M.-R. and V.V.-M.; 執筆-レビューと編集, D.V.-M., G.N.-A., C.G.-E. and V.V.-M. すべての著者がこの原稿を読み、同意している。

データの利用可能性に関する声明
該当なし。

利益相反
著者らは利益相反を宣言していない．

脚注
免責事項/出版社からの注意事項：すべての出版物に含まれる声明、意見およびデータは、個々の著者および寄稿者のものであり、MDPIおよび/または編集者のものではありません。MDPIおよび/または編集者は、コンテンツで言及されたアイデア、方法、指示、または製品に起因する人または財産の損害について責任を負わないものとします。

記事情報
マイクロオーガニズム 2023 Jan; 11(1): 76.
2022年12月27日オンライン公開 doi: 10.3390/microorganisms11010076
PMCID: PMC9865641
PMID: 36677368
María F. Morales-Rivera,1,2 Diego Valenzuela-Miranda,1,2,3 Gustavo Nuñez-Acuña,1,2 Bárbara P. Benavente,1,2 Cristian Gallardo-Escárate,1,2 and Valentina Valenzuela-Muñoz1,2,3,* （英語）。
Jarl Bøgwald 学術担当編集者
1コンセプシオン大学水産養殖学際研究センター（INCAR）、コンセプシオン、4030000、チリ
2コンセプシオン大学海洋学部生物工学・水圏ゲノム研究室 〒4030000 チリ共和国コンセプシオン市旭町1-1-1
3コンセプシオン大学バイオテクノロジーセンター（チリ、コンセプシオン、4030000番地
*Correspondence: lc.cedu@aleuznelavelav; Tel: +56-41-2204402
Received 2022 Oct 26; Revised 2022 Dec 7; Accepted 2022 Dec 20.
Copyright © 2022 by the authors.
ライセンシー：MDPI, Basel, Switzerland. この記事は、クリエイティブ・コモンズ表示（CC BY）ライセンス（https://creativecommons.org/licenses/by/4.0/）の条件に基づいて配布されるオープンアクセス記事です。
Microorganismsからの記事はMultidisciplinary Digital Publishing Institute (MDPI)の提供でここに提供されます。
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