糞便微生物叢移植は空腸Th17/Treg細胞のバランスをとることでニワトリの成長成績を改善する

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公開日：2023年6月21日
糞便微生物叢移植は空腸Th17/Treg細胞のバランスをとることでニワトリの成長成績を改善する

https://microbiomejournal.biomedcentral.com/articles/10.1186/s40168-023-01569-z

ジユー・マー
ムハンマド・アクタル
...
劉華振
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マイクロバイオーム第11巻、論文番号：137（2023） この記事を引用する
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指標詳細
概要
背景
腸内炎症は、世界中で鶏の生産における脅威的な懸念となっており、Th17/Treg細胞の不均衡と密接に関連している。いくつかの研究では、腸内細菌叢が腸管免疫ホメオスタシスと免疫細胞分化を調節することにより、ニワトリの成長に大きく関与していることが報告されている。糞便微生物叢移植（FMT）により腸内細菌叢を再構築することで、Th17/Treg細胞のバランスを整えることでニワトリの成長を改善できるかどうかは興味深い問題である。
結果
ここでは、Th17細胞とTreg細胞を比較するために、3つの異なる品種（トルファン闘鶏×白色レグホーン鶏、白色羽毛鶏、黄色羽毛鶏）の体重が有意に異なる鶏を用いた。qPCRとIHC染色の結果、Th17細胞関連転写因子Stat3とrorγt、サイトカインIL-6、IL-17A、IL-21が空腸で有意に（P < 0. 05）高く、一方、Treg細胞関連転写因子foxp3およびサイトカインTGF-βおよびIL-10は、低体重鶏の空腸で有意に（P < 0.05）低く、Th17/Treg細胞のアンバランスが鶏の成長成績と密接に関連していることが示された。成長成績が良く、糞便中の乳酸菌が豊富な健康なドナーの糞便微生物叢を生後1日のヒナに移植すると、成長成績が著しく向上し（P < 0.001）、Th17細胞関連の転写因子およびサイトカインが有意に減少し、空腸のTreg細胞関連の転写因子およびサイトカインが増加した（P < 0.05）。さらに、FMTは乳酸菌の量を増加させた（FMT vs Con; 84.98% vs 66.94%）。さらに、セロトニン、インドール、5-メトキシインドール酢酸を含むトリプトファンの代謝産物も増加し、それらの受容体であるアリール炭化水素受容体（AhR）を活性化し、Th17/Treg細胞のバランスと免疫恒常性を維持するためにCYP1A2とIL-22をより多く発現した。
結論
これらの結果から、Th17/Treg細胞のバランスが崩れるとニワトリの成長成績が低下する一方、FMTによって腸内細菌叢が新しくなると、すなわち乳酸菌が増えると、Th17/Treg細胞のバランスが保たれ、ニワトリの成長成績が向上することが示唆された。
ビデオ要旨
はじめに
慢性的な腸内炎症は飼料摂取量と栄養の消化吸収を低下させ、常在菌バランス、バリア透過性、粘膜構造生理、免疫反応、ホメオスタシスを調節し、鶏の成長成績の低下をもたらす[1,2,3]。腸炎をいかに減少させ、鶏の成長成績を向上させるかは、世界の鶏生産において特別な関心事となっている[4]。腸内には、ヘルパーT（Th）細胞や制御性T（Treg）細胞など多くの免疫細胞が存在し、これらが協力して免疫反応のバランスを保っている。そうでなければ、このバランスが崩れ、腸炎を引き起こすことになる。腸管免疫細胞は、慢性腸炎中のニワトリ腸において、炎症性サイトカイン、すなわちインターロイキン（IL）-6やIL-1βを多く産生し、抗炎症性サイトカイン、すなわちIL-10やトランスフォーミング増殖因子-β（TGF-β）を少なく産生した［6,7,8］。他の研究では、炎症性サイトカインは主にTh細胞、特にTh17細胞によって産生され、抗炎症性サイトカインは主にTreg細胞によって産生されることが示された [9, 10]。さらに、慢性腸炎は、レチノイド関連オーファン受容体γt（rorγt）やフォークヘッドボックスP3（foxp3）などの重要な転写因子や、IL-6、IL-1β、IL-17A、IL-17F、IL-21、IL-10、TGF-βなどの主要なサイトカインを介して、不均衡なTh17細胞とTreg細胞と密接に関連していることが立証されている［11,12,13］。例えば、IL-6は、IL-23R依存性のStat3シグナル伝達を介して、シグナル伝達物質および転写活性化因子3（Stat3）のリン酸化を引き起こし、rorγtを誘導し、Th17細胞の分化を促進し、腸の炎症を悪化させる [14, 15]。慢性的な腸の炎症が介在するIL-1βの分泌もTh17細胞の蓄積を促進し、Th17細胞はIL-17AとIL-17Fを産生し、腸の炎症を悪化させる [16]。同様に、IL-21もTh17細胞の分化にStat3シグナルに依存し、Treg細胞の機能も阻害するため、腸炎症におけるTh17細胞の分化を促進する［15, 17］。一方、TGF-βはナイーブCD4+ T細胞を刺激し、foxp3転写の活性化を誘導し、その結果Treg細胞の分化を促進し、他のT細胞の活性化を抑制し、免疫応答を制御することで炎症を制御する [14, 18]。我々の以前の研究で、高体重のニワトリと低体重のニワトリの十二指腸、空腸、回腸、盲腸の炎症レベルを比較したところ、空腸の炎症レベルはIL-10の発現量が高いほど有意に異なることがわかった、 IL-4、TGF-βの発現量が高く、IL-1β、IFN-γ、TNF-αの発現量が低いことがわかった（未発表データ）。これは、Treg細胞関連サイトカインの増加による空腸の炎症レベルの低下が、ニワトリの成長成績と密接に関係していることを示唆している。その上、空腸は効率的な栄養吸収／摂取のために最大の表面積を持つユニークな特徴を持っている。もし炎症がその構造を破壊すれば、成長成績は大きく影響されるだろう[2]。したがって、空腸のTh17/Treg細胞のバランスをとることは、鶏の成長成績を向上させるために重要である。
腸内細菌叢は腸管免疫ホメオスタシスと密接に関連しており、腸管炎症の予防に大きく寄与している［19, 20］。さらなる研究により、腸内細菌叢はTh17/Treg細胞のバランスをとることで免疫ホメオスタシスを制御できることが示された［21, 22］。例えば、バクテロイデス・フラジリス（Bacteroides fragilis）とビフィドバクテリウム・インファンティス（Bifidobacterium infantis）は、foxp3の発現を増加させることでTreg細胞を誘発し [14, 23]、ラクトバチルス・プランタラム（Lactobacillus plantarum）は、免疫抑制マウスにおいてTh17/Treg細胞のバランスを制御し [24] 、宿主の腸内恒常性を維持している。糞便微生物移植（FMT）が腸内細菌叢を再構築する効果的な方法であることが報告されている［25］。例えば、FMTは微生物の多様性と豊かさを高め[26]、ニワトリの成長成績を向上させる可能性がある[27]。また、確立された腸内細菌叢が腸の炎症を緩和することにより、鶏の成長成績を向上させることが報告されている[2]。したがって、FMTがTh17/Treg細胞のバランスをとることによって鶏の成長成績を改善できるかどうかは、興味深い疑問となっている。
この疑問に答えるため、第一に、Th17/Treg細胞のアンバランスと成長成績の低下との関連を解明するために、本研究では3つの異なる鶏種（トルファン闘鶏×白色レグホーン鶏、白色羽毛鶏、黄色羽毛鶏）の成長成績が有意に異なる鶏を用いた。次に、腸内細菌叢の早期コロニー化がTh17/Treg細胞のバランスを維持することで成長成績を改善できるかどうかを検証するために、成長成績の良い健康なドナー鶏の糞便微生物叢を1日齢のヒナに移植することを達成した。さらに、FMTがTh17/Treg細胞のバランスをとることによって、どのように成長成績を向上させるかについても検討した。
結果
高体重ニワトリと低体重ニワトリの成長成績は有意に異なっていた
本研究では、3つの異なる鶏種（トルファン闘鶏×白色レグホーン鶏、白色羽毛鶏、黄色羽毛鶏）を用いて、それぞれ成長成績が有意に異なる個体を得た。体重（P < 0.0001）、脚筋重量（P < 0.01）および胸筋重量（P < 0.01）は、3品種とも高体重群の方が低体重群よりも有意に高かった（図1A）。さらに、ヘマトキシリン・エオジン（HE）染色の結果、片脚（P < 0.01）および胸筋（P < 0.0001）の筋細胞の断面積は、3品種とも高体重群で低体重群に比べ有意に大きかった（図1B）。これらの結果は、同様の飼育条件下で生育した3つの異なる品種の鶏が、成長成績に有意な差を示したことを示している。
図1
3品種（トルファン闘鶏×白色レグホーン鶏、白色羽毛鶏、黄色羽毛鶏）の高体重鶏と低体重鶏の成長成績の差。3品種（トルファン闘鶏×白色レグホーン鶏、白色羽毛鶏、黄色羽毛鶏）の鶏をすべて6週間育成した。A 高体重鶏と低体重鶏の体重、脚筋重量、胸筋重量の比較。B 高体重ニワトリと低体重ニワトリの脚および胸筋細胞の断面積の比較（H & E染色）。スケールバー、100μm。データは平均値±SEMで示す。*p < 0.05, **p < 0.01, ***p < 0.001, ****p < 0.0001。H：高体重群（n = 10）；L：低体重群（n = 10）
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Th17/Treg細胞のアンバランスがニワトリの成長成績を有意に低下させた
免疫細胞のアンバランスは通常、腸の炎症性疾患を引き起こし、成長成績を低下させる[28]。Th17細胞とTreg細胞は腸において非常に重要な免疫細胞である。そこで、空腸のTh17細胞とTreg細胞に関連する転写因子とサイトカインを高体重のニワトリと低体重のニワトリで比較した。mRNAレベルでは、Th17細胞に関連するレチノイド関連オーファン受容体γt（rorγt）、インターロイキン（IL）-6、IL-17A、IL-21、シグナル伝達および転写活性化因子3（Stat3）の相対発現量は、高体重群と比較して低体重群で有意に（P < 0.05）高かった（図2A）。しかし、Treg細胞に関連するフォークヘッドボックスP3（foxp3）、トランスフォーミング成長因子-β（TGF-β）およびインターロイキン-10（IL-10）の相対的mRNA発現は、低体重群の方が高体重群よりも有意に（P＜0.05）低かった（図2B）。タンパク質レベルでは、rorγtの発現が有意に（P < 0.001）高かったが（図2C）、foxp3の発現は3品種とも低体重の鶏で有意に（P < 0.01）低かった（図2D）。以上の結果から、Th17細胞の増加とTreg細胞の減少が鶏の成長成績を低下させることが示された。
図2
空腸におけるTh17/Treg細胞関連転写因子およびサイトカインの発現を3品種（トルファン闘鶏×白色レグホーン鶏、白色羽鶏、黄色羽鶏）の高体重鶏と低体重鶏で比較した。A 低体重鶏と高体重鶏の空腸におけるTh17細胞関連転写因子およびサイトカインの相対的mRNA発現量の比較（qPCR）。B 低体重ニワトリと高体重ニワトリの空腸におけるTreg細胞関連転写因子およびサイトカインの相対的mRNA発現量の比較（qPCR）。C 低体重ニワトリと高体重ニワトリの空腸におけるrorγtのタンパク質発現レベルの比較（免疫組織化学染色）。D 低体重ニワトリと高体重ニワトリの空腸におけるfoxp3のタンパク質発現レベルの比較（免疫組織化学染色）。スケールバー、100μm。データは平均値±SEMで示す。*p < 0.05, **p < 0.01, ***p < 0.001, ****p < 0.0001。IOD、積算光学濃度；H、高体重群（n = 10）；L、低体重群（n = 10）
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糞便微生物叢移植は、ニワトリの成長パフォーマンスを有意に改善し、Th17/Treg細胞のバランスを整える可能性がある
腸内細菌叢を再構築することで、Th17/Treg細胞のバランスを整え、ニワトリの成長パフォーマンスを改善できるかどうかを調べるため、糞便微生物叢移植（FMT）実験を行った。その結果、体重（FMT対Con、627.40±7.35g対567.30±3.89g、P＜0.0001）、脚筋重量（FMT対Con、41.33±0.55g対37.07±0.66g、P＜0.001）、胸筋重量（FMT対Con、61.23±1.68g対51.44±1.50g、P＜0.01）は、対照群と比較してFMT群で有意に高かった（図3A）。空腸長（FMT群 vs Con群、745.3±32.79cm vs 650.9±22.17cm）もFMT群が対照群より有意に（P＜0.05）長いことが観察された（図3A）。HE染色の結果、空腸絨毛の長さ（FMT群 vs Con群、1499±26.87μm vs 853.6±58.82μm、P＜0.0001）はFMT群で対照群に比べ有意に大きかった（Fig. 3B）、単脚筋細胞（FMT vs Con、48.45±2.92μm2 vs 29.99±1.66μm2、P＜0.0001）および単胸筋細胞（FMT vs Con、25.99±0.69μm2 vs 19.37±0.31μm2、P＜0.0001）の平均断面積もFMT群で有意に大きかった（図3C）。さらに、foxp3（FMT vs Con、1.41±0.27 vs 0.79±0.07、P＜0. 05）、TGF-β（FMT vs Con、1.22±0.24 vs 0.64±0.073、P＜0.05）、IL-10（FMT vs Con、1.46±0.27 vs 0.58±0.17、P＜0.05）などの転写因子やサイトカインは、FMT群で有意に高かった（Fig. 3D）、Th17細胞関連転写因子およびサイトカインであるrorγt（FMT vs Con、0.82±0.14 vs 1.87±0.20、P＜0.01）、Stat3（FMT vs Con、0.84±0.12 vs 1.53±0.26、P＜0.05）、IL-6（FMT vs Con、0. 66±0.13対1.62±0.39、P＜0.05）、IL-17A（FMT対Con、0.78±0.11対2.16±0.54、P＜0.05）、IL-21（FMT対Con、0.85±0.10対1.136±0.05、P＜0.05）はFMT群で有意に低かった（図3E）。さらに、タンパク質レベルでは、IHCの結果、foxp3の発現（FMT vs Con、290.60±2.05 vs 98.33±14.30、P＜0.001）はFMT群で有意に高く、rorγtの発現（FMT vs Con、117.70±23.38 vs 557.00±34.50、P＜0.001）はFMT群で有意に低いことが示された（図3F）。以上の結果から、FMTはニワトリの成長成績を有意に改善し、空腸においてTh17細胞を減少させ、Treg細胞を増加させることが示された。
図3
糞便微生物叢移植（FMT）がニワトリの空腸における成長成績およびTh17/Treg細胞関連因子に及ぼす影響。A FMT群と対照群の体重、脚筋重量、胸筋重量、空腸長の比較。B FMT群と対照群の空腸絨毛の長さの比較（H & E染色）。スケールバー、500μm。C FMT群と対照群間の片脚および乳房筋細胞の断面積の比較（H & E染色）。スケールバー、100μm。D FMT群と対照群の空腸におけるTreg細胞関連因子の相対mRNA発現量の比較（qPCR）。E FMT群と対照群の空腸におけるTh17細胞関連因子の相対的mRNA発現量の比較（qPCR）。F FMT群と対照群の空腸におけるfoxp3とrorγtのタンパク質発現レベルの比較（免疫組織化学染色）。スケールバー、100μm。IOD、積算光学密度。データは平均値±SEMで示した。*p < 0.05, **p < 0.01, ***p < 0.001, ****p < 0.0001。FMT：糞便微生物叢移植群（n＝10）；Con：対照群（n＝10）
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糞便微生物叢移植は空腸の乳酸菌量を有意に増加させた
FMTが、腸内細菌叢を再構築することによって、ニワトリの成長パフォーマンスを改善し、Th17/Treg細胞のバランスを改善したかどうかを明らかにするために、16S rRNA遺伝子配列決定を行い、FMT群と対照群の空腸内容物の細菌群集組成を比較した。微生物の多様性（Shannon index）は、FMT群では有意ではなかったが、顕著に低かった（図4A）。しかし、微生物量（Chao index）はコントロール群に比べFMT群で有意に（P < 0.01）低く（図4B）、微生物叢移植が微生物群集の多様性を明確に変化させた可能性が示された。属レベルでは、乳酸菌の相対的存在量はFMT群で高く（FMT vs Con、84.98％ vs 66.94％）、日和見病原体、すなわち腸球菌（FMT vs Con、4.42％ vs 19.42％）および連鎖球菌（FMT vs Con、1.53％ vs 4.58％）の相対的存在量は対照群と比較してFMT群で低かった（図4C）。さらに、属レベルでの細菌群集の差異分析、すなわち線形判別分析効果量（LEfSe）では、乳酸桿菌、Gardnerella、およびg_norank_f_Actinomycetaceaeのような一部の細菌の相対的存在量がFMT群で高く、EnterococcusおよびStreptococcusのような一部の日和見病原性細菌の相対的存在量がFMT群と比較して対照群で高いことが示された（図4D）。シーケンシングの結果、FMTは乳酸菌を増加させ、日和見病原性細菌を減少させることが示された。
図4
レシピエント鶏の空腸の微生物群集に対する糞便微生物叢移植（FMT）の効果。A FMT群と対照群の空腸微生物叢の多様性（Shannon index）の比較。B FMT群と対照群の空腸微生物叢の豊かさ（チャオ指数）の比較。C属レベルで、FMT群と対照群間の乳酸桿菌の相対存在量の比較。D FMT群と対照群間の乳酸桿菌、ガルドネレラ菌、放線菌、その他の菌の相対存在量の比較。LDAスコア≧2。**P < 0.01. FMT、糞便微生物叢移植群（n = 10）；Con、対照群（n = 10）
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増加した乳酸菌はトリプトファンシグナル経路でより多くの代謝産物を産生した
乳酸菌が特殊な代謝産物を産生することにより、鶏の成長パフォーマンスを向上させることが確立されている。液体クロマトグラフィー・タンデム質量分析（LC-MS）を行い、FMT群と対照群の空腸内容物における代謝物の濃縮度を比較した。部分最小二乗弁別分析（PLS-DA）モデルでは、両群間で代謝物が有意に分離していた（Q2＞0.5）（図5A）。投影における変数の重要度（VIP > 1）に基づく上位40の顕著に（P < 0.05）異なる代謝物の中で、トリプトファン、およびセロトニン、インドール、5-メトキシインドール酢酸を含むその3つの主要なトリプトファン代謝物は、FMT群の空腸内容物に有意に（P < 0.05）濃縮された（図5B）。KEGG機能解析ではさらに、トリプトファン代謝経路は、ベンゾオキサジノイド生合成経路、ゼアチン生合成経路、ビオチン代謝経路、グルコシノレート生合成経路と比較して、有意に（P < 0.0001）高い濃縮度と影響を持つことが示された（図5C）。トリプトファン代謝物の受容体であるアリール炭化水素受容体（AhR）シグナル伝達経路は、Th17/Treg細胞のバランスをとることで腸の炎症を改善することに関与していることから、両群の空腸におけるAhR受容体およびその応答遺伝子であるチトクロームP450ファミリー1サブファミリーAポリペプチド2（CYP1A2）、IL-22の発現レベルを調べた。その結果、AhR（FMT群 vs Con群、1.75±0.22 vs 0.91±0.09、P＜0.01）、CYP1A2（FMT群 vs Con群、2.66±0.50 vs 0.54±0.13、P＜0.01）、IL-22（FMT群 vs Con群、2.09±0.39 vs 0.97±0.18、P＜0.05）の相対的mRNA発現量は、対照群と比較してFMT群で有意に高かった（図5D）。同様に、IHCの結果、AhRのタンパク質発現（FMT vs Con、230.30±28.87 vs 85.33±2.91、P＜0.01）もFMT群で有意に高かった（図5E）。スピアマン相関分析によると、乳酸菌の相対量はセロトニン、インドール、5-メトキシインドール酢酸と正の相関があった（P < 0.05）（図5F）。これらの結果は、乳酸菌の存在量が多いほどトリプトファン代謝が促進され、AhR代謝経路を調節することによって腸内代謝産物が調節され、その結果、FMTニワトリの空腸においてTh17/Treg細胞のバランスを維持できることを示していた。
図5
糞便微生物叢移植（FMT）はレシピエントニワトリの空腸の代謝物プロファイルを顕著に変化させる。A FMT群と対照群の空腸内容物のメタボロームプロファイルの比較（部分最小二乗判別分析）。B FMT群と対照群の40種類の代謝物のヒートマップ比較。C FMT群と対照群の代謝物経路濃縮解析の比較。Dトリプトファン代謝物受容体アリール炭化水素受容体（AhR）、CYP1A2、IL-22のmRNA相対発現量をFMT群と対照群で比較した（qPCR）。E FMT群とコントロール群間のアリール炭化水素受容体（AhR）のタンパク質発現レベルの比較（免疫組織化学染色）。スケールバー、100μm。F 空腸内細菌叢の差とトリプトファン代謝産物とのスピアマンの相関のヒートマップ。データは平均値±SEMで示した。*p < 0.05、p < 0.01。FMT、糞便微生物叢移植群（n = 10）、Con、対照群（n = 10）。PLS-DAモデルの投影における変数重要度（VIP）の値が1以上の代謝物
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トリプトファンシグナル経路における代謝産物の増加は、Th17/Treg細胞のバランスと密接に関連していた
スピアマン相関分析を用いて、トリプトファン代謝産物、空腸内細菌叢、Th17/Treg関連転写因子、サイトカインと成長成績との関係を調べた。解析の結果、乳酸菌、セロトニン、インドール、5-メトキシインドール酢酸トリプトファン代謝産物の相対量は、成長成績およびTreg細胞関連の転写因子やサイトカイン（foxp3、IL-10、TGF-βなど）と正の相関を示し（図6）、Th17細胞関連の転写因子やサイトカイン（rorγt、Stat3、IL-6、IL-17A、IL-21など）とは負の相関を示した（図6）。一方、日和見病原細菌である腸球菌とレンサ球菌は、増殖能やTreg細胞関連の転写因子やサイトカインと負の相関を示し、Th17細胞関連の転写因子やサイトカインと正の相関を示した（図6）。
図6
空腸内細菌叢の差、トリプトファン代謝産物、Th17/Treg細胞関連転写因子およびサイトカインと成長成績との間のスピアマンの相関のヒートマップ。色は青（負の相関）から赤（正の相関）まで。*P < 0.05およびP < 0.01
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考察
Th17細胞とTreg細胞はCD4+ T細胞から分化し、相乗的に腸管免疫機能に関与している[29]。Th17細胞はしばしば自己免疫／炎症に関与するのに対し、Treg細胞は相互に働くため、Th17／Treg細胞のバランスは腸管免疫恒常性の維持に極めて重要であることが確立されている［22, 29］。Th17細胞および/またはTreg細胞の分化を変化させると、腸のホメオスタシスが不安定になり、これはTh17/Treg細胞のアンバランスに起因している [30]。別の研究では、病原性Th17細胞はTregの生成を抑制し、炎症の発症に寄与すると報告している [31]。このように、アンバランスなTh17/Treg細胞は全身の炎症を増強し、栄養の消化吸収を損ない、鶏の体重増加を減少させる。科学者たちは、IL-6が介在するStat3が、核内受容体rorγtを誘導することにより、Th17細胞の分化に不可欠な転写因子として働くことを発見し [33]、一方、TGF-βはfoxp3の転写を刺激し、続いてTreg細胞の分化を促進する [18]。Th17細胞の増加は、炎症を起こした粘膜でrorγt、IL-17A、IL-17F、IL-21を発現することにより、炎症性腸疾患（IBD）や大腸炎の病因と関連している [34, 35]。大腸炎の病態では、IL-17AとIL-17Fの両方が腸の炎症発症に関与していることが示されている。しかしながら、Treg細胞関連転写因子であるfoxp3は、Th17細胞の転写能を阻害することにより、Th17細胞の極性化を制限しており [33]、これらの細胞間の複雑な相互作用を示唆している。最近の証拠によると、foxp3とその関連サイトカインであるTGF-βとIL-10は、ニワトリの腸においてTh17/Treg細胞のバランスを維持することが観察された[37, 38]。本研究では、3品種すべての低体重鶏の空腸において、IL-6、Stat3、およびrorγtのmRNA発現が上昇したことから、Th17細胞の分化が高いことが示され、3品種すべての低体重鶏の空腸において、TGF-βおよびfoxp3のmRNA発現が低下したことから、Treg細胞の分化が低いことが示された。一般的に、IL-17AとIL-21の相対的mRNA発現量は低体重鶏で有意に高く、IL-10の相対的mRNA発現量は低体重鶏で有意に低かったことから、Th17/Treg細胞のアンバランスが腸炎を引き起こし、鶏の成長パフォーマンスを低下させることが示された。したがって、腸内のTh17/Treg細胞のバランスを整えることは、鶏の成長成績を改善する有効な方法かもしれない。
腸内細菌叢は腸管免疫恒常性と主に関連しており、腸管炎症を予防することが立証されている[19, 20]。腸内細菌叢のバランスが乱れると、腸の炎症が悪化する [39]。近年、糞便微生物叢移植（FMT）は、乱れた微生物群集を再確立する有用な技術として台頭してきており、鶏の成長に効果的に寄与している[40]。そこで本研究では、FMTがレシピエントヒナの腸内細菌叢を再構築し、その成長パフォーマンスを向上させることができるかどうかを明らかにした。興味深いことに、FMT群では対照群と比較して、体重、胸筋／脚筋重量、胸筋／脚筋の平均面積が有意に増加し、微生物叢移植と鶏の成長との関連性が示された。また、ニワトリの成長が腸の効果的な粘膜生理と関連していることはよく知られており、これは栄養消化を促進するような腸管構造、特に絨毛の高さ、栄養吸収に十分な表面積を提供することに依存している[41]。本研究では、FMTによって空腸の空腸長と絨毛長が顕著に増加したことから、糞便懸濁液の移送が腸管構造に有益な効果を及ぼし、その結果、栄養の消化・吸収が促進されたことが示された。注目すべきは、潜在的なプロバイオティクスである乳酸桿菌が、ヒトと動物の腸の両方で優勢な細菌として認識されていることである。乳酸菌の競争的排除は腸内細菌叢の平衡に大きな影響を及ぼし、有用な細菌、すなわちビフィズス菌を奨励し、好ましくない細菌、すなわちブドウ球菌、大腸菌、連鎖球菌を抑制する［42, 43］。これらの知見と一致して、我々はまた、FMT群の空腸でより高い乳酸桿菌の存在量を観察し、鶏における乳酸桿菌の成長促進能を示唆した。一方、Steckらは炎症性腸疾患患者の血清中に腸球菌に関連する特異的抗体を発見し、腸球菌が上皮バリアを破壊し、腸の炎症に寄与していることを示した[44]。蓄積された証拠から、腸内細菌叢はTh17/Treg細胞のバランスをとることで免疫恒常性を制御することが明らかになった [21, 22]。そこで次に、FMTがTh17/Treg細胞の関連転写パラメーターおよびサイトカインパラメーターを調節できるかどうかを調べた。本研究では、FMT群の空腸においてfoxp3、TGF-β、IL-10の相対mRNA発現が上昇し、対照群の空腸においてrorγt、Stat3、IL-6、IL-17A、IL-21の相対mRNA発現が上昇したことから、ニワトリ空腸における腸内細菌叢の早期コロニー形成が、それらの関連転写因子やサイトカインを制御することによってTh17/Treg細胞のバランスを維持していることが示された。興味深いことに、FMT群におけるTh17/Treg細胞のバランスに関する我々の知見は、高体重のニワトリと一致しており、糞便微生物叢の移入がTh17/Treg細胞のバランスを整えることによってニワトリの成長パフォーマンスを高める可能性があることを明らかにした。しかし、糞便懸濁液には乳酸菌以外にもいくつかの細菌が含まれているため、他の細菌が相乗作用を示すかどうかについてはさらなる研究が必要である。
最近のエビデンスにより、腸内細菌叢由来の代謝産物は、主にTh17/Treg細胞のバランスをとることにより、宿主免疫系を制御して腸の恒常性を維持することが明らかになった[22, 45]。一般的に、トリプトファンはニワトリにおいて重要な意味を持つ。なぜなら、腸内細菌叢はトリプトファンに直接的または間接的に影響を与え、アリール炭化水素受容体（AhR）、セロトニン、インドールおよび／またはその誘導体のリガンドに変換するからであり [45, 46]、乳酸菌はこれらの代謝産物を産生する可能性のある細菌である [47, 48]。Fouadらは、トリプトファンが主に善玉菌、すなわち乳酸菌やビフィズス菌を増殖させ、有害菌である大腸菌を抑制することに関与していると報告している[49]。本研究では、代謝物KEGGパスウェイ濃縮マップにより、トリプトファン代謝が最も重要なパスウェイであることが明らかになり、セロトニン、インドール、5-メトキシインドール酢酸もFMT群で有意に高く、鶏の成長におけるこれらの代謝物の役割が示された。興味深いことに、我々の結果は、最近報告されたインドールが腸症を改善することによって腸のバリア機能を強化すること[50]や、セロトニンが栄養素の吸収や免疫反応に関与すること[27]を示す知見と一致している。さらにSaeediらは、乳酸菌が産生する5-メトキシインドール酢酸が、腸から肝臓に移行して肝代謝を促進することにより、肝毒性を保護することも発見した [51]。一方、別の研究では、トリプトファン代謝産物が、CD4+細胞をTreg細胞に再プログラムすることによって、Th17細胞の炎症性表現型への極性化を阻害することが示された [52]。特に、セロトニンはTh17細胞を抑制する一方でTreg細胞を促進し [53]、インドールもまたこれらの細胞を制御し、ニワトリのAhR活性化を介して組織傷害から腸を保護する [5]。本研究では、FMT群におけるトリプトファン代謝産物（セロトニン、インドール、5-メトキシインドール酢酸）およびTreg細胞の顕著な上昇とともに、乳酸菌の存在量の増加が、栄養吸収および免疫調節の増加による鶏の成長成績の向上への累積的効果を示唆し、これは上述の知見によって明確に支持された。また、AhRの活性化が腸のホメオスタシスの維持に重要であることも述べられている。リガンドと結合後、AhR は核に移動し、AhR nuclear translocator と結合してヘテロ二量体を形成し、異種物質応答性エレメントと結合することで標的遺伝子（CYP1A2）の発現を調節する[54, 55]。また、炎症時にはCYP1A2のダウンレギュレーションが観察され [56]、一方、AhRの活性化はCYP1A2の発現を促進することにより腸炎から腸上皮を保護すること [57,58,59]、インドール誘導体はAhRを活性化してIL-22の分泌を促進し、腸粘膜の防御を高めること [60]が分かっている。興味深いことに、本研究では、FMT群の空腸でAhR、CYP1A2、IL-22の発現が有意に上昇したことから、腸内細菌叢（おそらく乳酸菌）が産生する代謝産物が空腸を炎症から保護し、腸の恒常性を促進することが示された。これらの結果から、腸内細菌叢が産生する代謝産物はTh17/Treg細胞のバランスをとることでニワトリの成長を促進することが明らかになった。
結論
以上の結果から、Th17/Treg細胞のバランスが崩れると、ニワトリの成長成績が低下することが示唆された。一方、FMTでリフレッシュされた腸内細菌叢は、トリプトファンとその代謝産物であるセロトニン、インドール、5-メトキシインドール酢酸をより多く産生し、アリール炭化水素受容体（AhR）を活性化し、Th17/Treg細胞のバランスと免疫恒常性を維持するためにCYP1A2とIL-22をより多く発現させ、最終的にニワトリの成長成績を向上させた。
材料と方法
動物
華中農業大学Institutional Animal Care and Use Committee (HZAUCH-2018-008)より、動物実験に関連するすべての手順の承認を得ており、すべての方法は関連するガイドラインおよび規則で許可された通りに実施されている。
成長成績が有意に異なる鶏を得るため、本研究では、トルファン闘鶏×白色レグホーン鶏、白羽鶏、黄色羽鶏を含む孵化したばかりのヒナを用いた。本研究では合計600羽（各品種200羽）の鶏を用いた。華中農業大学の養鶏場で、3品種とも金属製ケージ（1ケージあたり5羽）で標準的な飼育条件下で飼育した。すべての鶏は餌と水に自由にアクセスでき、ワクチン接種も投薬もせず、トウモロコシと大豆のペレット飼料を与えた。生後6週目にすべての鶏の体重を測定し、各鶏種から体重の最も多い雄鶏10羽と最も少ない雄鶏10羽をそれぞれ選び、さらに研究を進めた。糞便微生物叢移植（FMT）実験では、同じ遺伝的背景を持つ1日齢のイエローフェザーの雄鶏60羽をレシピエントとして選んだ。
FMTドナーの選択
良好なFMTドナーを得るため、トルファン闘鶏×白色レグホーン鶏（3ヶ月齢）のうち、体重の多い鶏4羽（雄2羽、雌2羽）と体重の少ない鶏4羽（雄2羽、雌2羽）を選抜した。糞便中の微生物相を16S rRNA遺伝子配列決定法を用いて比較した。その結果、高体重のニワトリの乳酸菌相対量は低体重のニワトリに比べて有意に高かった。また、雌の高体重鶏の乳酸桿菌の相対量は雄の鶏のそれよりも有意に高かった（図S1A）。さらに、選択したドナー鶏の糞便細菌組成は週ごとに安定した変化を示し（図S1B）、FMT実験の4週間、レシピエント鶏に安定した細菌源を提供できることが示された。したがって、乳酸菌が最も豊富な高体重の雌鶏をFMTドナーとして選択した。
糞便懸濁液の調製
毎朝、ドナーのニワトリが排便したら、糞便の白い部分は尿酸を含むので取り除いた。次に、糞便7gを50mLの滅菌遠心チューブに採取し、生理食塩水（0.75％）と1：6の割合で混合した（糞便1gあたり生理食塩水6mLを混合）。その後、残渣が完全に沈殿するまで、滅菌チューブ内のミキサーをアイスボックスに入れた。その後、上清を回収した後、無菌ガーゼでろ過し、糞便懸濁液を得た。
動物実験
生後1日齢の雄イエローフェザーのヒナ60羽をレシピエントとして選択し、対照群とFMT群（n = 30）に無作為に分けた。FMT群の鶏には糞便懸濁液（1 mL）を経口投与し、対照群の鶏には0.75％生理食塩水（1 mL）を28日間毎日午後に経口投与した。すべてのニワトリは30日目に犠牲にされ、その後の分析のためにサンプルが採取された。
試料の採取
12時間の絶食後、すべての鶏の体重を測定し、犠牲にした。脚および胸筋の重量を測定し、空腸長も測定した。腸内細菌叢および非標的メタボロームプロファイルの解析のため、各鶏の空腸 13～15 cmを迅速に切除し、内容物（1羽あたり1～1.5 g）を滅菌遠心チューブ2本（1.5 mL）に採取し、液体窒素で急速凍結した後、配列決定用に-80℃で保存した。組織形態学的解析のために、新鮮な筋肉と空腸組織を4％パラホルムアルデヒド溶液で固定した。遺伝子発現解析のため、摘出した空腸切片を切り開き、0.75%食塩水で静かに洗浄した後、直ちに液体窒素で凍結し、-80℃の冷蔵庫で保存した。
ヘマトキシリン・エオジン染色
形態学的観察のため、下腿筋、胸筋、空腸の組織サンプルをパラフィンに包埋し、回転切片作製機（LEICARM2245、Leica、ドイツ）を用いて3μm厚の切片に切り出した。最後に、組織切片を標準的なヘマトキシリン-エオジン染色で、先に述べた研究 [2] の手順に従って染色した。
免疫組織化学染色
空腸におけるfoxp3、rorγt、AhRのタンパク質発現と分布は、我々の既発表文献[2]の手順に従って、免疫組織化学染色で検出した。空腸切片は、キシレン中で脱パラフィンし、勾配エタノール溶液で水和した。その後、抗原を修復するために、切片をクエン酸緩衝液に入れ、電子レンジで温めた後、室温で冷却した。内因性ペルオキシダーゼを不活性化するために、3％過酸化水素を適用し、非特異的結合部位は、組織切片を5％BSA中で37℃で30分間インキュベートすることによりブロックした。その後、ウサギ抗foxp3（1:300）（A12685、Abclonal、中国）、ウサギ抗rorγt（1:300）（A10240、Abclonal、中国）、ウサギ抗AhR（1:300）（A1451、Abclonal、中国）の一次抗体を切片に一滴ずつ加え、4℃で12時間インキュベートした。その後、二次抗体（西洋ワサビペルオキシダーゼ）を組織切片に滴下し、37℃で30分間インキュベートした。最後に、DAB発色法を用いて組織切片を発色させ、ヘマトキシリンで再染色した後、切片を密封した。
定量的リアルタイムポリメラーゼ連鎖反応（qPCR）
Th17細胞およびTreg細胞に関連する遺伝子の相対的mRNA発現量を検出するために、空腸切片からTRIzol試薬（日本、タカラ）を用いて、製造元の指示に従って全RNAの抽出を行った。ゲノムDNAを除去した後、PrimeScript™-RT reagent Kit with (gDNA) Eraser (Takara, Japan)を用いて各サンプルのRNA（1μg）を逆転写し、cDNAを得た。合計10μLのqPCR反応ミキサーには、SYBR色素（5μL）（日本、タカラ）、酵素不含の水（3.2μL）、フォワードプライマー（0.4μL）、リバースプライマー（0.4μL）、および鋳型cDNA（1μL）が含まれている。リアルタイムqPCRプロービングシステム（Bio-Rad CFX Connect）を用いてqPCR反応を行った（Bio-Rad, Hercules, CA, USA）。手順は以下の通りである： 95℃で5分間の予備変性、95℃で30秒間の変性（40サイクル）、60℃で30秒間のアニーリング、最後に72℃で15秒間の伸長。異なるプライマーの配列は、参照遺伝子（β-アクチン）に従い表1に示した。2-ΔΔCT法を用いて、異なる遺伝子の発現量を定量的に算出した。
表1 qPCR用プライマーの塩基配列
原寸大表
ノンターゲットメタボロミクス
代謝物の抽出と定量
腸内容物（50 mg）を採取し、メタノール：水＝400µL溶液（4：1、v/v）を用いて代謝物抽出を行い、L-2-クロロフェニルアラニン（0.02 mg/mL）を標準物質として用いた。この混合物を-10℃で沈殿させた後、ハイスループット組織破砕機Wonbio 96c (Shanghai Wanbo Biotechnology Co., Ltd.)を用いて、5℃、40kHzで30分間超音波処理を行った後、50Hzで6分間処理した。タンパク質の沈殿は、サンプルを20℃で静置して行った。その後、遠心分離（13,000 g）を4℃で15分間行った。上清液が得られ、その後のLC-MS分析用に慎重にサンプルバイアルに移された。品質管理されたサンプルは、再現性よくすべてのサンプルを等量で組み合わせることによって調製される。
LC-MS分析には、UHPLC-Q Exactive HF-Xシステム（ThermoFisher Scientific）のプラットフォームを使用した。簡単に説明すると、寸法（1.8μm、100mm×2.1mm）のHSS T3カラムを使用して2μLのサンプルを分離し、質量分析検出システムにロードした。移動相は、溶媒A（水：アセトニトリル（95:5）v/v）にギ酸（0.1％）、溶媒B（アセトニトリル：イソプロパノール：水（47.5:47.5:5）v/v）にギ酸（0.1％）を含む。溶媒勾配は以下の通り：0～0.1分、0～5％B；0.1～2分、5～25％B；2～9分、25～100％B；9～13分、100～100％B；13～13.1分、100～0％B；13.1～16分、0～0％Bで系を平衡化。一度に合計2 µLのサンプルを適用し、流速は毎分0.4 mLに設定した。カラムの温度は40℃であった。実験中、サンプルは4℃の冷蔵庫に保管した。質量分析データは、ポジティブまたはネガティブイオンモードで動作するエレクトロスプレーイオン化（ESI）源を備えたThermo UHPLC-Q Exactive質量分析計を使用して収集した。
代謝物の差分分析
LC-MSから生データを得た後、Progenesis QI (Waters Corporation, Milford, USA) ソフトウェアを使用して前処理を行った。データ解析はmajorbio-cloudプラットフォーム（cloud.majorbio.com）を通して行い、サンプルデータの前処理後に得られたマトリックスファイルに対して分散分析を行った。部分最小二乗-判別分析(PLS-DA)と主成分分析(PCA)は、Rパッケージropls (Version 1.6.2)を用いて分析した。また、折れ差分析とStudent t-検定も行った。PLS-DA解析とStudent検定の結果、Variable importance in projection (VIP)が得られ、VIP値に基づいて有意差のある代謝物を選択した。VIP値が1以上かつP < 0.05の代謝物を有意差代謝物とした。KEGGデータベース（KEGG, http://www.genome.jp/kegg/）に基づき、2群間の差分代謝物を生化学的代謝パスウェイにマッピングし、パスウェイの濃縮解析も行った。
16S rRNA 遺伝子の配列決定と解析
微生物群集のゲノム DNA は、FastDNA-SPIN 抽出キット（MP Biomedicals, Santa Ana, CA, USA）を用いて、標準的な製造業者の指示に従って空腸内容物から抽出した。抽出されたDNAのOD（260/280）は1.8から2.0であり、NanoDrop ND1000 Spectrophotometer（ThermoFisher Scientific, Waltham, MA, USA）と1％アガロースゲル電気泳動で定量した。細菌16S-rRNA遺伝子は、超可変領域（V3およびV4）を含み、これらは、それぞれフォワード338F（5′-ACTCCTACGGGAGGCAGCA-3′）およびリバース806R（5′-GGACTACHVGGTWTCTAAT-3′）プライマーを用いて、我々の以前の研究[2]の手順に従って増幅した。すべての空腸サンプルから精製したアンプリコンライブラリーの濃度は0.5 ng/μLである。等モルおよびペアエンドシーケンス（2×300bp）での精製アンプリコンのプーリングは、Majorbio Bio-Pharm Technology Co. (Ltd.（中華人民共和国、上海）の標準的な説明書に従って行った。この方法で、精製アンプリコンライブラリーあたり合計30,000のクリーンリードを得た。
16S rRNA遺伝子のシーケンスデータから得られた生のリードは、デマルチプレックスされ、Trimomaticでフィルタリングされ、最終的にFLASHでマージされた。UPARSE (version 7.1, http://drive5.com/uparse/)を用いて、類似度97%カットオフを用いたoperational taxonomic unit (OTU)のクラスタリングを行った。その後、キメラ配列の同定と除去を行い、有効なリードを得た。Silva 138 (16S rRNA)データベースに対する各OTU代表配列の分類学的性質を解析するために、信頼閾値として0.7を設定し、RDP Classifier (http://rdp.cme.msu.edu/)を適用した。
α-およびβ-多様性の測定における配列決定深度の影響を軽減するため、すべてのサンプルからリードのサブサンプリングを行った。FMT群と対照群の空腸内容物の最小有効リード数は42,687であった。α多様性の表現には、シャノン指数とチャオ指数を用いた。属レベルの群集構造を示すために、円グラフと棒グラフを用いた。デフォルトのパラメータに基づき、線形判別分析の効果量（LEfSe）を実行し、グループ間で有意差のある分類群をチェックした。Tax4Funに基づき、KEGG関数を用いて配列のアノテーションを行い、最後にSTAMPソフトウェアパッケージを用いてこれらの配列の統計量を可視化した。
統計解析
各サンプルのデジタル画像は、デジタルカメラ（DP72, Olympus）を用いて、光学顕微鏡（BH-2, Olympus, Japan）で撮影した。各群から8切片を選択し、組織の種類に応じて各切片で8枚のランダム視野画像を取得した。各視野画像において、Image-Pro Plus 6.0（Media Cybernetics社、米国）を用いて、単一の脚および/または乳房筋細胞の平均断面積ならびにIHC陽性シグナルをカウントした。各視野におけるIOD陽性シグナルと空腸絨毛の長さも測定した。Prism software 8（GraphPad, Inc. 平均値±SEMのデータをここに示し、統計的有意性を決定するためにStudent t-testを適用した。2群間の平均値を比較する場合は、(P < 0.05)を統計的に有意な値として用いた。また、PLS-DAモデルの投影における変数重要度（VIP）の値が1以上、かつStudentのt検定のP値が0.05未満の代謝物を有意差があるとみなした。
データおよび材料の入手
生の16S rRNA遺伝子およびメタゲノム配列データは、NCBI Sequence Read Archive (SRA)のBioProject (PRJNA900164)で入手可能。
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資金提供
中国国家重点研究開発計画（2017YFE0113700、2019YFE0115400）および大学生研究費（BC2021203）により本研究を支援された。
著者情報
著者ノート
Ziyu Ma、Muhammad Akhtar、Hong Panは筆頭共著者として同等に貢献した。
著者および所属
中華人民共和国武漢市430070華中農業大学教育部農業動物遺伝育種繁殖重点実験室
Ziyu Ma、Muhammad Akhtar、Hong Pan、Qiyao Liu、Yan Chen & Huazhen Liu
中華人民共和国武漢市430070華中農業大学畜産学院予防獣医学部
周欣欣、余英廷、石德志
貢献
ZM、MA、HP、QYL、YC、XXZ、YTU、DSS、HZLはすべて、プロジェクトのコンセプトデザインと原稿中の実験に貢献した。ZM、MA、HPは実験とデータ解析を行い、サンプル収集、動物の取り扱い、臨床データ収集に貢献した。MA、QYL、YC、XXZ、YTU、DSS、HZLは原稿の編集と修正を行った。ZM、MA、DSS、HZLは原稿執筆に貢献した。HZLは原稿執筆、解析、実験、原稿審査、資金獲得、プロジェクト管理を監督した。著者全員が最終原稿を読み、承認した。
責任著者
Huazhen Liuまで。
倫理申告
倫理承認と参加同意
今回の科学的調査は、華中農業大学動物使用倫理委員会（HZAUCH-2018-008）（中国、武漢市）の規則に従って実施した。
論文発表の同意
該当なし。
競合利益
著者らは競合する利益はないと宣言している。
追加情報
出版社ノート
シュプリンガー・ネイチャーは、出版された地図の管轄権の主張および所属機関に関して中立を保っている。
補足情報
追加ファイル1：補足図S1.
ドナー候補鶏の糞便微生物組成を属レベルで示す。A. 異なるドナー鶏の糞便微生物組成。B. 選択されたドナーニワトリの糞便微生物組成。HFは高体重の雌ドナー鶏、HMは高体重の雄ドナー鶏、LFは低体重の雌ドナー鶏、LMは低体重の雄ドナー鶏、W1〜W4はそれぞれ1週間、2週間、3週間、4週間を表す。
権利と許可
オープンアクセス 本論文は、クリエイティブ・コモンズ表示4.0国際ライセンスの下でライセンスされている。このライセンスは、原著者および出典に適切なクレジットを与え、クリエイティブ・コモンズ・ライセンスへのリンクを提供し、変更が加えられた場合を示す限り、いかなる媒体または形式においても、使用、共有、翻案、配布、複製を許可するものである。この記事に掲載されている画像やその他の第三者の素材は、その素材へのクレジット表記に別段の記載がない限り、記事のクリエイティブ・コモンズ・ライセンスに含まれています。この記事のクリエイティブ・コモンズ・ライセンスに含まれていない素材で、あなたの意図する利用が法的規制によって許可されていない場合、あるいは許可された利用を超える場合は、著作権者から直接許可を得る必要があります。このライセンスのコピーを閲覧するには、http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/。クリエイティブ・コモンズ・パブリック・ドメインの権利放棄（http://creativecommons.org/publicdomain/zero/1.0/）は、データへのクレジット表記に別段の記載がない限り、この記事で利用可能となったデータに適用されます。
転載と許可
この記事について
この記事の引用
Ma, Z., Akhtar, M., Pan, H. et al. 糞便微生物叢移植は空腸Th17/Treg細胞のバランスをとることでニワトリの成長パフォーマンスを改善する。Microbiome 11, 137 (2023). https://doi.org/10.1186/s40168-023-01569-z
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2022年11月16日受領
受理2023年5月09日
2023年6月21日発行
DOIhttps://doi.org/10.1186/s40168-023-01569-z
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キーワード
糞便微生物叢移植
Th17/Treg細胞バランス
鶏の成長成績
乳酸菌
トリプトファン
マイクロバイオーム
ISSN: 2049-2618
お問い合わせ
投稿に関するお問い合わせ：lyndie.manicani@springernature.com
一般的なお問い合わせ：info@biomedcentral.com
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