ヒト糞便から分離されたAkkermansia muciniphila 8株の再分類とAkkermansia massiliensis sp.nov および Candidatus Akkermansia timonensisの記載

公開日：2022年12月16日
ヒト糞便から分離されたAkkermansia muciniphila 8株の再分類とAkkermansia massiliensis sp.nov および Candidatus Akkermansia timonensisの記載
Sokhna Ndongo, Nicholas Armstrong, ...Pierre-Edouard Fournier 著者を表示する。
Scientific Reports 12巻 記事番号: 21747 (2022) この記事を引用する

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2 アルトメトリック

メトリクス詳細

概要
Akkermansia muciniphilaはヒトの腸内細菌で、粘液層の更新に重要な役割を果たす。いくつかの研究により、この菌が腸のホメオスタシスの調節因子であり、ヒトの健康のためのプロバイオティクスであることが証明されている。Akkermansia属には、命名法の定まった2種が存在するが、そのゲノム多様性は不明なままである。本研究では、ヒト腸管から新たに8株のAkkermansia sp.を分離し、Digital DNA-DNA Hybridization法により、Akkermansia sp.のゲノム多様性を検討した。A. muciniphilaの全ゲノム104配列を対象に、digital DNA-DNA hybridization（dDDH）、平均塩基同一性（ANI）、コアゲノムベース系統樹解析を行い、3つのクラスターに再分類された。クラスターIはA. muciniphila（タイプ株としてATCC BAA-835T株を含む）、クラスターIIとIIIは2つの新種を表している。クラスタIIに属するMarseille-P6666株は、A. muciniphila ATCC BAA-835T株やA. glycaniphila PytT株と異なり、42℃までの微好気性雰囲気下で増殖し、種々の炭素源を同化して、いくつかの化合物から酸を生産する能力を有していることが明らかにされた。Marseille-P6666株の主要な脂肪酸は、12-methyl-tetradecanoic acidとpentadecanoic acidであった。また、Marseille-P6666株のDNA G + C含量は57.8%であった。これらのことから，Marseille-P6666T（= CSUR P6666 = CECT 30548）株をタイプ株として，クラスターIIに属する菌株をA. massiliensis sp. また、未培養株のみを含むクラスターIIIのメンバーには、Akk0196株をタイプ株として、"Candidatus Akkermansia timonensis" sp.nov. という名称を提案する。

はじめに
ヒトの消化管は複雑な生態系であり、そこにはダイナミックな微生物群集が生息している。この微生物相の大部分は、免疫、様々な代謝過程、宿主の健康に重要な影響を与え、身体の生理学的バランスに重要な役割を果たす細菌によって表されている1。Akkermansia muciniphilaは、2004年にDerienらによって報告された細菌で2、ムチンを唯一の炭素源として利用することができる菌である。ムチンを唯一の炭素源とする細菌で、粘液の再生と腸管バリアの維持に関与している3。腸内細菌叢の常在菌（3-5％）4であり、その存在量は腸内細菌叢の健全性を示すバイオマーカーであることが示唆されています5,6。一方、クローン病、大腸がん、潰瘍性大腸炎などの炎症性腸疾患7や肥満8、2型糖尿病などの代謝性疾患9では、その減少や枯渇を示す研究が増え続けています。経口投与によりその量を回復させること（マウスモデル）は、アルコール性肝疾患の動物における肝障害、脂肪沈着および好中球浸潤の減少など、いくつかの有益な効果と相関している10。動脈硬化病変および代謝性エンドトキシン誘発炎症の減少11、デキストラン硫酸ナトリウム（DSS）誘発急性大腸炎の減衰12、ApcMin/+マウスにおける大腸腫瘍形成の抑制、ヌードマウスに移植したHCT116またはCT26腫瘍の成長抑制13などである。

また、Akkermansia muciniphilaは、粘液層に対して有益なプロバイオティクス活性を有している3,14。A. muciniphila のサプリメントは、妊娠中の吐き気、嘔吐、便秘の重症度を著しく軽減し、代謝機能の調節に重要な役割を果たし、肥満を予防し15,16、耐糖能を高め、脂肪組織の炎症を抑制し17、糖尿病の発症を抑えることが証明されている18。

Akkermansia属には、2つの有効な種、すなわちA. muciniphilaとA. glycaniphila2,19が含まれています。2021年、Gilroyらにより2つの新種Akkermansia（Candidatus A. intestinaviumとCandidatus A. intestinigallinarum）が報告されました20。同様に、Orellana らは、表層海水サンプルのメタゲノム解析から、Akkermansiaceae 科の新属である "Candidatus Mariakkermansia forsetii" を報告している22。しかし、多くの研究によりプロバイオティクスとしての役割が確認され、宿主の健康に役立つにもかかわらず、Akkermansiaの種についてはほとんど報告されていない。我々は、Akkermansia muciniphilaの新種を探索し、そのゲノム多様性を解析するプロジェクトにおいて、Akkermansiaの新種に属すると思われる2菌株を発見した。本論文では、この新種のタクソノジェノミクス的記述と、その表現型および生化学的特徴について報告する。また、公開されているA. muciniphilaの全ゲノムと、我々のコレクションから分離された8株のゲノムを解析した結果、本属に再分類することが可能となった。

結果および考察
菌株の同定と系統解析
本研究で分離された全株を MALDI-TOF-MS により同定し、そのペプチドプロファイルを Bruker データベースに登録されているものと比較したところ、Akkermansia muciniphila であることが確認された。8株の塩基配列を決定した後、各株の16S rRNA配列を抽出し、NCBIデータベース(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/)の近縁種の配列と比較した。Marseille-P6666, Marseille-P9185, Marseille-P5162, Marseille-P6566, Marseille-P7245, Marseille-P9184, Marseille-P9642, Marseille-Q2586株は最高の16S rRNA配列類似度を示し、99. 20, 98.95, 99.73, 99.79, 99.72, 99.96, 99.79, 99.86%, A. muciniphila ATCC BAA-835T (AY271254) と最も高い16S rRNA配列の類似度を示した。

表現型および生化学的解析
Marseille-P6666株の細胞は棒状（0.5 × 0.8 μm）、運動性、グラム陰性であった（Fig. 1）。液体が存在すると、細胞は自転し、自走する。菌体表面には複数の繊毛が観察される（Fig.1）。コロンビア寒天培地プレート上で増殖したコロニーは、72時間培養後、白色、非溶血性、直径0.5 mmの円形に見えた。マルセイユP6666株は、37〜42℃、pH6〜7.5、0〜5 g/l NaCl存在下で最適な生育を示した。マルセイユP6666株は、微好気性雰囲気で増殖することができ、消化管の粘液層で生存することが可能であった23。この新規分離株は、ムチンを単独で炭素源として利用することができた。

図1
図1
Akkermansia massiliensis Marseille-P6666 株の透過型電子顕微鏡写真。

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細胞はカタラーゼ陽性、オキシダーゼ陰性であった。API ZYM ストリップ (bioMérieux) を用いた場合、アルカリホスファターゼ、エステラーゼ (C4)、酸性ホスファターゼ、ナフトール-AS-BI-ホスホヒドラーゼ、αガラクトシダーゼ、βガラクトシダーゼ、βグルクロニダーゼ、N-アセチル-β-グルコサミニダーゼは陽性であった。API 20NEストリップ（bioMérieux社製）を用いて、マルセイユP6666株はエスクリンを加水分解し、β-ガラクトシダーゼを生産することができた。API 20Aストリップ（bioMérieux）を用いた場合、D-グルコース、D-マンニトール、D-ラクトース、D-マルトース、クエン酸エスクリンおよびD-マンノースの酸分解に陽性反応が得られた。API 50CHストリップ（bioMérieux）を用いて、Marseille-P6666株はL-アラビノース、D-リボース、D-ガラクトース、D-グルコース、D-フルクトース、D-マンノース、D-マンニトール、D-ソルビトール、N-アセチルグルコサミン、サリシン、クエン酸エスクリン、D-マンノース、D-マンニトール、N-アセチルグルコサミンを利用した。エスクリン クエン酸第二鉄、セロビオース、D-マルトース、D-ラクトース、D-メリビオース、アミグダリン、D-サッカロース、D-トレハロース、アルブチン、ゲンチオオース、D-ツラノース、D-タガロースおよびグルコン酸カリウムを唯一の炭素源としています。API ZYM, 50CH, 20A, 20NEストリップから得られたすべての陰性特性を新規種の記述にまとめた。さらに、Marseille-P6666T株の生理学的および生化学的特性を表1にまとめ、他の近縁種と比較した。マルセイユP6666株はtrimethoprim-sulfamethoxazole，doxycycline，rifampicin，clindamycin，amoxicillin，oxacillinおよびbenzylpenicillinに感受性を示し，vancomycin，amikacin，ciprofloxacin，tobramycin，ceptriaxoneおよびceptazidimeに感受性のあることが判明した．Marseille-P6666株の主要な細胞内脂肪酸は飽和構造であった。12-methyl-tetradecanoic acid（58.4%），pentadecanoic acid（15.8%）および12-methyl-Tridecanoic acid（6%）であった。2つの主要な脂肪酸、すなわちanteiso-C15:0とC15:0は、Marseille-P6666株、MucT株、PytT株で類似している（表2）。酢酸 (12 ± 7 mM) やプロパン酸 (5 ± 2 mM) などの短脂肪酸が生産された。Marseille-P6666 株は、スフィンゴミエリン、N-アシルエタノールアミン、アシルカルニチン、 ホスファチジルエタノールアミン、リゾホスファチジルコリン、セラミド-グリセロ脂質、脂肪アシル-グリセロ脂 質、ホスファチジン酸、いくつかの構造不明物質とリン脂質など様々な極性脂質クラスを生成した（補足図 1 および補足表 1）。

表1 Akkermansia massiliensis Marseille-P6666 株 (a), Akkermansia muciniphila ATCC BAA-835T 株 (b), Akkermansia glycaniphila PytT 株 (c), Verrucomicrobium spinosum DSM4136T 株 (d), Prosthecobacter debontii ATCC 700200T 株 (e); (+): 正; (-): 負; (*): 弱; NA not available data.の生理的性質
原寸表
表2 Akkermansia massiliensis Marseille-P6666 株、Akkermansia muciniphila ATCC BAA-835T 株および Akkermansia glycaniphila PytT 株の細胞内脂肪酸組成（%）.
フルサイズ表
ゲノム解析と比較
本研究で塩基配列を決定した8株のゲノム特性を表3にまとめた。これらの分離株のゲノム配列は、2,740,501から3,280,190 bpの範囲で異なるサイズであった。

表3 研究したAkkermansia属と他の近縁種のゲノムの特性。
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Marseille-P6666のゲノムは3,280,190 bpの長さで、平均G + C含有率は57.8%である。3つのコンティグから構成されている。予測された2793個の遺伝子のうち、2726個がタンパク質コード遺伝子、9個がRNA、1個がtmRNA、57個がtRNA遺伝子であった。この株の円形マップを図2に示す。Marseille-P6666のゲノムは、A. muciniphila ATCC BAA-835T (= MucT), (2,664,051 bp)やA. glycaniphila pytT (3,074,078 bp)より大きなものであった。Marseille-P6666のG + C含量はA. muciniphila ATCC BAA-835Tのそれ（55.6%）より大きく、A. glycaniphila PytTのそれ（58.2%）より小さい。Marseille-P6666と他の近縁種との間のCOGs機能カテゴリーへの遺伝子分布を図3および表4に示した。各COGカテゴリーからの遺伝子数は、A. muciniphila ATCC BAA-835T株よりもMarseille-P6666株の方が多く、特に細胞壁や膜の生合成、エネルギー生産と変換、防御機構、糖質、アミノ酸、ヌクレオチド、無機イオンの輸送と代謝をコードする遺伝子が多く含まれていた。このことは、A. muciniphila ATCC BAA-835T株（1084遺伝子）よりもMarseille-P6666株の方がコーディング遺伝子が多い（1983遺伝子）事実と一致する。コアゲノムに基づく系統樹では、ツリークラスター（I、II、III）が同定され、従来A. muciniphilaに属すると考えられていた菌株が同定された。本研究で分離されたAkkermansia株のうち、6株はA. muciniphila ATCC BAA-835T株とクラスターを形成した（Cluster I）。また、2株は従来A. muciniphila属に分類されていた他の株とクラスターを形成した（Cluster II）。クラスタI、II、IIIのゲノムをA. muciniphila ATCC BAA-835Tと比較したところ、クラスタIのメンバーではdDDH値が70%以上（範囲74.80%〜100%）、クラスタIIとIIIのメンバーでは70%以下（範囲33.8〜34.2%、17.1〜24.9%、補足表2）であることが分かった。クラスタI、II、IIIの分離株間のANI値は、A. muciniphila ATCC BAA-835Tとそれぞれ97-100%、88%、82%であった（補足図2）。3つのクラスター（I、II、III）間のANI値は、細菌種を定義するために提案されているカットオフ値95%より有意に低かった24,25。最近の研究では、新しい細菌種を作成するためのANI閾値を96.5%に再定義したものさえある26。一方、あるクラスター内のすべてのANI値は97%以上であった。したがって、従来 A. muciniphila とみなされていた菌株は、ゲノムに基づく系統解析と DDH および ANI 値によって、3 つの異なる細菌種に分類されることが明確に支持された。

図2
図2
A. massiliensis Marseille-P66 のグラフィカルな円形マップ。massiliensis Marseille-P6666 を参照ゲノムとして、Akkermansia muciniphila ATCC BAA-835T 株、Akkermansia glycaniphila PytT 株などの近縁種のゲノム構成と比較した。Candidatus Akkermansia intestinavium" 株 ChiGjej6B6-8097T, "Candidatus Akkermansia intestinigallinarum" 株 14975T, そして新種候補 "Candidatus Akkermansia timonensis" 株 Akk0196. なお、円形図に使用した色の違いは、図右の凡例に示している。

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図3
図3
Akkermansia muciniphila ATCC BAA-835T株（Cluster I）、Akkermansia massiliensis Marseille-P6666株（Cluster II）、Candidatus Akkermansia timonensis Akk0196株（Cluster III）、 Akkermansia glycaniphila PytT株およびその他近縁種の予測タンパク質コーディング遺伝子をCOGカテゴリーで分布したもの。

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表4 クラスター・オブ・オーソログ・グループ（COG）において、25の機能カテゴリーに関連する遺伝子数。
フルサイズの表
したがって、今回のゲノム解析の結果は、現在A. muciniphilaに分類されている株が3つの異なる種に属することを強く示唆するものであった。しかし、細菌種を分類するために定められた16SrRNA配列類似度98.7%の閾値27では、Akkermansia属の種間を識別することはできない。このことは、いくつかの細菌属の中で正しく種を分類するための16S rRNA遺伝子解析の限界を浮き彫りにしている（補足図3）28。クラスター I は、A. muciniphila の菌株で形成され、その中にはタイプ株である ATCC BAA-835T が含まれる (Fig. 4)。クラスターIIは、Marseille-P6666株、Marseille-P9185株、その他先行研究で報告された12株で形成されている（Fig.） 最近、Kumar ら29 は、EB-AMDK-39 株、EB-AMDK-40 株および EB-AMDK-41 株に系統的に近い新 しい Akkermansia 株、DSM 33459 を記載し、この株が新しい Akkermansia 種に属すると提唱した。その結果、Akkermansia sp. DSM 33459) は EB-AMDK-39、EB-AMDK-40、EB-AMDK-41 と OrthoANI 値 > 98% を示し、同一種に分類されることが明らかになった。この結果は、Akkermansia sp. DSM 33459 株が Marseille-P6666 株および Marseille-P9185 株と同じクラスターに属し、おそらく同じ種に属することを示唆するものである。しかし、Akkermansia sp. DSM 33459株のゲノム配列については、Kumarらからアクセッション番号が提供されていないため、我々の解析に含めることができなかった。また、著者らはDSM 33459株をDSMZコレクションに寄託したが、新種記載に関する原核生物命名法の国際規約30で要求されている第2培養コレクションには寄託しなかった30。また、著者らはこの新種の名前を提案しておらず、Kumarらの論文には新種の特性を公式に記述するためのプロトログが含まれていない。クラスター III には、Akk0196T、Akk0490、Akk0496a、Akk0496b、Akk2750 の 5 株が含まれている（図 4）。

図4
図4
Akkermansia muciniphila ATCC BAA-835T 株（Cluster I）、Akkermansia massiliensis Marseille-P6666 株（Cluster II）、 "Candidatus Akkermansia timonensis" Akk0196 株（Cluster III）と Akkermansia 属および Verrucomicrobiaceae の他の型株との相対的位置関係を示す Core Genome-based phylogenetic tree（クラスターII）。MUGSYを用いて配列のアライメントを行い、最尤法により系統樹を作成した。ノードの数字は、解析を1,000回繰り返して得たブートストラップ値（≥70%）。スケールバーは塩基配列の乖離が10%であることを示す。

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Jannekeらによって最初に報告されたA. glycaniphila株PytTは、A. muciniphila株ATCC BAA-835T19とdDDHおよびANI値がそれぞれ22.5%と73%であることが確認された。また、A. glycaniphilaのPytT株は、Akkermansia属の他のすべてのメンバーとの間で、dDDHおよびANI値がそれぞれ18.5から24%、73から74%の範囲であった。

Akkermansia muciniphila、Akkermansia massiliensis sp.nov.
A. muciniphila株（85株）の汎ゲノムとコアゲノムは、それぞれ6357遺伝子と1193遺伝子から構成されていた。また、1654個の遺伝子はアクセサリー遺伝子である。A. muciniphilaの1株のみから合計1108個の特異的な遺伝子が見出された。

A. massiliensis 14株のパンゲノムとコアゲノムは、それぞれ3632遺伝子と2138遺伝子から構成されていた。付属ゲノムは410遺伝子が含まれ、菌株に特異的であった。

A. timonensis株（5株）のパンゲノムおよびコアゲノムは、それぞれ2767遺伝子および2539遺伝子から構成されていた。アクセサリゲノムのサイズは228遺伝子であった。A. timonensisの1株のみから合計125個の特異的遺伝子が検出された。

A. muciniphila ATCC BAA-835Tのパンゲノム（6357遺伝子）は、A. massiliensis Marseille-P6666のそれ（3632遺伝子）より大きい。A. muciniphila ATCC BAA-835Tのコアゲノムの割合は、A. massiliensis Marseille-P6666のそれよりも小さく、それぞれ18.7%と60.1%であった。しかし、各パンゲノムの解析に用いたゲノム数の違いにより、A. muciniphila ATCC BAA-835T のアクセサリー遺伝子数（85 株）は A. massiliensis Marseille-P6666 のそれ（14 株）より多く、パンゲノムに対してそれぞれ 26%, 11.2% であった。

結論
これらの結果から、2 種類の新種が誕生することが示唆された。また、Akkermansia timonensisは、Akk0196, Akk0490, Akk0496a, Akk0496b, Akk2633株を含む新種であることが示唆された。

Akkermansia massiliensis sp.nov.の説明
Akkermansia massiliensis (mas.si.li.en'sis L. fem. adj. massiliensis, of Massilia, the Latin name of Marseille where the strain is isolated)の略。

グラム株陰性、棒状の細胞（0.5×0.8μm）。カタラーゼ陽性、オキシダーゼ陰性で運動性の菌である。無芽胞性。コロンビア寒天培地上で増殖したコロニーは、白色で円形、凸状で縁全体が均一である。嫌気性雰囲気、37℃、pH7、5g/l NaClの存在下で最適な増殖が見られる。また、微好気性雰囲気、42℃までの温度でも増殖することがある。硝酸塩還元活性、インドール生産活性、ゼラチン加水分解活性、ウレアーゼ活性はない。マルセイユP6666T株はエスクリン加水分解に陽性で、α-ガラクトシダーゼ、β-ガラクトシダーゼ、β-グルクロニダーゼ、N-アセチル-β-グルコサミニダーゼ、β-ガラクトシダーゼ、アルカリホスファターゼ、エスターゼ（C4）ナフトールホスホヒドラーゼおよび酸性ホスファターゼ活性が認められる。エステラーゼ・リパーゼ（C8）、リパーゼ（C14）、ロイシンアリールアミダーゼ、バリンアリールアミダーゼ、シスチンアリールアミダーゼ、トリプシンα-キモトリプシン、α-グルコシダーゼ、β-グルコシダーゼ、α-マンノシダーゼ、α-フコシダーゼ活性が検出されない。生育と酸の生産には以下の基質が使用される。L-アラビノース、D-リボース、D-ガラクトース、D-グルコース、D-フルクトース、D-マンノース、D-マンニトール、D-ソルビトール、ムチン、N-アセチルグルコサミン、サリシン、クエン酸第二鉄エスキュリン。セロビオース、D-マルトース、D-ラクトース、D-メリビオース、アミグダリン、D-サッカロース、D-トレハロース、アルブチン、ゲンチオビオース、D-ツラノース、D-タガロースおよびグルコン酸カリウム。Strain Marseille-P6666Tは、グリセロール、エリスリトール、D-アラビノース、D-キシロース、L-キシロース、D-アドニトール、メチル-α D-マンノピラノシドMethyl-α D-グルコピラノシド、L-ソルボス、L-ラムノース、ダルシトール、イノシトールを利用しない。Methyl-α D-Glucopyranoside、Methyl-α D-Mannopyranoside、イヌリン、D-メレジトース、D-ラフィノース、グリコーゲン、アミドン、D-フコース、L-フコース、D-アラビトン、L-アラビトン、2-cetogluconate potassium、5-cetogluconate potassiumが挙げられる。主な脂肪酸は、12-メチル-テトラデカン酸、ペンタデカン酸。酢酸とプロパン酸が生成される。様々な極性脂質クラスが見られる：スフィンゴミエリン、N-アシルエタノールアミン、アシルカルニチン、ホスファチジルエタノールアミン、リゾホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジルコリン、リゾホスファチジルコリン、セラミド-グリセロ脂質、脂肪アシル-グリセロ脂質、ホスファチジン酸といくつかの未知の構造およびリン脂質である。

ゲノムDNAのG + C含量は57.8%である。タイプ株はMarseille-P6666T (= CSUR P6666 = CECT 30548)で，ヒトの便から分離された．

Candidatus Akkermansia timonensis sp. nov.の解説
Candidatus Akkermansia timonensis（ti.mo.nen'sis. L. fem. adj. timonensis、このゲノムを解析した病院の名前であるTimoneの）。

Akkermansia属に属するCandidatus Akkermansia timonensisは、メタゲノム解析により同定された細菌種である。タイプゲノムのゲノム長は3,212,887 bp、G + C含量は56.7%である。

タイプ材料は、ヒトの便から得たメタゲノム集合体であるAkk0196である。

材料と方法
MALDI-TOFによる菌株の単離と同定
腸からできるだけ多くの異なるヒト関連細菌種を分離することを目的としたカルトロミクスプロジェクトの一環として、フランス人患者8名から得られた便を、2017年から2020年にかけて研究に組み入れました。本研究で使用されたすべての方法は、ヘルシンキ宣言に準拠した関連ガイドラインおよび規則に従って実施された。便提供者からはインフォームドコンセントおよび口頭での同意を得た。各便検体の約1 gを2 mlのリン酸緩衝生理食塩水（Life, Technologies, Carisbad, CA, USA）に懸濁した。その後、各便の懸濁液100 µlを10-10まで10倍希釈した。その後，50μlを5％羊血濃縮コロンビア寒天培地（BioMérieux, Marcy l'Etoile, France）に接種し，AnaeroGen generator（bioMérieux）で生成した嫌気性雰囲気で37℃にて培養を行った．72時間培養後、単一コロニーを選択し、純粋な分離株を得るために同じ培地で継代培養した。菌株はMicroflex MALDI-TOF MS spectrometer (Bruker, Daltonics, Leipzig, Germany)を用いて、既報の通り同定した31。

表現型および生化学的特性評価
これらの分離株の細胞形態と特性は、既報の通り、新鮮なコロニーからTM4000走査型電子顕微鏡（日立、東京、日本）を用いて観察した30。コロニー形態は、37 ℃で4 日間培養した株を観察した後に記載した。グラム染色と胞子形成を調べ、顕微鏡観察により移動性を調べた32。異なる温度（21℃、28℃、37℃、42℃、45℃）および微好気条件下でのコロンビア寒天培地での生育は、72時間培養後にCampyGenTM（BioMérieux, ThermoFisher scientific）を用いて試験した。様々なNaCl濃度（0、5、10、15 g/L）およびpH5から8.5の範囲（0.5 pH単位の間隔）での増殖は、コロンビア寒天プレートを用いて評価した33。

ムチンを唯一の炭素源として使用する能力は、Derrienら2によって記述された修正基底培地を用いて試験した。簡単に言えば、この修正培地は0.11 g CaCl2; 0.3 g NaCl; 0.53 g Na2HPO4; 0.4 g KH2PO4; 0.3 g NH4Cl; 0.1 g MgCl2.6H2O; 0.5 mg resazurin; 4 g NaHCO3; 0.25 g Na2S.7 -9H2O、ビタミン液1ml（0.10mgビタミンB12、2.0mgビオチン、5.0mgリボフラビン、10.0mgピリドキシン-塩酸、5.0mgニコチン酸、5.0mgパラミノ安息香酸、2.0mg葉酸、5.0mgリポ酸、5.0mg D-Ca-pantothenate および 5.0mg Thiamine-HClx 2H2O）である。

カタラーゼ活性とオキシダーゼ活性は、BBL™ DrySlide™ (Becton, Le Pont de Claix, France) を用いて、メーカーの説明書に従って評価した。その他の酵素活性および代謝特性は、API ZYM、API 50CH、API 20AおよびAPI NEストリップを用い、製造元の指示に従って調査した（bioMérieux）。抗生物質に対する感受性は、以下のE-テストストリップ勾配を用いて試験した：アモキシシリン、ベンジルペニシリン、オキサシリン、セフォタキシン、セフトリアキソン、アミカシン、トブラマイシン、シプロフロキサシン、クリンダマイシン、ドキシサイクリン、リファンピシン、バンコマイシンおよびトリメトプリム・スルファメトキサゾール。各試験対象抗生物質の最小発育阻止濃度（MIC）は製造元の説明書に従って測定した34。

ケモタクシス特性
細胞性脂肪酸メチルエステル（FAME）分析は、以前に記述したようにガスクロマトグラフ／質量分析（GC／MS）により行った35。嫌気条件下で37℃、3日間培養した複数のコロンビア寒天培地プレートから採取した細菌バイオマス約65 mgを、2本の滅菌チューブにそれぞれ分配した。FAMEは、Sasser36によって以前に記載されたように抽出され、調製された。GC/MS 分析は、以前に記載された方法で行った35。

短鎖脂肪酸 (SCFA) は、3 つの独立した培養ボトル (ブランクとサンプルの両方) から抽出し、分析した。株Marseille-P6666は、5％滅菌羊血（Becton-Dickinson, Pont de Claix, France）を濃縮した嫌気性血液培養ビンで3日間培養した。SCFAは、Diopらの既報の通り、SQ8s質量分析計（Perkin Elmer）に接続したClarus 500クロマトグラフィーシステムを用いて測定した37．

Marseille-P6666 株の極性脂質分析は、親水性相互作用液体クロマトグラフィー-質量分析計 (HILIC-MS) で行った。Bligh and Dyer のプロトコール38 に従って、培養プレートから総脂質を抽出した。窒素気流下で乾燥させたクロロホルム抽出物を、50%クロロホルム/メタノールで再構成し、100 µL (v:v) あたり約 0.5 mg の脂質含量に相当させた。脂質抽出物をHILICカラム (BEH HILIC, 2.1 × 100 mm, 1.7 µm, Waters, Guyancourt, France) に注入した (5 µL)。カラムからの脂質の溶出は、以下の溶媒組成のグラジエントを用いて、脂質の極性に応じて行った。A = 5%水/95%アセトニトリル、B = 50%H2O/50%アセトニトリル、いずれも10 mM酢酸アンモニウム pH8。脂質コントロールには、既報の通りポジティブモードおよびネガティブモードのHD-MS法 (Vion ESI-IMS-Q-TOF mass spectrometer, Waters) を用いた39。脂質クラスの割り当ては、注入した標準物質 (Splash Lipidomix, Avanti Polar Lipids, Alabaster, AL, USA) の保持時間 (RT) に基づいて行われました。COMP DB LipidMAPS データベース (許容誤差 0.0005 m/z; 全鎖活性化) との対応する質量の比較も、脂質クラスの確認のために行われました。

ゲノム配列決定とアセンブリ
全株のゲノムDNA（gDNA）をEZ1バイオロボットとEZ1 DNA Tissueキット（Qiagen, Hilden, Germany）を用いて抽出した。gDNAは、高感度キット（Thermofisher Scientific）を用いたQubitアッセイにより0.2ng/μlまで定量した。gDNAは、MiSeqシーケンサー（Illumina, San Diego CA, USA）によりペアエンド戦略で配列決定した。SPAdesを使用して、全ゲノムの全リードをアセンブルした。800 bp未満のスキャフォールドと平均深度の25%未満の深度を持つスキャフォールドは削除された（コンタミの可能性があると考えられる）。

ゲノムのアノテーションと比較
ゲノムのアノテーションは、Prokka ソフトウェア40 を用いて行った。バクテリアのタンパク質コード配列は、COG (Clusters of Orthologous Groups) データベースに対して BLASTP (E-value of 1e-03, coverage 0.7, identity 30%) を用いて予測した。ゲノムのグラフィカルな円形マップは、CGView (Circular Genome Viewer) ソフトウェアを使用して作成された41。

2022年2月22日現在、NCBI GenBankデータベースで191のA. muciniphilaの完全なゲノム配列が利用可能であり、これをダウンロードした。ゲノム比較のために、重複する配列を排除し、いくつかの研究から96の完全な配列のみを残した（補足表3）。その結果、本研究の8配列、他のAkkermansia属の3配列（A. glycaniphila, "Candidatus A. intestinigallinarum" and "Candidatus A. intestinavium"）、Verrucomicrobiaceaeの近縁種からの7配列を含む合計114配列が解析されました。Akkermansia属内の種を区別するために、いくつかのゲノム比較アプローチが用いられた。Genome-to Genome Distance Calculator (https://ggdc.dsmz.de/) および PyANI (ANI計算をサポートするPythonパッケージおよびスクリプト)42 を用いて、研究対象株間のデジタルDNA-DNAハイブリダイゼーション (dDDH) および平均塩基一致度 (ANI) をレトロスペクティブに算出した。また、Roary ソフトウェア43 を用いて、Akkermansia 株のパンゲノムを解析した。

ヌクレオチド配列のアクセッション番号
16SrRNA 遺伝子・ゲノム配列は GenBank のアクセッション番号 ON014381/JAMGSI000000000 で公開されている。 1 (Akkermansia massiliensis strain Marseille-P6666), ON014382/JAMYIA000000000 (Akkermansia massiliensis strain Marseille-P9185), ON014383/JAMZOC000000000 (Akkermansia muciniphila strain Marseille-P5162), ON014384/JAMGSH000000000 (Akkermansia muciniphila strain Marseille-P7245) の各番号に対応しています。ON014385/JAMZOB000000000 (Akkermansia muciniphila strain Marseille-P6566), ON014386/JAMGSG000000000 (Akkermansia muciniphila strain Marseille-P9184), ON014387/JAMGSF000000000 (Akkermansia muciniphila strain Marseille-P9642) およびON014388/JAMGSE000000000 (Akkermansia muciniphila strain Marseille-Q2586)が挙げられる。Candidatus Akkermansia timonensis AKK7 のゲノム配列アクセッション番号は 20100303_Bin_52_1 である。

倫理的声明
すべての患者から口頭でのインフォームドコンセントを得た。研究デザインは、IHU Méditerranée Infectionの倫理委員会により、番号2016-011の下で検証された。

略語の説明
CSUR:
Collection de Souches de l'Unité des Rickettsies（リケッチュ病コレクション）。

DSM：Deutsche Sammlung von Rickettsies:
Deutsche Sammlung von Mikroorganismen（ドイツ微生物研究所

MALDI-TOF MS:
マトリックス支援レーザー脱離イオン化飛行時間型質量分析法

FAME:
脂肪酸メチルエステル

ORF:
オープンリーディングフレーム

COGs:
クラスター・オブ・オーソロガス（Cluster of orthologous groups

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資金提供
この研究は、Méditerranée Infection foundation（フランス、マルセイユ）およびフランス政府によるAgence Nationale de la Recherche (ANR) が管理する "Investissements d'avenir" プログラム（番号10-IAHU-03）の支援を受けて行われたものである。本研究は、Région Provence-Alpes-Côte d'Azurおよび欧州資金FEDER PRIMIからの資金援助も受けている。

著者情報
著者名および所属
MEPHI, IHU Méditerranée Infection, Aix Marseille University, 19-21 Boulevard Jean Moulin, 13005, Marseille, France（エクス・マルセイユ大学、フランス

Sokhna Ndongo & Didier Raoult

フランス・マルセイユ、IHU-Méditerranée Infection（メディテラネ感染症研究所

Sokhna Ndongo、Nicholas Armstrong、Didier RaoultおよびPierre-Edouard Fournier

エクス・マルセイユ大学IRD、AP-HM、SSA、VITROME、IHU-Méditerranée Infection、フランス、マルセイユ

ニコラス・アームストロング、ピエール・エドゥアール・フルニエ

キング・アブドゥルアジーズ大学キング・ファハド医学研究センター特殊感染症ユニット（サウジアラビア、ジェッダ

Didier Raoult

貢献
コンセプト立案と監督。P.-E.F.およびD.R.方法論、調査および原稿執筆。脂肪酸および極性脂質の分析：S.N: N.A. 資金獲得。D.R.。

協力者
Sokhna Ndongo または Pierre-Edouard Fournier に連絡すること。

倫理的宣言
利益相反
著者らは、競合する利益を宣言していない。

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この記事の引用
Ndongo, S., Armstrong, N., Raoult, D. et al. Akkermansia muciniphila 8株の再分類と、ヒト糞便から分離したAkkermansia massiliensis sp.nov. および Candidatus Akkermansia timonensisの記載。Sci Rep 12, 21747 (2022)。https://doi.org/10.1038/s41598-022-25873-0。

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受付開始
2022年7月21日

受理済
2022年12月6日

公開日
2022年12月16日発行

DOI
https://doi.org/10.1038/s41598-022-25873-0

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研究テーマ
バクテリアの進化
バクテリアゲノミクス
微生物学
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サイエンティフィック・リポーツ（Sci Rep） ISSN 2045-2322（オンライン版）

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