大腸炎による小腸運動低下はマウスにおける腸内分泌細胞の消失に依存する
原著論文| 18巻1号 p53-70, 2024
大腸炎による小腸運動低下はマウスにおける腸内分泌細胞の消失に依存する
https://www.cmghjournal.org/article/S2352-345X(24)00051-1/fulltext
オープンアクセス公開日:2024年03月01日DOI:https://doi.org/10.1016/j.jcmgh.2024.02.017
背景と目的
大腸炎患者が経験する腹部不快感は、小腸運動障害の存在に一部起因している可能性があるが、大腸炎症と小腸運動との関連機序はほとんど解明されていない。われわれは、大腸炎は小腸内の腸内分泌細胞（EEC）の消失に起因する小腸運動低下をもたらすが、セロトニン作動性調節薬を用いてこれを回復させることができるという仮説を立てた。
方法
雄性C57BL/6Jマウス、およびNeuroD1+腸内分泌細胞を過剰発現（EECOVER）または欠損（EECDEL）させたマウスをデキストラン硫酸ナトリウム（DSS）大腸炎（2.5％または5％、7日間）に暴露し、小腸運動性を70キロダルトンのフルオレセインイソチオシアネート-デキストラン蛍光トランジットで評価した。EECの数と分化は、免疫組織化学、ターミナルデオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼを介したデオキシウリジン三リン酸ニックエンドラベリング染色、定量的逆転写酵素ポリメラーゼ連鎖反応によって評価した。マウスは、セロトニンシグナル伝達を回復させるため、5-ヒドロキシトリプタミン受容体4作動薬プルカロプリド（5mg/kg、毎日経口投与）で治療された。
結果
DSS誘発大腸炎は、小腸に顕著な炎症がないにもかかわらず発症した顕著な小腸運動低下と関連しており、EEC密度の有意な低下と関連していた。EECの減少は、Tph1、Ddc、Slc6a4などの主要なセロトニン合成およびトランスポーター遺伝子の発現変化と同時に起こった。重要なことは、EECを過剰発現させたマウスでは小腸の運動性が改善したのに対して、EECを欠損させたマウスではDSSに暴露すると腸の運動性が悪化したことである。最後に、5-ヒドロキシトリプタミン受容体4作動薬プルカロプリドをDSS曝露マウスに投与すると、小腸運動性が回復し、大腸炎が抑制された。
結論
実験的DSS大腸炎は、腸内分泌機能低下によりマウスに顕著な小腸運動障害を引き起こすが、EECの遺伝的調節やセロトニンアナログの投与により回復させることが可能であり、症候性大腸炎患者に対する新たな治療アプローチを示唆している。
グラフ抄録
キーワード
本稿で使用した略語：
BrdU（ブロモデオキシウリジン）、CHGA（クロモグラニンA）、DAI（疾患活動性指標）、DSS（デキストラン硫酸ナトリウム）、DTR（ジフテリア毒素受容体）、EEC（腸内分泌細胞）、FITC（フルオレセインイソチオシアネート）、GPR（Gタンパク質共役受容体）、IBD（炎症性腸疾患）、Il（インターロイキン）、mRNA（メッセンジャーRNA）、 Neurod1（神経原性分化1）、qRT-PCR（定量的逆転写ポリメラーゼ連鎖反応）、TLR（Toll様受容体）、Tnf（腫瘍壊死因子）、TUNEL（末端デオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼ媒介デオキシウリジン三リン酸ニック末端標識）、5-HT（-ヒドロキシトリプタミン）
炎症性腸疾患、特に潰瘍性大腸炎の患者が経験する症状には、血便、腹痛、体重減少などの大腸性のものと、激しい吐き気や腹部膨満感などの全身性のものがある。
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最初の一連の症状は大腸の炎症そのものに起因すると考えられるが、より漠然とした症状は小腸運動機能不全患者が経験する症状と重なるようである、
薬剤に対する反応などである、
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または糖尿病。
この可能性を支持するものとして、実験的大腸炎における腸管運動異常の発生についていくつかの研究者が報告している、
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これは腸神経機能の低下に起因している。
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しかし、重要なことは、大腸炎患者にみられる腸管運動障害の根底にあるメカニズムが解明されていないことである。
セロトニンは、腸粘膜のエンテロクロマフィン細胞（腸内分泌細胞[EECs]）と、平滑筋の収縮を調節する腸管神経細胞という2つの主要な供給源を通じて腸から放出される14、
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セロトニンは、リガンドゲート型イオンチャネルである5-ヒドロキシトリプタミン（5-HT）3やGタンパク質共役型受容体である5-HT4など、消化管全体に存在するいくつかの受容体に作用し、これらは消化管運動との関連で広く研究されている。
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これらの受容体は、臨床的に消化管運動を調節するために薬理学的に標的とすることができる。
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体内で最も多くの5-HTが腸管粘膜内のEECによって合成されることを考えると、これらの受容体は腸管運動の調節に有用である、
消化管運動に関する5-HTの機能的役割について、広範な研究が行われてきた。1950年代に行われた重要な研究により、5-HTが蠕動運動中に放出されることが確立された。
これらの知見が、5-HTが蠕動運動を増強するという証拠と結びついたとき、研究者らは、内因性の5-HT放出が腸の蠕動運動メカニズムにおいて重要な役割を果たしていると結論づけた23。
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EECは、消化管全体にまばらに分布する上皮細胞である、
EECは、消化管全体にまばらに分布する上皮細胞であり、神経鞘を介して腸管ニューロンとシナプス様結合を形成する能力を含む、いくつかのニューロン様特徴を有している26。
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グレリン、グルコース依存性インスリン分泌促進ポリペプチド、ソマトスタチン、セロトニン（エンテロクロマフィン細胞）、またはグルカゴン様ペプチド1、コレシストキニン、ニューロテンシンの組み合わせのいずれかの発現によって定義される、少なくとも5つの異なるEEC系統が存在する。
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ヒトでは、クローン病患者の回腸末端の検体において、PHOX2BやUBE4Aを含むEECマーカーが変化していることが、ゲノムワイド関連研究によって明らかにされている30、
大腸炎発症におけるEECの役割を示唆している。腸内分泌細胞数とホルモン分泌の変化は、炎症性腸疾患患者と大腸炎の動物モデルで認められている31、
これまでの研究者らは、腸管炎症時にEECの反応を誘導する炎症性および微生物学的誘因を探求してきた32。
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重要なことは、EECと炎症性腸疾患（IBD）の研究において比較的未解明な領域が、大腸炎症時における小腸内のEEC集団の反応であるということである。本研究では、大腸炎時に小腸の運動低下をもたらす病態生理学的メカニズムをより詳細に検討することを目的として、この関係を調べようとした。
我々は、実験的大腸炎は、小腸内の腸内分泌細胞の消失に起因するセロトニンシグナル伝達障害によって小腸運動低下を誘導するという仮説を立てた。さらに、腸内分泌細胞の減少は、アポトーシスの増加と腸陰窩内の前駆細胞からの分化の低下によって起こるという仮説を立てた。これらの仮説の裏付けとして、我々は今回、デキストラン硫酸ナトリウム（DSS）大腸炎が、回腸粘膜内のEECの消失に起因する小腸運動低下を誘導することを明らかにした。重要なことは、神経原性分化1（Neurod1）＋EECの遺伝的過剰発現によるEECの回復、あるいは薬理学的セロトニンアゴニストによる機能的再構成により、マウスの小腸運動が回復し、大腸炎が抑制されたことである。これらの知見を総合すると、大腸炎は小腸の運動機能低下を誘導し、それがこの疾患の患者の症状の一因となっている可能性がある。
研究結果
実験的DSS大腸炎はマウスの小腸運動低下を誘導する
我々はまず、7日間の黄砂大腸炎モデルがマウスの小腸運動性に影響を与えるかどうかを検討した。図1に示すように、雄マウスに大腸炎が誘発され、非SS対照と比較して、結腸長が短縮し、肉眼的検査で粘膜出血が認められ（図1AおよびB）、体重が減少し（図1C）、結腸粘膜で炎症性サイトカインであるインターロイキン1β（Il1b）と腫瘍壊死因子（Tnf）の発現が増加した（図1DおよびE）。結腸サンプルの組織学的分析から、粘膜構造の消失、陰窩の損傷、白血球浸潤が明らかになった（図1F-H）。DSSの投与量が2.5％から5％に増加するにつれて、大腸の炎症の程度（図1A-H）と大腸炎の疾患活動性指数（DAI）は増加した（図1I）。重要なことに、黄砂による大腸炎の存在は、小腸を通るフルオレセインイソチオシアネート（FITC）デキストランの腸管輸送の減少（図1J）によって示されるように、著しい小腸運動低下（図1JおよびK）と関連しており、その結果、FITCシグナルの幾何学的中心が低下した（図1K）。実験的大腸炎が腸管運動障害と関連していることを示したので、次にその潜在的な機序を理解しようと努め、EECがセロトニンを含むホルモンやシグナル伝達分子の主な供給源であることから、腸粘膜内のEECの潜在的な役割に注目した。
図1DSS大腸炎によるマウスの小腸運動低下。(A-I)DSS誘発大腸炎マウスモデルの検証。(A)大腸長の有意な減少、(B)炎症、血便、短縮した大腸を示す肉眼的大腸写真、(C)体重変化率、 C57/Bl6マウスに2. 5％および5％DSSを1週間飲水投与したC57/Bl6マウスのDAI（I）。スケールバー： 50 μm。(JおよびK）DSS投与は、（J）FITC-デキストラン蛍光トランジットのピーク強度（矢印）および（K）DSS群における有意に低い幾何学的中心によって示されるように、小腸運動低下と関連している。mRNAレベルはハウスキーピング遺伝子Rplp0発現に対する相対値として表した。各グラフのドットは個々のマウスのデータを表す。すべてのマウス実験は、各実験で1群あたり少なくとも5-6匹のマウスを用いて3回繰り返した。統計的有意性は、GraphPad Prism 10ソフトウェアを用いて、一元配置分散分析、Tukey多重比較検定により決定した。∗∗P＜0.01、P＜0.001またはP＜0.0001。Avgは平均、Duoは十二指腸、Stoは胃。
大腸炎誘発性小腸運動低下症の発症はEECの消失と関連している
EECが高発現する酸性タンパク質であるマーカー、クロモグラニンA（CHGA）を用いたEECの免疫組織化学染色、
を用いたEECの免疫化学染色では、DSSに曝露したマウスの回腸において、EECの全体数が対照と比較して有意に減少していることが明らかになった（図2A-D）。ChgAメッセンジャーRNAのさらなる解析でも、定量的逆転写ポリメラーゼ連鎖反応（qRT-PCR）により近位3分の1、中位3分の1、遠位3分の1で調査したように、DSS存在下では小腸全体にわたってEECのこの集団が一貫してダウンレギュレーションすることが示された（図3）。並行して行った実験では、大腸炎の誘発は腸細胞（図4A-C）、杯細胞（図4F-H）、パネス細胞（図4K-M）の密度を変化させないことが、免疫組織化学染色およびこれらの上皮細胞のシグネチャー遺伝子と転写因子のqRT-PCR発現によって明らかになった（図4D、E、I、J、N、O）。同様に、腸管ニューロン（図5A-D）および腸管グリア（図5E-H）の全体数には、DSSの影響は見られなかった。そこで、我々は小腸EECに対する黄砂大腸炎の特異的影響に注目した。注目すべきことに、大腸組織の分析では、すべてのDSS濃度において、大腸上皮内のEECにそのような変化は見られなかった（図6）。
図2大腸炎誘発性小腸運動低下症の発症はEECの消失と関連している。(A-C）EECを示すクロモグラニンA免疫染色回腸切片の代表的共焦点画像（赤色CHGA+細胞、白矢印）、（E-G）アポトーシスを示すTUNEL染色回腸切片の代表的共焦点画像（緑色TUNEL+細胞、白矢印）。(AおよびE）DSSなしCtrl、（BおよびF）2.5％DSS、（CおよびG）5％DSS。スケールバー： 50 μm。(D)CHGA+EECおよび(H)TUNEL+細胞のImageJ2ソフトウェアによる定量。(I）腸におけるEEC分化経路の図解。(J）遠位小腸で発現するEEC系譜遺伝子のqRT-PCR； ロイシンリッチリピート含有Gタンパク質共役型受容体5（Lgr5）、ノッチ受容体1（Notch1）、モノクローナル抗体Ki 67（Mki67）によって同定された増殖メーカー抗原、 Atonal basic Helix-Loop-Helix (bHLH) transcription factor 1 (Atoh1)、growth factor independent one transcription repressor (Gfi1)、neurogenin 3 (Neurog3)、neurogenic differentiation 1 (Neurod1)、Chromogranin A (ChgA)。各グラフのドットは個々のマウスのデータを表す。mRNAレベルはハウスキーピング遺伝子Rplp0発現に対する相対値として表した。すべてのマウス実験は3回繰り返し、各実験で1群につき少なくとも5-6匹のマウスを用いた。統計的有意性は、GraphPad Prism 10ソフトウェアを用いて、一元配置分散分析、Tukey多重比較検定により決定した。∗P＜0.05、P＜0.01、P＜0.001またはP＜0.0001。
図3EECは小腸全体で一様に減少し、結腸では比較的変化がない。qRT-PCRデータはEEC特異的分泌タンパク質クロモグラニンA（ChgA）の相対発現を示す。各グラフのドットは個々のマウスのデータを示す。統計学的有意性は、パラメトリックガウス分布とHolm-Sidak法による多重補正を行った調整P値を用いた複数の対応のないt検定により決定した。データはGraphPad Prism 10ソフトウェアを用いて解析した。∗P＜0.05およびP＜0.001。Ctrlはコントロール。
図4DSS処理は腸細胞、杯細胞およびパネス細胞の分化に影響を及ぼさない。(A-C、F-H、K-M）（A、F、K）DSS無添加コントロール、（B、G、L）2.5％DSS投与マウス、（C、H、M）5％DSS投与マウスの（A-C）回腸切片の代表的染色像。(D、E、I、J、N、O）qRT-PCRによる（D）腸細胞遺伝子スクラーゼイソマルターゼ、Sis；（E）腸細胞系転写因子-Hesファミリー塩基性ヘリックス-ループ-ヘリックス（bHLH）転写因子1、Hes1；（I）杯細胞遺伝子ムチン2、Muc2； (E）杯細胞系転写因子-クルッペル様転写因子4、Klf4、（N）パネス細胞遺伝子リゾチーム、Lyz1、および（O）パネス細胞系転写因子-SRY（性決定領域Y）-ボックス9、Sox9。スケールバー： 50 μm。各グラフのドットは個々のマウスのデータを表す。mRNAレベルはハウスキーピング遺伝子Rplp0発現に対する相対値として表した。統計的有意性は、GraphPad Prism 10ソフトウェアを用いて、一元配置分散分析、Tukey多重比較検定により決定した。Ctrlはコントロール。
図5DSS投与は小腸腸管ニューロンおよび腸管グリアに影響を与えない。(A-C)回腸切片の代表的共焦点画像。成熟腸神経細胞マーカー-チューブリン、β3クラスIII、TUBB3、白矢印、(E-G)腸グリアマーカー-グリア線維酸性タンパク質、GFAP、白矢印は、(AおよびE)無処置コントロール、(BおよびF)2.5%DSS投与、(CおよびG)5%DSS1週間投与マウスのもの。スケールバー： 50 μm；挿入図：10 μm。ImageJ2ソフトウェアを用いた（D）腸ニューロンおよび（H）腸グリアの定量化。各グラフのドットは個々のマウスのデータを表す。統計的有意性は、GraphPad Prism 10ソフトウェアを用いて、一元配置分散分析、Tukey多重比較検定により決定した。Ctrlはコントロール、hpfは高倍率視野。
図6DSSに伴う小腸の運動低下は、大腸EECの有意な消失を伴わずに起こる。(A-C）EEC（赤）を示すクロモグラニンA免疫染色結腸切片の代表的共焦点画像。(D）ImageJ2ソフトウェアを用いたChgA+細胞の定量化。各グラフのドットは個々のマウスのデータを表す。スケールバー： 50 μm；挿入は10 μm。統計的有意性は、GraphPad Prism 10ソフトウェアを用いて、一元配置分散分析、Tukey多重比較検定により決定した。Ctrlはコントロール、hpfは高倍率視野。
大腸炎がどのようにしてEECの消失を引き起こすかを理解するために、次に大腸炎がEECのアポトーシスの程度を変化させるかどうか、また大腸炎がEECの分化を担う主要な転写因子の発現を破壊するかどうかを調べた。図2 FおよびGに示したように、大腸炎を誘発すると、回腸上皮層内でアポトーシスマーカーである末端デオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼを介したデオキシウリジン三リン酸ニック末端標識（TUNEL）を染色する細胞が増加し、細胞の位置と形態から、それらはEECであると考えられた。この考えを裏付けるように、2.5％DSSに曝露したマウスの回腸サンプルでTUNELとクロモグラニンAの共発現が認められ（図7）、回腸上皮内のアポトーシス細胞の一部が実際にEECであったことが確認された。さらに、大腸炎の誘発により、EECの分化経路に重要な遺伝子（転写因子Atoh1、Gfi1、Neurog3、NeuroD1、分泌タンパク質ChgAなど）の腸粘膜内での発現が有意に低下した（図2IおよびJ）。これらの所見から、大腸炎によるEECの減少は、これらの細胞のアポトーシスと、陰窩前駆細胞からの分化からの転写シフトの組み合わせによって起こる可能性が示唆される。これらの所見を説明する一つの可能性は、DSS投与が回腸に直接炎症作用を誘導し、それが二次的にEECの消失につながったということである。この可能性を排除するために、次に、モデルに用いた2濃度のDSSの下で、回腸の組織学的外観を評価した。図8A-Cに示すように、回腸遠位部サンプルの組織学的解析では、5％DSSマウスで炎症性サイトカインTnfがわずかながら有意に増加した以外は、組織構造が保たれ、細胞浸潤がないことが示された（図8D）。これらの所見を総合すると、DSSは小腸に重大な炎症を誘導しないことがわかる。同様に、5'-ブロモ-2'-デオキシ-ウリジン（BrdU）注射後の腸細胞増殖を評価したところ、DSS投与群と対照群に差はみられず、腸細胞増殖を低下させると予想される腸炎症がないことと一致した
(図8E-H）。これらの研究から、黄砂による大腸炎は小腸の著しい運動低下と腸内分泌細胞の減少を引き起こすが、回腸の著しい炎症とは無関係であることが示された。
図7CHGAとTUNELの共染色。(AおよびB) (A)コントロールおよび(B)2.5%DSS大腸炎回腸組織からのEEC分泌タンパク質CHGAおよびアポトーシスマーカーTUNELで免疫染色した回腸切片の代表的共焦点画像。白矢印で示した二重陽性細胞はDSS投与マウスの回腸切片にのみ見られた。スケールバー、50μm；挿入部、10μm。Ctrl、コントロール；DAPI、4′,6-diamidino-2-phenylindole。
図8低用量（2.5％）の黄砂では明らかな小腸炎症はなく 、 高用量（5％）の黄砂では炎症性サイトカイン Tnfが軽度に増加 し 、いずれの用量でも小腸の増殖に有意な影響は認められなかった。(A-C）H&E染色切片で示される小腸炎症の欠如と、（D）5％DSSでの炎症性サイトカインTnfの有意な増加。(E-G）回腸切片の腸管幹細胞増殖を示すBrdU免疫染色の代表的共焦点画像。(AおよびE）DSSなし対照、（BおよびF）2.5％DSS、（CおよびG）5％DSS投与マウス。スケールバー： 50 μm。(H）ImageJ2ソフトウェアを用いたBrdU+細胞の定量。各グラフのドットは個々のマウスのデータを表す。mRNAレベルはハウスキーピング遺伝子Rplp0発現に対する相対値として表した。統計的有意性は、GraphPad Prism 10ソフトウェアを用いて、一元配置分散分析、Tukey多重比較検定により決定した。∗∗∗P< .001. Ctrlはコントロール、hpfは高倍率視野。
DSS誘発性低身長症はセロトニン作動性シグナル伝達の消失と関連している
次に我々は、大腸炎におけるEECの消失は、重要なセロトニン産生および輸送遺伝子の発現の変化と関連しているであろうという仮説を立てた。
図9 Aで強調したように、セロトニン合成および輸送の酵素をコードする主要遺伝子の測定をqRT-PCR法で行った。黄砂による大腸炎の誘発は、2.5％および5％の黄砂に曝露したマウスの回腸において、セロトニン産生遺伝子の発現を有意に低下させた（Tph1およびDdc）（図9BおよびC）。主要なセロトニントランスポーターの遺伝子（Slc6a4と Htr2b）（図9Dと E）も、5％黄砂に暴露したマウスの回腸組織で発現が低下した。大腸におけるこれらの遺伝子の解析では、黄砂に対するこれらの遺伝子の反応が非常に多様であることがわかった。2.5％の黄砂に暴露したマウスでは、Tph1、Slc6a4、Htr2bの発現に有意な変化は見られなかったが、Ddcの発現は有意に低下した（図9F-I）。5%群では、Tph1とHtr2bのアップレギュレーションが観察され、同時にDdcの有意なダウンレギュレーションが見られ、Slc64aには変化がなかった。先に述べた知見と一致して、EECでは5-HTがChgAと共発現しており、DSS処理により回腸で5-HT+細胞の数が減少していることがわかった。これらの知見に基づき、次にEECの過剰発現および枯渇の遺伝学的モデルを用いて、大腸炎に伴う小腸運動低下へのEECの関与という仮説を確認しようとした。
図9DSS誘発性小腸運動低下症はセロトニン作動性シグナル伝達の消失と関連している。(A）セロトニン作動性経路の酵素とトランスポーターの図。Bと F）トリプトファン水酸化酵素1、Tph1、（Cと G）ドパ脱炭酸酵素、Ddc、（Dと H）セロトニントランスポーターのqRT-PCR： 2.5％および5％DSS投与マウスの（B-E）回腸組織および（F-I）結腸組織における（EおよびI）5-ヒドロキシトリプタミン（セロトニン）受容体2B、Htr2b。 5％および5％DSSを1週間飲水投与したマウスの回腸および結腸組織におけるmRNAレベル。mRNAレベルはハウスキーピング遺伝子Rplp0発現に対する相対値として表した。各グラフのドットは個々のマウスのデータを表す。すべてのマウス実験は3回繰り返し、各実験で1群につき少なくとも5-6匹のマウスを用いた。統計的有意性は、GraphPad Prism 10ソフトウェアを用いて、一元配置分散分析、Tukey多重比較検定により決定した。∗P＜0.05、P＜0.01、P＜0.001またはP＜0.0001。Ctrl、コントロール；DOPA、芳香族L-アミノ酸脱炭酸酵素。
図10CHGAと5'HTの共染色。(AおよびB) (A)コントロールおよび(B)2.5%DSS大腸炎回腸組織からのEEC分泌タンパク質CHGAおよびEECセロトニン作動性シグナル分子5'HT（セロトニン）について免疫染色した回腸切片の代表的共焦点画像。二重陽性細胞はマージ画像で示した。スケールバー： 50 μm；挿入図：10 μm。(C）ImageJソフトウェアを用いた5'HT+細胞の定量。グラフの各ドットは異なるマウスを表す。統計学的有意性は、GraphPad Prism 10ソフトウェアを用いた対応のないt検定により決定した。∗P< .05. Ctrl、コントロール；DAPI、4′,6-diamidino-2-phenylindole；hpf、高倍率視野。
EECを減少させたマウスモデルは重度の大腸炎誘発性小腸運動低下性大腸炎を示すが、腸内分泌細胞を過剰発現させたマウスは大腸炎誘発性小腸運動低下性大腸炎から保護される。
EECの消失が大腸炎誘発性小腸運動低下症に直接関与しているかどうかを調べるため、次に3つの異なるトランスジェニックマウスモデルで実験を行った： (1)ROSA26-iDTR/NeuroD1cre EECでは、EEC上に発現するDT誘導性ジフテリア毒素受容体を介してNeuroD1cre発現細胞を枯渇させた（飼育戦略とEEC枯渇の検証を図11 BおよびCに示す）； (2) ビリン-creトランスジェニックマウスとの交配により、幽門から直腸までの腸管上皮からEECの分化に必要なEECマスター転写因子NeuroD1をノックアウトしたNeuroD1villin 条件付きノックアウト（CKO）マウス（飼育戦略およびEEC消失の検証を図11DおよびEに示す）； 3）Villincre-loxP-STOP -loxP-NeuroD1発現カセットを用いて腸管上皮でNeuroD1を過剰発現させたNeuroD1villinOverマウスモデル（飼育戦略およびEEC過剰発現の検証を図11FおよびGに示す）。これらの各株を飲料水中に2.5％DSSを1週間投与し、前述のように大腸炎の発症と小腸運動性を評価した。重要なことは、EECの枯渇は、野生型株と比較して、結腸組織像（図12A-C）、有意に多い体重減少（図12E）、結腸短縮（図12F）、およびTnf発現の増加（図12G）によって示されるように、重篤なDSS大腸炎を引き起こすことである。EECの過剰発現は、体重減少（図12E）、結腸長（図12F）、結腸組織像（図12D）に基づくDSS誘発大腸炎の重症度を軽減せず、炎症性サイトカインTnfの発現増加をもたらした（図12G）。セロトニン合成・輸送遺伝子Tph1、Ddc、Slc6a4は、EEC過剰発現株ではTph1の発現が増加したが、EEC欠損株の結腸組織では変化しなかった（図12H-J）。
図11EECを減少させたマウスモデルでは、重篤な大腸炎誘発性小腸運動低下性大腸炎が認められるが、腸内分泌細胞を過剰発現させたマウスでは大腸炎誘発性小腸運動低下性大腸炎から保護される。(A-F）（A）野生型、（C）Neurod1cre△DTR/EECDEL、（E）Vilcre△Neurod1/EECCKO、（F）VilcreLSLNeurod1OVER/EECOVERの代表的な共焦点画像によって示されるNeuroD1変異マウスの作製の検証、および（B、D、E）変異マウス作製戦略の概略図。(G-J)回腸切片の代表的なH&E染色共焦点画像、(K)2.5%DSS処理液の飲水投与により大腸炎を発症させた野生型およびEEC変異マウスにおける炎症性サイトカインTnfのqRT-PCR。スケールバー： 50 μm。(LおよびM）経口投与30分後のFITC-デキストラン通過時間で測定した小腸運動性。野生型マウスと比較して、Neurod1欠損マウス（Neurod1cre△DTR/EECDELおよびVilcre△ Neurod1/EECCKO）ではFITC-デキストラン通過時間が遅く、過剰発現マウス（VilcreLSLNeurod1OVER/EECOVER）ではFITC-デキストラン通過時間が速い。(N-P)回腸組織における(N)トリプトファン水酸化酵素1,Tph1、(O)ドーパ脱炭酸酵素,Ddc、(P)セロトニントランスポーターsolute carrier family 6 (neurotransmitter transporter, serotonin), member 4,Slc6a4のqRT-PCR。各グラフのドットは個々のマウスのデータを表す。mRNAレベルはハウスキーピング遺伝子Rplp0発現に対する相対値で表した。すべてのマウス実験は3回繰り返され、各実験で1群につき少なくとも3-4匹のマウスが用いられた。遺伝子モデルには野生型の同腹子を用い、ジフテリア毒素による同一の処置を行った。統計的有意性は、GraphPad Prism 10ソフトウェアを用いて、一元配置分散分析、Tukey多重比較検定により決定した。∗P＜0.05、P＜0.01、P＜0.001。WTは野生型。
図12EECの遺伝子欠損または過剰発現はDSS誘発大腸炎を防御しない。(A-D）結腸切片の代表的なH&E染色共焦点画像、（E）体重変化、（F）結腸長、（G）炎症性サイトカインTnfのqRT-PCR。(H-J）飲料水に2.5％黄砂を1週間投与した野生型マウスおよびEEC変異マウスの結腸組織における（H）トリプトファン水酸化酵素1（Tph1）、（I）ドーパ脱炭酸酵素（Ddc）、および（J）セロトニントランスポーター：ソリュートキャリアファミリー6（神経伝達物質トランスポーター、セロトニン）、メンバー4（Slc6a4）のqRT-PCR。各グラフのドットは個々のマウスのデータを表し、n = 4-11マウス。mRNAレベルはハウスキーピング遺伝子Rplp0発現に対する相対値で表した。スケールバー： 50 μm。統計的有意性は、GraphPad Prism 10ソフトウェアを用いて、一元配置分散分析、Tukey多重比較検定により決定した。∗P＜0.05、P＜0.01、P＜0.001。WTは野生型。
さらに、小腸の組織学的評価とTnf発現から、villin-EEC欠失マウスとvillin-EEC過剰発現マウスでは明らかな炎症は見られず、正常な絨毛構造を示した（図11I-K）が、誘導性ジフテリア毒素受容体（Idtr）-EEC欠失マウスでは上皮がわずかに崩壊していた（図11H）が、Tnf発現は正常であった（図11L）。重要なことに、EECを遺伝的に欠損させたマウスは、野生型マウスと比較して小腸運動性が有意に悪化しており（図11MおよびN）、図1Jの結果と一致し、EECの欠損が大腸炎後の腸運動性の低下をもたらすことが明らかになった。EEC枯渇モデルにおける運動解析では、DSS投与前のベースラインにおいて顕著な運動低下-正常な腸運動を維持する上で小腸EECが重要な役割を担っていることが明らかになった（図13）。対照的に、EECを過剰発現するように遺伝子操作したマウスは、DSSに反応して頑健な大腸炎を起こしたにもかかわらず、大腸炎誘発性小腸運動低下に対して相対的な抵抗性を示し（図11MおよびN）、EECの過剰発現がこの遺伝学的モデルにおける運動低下に対する防御を牽引しているという結論をさらに支持した。EECを欠損させたマウスでは、セロトニン処理に関与する遺伝子の発現低下が認められたが、これはEECを過剰発現させたマウスでは救済された（図11OおよびP）。これらの所見を総合すると、小腸からのEECの消失が実験的大腸炎で観察される腸管運動低下を媒介することがわかる。
図13腸内分泌細胞欠失（EECDEL,Neurod1cre△DTR/EECDEL）変異マウスは基礎運動低下を示している。(A)FITC-デキストラン通過時間のピーク強度（矢印）と(B)幾何学的中心によって示されるEEC欠失マウスの小腸運動低下。各グラフのドットは個々のマウスのデータを表す。統計学的有意性はGraphPad Prism 10ソフトウェアを用いた対応のないt検定により決定した。∗∗∗P< .001. Duoは十二指腸、Stoは胃、WTは野生型。
DSS誘発小腸運動低下はセロトニン受容体作動薬プルカロプリドの投与で回復できる
次の一連の実験では、セロトニンシグナル伝達を増強する薬理学的アプローチが、腸運動に対するDSS大腸炎の有害な影響を逆転させることができるかどうかを調べようとした。そのために、セロトニン受容体の選択的作動薬であるセロトニンタイプ4（5-HT4）作動薬プルカロプリドを選択した。
対照マウスにはビヒクルのみを投与した。図14に示すように、プルカロプリドを投与したDSS投与マウスは、DSS投与マウスと比較して大腸の長さが増加したことから明らかなように、大腸炎症の程度が有意に減少し、コントロールマウスと同程度であった（図14AおよびB）。プルカロプリドを投与したDSS処置マウスは、体重減少量の減少（図14C）、炎症性サイトカインIl1b（図14D）およびIl6（図14E）の発現の減少、大腸組織像の改善（図14F-H）、およびDAI（図14I）の改善も示した。重要なことは、われわれの最初の仮説と一致して、プルカロプリドを野生型マウスに投与すると、小腸運動（図14JおよびK）に対する黄砂性大腸炎の有害な影響が、無処置のコントロールと同程度のレベルまで回復したことである。プルカロプリドはまた、EEC欠失マウスで行った黄砂モデルにおいて、小腸の運動低下を回復させる部分的な保護効果を有することが見出された（図14JおよびK）。これらの所見を総合すると、DSS大腸炎はEECの喪失を介して腸管運動低下を誘導し、それはセロトニン受容体作動薬で回復可能であることが明らかになった。
図14DSSによる小腸運動低下はセロトニン受容体作動薬プルカロプリドの投与により回復する。(A-I）プルカロプリドを投与したマウスにおけるDSS誘発大腸炎に対する防御の特徴。プルカロプリドの経口投与は、(A)結腸長のドットグラフ、(B)結腸の肉眼写真、(C)体重変化率、炎症性サイトカイン(D)Il1bおよび(E)Il6のqRT-PCR、(F-H)代表的なH&E染色結腸像、および(I)2. 5%DSSを1週間飲水投与し、5-HT4セロトニン作動薬プルカロプリドを1日1回経口投与した。スケールバー： 50 μm。(JおよびK）プルカロプリド投与は、FITC-デキストラン蛍光強度の（J）ピーク強度測定（矢印）および（K）有意な幾何学的中心によって示されるように、DSS誘発小腸運動低下を防御する。各グラフのドットは個々のマウスのデータを表す。mRNAレベルはハウスキーピング遺伝子Rplp0発現に対する相対値で表した。すべてのマウス実験は3回繰り返し、各実験で1群につき少なくとも5-6匹のマウスを用いた。統計的有意性は、GraphPad Prism 10ソフトウェアを用いて、一元配置分散分析、Tukey多重比較検定により決定した。∗P＜0.05、P＜0.01、P＜0.001またはP＜0.0001。Avgは平均；Ctrlはコントロール；Duoは十二指腸；Stoは胃；WTは野生型。
考察
我々は、実験的な黄砂による大腸炎が小腸の運動低下につながるという証拠を提供したが、その機構は小腸粘膜内のEECの消失によって説明できる。マウスにEECを過剰発現させると、大腸炎誘発性の運動機能低下が抑制されることがわかった。一方、EECを欠損したマウスは、大腸炎誘発後、野生型マウスに比べて運動機能低下が有意に悪化した。大腸炎によるEECの消失は、アポトーシスやEEC分化経路を制御する遺伝子の発現障害に起因している可能性がある。他の腸管上皮細胞や、腸グリアや神経細胞といった運動性に関連する他の細胞型の密度には有意な変化が見られなかったことは注目に値する。重要なことは、セロトニン作動薬による治療が、大腸炎によって誘発された小腸の運動低下を改善し、大腸炎の重症度を軽減したことである。これらの結果を総合すると、大腸炎で観察される腸管運動低下を説明するメカニズムが明らかになった。
我々は、今回の知見を、時に矛盾することもある黄砂性大腸炎における小腸運動に関する先行研究との関連において位置づけたい。具体的には、先行研究者らは炎症が大腸の運動機能に影響を及ぼす可能性を示しているが、以下のような研究結果がある、
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大腸炎中および大腸炎後の小腸蠕動について調べた研究は比較的少ない。Aldiniら
は、同様のマウスモデルである黄砂性大腸炎では小腸運動が障害されることを示した。
は、大腸炎が回腸における遊走運動複合体の頻度の増加と関連していることを示した。これらの一見食い違う所見は臨床研究にも及び、大腸炎時の小腸運動低下か運動亢進かの議論は活発な分野であり、両論を支持する証拠もある。
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マウス大腸炎モデルにおける我々の知見は、大腸炎が小腸運動低下と関連しているという仮説を支持するものである（図1）。
本研究はまた、大腸炎における粘膜内のEECの消失を説明する潜在的なメカニズムにも光を当てている。図2E-Gに示すように、CHGA/TUNEL共陽性細胞数の有意な増加が観察され（図7）、これは観察されたEECの消失にアポトーシス細胞死が関与している可能性を支持する所見である。他の腸管上皮系譜（杯細胞、パネス細胞、腸細胞）の数には同様の減少が観察されなかったことは注目に値する（図4）ことから、回腸EECプールに対する大腸炎の特異的な影響が示唆される。なぜこのようなことが起こるのかについては、いくつかの可能性が考えられる。アポトーシスは小胞体ストレス下で起こることから、大腸炎による小胞体ストレスが、他の細胞種よりもEECに優先的に作用している可能性が考えられる。別の説明として、Nealら
は、Toll様受容体（TLR）を介した微生物のシグナル伝達の亢進に反応して腸管内膜のアポトーシスが誘導される可能性を示し、EEC上のToll様受容体の活性化がアポトーシスによるEECの死につながることを示唆した。この可能性を支持するものとして、Bogunovic et al
は、培養中のEECがTLR4およびTLR1やTLR2を含む他の細菌レセプターを発現していることを示した。さらにEECは、微生物叢由来の短鎖脂肪酸を感知するGタンパク質共役型受容体（GPR）（GPR40、GPR41、GPR43、GPR119、GPR120）を発現していることが判明している。
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我々は現在、EECがTLR4やその他の微生物レセプターをin vivoで発現していること、これらのレセプターの発現が大腸炎時に回腸で増加すること、そしてこれらのレセプターの過剰な活性化がEECのアポトーシスを誘導することを仮定している。EECの喪失におけるアポトーシスの役割を証明するためには、さらなる研究が必要であり、それにより、大腸炎の設定においてEECを維持するための新たな治療アプローチが得られるかもしれない。
今回の研究において、我々が用いたEEC枯渇モデルが、ニューロジェニン-3欠損マウスに見られる汎腸管欠損に伴う重度の吸収不良と早期致死を再現していないことは注目に値する。
Neurod1欠損マウスは、Neurogenin-3欠損マウスよりも重症度の低い表現型である。Neurod1欠損マウスは、ベースライン時に有意な体重減少、神経症状、死亡を示さなかったため、より重症のNeurogenin-3欠損マウスとは区別された。
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ジフテリア毒素を用いたEEC欠失モデルは、Villin特異的コンディショナルノックアウトマウスよりも顕著な運動機能低下を示した（図11LおよびM）。したがって、EECの枯渇を達成するために2つの異なるアプローチを用いることは、今回の研究にとって重要であり、ジフテリア毒素処理後には見られないvillin-creアプローチを用いた場合に起こりうる適応を説明するものである。
EECを過剰発現させたマウスは小腸の運動性の回復を示したが、他の遺伝子モデルやコントロールと比較すると、Tnfを含む大腸炎症性サイトカインのレベルも有意に高かった（図12）。この所見は、Neurod1依存性の子孫の中には、大腸炎の設定において炎症促進作用を持つサブセットが存在する可能性を示唆している。大腸炎の病態をより広範に解明するためには、この分野の研究をさらに進めることが重要であろう。
今回の研究は、特に腸の炎症が起こっている状態における腸の運動性のダイナミックな性質を浮き彫りにしている。現在の考えでは、5-HTは複数の受容体サブタイプを活性化し、移動性運動複合体を生成することによって腸の運動を促進すると考えられている、
そして、5-HT調節は現在、嘔吐、下痢、便秘を治療するために、IBSやIBDなどの病態に臨床応用されている。
5-HT4は、消化管運動に関連する5-HT受容体の主要なアイソフォームである、
は、慢性便秘の緩和や慢性腸閉塞の治療への応用が臨床的に注目されている。
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旧来の5-HT4作動薬は、不整脈や肝毒性などの重大な副作用によって臨床的な支障をきたしていた。
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プルカロプリドは、先行する5-HT4作動薬とは異なるユニークな化学的実体であり、他のセロトニン受容体に対する活性は最小であり、慢性特発性便秘の症状を最小限の副作用で緩和することが判明している。
今回の研究により、プルカロプリドのようなセロトニン作動薬が潰瘍性大腸炎の運動障害の症状を軽減する可能性が出てきた。
また、5-HT4の活性化が筋マクロファージの抑制を介して腸において抗炎症作用を発揮する可能性があることにも注目したい、
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従って、セロトニン受容体作動に反応して抗炎症経路が直接誘導されることも、図5で観察された保護反応を媒介する可能性がある。プルカロプリドの抗炎症作用が、5-HT4活性化を通じて、あるいは腸管運動への作用を通じて、どのような役割を果たすのか、さらなる調査が必要である。
今回の研究にはいくつかの潜在的な限界があった。第一に、本研究はすべてマウスで行われたため、今回の知見がヒト患者にも適用されると推測されるが、この点については直接検証されていない。さらに、オスではメスよりも強固で一貫性のある大腸炎が発症することから、本研究では大腸炎の一貫性を確保するためにオスマウスのみを用いた。
炎症反応における性差はよく知られているので、この研究を他の動物モデルやヒトに適用する際には、この限界を考慮することが重要である。
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さらに、今回の研究は潰瘍性大腸炎の臨床的特徴を共有するモデルで行われた、
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したがって、これらの所見が感染性大腸炎やクローン病にも当てはまるかどうかは、まだ評価されていない。
黄砂の投与量そのものが、大腸の腸粘膜に直接的な炎症促進作用を及ぼす可能性があり、その結果、炎症性サイトカインが放出され、小腸の運動が抑制される可能性がある。この可能性を裏付けるように、5％の黄砂を投与したマウスは、2.5％の黄砂を投与したマウスと比較して、EECの損失が同程度であるにもかかわらず、Tnfの発現が有意に高いことがわかった（図8）。この潜在的な交絡因子に光を当てるには、腸管運動における炎症性サイトカイン放出の役割について、より詳細な解析が必要であろう。最後に、セロトニン受容体の活性化が大腸炎に誘発された運動障害を逆転させる正確な機序はまだ明らかにされておらず、筋固有層におけるエフェクター細胞の直接的な活性化を含む可能性がある、
あるいは、セロトニンが介在する大腸炎の重症度の軽減が関与しているかもしれない。
材料と方法
証明
すべての著者が研究データにアクセスし、最終原稿を確認・承認した。
動物
本研究に記載されたすべてのマウス実験は、米国国立衛生研究所（National Institutes of Health）が推奨するGuide for the Care and Use of Laboratory Animalsに従って行われ、NC3RS Animal Researchに従ってJohns Hopkins UniversityのプロトコルMO20M276により承認された： 生体内実験の報告（ARRIVE）ガイドラインに従った。C57BL/6Jマウスはジャクソン研究所から購入し、ジョンズ・ホプキンス大学の病原体フリー施設で何世代にもわたって飼育し、腸内細菌叢を安定化させた。すべてのマウスに水と餌を自由摂取させ、12:12時間の明暗サイクルで温度管理された部屋（22℃）で飼育した。試験に使用したすべてのマウスは、吸入によるイソフルラン麻酔（3％～4％イソフルラン）後、頸椎脱臼により人道的に殺処分した。
マウス系統
C57BL/6J（Jax系統#000664）、ROSA26iDTR（C57BL/6-Gt[ROSA]26Sor tm1[HBEGF]Awai/J、Jax系統#007900）、VillinCre（B6.Cg-Tg[Vil1-cre]997Gum/J、Jax系統#004586）、NeuroD 1cre（Tg[Neurod1-cre]1Able/J、Jax系統#028364）マウスはJackson Laboratoryより入手した。Neurod1-loxP
は、Sandra Goebbels博士（Max Planck Institute of Experimental Medicine、ゲッチンゲン、ドイツ）から提供された精子を用い、Johns Hopkinsトランスジェニックコア施設で再導出された。Rosa26LSLNeurod1は、Gabriela Pavlinkova, PhD（チェコ）からの寄贈である。
すべてのマウス系統は、水と標準的なげっ歯類用飼料（Teklad Global 18%タンパク質げっ歯類用飼料；Envigo）を自由に摂取できた。大腸炎は雌よりも雄の方が強固で一貫して発症することから、誘導される大腸炎の一貫性を確保するため、雄マウスのみを用いて研究を行った。
EEC変異マウスの作製
転写因子Neurod1を発現するEEC細胞上でジフテリア毒素受容体（DTR）を発現させるため、Neurod1プロモーター上でCreリコンビナーゼを発現するトランスジェニック雄（Neurod1Cre）とROSA26iDTR雌を交配させ、ジフテリア毒素で処理することにより、ジフテリア毒素誘導性EEC欠失変異マウスを作製した（2. 5ng/g体重、腹腔内、1日1回、カタログ番号D0564-1MG；Sigma）を2日間連続投与してDTRを活性化し、Neurod1+ EEC集団を枯渇させた。これと並行して、Neurod1 loxP変異雌とVillinプロモーター上でCreリコンビナーゼを発現するトランスジェニックマウス（Neurod1loxP X Neurod1loxP+;VillinCre）を交配することにより、Villin発現腸上皮細胞上の転写因子Neurod1を欠損するEEC変異マウスを作製した。これら2つの系統は、大腸炎後の運動機能低下におけるNeurod1+ EECの役割を理解するための並行したアプローチを提供する。DTRモデルはEECを急性的に枯渇させるが、villin-cre NeuroD1変異体はEECの喪失に適応するウィンドウを経験する。これと並行して、Neurod1loxP-STOP-loxP -OVER変異雌マウスとVillinプロモーター上でCreリコンビナーゼを発現するトランスジェニックマウスを交配することにより、Villin発現腸上皮細胞上でNeurod1を過剰発現するEEC変異マウスを作製した。変異マウスの作製に成功したことは、対立遺伝子特異的プライマーを用いたゲノムDNA PCRと免疫組織化学によって確認された。
DSS大腸炎モデル
6〜10週齢の雄性野生型マウス（C57BL/6）またはEEC変異マウスに、0.5％ショ糖飲料水中2.5％または5％の濃度のDSS（分子量40〜50キロダルトン、カタログ番号J14489-22；ThermoFisher Scientific）を1週間投与し、大腸炎を発症させた。対照マウスには0.5%ショ糖飲料水のみを与えた。マウスはモデル期間中毎日体重を測定し、体重減少、下痢、直腸出血、一般健康状態、死亡率を徹底的にモニターした。組織中に残留するDSSが逆転写酵素を阻害し、遺伝子発現解析を妨害する可能性を考慮し、DSS処理水を殺処分の前夜に通常の水と交換し、組織をDSS汚染なしにRNA単離に使用できるようにした。
マウスは、増殖細胞を標識するために、殺される24時間前にBrdU標識試薬（cat #00 -0103、腹腔内、10μL/g体重；Invitrogen社製）を投与された。DSS大腸炎の重症度は、Kimらの方法に従ってDAIで評価した71。
の方法に従った。DAI総スコアは、体重減少（0、減少なし；1、1％～5％の体重減少；2、5％～10％の体重減少；3、10％～20％の体重減少；および4、20％以上の体重減少）、治療中または組織採取時に認められた便の硬さ（0、正常；2、緩い便；および3、下痢）、出血（0、血液なし； 1、血便陽性、2、肛門に血痕の痕跡、3、肉眼的出血）、死亡率（0、死亡なし、1、10％～20％、2、20％～25％、4、30％以上）、組織学的大腸炎スコア（0、損傷なし、1～2、構造的上皮変化、3～4、上皮の損傷の程度、陰窩の消失）。
腸管通過時間と腸管運動研究
腸管通過時間と腸管運動性の測定は、最近報告されたように、70キロダルトンのフルオレセインイソチオシアネート-デキストラン（FITC-デキストラン、カタログ番号90718；Sigma）を用いて行った。
FITCデキストラン（2％メチルセルロース中10mg/mLを100μL）を、各マウス（雄のみ）に、殺処分の30分前に24F血管カテーテルを用いて経口投与した。胃から結腸までの腸を採取し、2cmの切片に分割した後、300μLのダルベッコのリン酸緩衝生理食塩水を入れたビーズホモジナイジングチューブに移した。サンプルは、後の研究のために処理するまで-20℃で保存するか、ビーズホモジナイザーを用いて直ちにホモジナイズし、12,000×gで3分間遠心分離して透明な上清を得た。SpectraMax M3分光光度計（Molecular Devices）を用いてFITC蛍光（λ励起、492 nm；発光、518 nm）を測定するために、合計100 μLの透明上清を用いた。小腸通過時間は、小腸内のFITCデキストランの幾何学的中心の位置から求めた。
指示された場合、5-HT4セロトニン作動薬プルカロプリド（カタログ番号SML1371；Sigma）をメチルセルロースビヒクルに懸濁し、DSSモデルの1日目から6日目まで1日1回（5mg/kg）、100μLの容量で経口経口投与した。対照動物にはビヒクルのみを投与した。
定量的リアルタイムPCR
RNeasy mini kit（Qiagen）を用いて全RNAを単離し、QuantiTect Reverse Transcription kit（Qiagen）を用いて0.5μgの全RNAから製造者の指示に従って相補的DNAを合成した。iTaq universal SYBR Green mix（Bio-Rad）を用いてBio-Rad CFX96 Real-Time Systemで表1に示す遺伝子特異的プライマーを用いてqRT-PCRを行った。ハウスキーピング遺伝子であるリボソームタンパク質ラージP0（Rplp0）に対するmRNA発現量は、既述のように2-ΔΔCt法を用いて算出した。
表1プライマー配列
遺伝子名 Forward; Reverse
Atoh1 ATGGCCCAGATCTACATCAACGCT; GTGCGAAGGTGATGGTGGTCATTT
ChgA AAGGTGATGAAGTGCGTCCTGGAA; AGCAGATTCTGGTGTCGCAGGATA
Ddc TGGTCTGCTTCCGGCTAAAG; CGGAGACGACATGGAACCAA
Gfi1 CTCCGTGTCTCCAGCGTCGG; CACCAGGTGCCGCAGGTCAG
Hes1 CAGCTCCGGGAAAGCAAGCCC；GCCACCTTTCTGAGTCACCGC
Htr2b AATAGGCATCGCCATCCCAG; CAAAGCGTCCTTTGTCAGC
Il6 CCAATTTCCAATGCTCTCCT; ACCACAGTGAGGAATGTCCA
Il1b AGTGGATCCCAAGCAATACCCA; TGTCCTGACCACTGTTGTTTCCCA
Klf4 GCAGCCACCTGGCGAGTCTG; CGCCAACGGTTAGTCGGGC
Lgr5 TGAGCGGACCTTGAAGATTTCCT; TACCAAATAGGTGCTCACAGGGCT
Lyz1 AAGCTGGCTGACTGGGTGTTTA; CACTGCAATTGATCCCACAGGCAT
MKi67 CCAAGGCCCAAGTTTGATGC; GACTTGGCCGAGATGTAG
Muc2 TAGTGGAGATTGCCGCTGAAGT; AGAGCCCATCGAAGGTGACAAAGT
Neurod1 TGACCAAATCATACAGCGAGCG; TGGCTTCAAGCTCGTCCTCTTTCT
Neurog3 AGACGCTGCGCATAGCGGAC; ACCCGCTTGGGAGACTGGGGG
ノッチ1 CATGGGCGCACAGGTCTGCT; AGGGGCAGGTGCAGATGGCT
Slc6a4 TGGATAGTACGTTCGCAGGC; CATACGCCCCTCCTGATGTC
Sis GCCCATTCATGGTGGAAC; TCCAATGACAGGAGTCACCA
Sox9 GACGTGCAAGCTGGCAAAGTTGAT; TCAATGTTGGGAGATGACGTCGCTG
Tnf TTCCGAATTCACTGGAGCCTCGAA; TGCACCTCAGGGAAGAATCTGGAA
Tph1 TCCCCTCTACACTCCAGAGC; AAGGGAAGCCAGGCCAATTT
Rplp0 GGCGACCTGGAAGTCCAACT; CCATCAGCACCACAGCCTTC
免疫蛍光と組織学的解析
遠位小腸（回腸）および遠位結腸組織（約2-3 cm）を死亡直後に採取し、リン酸緩衝生理食塩水中の4％パラホルムアルデヒド（cat #RT15700 ; Electron Microscope Services）で一晩固定した。その後、組織をMicrom STP 120 Spin Tissue Processor（Thermo Scientific）を用いて処理し、パラフィンに包埋し、CUT 6062ミクロトーム（D-55129；SLEE Medical GmbH）を用いて5μm厚の切片を切り出した。パラフィン包埋組織切片をH&E染色および免疫組織化学に用い、クロモグラニンA（カタログ番号NB100-2037；Novus Biologicals）、スクラーゼイソマルターゼ（カタログ番号A-17:sc-276003；Santa Cruz Biotechnology）、リゾチームC（カタログ番号C-19, sc： 27958; Santa Cruz Biotechnology）、BrdU（カタログ#BU1/75; Novus Biologicals）、セロトニン（5'-HT）（カタログ#ab66047; Abcam）を、Tween20を含むトリス緩衝生理食塩水（TBST）で1:200希釈し、4℃で一晩、種特異的Alexa Fluorロバ二次抗体（Invitrogen）を1： 1000で室温で2時間、その後洗浄し、核染色（4'，6-ジアミノ-2-フェニルインドール）で染色した後、ゲルバトールマウンティングメディアでマウントした。ゴブレット細胞はアルシアンブルー染色で染色した。In Situ Death Detection Kitでは、フルオレセイン（TUNEL、cat #11684795910 ；Roche）を製造者の指示に従って染色した。画像はすべてLeica広視野顕微鏡（DMi8）またはNikon Confocal AX-R顕微鏡で撮影した。画像はImageJ2ソフトウェア（バージョン2.3.0/1.53p；National Institutes of Health）を用いて定量化した。すべての共焦点撮影は群間で同じ露光量で行った。EECの定量化のための画像解析は、Fiji ImageJソフトウェア（バージョン2.3.0/1.53p;https://imagej.net/software/fiji）を用いて行った。
統計解析
すべてのデータはGraph Pad Prism 10（GraphPad Software）を用いて解析した。データは、通常の一元配置分散分析とTukey多重比較検定によって統計的有意性を分析した。Welch補正を用いた両側検定なしのt検定は、2つの治療群を含む実験のデータを比較するために用いた。新生マウスの実験データ群の生物学的データは正規分布していた。P値が0.05（95％信頼水準）未満を統計的に有意とみなし、データは平均値±SEMで示した。すべての実験は、3匹以上のマウス群で少なくとも2-3回繰り返し、独立して行った。グラフは各マウス標本について個々の動物を点で示す。
結論
要約すると、我々は小腸粘膜内のEECの消失を通じて大腸炎発症時に小腸の運動低下が起こる新規メカニズムを同定したが、これはセロトニンアゴニストの使用により回復しうる。これらの知見は、EECに基づく治療アプローチが、IBD患者に生じる運動障害の症状を緩和する可能性を示唆している。
CRediT著者による貢献
David J. Hackam, PhD, MD (方法論：同等; 監修：同等; 原著：同等)
Zachariah Raouf (調査：同等、方法論：同等、原案執筆：同等)
Steve N. Steinway (調査：補助)
Daniel Scheese (方法論：支援)
カーラ M. ロペス (構想: 助手)
Johannes W. Duess (概念化: 助手)
坪井孝一 (データキュレーション：サポート)
Maame Sampah (概念化：サポート)
ダフネ・クラーク (調査：サポート)
マフムード・エル・バアシリ (概念化：サポート)
ハンナ・ムーア（形式分析：サポート）
Cody Jonathan Tragesser, MD (データキュレーション：支援; 調査：支援)
Thomas Prindle (プロジェクト管理：サポート)
Sanxia Wang (データキュレーション：サポート)
Menghan Wang (データキュレーション: 助手)
Hee-Seong Jang (データキュレーション: 助手)
William B. Fulton (形式分析: 助手)
Chhinder P. Sodhi (概念化： 同等： 同等： 同等： 同等、原案執筆： 同等）
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論文情報
出版履歴
オンライン公開 2024年3月1日
受理 2024年2月26日
受理：2023年9月20日 受理：2023年9月20日
脚注
利益相反著者らは利益相反を公表していない。
資金提供米国国立衛生研究所R35GM141956（D.J.H.）およびT32DK007713（C.M.L.、C.T.、D.S.）の助成を受けた。
Data Availability著者らによって作成され、本論文で言及されたすべてのデータは、リクエストにより入手可能である。
同定
DOI:https://doi.org/10.1016/j.jcmgh.2024.02.017
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サイエンスダイレクト
図表
図表による要約
図1DSS大腸炎はマウスの小腸運動低下を誘導する。(A-I)DSS誘発大腸炎マウスモデルの検証。(A)大腸長の有意な減少、(B)炎症、血便、短縮した大腸を示す肉眼的大腸写真、(C)体重変化率、 C57/Bl6マウスに2. 5％および5％DSSを1週間飲水投与したC57/Bl6マウスのDAI（I）。スケールバー： 50 μm。(JおよびK）DSS投与は、（J）FITC-デキストラン蛍光トランジットのピーク強度（矢印）および（K）DSS群における有意に低い幾何学的中心によって示されるように、小腸運動低下と関連している。mRNAレベルはハウスキーピング遺伝子Rplp0発現に対する相対値として表した。各グラフのドットは個々のマウスのデータを表す。すべてのマウス実験は、各実験で1群あたり少なくとも5-6匹のマウスを用いて3回繰り返した。統計的有意性は、GraphPad Prism 10ソフトウェアを用いて、一元配置分散分析、Tukey多重比較検定により決定した。∗∗P＜0.01、P＜0.001またはP＜0.0001。Avgは平均、Duoは十二指腸、Stoは胃。
図2大腸炎誘発性小腸運動低下症の発症はEECの消失と関連している。(A-C）EECを示すクロモグラニンA免疫染色回腸切片の代表的共焦点画像（赤色CHGA+細胞、白矢印）、（E-G）アポトーシスを示すTUNEL染色回腸切片の代表的共焦点画像（緑色TUNEL+細胞、白矢印）。(AおよびE）DSSなしCtrl、（BおよびF）2.5％DSS、（CおよびG）5％DSS。スケールバー： 50 μm。(D)CHGA+EECおよび(H)TUNEL+細胞のImageJ2ソフトウェアによる定量。(I）腸におけるEEC分化経路の図解。(J）遠位小腸で発現するEEC系譜遺伝子のqRT-PCR； ロイシンリッチリピート含有Gタンパク質共役型受容体5（Lgr5）、ノッチ受容体1（Notch1）、モノクローナル抗体Ki 67（Mki67）によって同定された増殖メーカー抗原、 Atonal basic Helix-Loop-Helix (bHLH) transcription factor 1 (Atoh1)、growth factor independent one transcription repressor (Gfi1)、neurogenin 3 (Neurog3)、neurogenic differentiation 1 (Neurod1)、Chromogranin A (ChgA)。各グラフのドットは個々のマウスのデータを表す。mRNAレベルはハウスキーピング遺伝子Rplp0発現に対する相対値として表した。すべてのマウス実験は3回繰り返し、各実験で1群につき少なくとも5-6匹のマウスを用いた。統計的有意性は、GraphPad Prism 10ソフトウェアを用いて、一元配置分散分析、Tukey多重比較検定により決定した。∗P＜0.05、P＜0.01、P＜0.001またはP＜0.0001。
図3EECは小腸全体で一様に減少し、結腸では比較的変化がない。qRT-PCRデータは、EEC特異的分泌タンパク質クロモグラニンA（ChgA）の相対発現を示す。各グラフのドットは個々のマウスのデータを示す。統計学的有意性は、パラメトリックガウス分布とHolm-Sidak法による多重補正を行った調整P値を用いた複数の対応のないt検定により決定した。データはGraphPad Prism 10ソフトウェアを用いて解析した。∗P＜0.05およびP＜0.001。Ctrlはコントロール。
図4DSS処理は腸細胞、杯細胞、パネス細胞の分化に影響を及ぼさない。(A-C、F-H、K-M）（A、F、K）DSS無投与のコントロール、または（B、G、L）2.5％DSS投与マウス、（C、H、M）5％DSS投与マウスの（A-C）回腸切片の代表的な染色像（腸細胞ブラシボーダー酵素スクラーゼ・イソマルターゼ、（F-H）杯細胞ムチン、（K-M）パネス細胞リゾチームC）。(D、E、I、J、N、O）qRT-PCRによる（D）腸細胞遺伝子スクラーゼイソマルターゼ、Sis；（E）腸細胞系転写因子-Hesファミリー塩基性ヘリックス-ループ-ヘリックス（bHLH）転写因子1、Hes1；（I）杯細胞遺伝子ムチン2、Muc2； (E）杯細胞系転写因子-クルッペル様転写因子4、Klf4、（N）パネス細胞遺伝子リゾチーム、Lyz1、および（O）パネス細胞系転写因子-SRY（性決定領域Y）-ボックス9、Sox9。スケールバー： 50 μm。各グラフのドットは個々のマウスのデータを表す。mRNAレベルはハウスキーピング遺伝子Rplp0発現に対する相対値として表した。統計的有意性は、GraphPad Prism 10ソフトウェアを用いて、一元配置分散分析、Tukey多重比較検定により決定した。Ctrlはコントロール。
図5DSS投与は小腸腸管ニューロンおよび腸管グリアに影響を与えない。(A-C)回腸切片の代表的共焦点画像。成熟腸神経細胞マーカー-チューブリン、β3クラスIII、TUBB3、白矢印、(E-G)腸グリアマーカー-グリア線維酸性タンパク質、GFAP、白矢印は、(AおよびE)無処置のコントロール、(BおよびF)2.5%DSS投与、(CおよびG)5%DSS1週間投与マウスのもの。スケールバー： 50 μm；挿入図：10 μm。ImageJ2ソフトウェアを用いた(D)腸ニューロンおよび(H)腸グリアの定量化。各グラフのドットは個々のマウスのデータを表す。統計的有意性は、GraphPad Prism 10ソフトウェアを用いて、一元配置分散分析、Tukey多重比較検定により決定した。Ctrlはコントロール、hpfは高倍率視野。
図6DSSに伴う小腸の運動低下は、大腸EECの有意な消失を伴わずに起こる。(A-C）EEC（赤）を示すクロモグラニンA免疫染色結腸切片の代表的共焦点画像。(D）ImageJ2ソフトウェアを用いたChgA+細胞の定量化。各グラフのドットは個々のマウスのデータを表す。スケールバー： 50 μm；挿入は10 μm。統計的有意性は、GraphPad Prism 10ソフトウェアを用いて、一元配置分散分析、Tukey多重比較検定により決定した。Ctrlはコントロール、hpfは高倍率視野。
図7CHGAとTUNELの共染色。(AおよびB) (A)コントロールおよび(B)2.5%DSS大腸炎回腸組織のEEC分泌タンパク質CHGAおよびアポトーシスマーカーTUNELの免疫染色を行った回腸切片の代表的共焦点画像。白矢印で示した二重陽性細胞はDSS投与マウスの回腸切片にのみ見られた。スケールバー、50μm；挿入部、10μm。Ctrl、コントロール；DAPI、4′,6-ジアミノ-2-フェニルインドール。
図8低用量（2.5％）の黄砂では明らかな小腸炎症はなく 、 高用量（5％）の黄砂では炎症性サイトカイン Tnfの軽度の増加を 伴うが、 いずれの用量でも小腸の増殖に有意な影響はない。(A-C）H&E染色切片で示される小腸炎症の欠如と、（D）5％DSSでの炎症性サイトカインTnfの有意な増加。(E-G）回腸切片の腸管幹細胞増殖を示すBrdU免疫染色の代表的共焦点画像。(AおよびE）DSSなし対照、（BおよびF）2.5％DSS、（CおよびG）5％DSS投与マウス。スケールバー： 50 μm。(H）ImageJ2ソフトウェアを用いたBrdU+細胞の定量。各グラフのドットは個々のマウスのデータを表す。mRNAレベルはハウスキーピング遺伝子Rplp0発現に対する相対値として表した。統計的有意性は、GraphPad Prism 10ソフトウェアを用いて、一元配置分散分析、Tukey多重比較検定により決定した。∗∗∗P< .001. Ctrlはコントロール、hpfは高倍率視野。
図9DSSによる運動機能低下はセロトニン作動性シグナルの消失と関連している。(A）セロトニン作動性経路の酵素とトランスポーターの図。Bと F）トリプトファン水酸化酵素1、Tph1、（Cと G）ドパ脱炭酸酵素、Ddc、（Dと H）セロトニントランスポーターのqRT-PCR： B-E）回腸組織、（F-I）結腸組織において、2. 5％および5％DSSを1週間飲水投与したマウスの回腸および結腸組織におけるmRNAレベル。mRNAレベルはハウスキーピング遺伝子Rplp0発現に対する相対値として表した。各グラフのドットは個々のマウスのデータを表す。すべてのマウス実験は3回繰り返し、各実験で1群につき少なくとも5-6匹のマウスを用いた。統計的有意性は、GraphPad Prism 10ソフトウェアを用いて、一元配置分散分析、Tukey多重比較検定により決定した。∗P＜0.05、P＜0.01、P＜0.001またはP＜0.0001。Ctrl、コントロール；DOPA、芳香族L-アミノ酸脱炭酸酵素。
図10CHGAと5'HTの共染色。(AおよびB) (A)コントロールおよび(B)2.5%DSS大腸炎回腸組織からのEEC分泌タンパク質CHGAおよびEECセロトニン作動性シグナル分子5'HT（セロトニン）について免疫染色した回腸切片の代表的共焦点画像。二重陽性細胞はマージ画像で示した。スケールバー： 50 μm；挿入図：10 μm。(C）ImageJソフトウェアを用いた5'HT+細胞の定量。グラフの各ドットは異なるマウスを表す。統計学的有意性は、GraphPad Prism 10ソフトウェアを用いた対応のないt検定により決定した。∗P< .05. Ctrl、コントロール；DAPI、4′,6-ジアミジノ-2-フェニルインドール；hpf、高倍率視野。
図11EECを減少させたマウスモデルでは、重度の大腸炎誘発性小腸運動低下性大腸炎が見られるが、腸内分泌細胞を過剰発現させたマウスでは、大腸炎誘発性小腸運動低下性大腸炎から保護される。(A-F）（A）野生型、（C）Neurod1cre△DTR/EECDEL、（E）Vilcre△Neurod1/EECCKO、（F）VilcreLSLNeurod1OVER/EECOVERの代表的な共焦点画像によって示されるNeuroD1変異マウスの作製の検証、および（B、D、E）変異マウス作製戦略の概略図。(G-J)回腸切片の代表的なH&E染色共焦点画像、(K)2.5%DSS処理液の飲水投与により大腸炎を発症させた野生型およびEEC変異マウスにおける炎症性サイトカインTnfのqRT-PCR。スケールバー： 50 μm。(LおよびM）経口投与30分後のFITC-デキストラン通過時間で測定した小腸運動性。野生型マウスと比較して、Neurod1欠損マウス（Neurod1cre△DTR/EECDELおよびVilcre△ Neurod1/EECCKO）ではFITC-デキストラン通過時間が遅く、過剰発現マウス（VilcreLSLNeurod1OVER/EECOVER）ではFITC-デキストラン通過時間が速い。(N-P)回腸組織における(N)トリプトファン水酸化酵素1,Tph1、(O)ドーパ脱炭酸酵素,Ddc、(P)セロトニントランスポーターsolute carrier family 6 (neurotransmitter transporter, serotonin), member 4,Slc6a4のqRT-PCR。各グラフのドットは個々のマウスのデータを表す。mRNAレベルはハウスキーピング遺伝子Rplp0発現に対する相対値で表した。すべてのマウス実験は3回繰り返され、各実験で1群につき少なくとも3-4匹のマウスが用いられた。遺伝子モデルには野生型の同腹子を用い、ジフテリア毒素による同一の処置を行った。統計的有意性は、GraphPad Prism 10ソフトウェアを用いて、一元配置分散分析、Tukey多重比較検定により決定した。∗P＜0.05、P＜0.01、P＜0.001。WTは野生型。
図12EECの遺伝子欠損または過剰発現はDSS誘発大腸炎を防御しない。(A-D）結腸切片の代表的なH&E染色共焦点画像、（E）体重変化、（F）結腸長、および（G）炎症性サイトカインTnfのqRT-PCR。(H-J）飲料水に2.5％黄砂を1週間投与した野生型マウスおよびEEC変異マウスの結腸組織における（H）トリプトファン水酸化酵素1（Tph1）、（I）ドーパ脱炭酸酵素（Ddc）、および（J）セロトニントランスポーター：ソリュートキャリアファミリー6（神経伝達物質トランスポーター、セロトニン）、メンバー4（Slc6a4）のqRT-PCR。各グラフのドットは個々のマウスのデータを表し、n = 4-11マウス。mRNAレベルはハウスキーピング遺伝子Rplp0発現に対する相対値で表した。スケールバー： 50 μm。統計的有意性は、GraphPad Prism 10ソフトウェアを用いて、一元配置分散分析、Tukey多重比較検定により決定した。∗P＜0.05、P＜0.01、P＜0.001。WTは野生型。
図13腸内分泌細胞欠失（EECDEL、Neurod1cre△DTR/EECDEL）変異マウスは基礎運動低下を示している。(A)FITC-デキストラン通過時間のピーク強度（矢印）と(B)幾何学的中心によって示されるEEC欠失マウスの小腸運動低下。各グラフのドットは個々のマウスのデータを表す。統計学的有意性はGraphPad Prism 10ソフトウェアを用いた対応のないt検定により決定した。∗∗∗P< .001. Duoは十二指腸、Stoは胃、WTは野生型。
図14DSSによる小腸運動低下はセロトニン受容体作動薬プルカロプリドの投与により回復する。(A-I）プルカロプリドを投与したマウスにおけるDSS誘発大腸炎に対する防御の特徴。プルカロプリドの経口投与は、(A)結腸長のドットグラフ、(B)結腸の肉眼写真、(C)体重変化率、炎症性サイトカイン(D)Il1bおよび(E)Il6のqRT-PCR、(F-H)代表的なH&E染色結腸像、および(I)2. 5%DSSを1週間飲水投与し、5-HT4セロトニン作動薬プルカロプリドを1日1回経口投与した。スケールバー： 50 μm。(JおよびK）プルカロプリド投与は、FITC-デキストラン蛍光強度の（J）ピーク強度測定（矢印）および（K）有意な幾何学的中心によって示されるように、DSS誘発小腸運動低下を防御する。各グラフのドットは個々のマウスのデータを表す。mRNAレベルはハウスキーピング遺伝子Rplp0発現に対する相対値で表した。すべてのマウス実験は3回繰り返し、各実験で1群につき少なくとも5-6匹のマウスを用いた。統計的有意性は、GraphPad Prism 10ソフトウェアを用いて、一元配置分散分析、Tukey多重比較検定により決定した。∗P＜0.05、P＜0.01、P＜0.001またはP＜0.0001。Avgは平均；Ctrlはコントロール；Duoは十二指腸；Stoは胃；WTは野生型。
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