マウスにおける急性寒冷ストレス時の代謝フラックスの包括的定量化
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マウスにおける急性寒冷ストレス時の代謝フラックスの包括的定量化
https://www.cell.com/cell-metabolism/fulltext/S1550-4131(23)00337-6
マーク・R・ボーンスタイン
マイケル・D・ネイナスト
Xianfeng Zeng
ミーガン・C・ブレア
ジョシュア・D・ラビノウィッツ
ゾルタン・アラニー 3
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脚注を表示する発行:2023年10月05日DOI:https://doi.org/10.1016/j.cmet.2023.09.002
ハイライト
包括的な同位体トレーサー研究により、寒冷による代謝フラックスの変化を定量化した。
BATは摂食時にはグルコースを、絶食時には脂肪酸をTCAサイクルフラックスに供給する
ピルビン酸カルボキシル化は、BATにおけるグルコースの主要な代謝運命である。
絶食マウスの耐寒性を維持するためには、肝臓での糖新生が必要である。
まとめ
寒冷誘導性熱発生（CIT）は、肥満治療の可能性のある方法として広く研究されているが、CITを促進する代謝変化についての十分な理解は不足している。本論文では、無麻酔マウスを用いたメタボロームプロファイリングと最小限の摂動で同位体トレーシングを行うことにより、急性寒冷曝露に対する代謝反応を包括的かつ定量的に解析した。寒冷暴露中、褐色脂肪組織（BAT）は主に、絶食マウスでは脂肪を、摂食マウスではグルコースを燃料としてトリカルボン酸（TCA）サイクルを回し、BATの代謝の柔軟性を明らかにした。BATは分岐鎖アミノ酸やケトン体をほとんど使わず、寒冷暴露中に筋肉で消費された。意外なことに、同位体標識分析により、BATはピルビン酸カルボキシル化を介したTCAアナプレローシスのために、主にグルコースを利用していることが明らかになった。最後に、寒冷誘導性肝グルコネシン新生が絶食時のCITに重要であることがわかり、グルコース代謝に重要な機能的役割があることが示された。これらの知見から、急性のCITを引き起こす代謝配線の詳細な地図が得られた。
図解抄録
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キーワード
褐色脂肪組織
熱産生
メタボロミクス
フラックス
グルコース
糖新生
FBP1
寒冷曝露
ピルビン酸カルボキシラーゼ
はじめに
1,2周囲の温度が下がると、生物は体内で熱を発生させて体温を維持しようとする複雑で協調的な反応を起こす。熱は、栄養素の無益な酸化を促進し、放出された化学エネルギーを熱として放散させる、進化的に保存された特異的なメカニズムを介して生成される4。安静時代謝量を増加させるこれらのメカニズムの能力により、栄養摂取量とエネルギー消費量の不均衡に起因する肥満や心代謝性疾患の治療のための魅力的な治療ターゲットとなっている5,6。
寒冷誘導性熱産生（CIT）は、戦慄熱産生と非戦慄熱産生という2つの異なるプロセスによって媒介される。主に褐色脂肪組織（BAT）で起こると考えられている非振動性熱産生は、UCP1を介したミトコンドリアプロトン勾配のカップリング解除やその他のメカニズムによって熱を産生する。しかし、これまでのCITに関する代謝研究は、その範囲が限られており、ほとんどBATのみに焦点が当てられてきた。さらに、定量的なin vivoフラックス測定が行われていないため、CIT中の全身および特定の組織における燃料嗜好性に関する重要な疑問が未解決のまま残されている。特に、どの栄養素がどのような目的でBATに利用されるのかについては、依然として議論の余地がある13,14。
ここでは、質量分析と安定同位体トレーシングの最近の進歩を利用して、マウスの急性寒冷曝露中に起こる代謝変化を定量化する。まず、血漿とさまざまな臓器における寒冷による代謝物レベルの変化を測定する。次に、13Cで標識した栄養素を定常的に注入することで、寒冷暴露中の全身的な栄養素フラックスと臓器特異的な燃料嗜好性を定量化する、最小摂動の安定同位体トレーシングアプローチを採用した。最後に、グルコースに焦点を当て、寒冷暴露に対する発熱反応における機能的役割を探る。
研究結果
寒冷暴露はBAT以外にも広範かつ全身的な代謝変化を引き起こす
全身代謝に対する寒冷曝露の影響を評価するため、まず、生きた無麻酔マウスを室温（RT）または4℃で6時間飼育し、動脈血漿サンプルを用いて非標的メタボローム解析を行った。液体クロマトグラフィー質量分析計（LC-MS）を用いて、合計605代謝物を測定した（表S1）。その結果、寒冷曝露マウスの血漿中では153種類が増加し、164種類が減少した（図1Aおよび1B）。寒冷曝露により、遊離脂肪酸（FFA）、特に不飽和FFAのレベルが広く上昇した（図1C）。特に、最も豊富な脂肪酸種であるパルミチン酸（C16:0）、オレイン酸（C18:1）、リノール酸（C18:2）15は、それぞれ55-70％増加した。対照的に、寒冷暴露はリゾリン脂質（図S1A）とトリグリセリド種（図1D）の両方のレベルの減少をもたらした。寒冷時に最も高率に誘導された代謝産物は、多価不飽和モノアシルグリセロール（図1E）であり、特に、カンナビノイド受容体16の内因性リガンドである2-アラキドノイルグリセロール（2-AG）としても知られるMG(20:4)であった（図S1B）。視床下部における2-AGを介したカンナビノイド受容体シグナル伝達は、熱発生とエネルギー消費を抑制する17,18,19。ここでの上昇は、2-AGがCITのフィードバック抑制因子として働く可能性を示唆している。寒冷曝露はまた、非脂質代謝物にも広範な変化を誘導した（図S1C）。これらの代謝物の中には、3-ヒドロキシイソ酪酸（3-HIB）20,21やアミノアジピン酸22など、非震盪性熱発生を促進することが知られているものもある。
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図1寒冷曝露による広範かつ全身的な代謝変化
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次に、6つの異なる臓器-BAT、心臓、肝臓、大腿四頭筋（quad）、横隔膜、生殖腺白色脂肪組織（g-WAT）-のメタボローム解析を行った（表S2）。寒冷暴露は、BATのような典型的な発熱臓器だけでなく、研究対象としたすべての臓器で実質的な代謝変化を引き起こし、これらの変化は組織によって大きく異なっていた（図2A-2GおよびS1D）。フェニルアラニンと3-ヒドロキシ酪酸（3HB）の2つの代謝物だけが、すべての組織で寒冷により有意に増加し、すべての組織で減少したものはなかった（図S1D）。FFA濃度はBATを除くすべての臓器で広く上昇し、循環上昇およびBATでの熱心な燃焼と一致した（図S1E）。クエン酸はBATでのみ増加し、これは寒冷によるBATのトリカルボン酸（TCA）サイクルの強力な活性化と一致していた（図S1F）。必須アミノ酸は全般的に肝臓で上昇し、寒冷による肝臓の著しいタンパク質分解を示唆した（図S1G）。これらのデータを総合すると、マウスの寒冷曝露に対する、協調的で広範かつ複雑な全身代謝反応の存在が示唆される。
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図2寒冷ストレスに応答する臓器間の代謝再配線
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絶食マウスにおける寒冷による全身炭素フラックスの変化の定量化
急激な寒冷曝露は、全身の代謝速度を劇的に上昇させる4,23。この上昇した代謝速度を維持するための栄養素を供給するために、寒冷曝露を受けた生物は、脂肪組織における脂肪分解24,25、肝臓における糖新生およびグリコーゲン分解26,27、筋肉および潜在的に他の組織におけるタンパク質分解28を含む、様々な臓器にわたる様々な代謝プログラムを活性化する。しかし、これらの経路が栄養素のフラックスおよび代謝速度の上昇に寄与しているかどうか、またどの程度寄与しているかについての定量的評価は不十分である。この疑問を解決するために、マウスを用いた二重線in vivo定常重同位体標識法を確立した（図3A）。微量の一様な13C標識燃料を、動脈カテーテルから断続的に血液サンプルを採取しながら、覚醒した自由に動くマウスに別々に静脈内注入した。1）ボーラス注入による実験とは対照的に、低用量の定常状態トレーサー注入により、フラックスの定量的決定が可能である、 (4)動脈留置ラインによる採血は、マウスへの負担が最小限であるため、他の方法（尾静脈など）による採血で生じるカテコールアミンの急上昇などの望ましくない影響を最小限に抑えることができる29、 そして（5）動脈血は全身の代謝を反映し、局所的な組織活性に不釣り合いに影響される、例えば尾静脈のような特定の血液源から静脈血や混合血を採取することによって生じる、誤解を招きかねない結論を回避することができる。
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図3絶食マウスにおける寒冷による全身炭素フラックスの変化の定量化
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寒冷による代謝フラックスの変化を包括的に把握するため、炭水化物（グルコースと乳酸）、アミノ酸（グルタミンとBCAA）、脂肪酸（パルミチン酸）、ケトン体（3HB）からなる豊富な栄養素を選択した。これらの注入は、まず絶食させたマウスで、RTまたは4℃にさらされる時間（6時間）行った。これらの別々の注入のそれぞれについて、注入した各栄養素の安定した定常状態の分画濃縮を達成した（図S2A-S2F）。13C分画濃縮度と既知の注入速度から、注入された代謝物の総循環フラックスを計算した
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(無傷分子の出現率
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)を計算した（図S2G）。さらに、原子加重循環炭素フラックス
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図3B）30。寒冷に反応して観察されたフラックスの変化は、血漿中の存在量の変化と部分的に一致していた（図3C）。グルコース、乳酸、BCAA、パルミチン酸、および3HB（グルタミンは含まない）の循環フラックスは、寒冷曝露に反応して増加し、特にパルミチン酸と3HBが増加した。必須アミノ酸であるBCAAの循環フラックスの増加は、全身のタンパク質分解を反映しており、パルミチン酸のフラックスは全身の脂肪分解を反映している。
次に、各輸液セットについて、二次代謝産物の分画標識を調べた。線形代数解析31 (STAR Methods)を用いて間接標識を補正し、他の各代謝物のフラックスに対する各代謝物の直接寄与を計算し、最終的に循環栄養素間の絶対フラックスを得た（図3D；表S3）。寒冷暴露により、解糖系（グルコースから乳酸へ）のフラックスが大きく増加し、また糖新生基質である乳酸とグルタミンからのグルコース生成も増加することがわかった。また、パルミチン酸のような脂肪酸やBCAAのようなアミノ酸（おそらくロイシンやイソロイシンはバリンとは異なりケトン生成性である）を含む複数の供給源からの3HB生成の増加も観察された。
次に、計算した栄養素の炭素フラックスの合計を、包括的実験動物代謝システム（CLAMS）を用いて測定した全身の炭素代謝（VCO2）と比較した。例えば、酸化前のグルコースから乳酸へのフラックスは、グルコースと乳酸の両方の循環フラックスにカウントされる。そこで、新たなパラメー タとして、最終生成物（EP）フラックスを定義した。
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として定義した（図S2HおよびS2I）（STAR Methods）。未測定の脂肪酸（FAs）とタンパク質-解離アミノ酸のフラックスは、公表されている比率31,32（STAR Methods）を用いて、パルミチン酸とBCAAsの測定フラックスから外挿し、RT時と急性寒冷曝露時の全身EPフラックスのモデルを作成した（図3E）。推定された累積EPフラックスは、測定されたVCO2よりも高く、いくつかの栄養素の非酸化的運命（例えば、同化代謝）を示している（図S2J）。絶食状態では、正味の同化代謝はあり得ない。したがって、これは、細胞内の高分子貯蔵物を介した相当量の栄養循環、例えば、脂肪酸のトリグリセリドプールへのエステル化と、これらの同じ貯蔵物の脂肪分解とを組み合わせたものを反映していると考えられる。対照的に、寒冷によって誘導されたEPフラックスの増加は、CO2産生の増加と正確に一致しており（図3F）、寒冷によって誘導された栄養フラックスは、高分子の循環を増加させることなく、完全に酸化に向けられていることを示唆している。驚くべきことに、EPフラックスの増加は主に脂肪酸の燃焼であり、脂肪酸が寒冷曝露絶食マウスにおける主な熱産生燃料であることを示唆している。
絶食マウスにおける急性寒冷曝露時の臓器特異的燃料嗜好性の定量化
次に、寒冷曝露が個々の臓器における燃料使用にどのような影響を及ぼすかを調べるため、各標識栄養素注入後の異なる組織におけるTCAサイクル代謝物の13C-濃縮度を測定し、各栄養素に由来するTCAサイクル炭素の割合を算出した（図S3A-S3F）。次に線形代数解析31（STAR Methods）を用いて二次代謝産物を介した間接標識を補正し、常温および4℃における各組織のTCAサイクルへの各栄養素の直接的寄与を求めた（図4A-4F）。
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図4絶食マウスにおける急性寒冷曝露時の臓器特異的燃料嗜好性の定量化
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以前に報告されたように33、絶食動物では多くの組織がTCAサイクルの燃料としてグルコースを直接使用しない。我々のデータでは、グルコースの直接酸化はBAT、心臓、横隔膜のような赤筋のような酸化性の高い組織に限られている（図4A）。驚くべきことに、心臓のグルコース利用は、絶食寒冷暴露中にほぼ完全に抑制された。寒冷暴露中の心臓では、乳酸嗜好性も有意に減少しており（図4B）、炭水化物利用の減少は、少なくとも部分的にはピルビン酸利用のレベルで制御されている可能性が示唆される。対照的に、BATにおけるグルコースの相対的利用は影響を受けていない。BATにおけるTCAサイクルの絶対流束は寒冷曝露によって大幅に増加するため8、BATによるグルコースの相対的利用が変わらないということは、おそらくグルコースの絶対的利用が大幅に増加したことを示しているのであろう。したがって、心臓による糖質利用の抑制は、BATのためにグルコースを確保するための寒冷誘導適応メカニズムを反映しているのかもしれない。
アミノ酸代謝も同様に、グルコースをBATに誘導するのに役立つような形で再配線される。寒冷に応答して、筋肉によるグルタミン利用の嗜好性は低下し（図4C）、グルタミンは代わりに糖新生に転用される（図S3GおよびS3H）。逆に、寒冷暴露は、BATが好まない基質であるBCAAの酸化に対する筋の嗜好性を著しく増加させた（図4D）。筋のBCAA利用の増加は、酵素遺伝子発現の変化（図S3I）や律速BCKDH複合体のリン酸化（図S3J）によっては媒介されない。しかし、血漿中のBCAA濃度は寒冷暴露中に大幅に上昇し（図1F）、大量作用効果を示唆している可能性があり、骨格筋におけるBCAA酸化は他の臓器よりも利用可能性の変化に反応しやすい可能性が示唆される。各組織におけるタンパク質分解によって遊離された非標識プールによる血漿中の標識BCAAの希釈に基づき、BCAAの循環フラックスおよび濃度の増加は、肝臓のタンパク質分解から実質的に生じていると推察された（図S3K）。
絶食寒冷ストレス時の主要な熱生成燃料が脂肪酸であることを示唆する循環フラックス解析と一致して、BATは寒冷に応答してパルミチン酸酸化の嗜好性を増加させた（図4E）。この反応は実質的であり、かつBAT特有のものである。脂肪酸取り込み関連遺伝子の発現は寒冷にはほとんど影響されないことから（図S3L）、他の手段、おそらくエネルギー需要によって消費が制御されていることがわかる。寒冷下でのBATのTCA回転率が高いことと合わせると、脂肪寄与の倍増はBATによる脂肪燃焼の寒冷による劇的なアップレギュレーションを反映している。一方、3HBはBATではほとんど酸化されず、代わりに筋肉組織でかなり利用され、四肢の寒冷暴露中に顕著に増加した（図4F）。
これらのデータを組み合わせ、パルミチン酸のデータを外挿することで総脂肪酸利用量を予測し、各組織におけるTCAサイクルへの総栄養素寄与を、常温および4℃の両方で推定した（図4Gおよび4H）。組織と条件全体を通して、TCAサイクルの炭素の平均約75％を占め、残りはグリコーゲンやトリグリセリドなどの細胞内燃料貯蔵に由来すると推定される。BATおよび特にg-WATにおけるTCAサイクル炭素の大部分は、これらの組織における大量の細胞内トリグリセリドプールの酸化を反映していると考えられる。したがって、これらのデータは、絶食中のBATは脂肪酸酸化に大きく依存しており、基礎状態では細胞内脂質が主要な基質として機能し、急性に活性化したBATでは主に外因性脂肪酸の消費に移行していることを示唆している。BATではなくWATの脂肪分解が急性寒冷耐性に必要であるというこれまでの知見24,25と合わせると、これらのデータは、WATの脂肪分解が、絶食マウスでは寒冷ストレスを受けたBATの主なTCAエネルギー源である循環FFAを産生することを示唆している。
自由摂取マウスにおける急性寒冷曝露の代謝効果の評価
次に、自由摂食マウスでも同様のフラックス解析を行った（図S4A-S4F）。寒冷曝露マウスは、常温維持マウスに比べて2倍以上の餌を食べた（図5A）。絶食マウスと同様に、グルコース、乳酸、BCAA、パルミチン酸、および3HBの循環フラックス増加が認められたが、グルタミンは認められなかった（図5BおよびS4G）。このような類似性があるにもかかわらず、寒冷によって誘発される変化の量的な大きさは、絶食条件と摂食条件とで大きく異なっていた。絶食マウスとは対照的に、摂食マウスは脂肪酸よりも炭水化物の循環フラックスを増加させた。3HBの循環フラックスは、絶食マウスよりも摂食マウスの方が低かったが、寒冷暴露中に同程度に増加した。一方、BCAAフラックスは、摂食マウスの方がベースラインで高く、寒冷暴露中に大きく増加した。寒冷暴露中の3HBおよびBCAAフラックスの増加は、血漿レベルの増加とも関連していたが、他の栄養素の存在量は変化しなかった（図5C）。
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図5自由摂食マウスにおける急性寒冷ストレス時の基質利用の定量化
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循環する栄養素間の相互変換フラックスを再度定量し（表S3）、それぞれについてEPフラックスを計算した（図S4H）。最終産物フラックスとVCO2（上記の方法を使用）を比較すると、絶食マウスとは異なり、寒冷によるフラックスの上昇はVCO2の上昇を上回り、摂食マウスでは寒冷によって同化フラックスがかなり誘導されていることが示された（図5DおよびS4I）。興味深いことに、摂食量は代謝量の測定値とほぼ一致しており（図S4JおよびS4K）、全身的には、同化作用のある高分子の合成と異化作用のある高分子の分解が一致しなければならないことを示唆している。まとめると、これらのデータは、摂食状態での寒冷に対する反応において、特に細胞内高分子貯蔵を介した栄養循環の役割を示唆している。
TCAサイクル中間体の13C分画濃縮度から計算される組織燃料嗜好性に対する寒冷曝露の影響も、自由摂食マウスでは大きく異なる（図5E-5JおよびS5）。絶食マウスは、すべての組織、特にBAT、心臓、横隔膜のような高酸化性臓器において、TCAサイクルへのグルコースの寄与が高いことを示した（図5E）。重要なことは、絶食マウスのBATは主に脂肪酸を燃焼するが、摂食マウスではグルコースが主なTCA基質であることである。さらに、BATの基本的な空腹時の脂肪に対する嗜好性が寒冷暴露によって増大するように（グルコースに対する嗜好性は変化しないが）、BATの基本的な摂食状態のグルコースに対する嗜好性も寒冷暴露によって増大する（パルミチン酸に対する嗜好性は変化しないが）。寒冷下でBATのTCAサイクルが全体的に増加することと合わせて、これらのデータは、寒冷下での脂肪とグルコースの消費、特に好ましい基質（空腹時は脂肪、摂食時はグルコース）に対する消費の一貫したアップレギュレーションを反映している。
寒冷暴露はまた、給餌マウスにおいて他の様々な燃料嗜好性の変化を引き起こす。絶食マウスとは異なり、摂食マウスでは寒冷ストレス下でも心臓での糖質利用は維持される。対照的に、摂食マウスは絶食マウスと同様に、寒冷暴露中、四肢においてグルタミンに対する嗜好性が減少し、BCAAに対する嗜好性が大きく増加した（図5Gおよび5H）。摂食マウスでは、TCAサイクルへのBCAAの寄与も、BATを含む他のほとんどの臓器で増加するが、四肢を除くすべての臓器で約2％以下のままである。パルミチン酸酸化の嗜好性は、餌を与えたマウスでは寒冷曝露に反応して横隔膜と肝臓の両方で低下した（図5I）。TCAサイクルへの3HBの寄与は、絶食マウスに比べ、摂食マウスでは一貫して低いが、寒冷暴露によりいくつかの組織で増加する（図5J）。
これらのデータを組み合わせて、摂食動物のTCAサイクルへの総栄養素の寄与を、常温および4℃の両温度で組織横断的に推定した（図5K）。絶食動物と同様に、BATにおけるTCAサイクルへの栄養寄与の説明できない部分は寒冷化とともに減少し、体内貯蔵燃料への依存度が低下していることを示している。しかし、摂食マウスでは、この変化は脂肪酸よりもむしろ炭水化物の使用の増加によって引き起こされ、BATにおける栄養素の嗜好性は柔軟であり、摂食状態に大きく影響されることが明らかになった。
急性寒冷曝露時のグルコース動態のマッピング
脂肪酸酸化はCITの文脈で広く研究されているが、この過程におけるグルコース利用の役割はあまりよく理解されていない34,35,36,37,38,39。寒冷曝露がBATにおけるグルコース取り込みを誘導することはよく知られており、ヒトではグルコース取り込みがBATの質量と活性の測定に用いられている46。そこでわれわれは、定常状態注入システムを用いて、寒冷曝露中のグルコースの運命を定量的にマッピングすることを試みた。
まず、循環系におけるグルコースから乳酸へのフラックスを調べた。寒冷暴露中の総グルコースフラックスの大幅な増加と同時に、空腹時および摂食マウスの寒冷時の乳酸へのグルコースフラックスも大幅に増加した（図6A）。しかし、摂食マウスでは寒冷で誘導されたグルコースフラックスの約22％が乳酸生成に費やされたに過ぎず、絶食マウスでは約74％であった（図6Aおよび6B）。このように、全身性の寒冷誘導グルコースフラックスは、絶食動物では主に乳酸生成に使われるが、摂食動物では使われない。
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図6肝臓の糖新生はBATのアナプレローシスを促進し、寒冷耐性に必要である。
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グルコース由来のピルビン酸は乳酸に変換される代わりに、TCAサイクルに炭素を供給するためにミトコンドリアに輸送され（図4Aおよび5E）、以下の2つの方法で輸送することができる： (1)ピルビン酸は、ピルビン酸デヒドロゲナーゼ(PDH)によってアセチル-コエンザイムA(CoA)に酸化・脱炭酸され、TCAサイクルを介して完全に酸化されるか、あるいは(2)ピルビン酸カルボキシラーゼまたは他の酵素（以下PCと総称する）によってカルボキシル化され、TCAサイクルの中間体であるオキサロ酢酸またはリンゴ酸を生成する（図6C）。後者の無呼吸反応はTCAサイクルのプールを維持するのに役立つ。これら2つの経路を通るフラックスは、同位体分析と13C標識グルコースを用いて区別できる。なぜなら、PDHは炭素数2のアセチル-CoAを生成するためにCO2としてピルビン酸炭素を1つ放出するのに対し、PCを介して生成されたオキサロ酢酸／リンゴ酸は、元のピルビン酸炭素3つすべてを保持するからである（図6C）。この基本的な枠組みを用いて、普遍的に標識されたU-13C-グルコースを注入したデータを用いて、それぞれの経路を通る相対的なフラックスをin vivoで定量する方法を開発した（STAR Methods）。驚くべきことに、絶食状態のマウス、あるいは4℃に曝露されたマウスでは、BATはグルコース由来の炭素をほぼ独占的にPCフラックスを介してTCAサイクルに取り込むことがわかった（図6Dおよび6E）。自由摂食のマウスでは、BATのPDHフラックスが関与しているが、ピルビン酸カルボキシル化が、TCAサイクルへのグルコース炭素導入の主要なメカニズムであることに変わりはない。したがって、BATにおけるピルビン酸カルボキシル化フラックスは相当なものであり、TCAサイクルの総回転量の3分の1を占める。対照的に、横隔膜はTCAサイクルの代謝にグルコースもかなり利用するが、空腹時および摂食状態のいずれにおいても、主にPDHフラックスを介して行われ、寒冷暴露時にはPCフラックスは完全に消失する（図S6AおよびS6B）。
これらの結論を検証するために、我々は直交トレーシング法を採用し、3-13C-グルコースの定常輸液を用いた。3-13C-グルコース上の標識炭素は、グルコース由来のピルビン酸がPDHによって酸化されるとCO2に失われるが、ピルビン酸カルボキシル化によってリンゴ酸に取り込まれると保持されるように配置されている（図S6C）49。この方法で計算されたグルコース由来のピルビン酸カルボキシル化によって生成されたリンゴ酸の割合は、BATと横隔膜の両方において、これまでの結果と非常に一致した（図S6D）。我々は、BATはTCAサイクル中間体を補充するために主にグルコースを利用すると結論づけた。
肝臓での糖新生はグルコース供給を維持し、絶食マウスにおける耐寒性に必要である。
摂食マウスでは、食餌炭水化物から循環グルコースが供給され、寒冷によるグルコースフラックスの増加は、ほとんど炭水化物消費の増加によって説明できる（図S6E）。しかし絶食状態では、グルコースは主にグリコーゲンの分解や糖新生といった別の供給源によって供給されなければならない。循環グルコースフラックスに対する肝臓グリコーゲン分解の寄与を決定するために、6時間絶食または4℃で絶食させたマウスの肝臓グリコーゲン含量の減少を測定した（図S6F）。3時間後までに、肝グリコーゲン含量はどちらの条件でも70％以上減少した。6時間後までに、肝臓グリコーゲンはさらに減少し、4℃にさらされたマウスではより減少した。しかし、この後半の3時間におけるグリコーゲンの純減少は、測定された全身のグルコースフラックスの約1％を占めるに過ぎず（図6Fおよび6G）、寒冷暴露の3-6時間までには、肝臓グリコーゲンは循環グルコース供給にほとんど寄与しないことが示された。
我々は上で、様々な栄養素、特に乳酸とグルタミンが絶食動物の循環グルコースに寄与することを示した（図3D）。しかし、これらの基質だけでは、寒冷暴露中のすべてのグルコースフラックスを説明するには不十分である。そこで、もう一つの重要な糖新生基質である13C標識グリセロールを定常状態で追加注入した（図S6G）50。グリセロールの循環フラックスは寒冷暴露中に増加し（図S6H）、脂肪分解によるグリセロール放出と一致した。グリセロールからのグルコニン生成フラックスも寒冷暴露中に増加し、常温と4℃の両方で総グリセロールフラックスと一致した（図S6I）。グリセロールと他の測定基質から計算された糖新生フラックスの合計は、基礎状態でも急性寒冷暴露中でも、ほとんど全てのグルコースフラックスを占める（図6H）。重要なことは、これらの基質からのグルコニン生成フラックスの増加が、測定された寒冷誘導性グルコースフラックスのすべてを占めていることである（図6I）。このように、絶食マウスにおける寒冷誘導性グルコースフラックスの主な原因は糖新生である。
糖新生は主に肝臓で起こり、腎臓で起こることもある。寒冷にさらされると、肝臓の主要な糖新生酵素PepckとFbp1のタンパク質レベルが上昇する（図S6JとS6K）。PepckのmRNAレベルも上昇するが、Fbp1は上昇しないことから（図S6L）、この反応は部分的にしか転写制御されていないことが示唆される。グルコースの供給がCITに必要かどうかを調べるため、Pepckとは異なり、グリセロールを含むすべての基質からの糖新生に必要なFbp1を肝細胞特異的に欠失させたマウスを作製した（図6J）。肝臓特異的ノックアウト（FBP1 LKO）マウスは、Fbp1flox/floxマウスにAAV8-Tbg-Creを注射することで作製した51。FBP1 LKOマウスは、正常な体重を維持し（図S6N）、正常な肝臓グリコーゲンレベルを有した（図S6O）。絶食させたFBP1 LKOマウスを4℃に曝露すると、血糖値はコントロールに比べて低下し（図6K）、グルコースフラックスの主要な供給源として肝臓の糖新生が確認された。しかしながら、血糖値は重度の低血糖（<60mg/dL）を超えており、おそらく腎臓での糖新生によって維持されていた。驚くべきことに、絶食状態のFBP1 LKOマウスは、4℃に急性暴露されると体温を維持できなくなる（図6L）。一方、15％グルコースを添加した飲料水を与えたFBP1 LKOマウス、あるいは自由摂取の餌を与えたFBP1 LKOマウスは、急性の寒冷曝露でも血糖値（図6MおよびS6P）と体温（図6NおよびS6Q）の両方を維持した。これらのデータを総合すると、寒冷曝露した絶食マウスでは肝臓での糖新生がグルコース供給を維持し、これらのマウスでは糖新生が熱発生をサポートするのに必要であることが示された。
考察
CITは、生体のエネルギー消費の調節において重要な役割を果たしている。4,8 心代謝性疾患5,6の予防や治療のために、熱発生プログラムを利用しようとする動きが高まっており、このプロセスを促進する代謝的変化についてよりよく理解する必要性が強調されている。ここでは、マウスの急性寒冷曝露に対する代謝反応を包括的かつ定量的に解析した。
メタボローム解析により、寒冷暴露中の代謝の変化が、発熱臓器に限定されないユニークな変化とともに、実質的かつ全身的に同定された。我々は、熱発生におけるシグナル伝達の役割が知られている脂質代謝産物（2-AG17,18など）および非脂質代謝産物（アミノアジピン酸22など）の血漿レベルの上昇を見出し、熱発生反応における機能的に重要な他の代謝産物を同定するためのこのアプローチの妥当性を示した。さらに、寒冷曝露中に発現が上昇または低下する代謝物のうち、まだ研究されていない数百の代謝物を同定し、今後の機能研究のための包括的なリソースを提供した。
絶食マウスでは、寒冷曝露により非エステル化FFAの血漿中濃度が広く上昇した。13C-パルミチン酸を用いたフラックス研究により、寒冷暴露中に脂肪酸の循環フラックスが大きく増加することが明らかになった。我々は、脂肪酸フラックスの増加が、寒冷による全身のCO2産生増加のほぼすべてを占めると推定されることを見いだし、絶食マウスにおける急性寒冷応答において、脂肪酸が主要な酸化的燃料であることを証明した。興味深いことに、BATを除いて、ほとんどの臓器でFFAレベルが大きく上昇している。また、他の組織とは異なり、BATは寒冷暴露中にTCAサイクルへの循環脂肪酸の相対的寄与を劇的に増加させた。これらのデータは、寒冷暴露がBATにおいてのみ脂肪酸酸化能を大幅に増加させ、組織内の脂肪酸量に変化がないにもかかわらず、酸化的フラックスの上昇を促進することを示唆している。これとは対照的に、絶食マウスでは寒冷ストレス中の全身脂肪酸フラックスの増加はわずかであり、寒冷による全身炭素フラックスの増加のごく一部を占めるに過ぎなかった。また、絶食マウスとは対照的に、BATにおけるTCAサイクルへの脂肪酸の寄与は、摂食マウスでは寒冷ストレスによって変化しなかった。とはいえ、今回の結果から、BATのTCAサイクルへの糖質フラックスは大部分が無呼吸性であることが示唆されるため（後述）、脂肪酸は摂食状態でもアセチル-CoA、ひいては酸化燃料の主要な供給源である可能性が高い。これらの知見は、BATにおける脂肪酸酸化の熱発生要件を詳述した確立された機能的データと一致しており34,35,39、この分野における今後の研究を支援する有用な定量的フラックス測定を提供している。
必須BCAAの循環フラックスの上昇は、絶食マウスにおいて急性寒冷曝露中に全身のタンパク質分解が約30％増加することを示していた。このようなタンパク質からのアミノ酸の遊離は、少なくとも部分的には肝臓によって促進されたと思われる。肝臓は、寒冷暴露中にほぼすべての必須アミノ酸のレベルが上昇し、血漿由来のBCAAの割合が最も低いという特異的な所見を示した。餌を与えたマウスでは、寒冷暴露によってBCAAのフラックスがさらに増加したが、これは少なくとも部分的には餌の摂取量の増加によるものであった。BCAA酸化は、BAT52とWAT53の両デポにおいて、非震盪性熱発生に重要な役割を果たすことが報告されているが、BCAA酸化はBATでは低く、WATでは最小であることがわかった。BATおよびWATにおけるTCAサイクルへのBCAAの寄与は、摂食マウスの寒冷曝露中に増加したが、TCAサイクル代謝の2％以上を占めることはなかった。したがって、BCAAの酸化は、完全な酸化以外のメカニズム、例えば、調節機能が知られている3-HIB、プロピオニル-CoA、分岐鎖脂肪酸などの代謝産物を介したシグナル伝達によって、脂肪組織の熱産生に寄与している可能性がある54,55,56。脂肪組織とは対照的に、BCAAの利用は、絶食および摂食のいずれの条件下でも、寒冷暴露中に骨格筋、特に四頭筋で大幅に上昇し、震え熱産生に重要な役割を果たしていることが示唆された。
しばしば重要な代替燃料源として示唆される3HBのレベル57は、寒冷暴露中に血漿および組織で増加し、3HBの循環流束は、絶食および摂食マウスともに寒冷によって増加した。しかし、驚くべきことに、BATはベースラインでも寒冷暴露中でも3HBをほとんど使用しなかった。したがって、ケトン体は急性寒冷時のBATにとって重要な燃料源ではない。これらの驚くべきデータは、代謝産物のフラックスを決定するためには、静的な測定に頼るのではなく、追跡研究を行う必要性を強調している。BATとは対照的に、筋肉組織における3HBの消費はかなり大きく、絶食させた寒冷曝露マウスの大腿四頭筋では、TCAサイクルの炭素数のほぼ10%にまで増加した。したがって、ケトン体は筋肉では熱発生の重要な燃料源であるが、BATではそうではないかもしれない。
全身グルコースフラックスは、血漿中濃度が変化しないか減少しているにもかかわらず、寒冷曝露中に大幅に増加する。このことは、寒冷暴露がBATにおけるグルコース取り込みを促進するという、長い間確立されてきた観察結果44,58,59と一致しており、熱発生反応におけるグルコース利用は、特に注目され議論されてきた分野である60。しかし、フルオロデオキシグルコース陽電子放出断層撮影（FDG-PET）イメージング研究62,63から、BATが寒冷ストレス時の解糖系フラックスのドライバーである可能性が高いことが示唆されている。
また、ミトコンドリアのピルビン酸運搬体MPC1が欠損すると、BATの熱発生が阻害されることも示されており64、ミトコンドリアのピルビン酸利用も熱発生に必要であることが示唆されている。驚くべきことに、BATのミトコンドリアのピルビン酸は、ピルビン酸カルボキシル化を介してTCAサイクル中間体のアナプレローシスを維持するために主に使われていることがわかった。この反応はおそらくピルビン酸カルボキシラーゼによって媒介されるが、逆リンゴ酸酵素フラックスからの寄与も否定できない。単離された褐色脂肪細胞ミトコンドリアにおけるPCフラックスは、数十年前に報告されており65、ヒト胚性幹細胞由来の褐色脂肪細胞を用いた最近の研究では、ピルビン酸カルボキシラーゼのノックアウトが、ささやかではあるが、測定可能な呼吸障害を引き起こすことが示された66。われわれの研究は、これらの観察結果を大幅に発展させ、無傷で覚醒している動物において、生理学的に適切な条件下でBATにおける実質的なPCフラックスを実証した。我々はまた、これらの動物のBATにおけるTCAサイクルへのPCフラックス対PDHフラックスの寄与率を定量化し、ほとんどの条件下でPCフラックスがPDHフラックスを大きく上回っていることを示した。BATにおけるこのような高いPCフラックスの機能的役割はまだ不明であるが、熱発生機能に必要なアミノ酸合成を助けるか、あるいはTCAサイクル中間体そのものの合成や分泌に使われる可能性があり、そのうちのいくつかは自己分泌、副分泌、および／または内分泌機能を持つことが知られている67。したがって、ピルビン酸のカルボキシル化は、ピルビン酸→オキサロ酢酸→リンゴ酸→ピルビン酸、またはピルビン酸→オキサロ酢酸→ホスホエノールピルビン酸（PEP）→ピルビン酸のような代謝の無駄なサイクルに寄与し、その各サイクルでATPが1つ消費されると考えられる。このようなサイクルにリンゴ酸酵素1が関与することで、細胞質NADPHが生成され、脂肪酸合成や、脂肪酸の同時合成と酸化からなる別の潜在的な発熱性無益サイクルをサポートする可能性もある40。
BATによるグルコース取り込みの増加は、熱発生反応の重要な特徴であるが、必ずしもそれが熱発生プログラムを駆動しているわけではないことが提唱されている（例えば、ある条件下では、UCP1欠損マウスは熱発生が損なわれているが、BATへのグルコース取り込みは維持されている70,71）。一方、新たな証拠によると、BATへのグルコース取り込みは耐寒性に必要である可能性が示唆されている72,73が、決定的なデータは不足している。我々は、摂食・絶食のいずれの条件下でも、低温で活性化されたBATは、他の組織よりも熱心にグルコース由来の炭素をTCAサイクルに取り込むことを発見した。実際、TCAサイクルの代謝のために心臓がグルコースを利用することは、絶食マウスの寒冷曝露によって消失しており、おそらくBATが利用するためにグルコースが温存されているのであろう。最後に、肝グルコース産生を阻害すると、絶食マウスにおいて耐寒性が著しく損なわれることがわかった。これは、栄養フラックス全体に対するグルコネオゲン産生フラックスの寄与が低く、寒冷による全身の酸化的代謝の増加にはほとんど寄与しないにもかかわらずである。このように、我々のデータは、CITにおけるグルコース利用経路のユニークで重要な役割を示している。
最近、Parkら69によって報告された、自由食を与えたマウスの肩甲骨間BATを含む毛細血管床の動静脈（A/V）メタボロームプロファイリングを用いた同時研究は、我々の研究とほぼ一致している。Parkらは、BATにおける正味の炭素取り込みの主要な源がグルコースであり、寒冷暴露中にこれが大幅に増加することを発見した。これと一致するように、われわれは、餌を与えたマウスではグルコースがTCAサイクルの代謝に主に寄与し、寒冷暴露によってこの嗜好性がさらに高まることを見いだした。また、絶食状態のマウスでは、脂肪酸がグルコースに代わってTCAサイクルの主要な炭素源となることから、BATは燃料の選択に関して非常に柔軟であることが示唆された。われわれの研究から、TCAサイクルへのグルコース炭素の導入は、大部分がピルビン酸カルボキシル化を介して行われることも明らかになった（上記考察参照）。興味深いことに、ParkらのA/Vデータでは、BATによる脂質の取り込みはわずかであるのに対し、われわれは、摂食マウスでも脂肪酸がTCAサイクル代謝に有意に寄与していることを発見した。このことは、同じ静脈系から排出されるWATから分泌される脂肪酸が、A/Vの測定に寄与していることを反映しているのかもしれない。あるいは、以前から示唆されているように、BATでは酸化と合成を同時に行う実質的な脂肪酸循環が存在するのかもしれない40。Parkらはまた、BATにおけるグルタミン循環、すなわちグルタミン分解とグルタミン合成の同時進行の証拠を発見しており、これはBATにおけるTCAサイクルへのグルタミン炭素の実質的な寄与を示す我々のデータと一致している。我々の研究では、肝臓や心臓を含む他のいくつかの臓器における燃料選択における確実な変化も同定しており、これらのデータを補完するために、今後のA/V研究が注目される。
まとめると、我々の研究は、急性寒冷曝露に対する発熱反応の根底にある代謝フラックスの変化について、包括的、定量的、全身的、組織特異的なマップを提供し、肝グルコネシン新生に重要な役割があることを明らかにした。
研究の限界
本研究は、急性寒冷曝露マウスに焦点を当てたものである。寒冷曝露に対する慢性適応後の代謝変化を調べるには、さらなる研究が必要である。また、我々はフラックス解析のために6つの主要代謝物に焦点を当て、外挿によっていくつかの未測定栄養素を考慮した。これらを総合すると、我々のデータは全身的なフラックスとTCAサイクルの寄与のほとんどを説明しているが、他のあまり多くない代謝物のフラックスも寒冷暴露中に重要であることが判明するかもしれない。最後に、RTはマウスの温度中性域を下回っている74。つまり、ベースライン時、この実験のマウスは部分的に寒冷適応していたことになる。このBATの部分的なプライミングにより、急性の寒冷によるBAT活性化をより確実に評価できたと考えられる。しかし、熱中症時の代謝状況を推測することはできず、マウスが急性寒冷曝露前に熱中症に適応していれば、結果は異なる可能性がある。
STAR★方法
主要リソース表
試薬またはリソースのソース IDENTIFIER
抗体
ウサギ抗FBP1抗体 MilliporeSigma Cat# HPA005857; RRID:AB_1848445
抗 PCK1/PEPC 抗体 Abcam Cat# ab70358; RRID:AB_1925305
ウサギ抗 BCKDHA 抗体 ベシル Cat# A303-790A; RRID:AB_11218185
ウサギ抗 BCKDHA, Phospho (S292) 抗体 Bethyl Cat# A304-672A; RRID:AB_2620867
抗 14-3-3 抗体 Cell Signaling Technology Cat# 8312S; RRID:AB_10860606
抗 B-アクチン ウサギ抗体 Cell Signaling Technology Cat# 4970S; RRID:AB_2223172
抗ウサギIgG, HRP結合抗体 Cell Signaling Technology Cat# 7074S; RRID:AB_2099233
化学物質、ペプチド、組み換えタンパク質
D-GLUCOSE (U-13C6, 99%) ケンブリッジアイソトープラボラトリーズ Cat# CLM-1396-5
SODIUM L-LACTATE (13C3, 98%) 20% W/W in H2O Cambridge Isotope Laboratories Cat# CLM-1579-PK
L-GLUTAMINE (13C5、99%) ケンブリッジアイソトープラボラトリーズ Cat# CLM-1822-H-0.1
L-LEUCINE (13C6、99%) ケンブリッジアイソトープラボラトリーズ Cat# CLM-2262-H-0.25
L-VALINE (13C5、99%) ケンブリッジアイソトープラボラトリーズ Cat# CLM-2249-H-0.25
L-イソロイシン（13C6、99％） ケンブリッジアイソトープラボラトリーズ Cat# CLM-2248-H-PK
パルミチン酸ソジウム（U-13C16、98％以上） ケンブリッジアイソトープラボラトリーズ Cat# CLM-6059-1
D-3-HYDROXYBUTYRATE ソジウム (13C4、99%) ケンブリッジアイソトープラボラトリーズ Cat# CLM-3853-0.5
グリセロール (13C3、99%) ケンブリッジアイソトープラボラトリーズ Cat# CLM-1510-1
D-GLUCOSE (3-13C、99%) ケンブリッジアイソトープラボラトリーズ Cat# CLM-1393-0.5
D-(+)-グルコース、無水、99% ThermoFisher Scientific Cat# A16828
RIPA Buffer、2x Solution Research Products International Cat# R26200
cOmpleteミニ、EDTAフリー プロテアーゼ阻害剤カクテル Roche Cat# 11836170001
Phosstop - ホスファターゼ阻害剤タブレット Roche Cat# 04906837001
2-メルカプトエタノール Bio-Rad Cat# 1610710
4x Laemmli サンプルバッファー Bio-Rad Cat# 1610747
TRIzol 試薬 Invitrogen Cat# 15596026
重要な市販アッセイ
グルコース（HK）アッセイキット MilliporeSigma Cat# GAHK20
Pierce BCA ポロテインアッセイキット ThermoFischer Scientific Cat# 23227
RNeasy Mini Kit Qiagen Cat# 74104
高容量 cDNA 逆転写キット ThermoFischer Scientific Cat# 4368814
寄託データ
メタボロミクスデータ 本論文 NMDR StudyID ST002813
データ S1：プロットおよび図の元データ 本論文 N/A
実験モデル 生物／系統
マウス C57BL/6J The Jackson Laboratory Cat# 000664
マウス Fbp1flox/flox M. Celeste Simon 研究所 N/A
オリゴヌクレオチド
RT-qPCR用プライマー、方法詳細参照 本論文 N/A
ソフトウェアとアルゴリズム
El-MAVEN ソフトウェア Elucidata https://resources.elucidata.io/elmaven
R, バージョン 4.2.2 CRAN https://cran.r-project.org/
MatLab R2022b MathWorks https://www.mathworks.com/products/matlab.html
Graphpad Prism グラフパッド プリズム https://www.graphpad.com/scientific-software/prism/
Accucor GitHub https://github.com/XiaoyangSu/AccuCor
Flux_CircMet GitHub https://github.com/tonyshenghui/Flux_CircMet
その他
Digi-Sense Temp-10 シングル入力 T 型熱電対 Cole-Parmer Cat# EW-91428-02
マウス、3/4" L .028dia. 先端.065 直腸プローブ Braintree Scientific Cat# RET-3
新しいタブで表を開く
入手可能なリソース
連絡先
リソースおよび試薬に関する詳細情報およびリクエストは、リードコンタクトであるZoltan Arany (zarany@pennmedicine.upenn.edu)までご連絡ください。
材料の入手可能性
本試験では新規の試薬は使用しなかった。
実験モデルと研究参加者の詳細
特に断りのない限り、すべての実験はJackson Laboratoryから取り寄せた14-15週齢の雄C57BL/6Jマウスを用いて行った。肝-FBP1ノックアウトマウスおよびコントロールマウスは、それぞれ雄性Fbp1flox/floxマウスにAAV8-Tbg-CreまたはAAV8-Tbg-GFPを導入して作製した51。実験に先立ち、すべてのマウスを室温（約22℃）で飼育し、12：12時間の明暗サイクル（明サイクルは午前7時から）で、水と標準的な餌（LabDiet 5010）を自由に摂取できるようにした。すべての実験は午前9時に開始し、6時間の実験は午後3時に終了した。すべての動物実験は、ペンシルバニア大学の動物飼育委員会（Institutional Animal Care and Use Committee：IACUC）により承認されたプロトコールに従った。
方法の詳細
AAVベクターと投与
肝臓のFBP1をノックアウトするために用いたカスタムAAV8ベクターは、ペンシルバニア大学のPenn Vector Coreから入手した： AAV8:TBG.PI.Cre.rBG（AAV8-Tbg-Cre）、AAV8:TBG.PI.eGFP.WPRE.bGH（AAV8-Tbg-GFP）。ベクターを希釈し、50uLの生理食塩水で1マウスあたり1.5e11ゲノムコピーの用量でイソフルラン麻酔したマウスに軌道後注射した。
動脈血漿採取と注入実験
頸静脈と頸動脈に1本ずつ、計2本のカテーテルをマウスに留置した。マウスは手術前にイソフルランで麻酔された。手術後、マウスは実験の前に少なくとも4日間回復させた。動脈血漿のメタボローム解析のため、マウスは個々に餌や巣を与えず、室温（RT、約22℃）または4℃で6時間飼育した。このとき、マウスを動揺させることなく、動脈カテーテルから40uLの血液を廃液し、ヘパリン処理したチューブに血液を採取した。輸液実験のために、マウスは個々に4-4.5時間、餌の有無にかかわらず、巣のないRTまたは4℃で飼育された。最初の動脈血サンプルを上記のように採取し、頸静脈カテーテルから13C標識代謝物の注入を開始した。特に指定がない限り、注入された代謝物はすべて13C標識されたものであった。注入は1.5～2時間で、総実験時間は6時間であった。注入終了の30分前と0分前に動脈血サンプルを採取した。輸液終了時、マウスはペントバルビタールで安楽死させ、続いて頸椎脱臼させ、組織を液体窒素中で急速に凍結クランプした。すべての血液を4℃で15分間、10,000 x gで遠心分離し、下流の代謝分析用に血漿を採取した。輸液速度および濃度については表S4を参照のこと。
耐寒試験
11-16週齢のLiver-FBP1 KOマウスおよびコントロールマウスを、餌あり、餌なし、または餌なしだが15%グルコースを含む飲料水とともに4℃で個体飼育した。体温は直腸温度計で1時間ごとに測定した。IACUCが承認した人道的エンドポイントに従って、体温がベースラインから10℃低下したらマウスを安楽死させ、この値をその後の解析に用いた。関連する実験では、血糖値もOneTouch Ultraグルコメーターで尾のスニップを介して毎時間測定した。
ウェスタンブロッティング
急速凍結した組織サンプルを、プロテアーゼおよびホスファターゼ阻害剤を含む1x RIPAバッファーで溶解した。サンプルをホモジナイズして遠心分離し、上清を回収した。タンパク質濃度はBCAタンパク質アッセイキットを用いて定量した。サンプルを2mg/mLに希釈し、2-メルカプトエタノールを加えた1x Laemmliサンプルバッファーで煮沸した。10uLのサンプルを4-20%勾配のTris-グリシンポリアクリルアミドゲル（Bio-Rad）にロードし、100mVで90分間電気泳動した（SDS-PAGE）。タンパク質ゲルをPVDF膜（Millipore）に500 mAで90分間転写した。転写後、膜を5％牛乳で1時間ブロッキングし、TBSTで洗浄した後、一次抗体と4℃で一晩インキュベートした。その後メンブレンを洗浄し、HRP標識二次抗体と1時間インキュベートし、再度洗浄した後、デジタルイメージャーで化学発光により画像化した。
RNAの単離と定量（RT-qPCR）
急速凍結した組織サンプルをTRIzol試薬で溶解し、ホモジナイズして遠心分離し、上清を室温で5分間インキュベートした。0.2容量のクロロホルムを加え、サンプルを十分に混合し、3分間静置した。水相を回収し、1容量の70％エタノールと混合した。最大700μLのサンプルをRNeasy miniカラム（Qiagen）に加え、8,000 x gで30秒間遠心した。サンプルを同じ濃度に希釈し、High Capacity cDNA Reverse Transcription kit（ThermoFischer）を用いてcDNAを作製した。SYBR Greenと選択したプライマーを用いてcDNAのRT-qPCRを行った。
36b4 (ggagccagcgaggccacactgctg, ctggccacgttgcggacctcc)
Gapdh（AGGTCGGTGTGAACGGATTTG、TGTAGACCATGTAGTTGAGGTCA）
Bcat2（CTCATCCTGCGCTTCCAG、TCACACCCGAAACATCCAATC）
Bckdha（ATCTACCGTGTCATGGACCG、ATGGTGTTGAGCAGCGTCAT）
Bckdhb（AGCTATTGCGGAAATCCAGTTT、ACAGTTGAAAAGATCACCTGAGC）
Dbt（AGACTGACCTGTGTTCGCTAT、GAGTGACGTGGCTGACTGTA）
Dld（GAGCTGGAGTCGTGTACC、CCTATCACTGTCACGTCAGCC）
Bckdk（ACATCAGCCACCGATACAC、GAGGCGAACTGAGGGCTTC）
Ppm1k（ATGTTATCAGCGGCCTTCATTAC、GTGGAGAAGTAGCAGGCAGG）
Fatp1（TCAATGTACCAGGAATTACAGAAGG、GAGTGAGAAGTCGCCTGCAC）
Fatp4（ACTGTTCTCCAAGCTAGTGCT、GATGAAGACCCGGATGAAACG）
Acsl1（TGCCAGAGCTGATTGACATTC、GGCATACCAGAAGGTGGTGAG）
Acsl3（CCAGCCATTGTTCATGGACTG、TGGGACCAAAGAGACTATTTCCT）
Acsl5（TCCTGACGTTTGGAACGGC、CTCCCTCAATCCACAGAC）
Fabp2（GTGGAAAGTAGACCGGAACGA、CCATCCTGTGATTGTCAGTT）
Fabp4（GGGGCCAGGCTTCTATTCC、GAGGCTGGGTTAGGTATGGGG）
Fabp5（TGAAAGAGCTAGGAGTAGGACTG、CTCTCGGTTGACCGTGATG）
Cd36 (GGCACAGACGCAGCCTCCTTTCCACC, GGTGATGCAAAGGCATTGGCTGGG)
VCO2測定
マウスは、22℃（RT）または4℃に設定された環境制御インキュベーター内に収容されたCLAMS（Columbus Instruments社製）代謝ケージに、餌ありまたは餌なしで6時間入れられた。実験の最後の 60 分間の VCO2 測定値を平均した。測定値は、理想気体の法則 PV=nRT を用いて nmol C/min/g に変換した。サンプルサイズは、絶食動物では RT (n=4) および 4°C (n=3)、摂食動物では各群 n=5 であった。
肝臓グリコーゲン測定
肝グリコーゲン含量は前述の方法で測定した。75,76 簡単に説明すると、急速凍結した肝サンプル 2 個 (各約 10 mg) を 30 uL/mg の 2 M HCl または NaOH でホモジナイズした。サンプルを100℃で5分間煮沸し、室温まで冷却した後、等容量の2 M NaOHまたはHClで中和した。中和したサンプルを4℃で10分間、16,000 x gで遠心分離し、上清を新しいチューブに移し、製造業者のプロトコールに従って、ヘキソキナーゼ結合酵素測定法（Sigma Glucose HK kit）によるグルコース定量を行った。グリコーゲン含量は、酸加水分解したサンプルのグルコースレベル（グリコーゲン-解離グルコース＋遊離グルコース）を計算し、塩基ホモジナイズしたサンプルのグルコースレベル（遊離グルコース）を差し引くことにより決定した。
血漿の水溶性代謝物抽出
血漿検体から水溶性代謝物を抽出するために、150～200μlの抽出溶液（メタノールまたは40：40：20メタノール：アセトニトリル：水）を5μlの血漿に添加した。この混合液を氷上で10分間インキュベートした後、17,000g、4℃で10分間遠心した。上清をMSバイアルに移し、LCMSで分析した。
組織の水溶性代謝物抽出
組織サンプルから水溶性代謝物を抽出するために、まず凍結組織をクライオミル（Restch, Newtown, PA）を用いて粉末にした。氷上で保存した抽出液（40:40:20メタノール:アセトニトリル:水）を、粉砕した組織約10mg（組織1mgあたり40μlの溶液）に加え、ボルテックスし、氷上で10分間保存した後、17,000g、4℃で10分間遠心した。上清を回収し、再度同じ速度で10分間遠心し、この2回目の上清をMSバイアルに移し、LCMSで分析した。
血漿の脂質抽出
血漿サンプルからの疎水性代謝産物（脂質）の抽出のために、ドライアイス上で保存した120μlのイソプロパノールを3μlの血漿に添加した。この混合物を10秒間ボルテックスし、ドライアイス上で10分間保持した後、17,000g、4℃で10分間遠心分離した。上清をMSバイアルのガラスインサートにロードし、LCMSで分析した。
液体クロマトグラフ質量分析計（LC-MS）による水溶性代謝物の定量
四重極オービトラップ質量分析計（Q Exactive、Q Exactive Plus、Exploris 240、またはExploris 480）をVanquish UHPLCシステム（Thermo Fisher Scientific）に連結し、エレクトロスプレーイオン化、スキャン範囲m/z 60～1000、1 Hz、少なくとも140,000の分解能で水溶性代謝物を測定した。LC分離はXBridge BEH Amideカラム（2.1x150mm、粒子径2.5μm、ポアサイズ130Å、Waters Corporation）を用い、溶媒A（95:5水:アセトニトリル、20mMの酢酸アンモニウムと20mMの水酸化アンモニウム、pH9.45）と溶媒B（アセトニトリル）のグラジエントで行った。流速は150μl/分。LCグラジエントの例：0分、85% B、2分、85% B、3分、80% B、5分、80% B、6分、75% B、7分、75% B、8分、70% B、9分、70% B、10分、50% B、12分、50% B、13分、25% B、16分、25% B、18分、0% B、23分、0% B、24分、85% B、30分、85% B。注入量は5～10μlで、オートサンプラーの温度は4℃に設定した。動脈血液サンプルからの非標的メタボロミクスデータは、ネガティブイオンモードとポジティブイオンモードの両方を使用して生成されました。その他のデータはすべてマイナスイオンモードを使用して作成しました。
LC-MSによる脂質定量
トリグリセリドおよびその他の脂質は、Q Exactive Plus質量分析計とVanquish UHPLCシステム（Thermo Fisher Scientific社製）を組み合わせ、ポジティブモードエレクトロスプレーイオン化を用いて測定した。LC分離は、Agilent Poroshell 120 EC-C18カラム（150×2.1mm、粒子径2.7μm）を用い、毎分150μlの流速で行った。グラジエントは、0分、25%B; 2分、25%B; 4分、65%B; 16分、100%B; 20分、100%B; 21分、25%B; 27分、25%B。溶媒Aは、水:メタノール(90:10)中1mM酢酸アンモニウム+0.2%酢酸。溶媒Bは、メタノール：2-プロパノール（2：98）中の1mM酢酸アンモニウム＋0.2％酢酸。動脈血液サンプルからの非標的メタボロミクスデータは、ネガティブイオンモードとポジティブイオンモードの両方を使用して生成されました。その他のデータはすべてマイナスイオンモードで生成されました。
定量および統計解析
メタボローム解析
データはRで解析し、統計解析には多重仮説検定のためのFDR調整を行った対応のない両側t検定を使用した。動脈血漿メタボロミクスデータは代謝物の平均値に正規化し、その結果値は統計解析の前にサンプルランの中央値に正規化しました。すべてのデータは室温サンプルの平均値に正規化した。
循環フラックスおよび相互変換フラックスの計算
循環フラックスと相互変換フラックスの値の計算は既述の方法で行った：
循環
フラックス
:
�
�
�
�
�
,
�
�
1
�
[
�
+
�
�
[
�
+
�
]
循環
炭素
フラックス
:
�
�
�
�
�
�
�
�
�
�
�
1
�
�
ここで、R は注入速度、C は代謝物 X の炭素原子数、L[M+i] は代謝物 X のうち標識型 [M+i] の割合、そして
�
∑
�
0
�
�
�
[
�
+
�
�
相互変換フラックスは以下のように計算した：
代謝物 X による代謝物 Y の正規化標識：
�
�
�
�
�
�
ここで LY と LX は、上記で定義したように一様に 13C 標識した代謝物 X を注入した際の、代謝物 Y と X の標識炭素の割合です。各代謝産物の他の代謝産物への直接寄与は、以下の一次方程式で計算されます。
�
(
�
�
←
�
�
�
�
�
�
�
�
�
←
�
�
�
�
�
�
�
⋮
�
�
←
3
�
�
)
(
�
�
←
�
�
�
�
�
�
�
�
�
←
�
�
�
�
�
�
�
⋮
�
�
←
3
�
�
)
ここで
�
�
←
�
はiに直接由来するkの割合、Mは正方行列であり、エントリ(X, Y)は
�
�
←
�
を表す。
�
�
は、kに対応する行と列の両方が削除されたMの部分行列である。標準誤差は、ブートストラップ法（n=100のシミュレーショ ン）を用いて、平均値と標準偏差が測定データに基づいて計算されたパラメータ の値に等しい正規分布からMとLの値を選択することによって推定した。そして、相互変換フラックスは以下のように計算された：
�
�
←
�
�
�
←
�
�
�
ここで
�
�
は循環炭素フラックスである。
�
�
31:
�
�
�
�
�
�
�
,
�
�
�
�
�
�
最適化、炭素循環補正、および標準誤差を含む相互変換フラックスの算出は、公表されているコード（Flux_CircMet）を用いて MatLab で行った。
グリセロールに対する他の栄養素の寄与は測定されていないため、グリセロールを最適化解析に含めることはできなかった。グリセロールからグルコースへのフラックス31 を除いて、グリセロールと他の栄養素の間のフラックスは最小限であり、すべてのグリセロールフラックス(
�
�
�
�
�
,
�
�
�
�
�
�
�
�
�
�
�
�
)はグルコースへのフラックスで説明でき（図S4F）、グリセロールからの間接的な糖新生フラックスは最小限であることを示唆している。そのため、このフラックスは次のように計算された：
�
�
�
�
�
�
�
�
←
�
�
�
�
�
�
�
�
�
�
�
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�
�
�
←
�
�
�
�
�
�
�
�
�
�
�
�
�
�
�
�
.
エンドプロダクトフラックス
エンドプロダクトフラックスとは、他の測定代謝物の生成では説明できない、補正された循環炭素フラックスの合計と定義する：
�
�
�
�
�
�
∑
�
≠
�
�
�
←
�
標準誤差は以下のように計算された：
�
�
(
�
�
�
�
)
�
�
(
�
�
)
2
+
∑
�
≠
�
�
�
(
�
�
←
�
)
2
TCAサイクルへの栄養素の寄与
各組織について、TCA サイクルへの総栄養素寄与は、上記で定義したように、注入された各代謝物によるリンゴ酸、コハク酸、グルタミン酸（a-ケトグルタル酸と平衡状態にあるが、より測定しやすい）の正規化標識を測定し、平均を計算することによって計算され、次式が得られる。
�
�
�
�
�
←
�
1
3
(
�
�
�
�
�
�
�
�
�
�
+
�
�
�
�
�
�
�
�
�
�
�
�
�
+
�
�
�
�
�
�
�
�
�
�
�
�
�
)
直接寄与率は、連立一次方程式を立てることによって計算された、
�
(
�
�
�
�
�
←
�
�
�
�
�
�
�
�
�
�
�
�
←
�
�
�
�
�
�
�
⋮
�
�
�
�
�
←
3
�
�
)
(
�
�
�
�
�
←
�
�
�
�
�
�
�
�
�
�
�
�
←
�
�
�
�
�
�
�
⋮
�
�
�
�
�
←
3
�
�
)
ここでMは上記のように定義される。直接寄与
�
�
�
�
�
←
�
および標準誤差は、公表されているMatLabコード（Flux_CircMet）を用いて、前述31のように非負値に対する条件付き最適化とブートストラップ解析によって再度計算した。いくつかの実験では、TCAサイクル標識の計算にリンゴ酸とグルタミン酸のみを用いた。
総脂肪酸およびタンパク質-解放アミノ酸フラックスの計算
脂肪酸の最終産物フラックスおよびグルコースへの総脂肪酸フラックスは、パルミチン酸を用いた関連フラックス値を、パルミチン酸、オレイン酸およびリノレイン酸の循環フラックス値の合計に対する循環パルミチン酸フラックスの公表比率（0.2111）31で除算することにより算出した。TCAサイクルへの総脂肪酸の直接寄与は、BAT（0.3092）、心臓（0.2806）、肝臓（0.2081）、四頭筋および横隔膜（筋肉：0.1751）、WAT（0.1562）それぞれについて、測定されたパルミチン酸の寄与を、パルミチン酸、オレイン酸、リノール酸の寄与の合計に対するパルミチン酸の寄与の公表比率で割って算出した31。タンパク質から解放されたアミノ酸の総末端産物フラックスは、BCAA（必須アミノ酸であるため、食事または内因性のタンパク質分解によってのみ生成される）のフラックスをタンパク質中のBCAAの割合（0.18）で割って算出した32。
食餌性燃料からの炭素フラックスの測定
食餌性燃料からの炭素フラックスは、常温または 4℃で 6 時間にわたって測定した食餌消費量に基 づき、食餌製品シート（LabDiet）に従って、タンパク質（0.04）、脂肪（0.064）、糖質（0.033）の消費量 1g あたりの平均炭素数と、代謝可能なタンパク質、脂肪（エーテル抽出物）、 炭水化物（無窒素抽出物）で構成される食餌の部分を推定することにより算出した。総フラックスは、3 つの合計を取ることにより算出した。
U-13C-グルコースを用いたPC対PDHフラックスの決定
補足方法 A を参照。
3-13C-グルコースを用いたPCフラックスの測定
グルコース由来のピルビン酸カルボキシル化により生成したリンゴ酸の割合を計算するために、室温で飼育したマウスに3-13C-グルコースを定常的に注入し、リンゴ酸のM+1分画濃縮度を測定した。3-13C-グルコースはM+1（標識）とM+0（非標識）のピルビン酸を1:1で生成するため、これを血漿中のグルコースのM+1分画濃縮率で正規化し、2を乗じた：
�
�
�
2
×
�
�
�
�
�
�
�
[
�
+
1
]
�
�
�
�
�
�
�
�
[
�
+
1
]
その他の統計解析
特に断りのない限り、データはGraphPad Prismを用いて解析し、平均値±標準誤差で示した。P値は、p＜0.05、＊＊p＜0.01、＊＊p＜0.001、＊＊p＜0.0001を有意と定義し、対応のない両側t検定を用いて計算した。寒冷暴露中のフラックス値の増加（寒冷誘導フラックス）は、4℃でのフラックスと常温でのフラックスの差として計算し、標準誤差は各フラックス値の標準誤差の二乗和の平方根として計算した。全フラックスとの比較、または全フラックスに対するパーセンテージの算出には、以下のものを使用した。
�
�
�
�
�
�
�
�
�
(グリセロールの場合）または
�
�
(グリセロールの場合)または�� (その他の栄養素の場合)を全フラックスの指標とする。
データとコードの利用可能性
メタボロミクスデータはNational Metabolomics Data RepositoryにStudy ID: ST002813で寄託されている。
すべてのプロットとグラフの基礎となる未処理のソースデータはData S1で入手可能。
すべてのオリジナルコードは本論文の補足情報に掲載されている。
本論文で報告されたデータを再分析するために必要な追加情報は、要求があれば主担当者から入手可能である。
謝辞
Fbp1flox/floxマウスを提供してくれたCeleste Simonに感謝する。M.R.B.はNIHの支援を受けた（2T32DK007314-41および1F30DK131829-01A1）。Z.A.はNIH（DK107667およびDK135958）の支援を受けた。また、カスタムAAV8ベクターを作製していただいたペンシルバニア大学のPenn Vector Core、およびペンシルバニア大学糖尿病研究センターのMetabolomics Core（NIH DK19525）に感謝する。いくつかの図はBioRender.comで作成した。
著者貢献
M.R.B.とZ.A.がプロジェクトを発案した。M.R.B.は実験の計画と実施、データ解析、図作成、原稿執筆を行った。M.D.N.、M.R.B.、X.Z.はLC-MSデータを作成した。M.D.N.は実験デザインとデータ解釈にも大きく貢献した。Q.C.はカテーテル手術を行った。J.A.、C.T.、K.L.、M.C.B.はそれぞれマウス組織採取の一部を手伝った。J.D.R.はM.D.N.およびX.Z.との共同研究を監督し、LC-MS装置の使用を許可し、フィードバックを提供した。Z.A.はプロジェクトを監督し、図と原稿の編集に大きく貢献した。すべての著者が原稿に目を通し、意見を寄せてくれた。
利害関係
著者らは競合する利益はないと宣言している。
補足情報
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ドキュメントS1. 補足方法A、図S1-S6、表S4
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表S1. 図1に関連する動脈メタボロミクスデータ
ダウンロード .xlsx (.09 MB)
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表S2. 図1に関連する組織メタボロミクスデータ
ダウンロード .xlsx (.01 MB)
xlsxファイルのヘルプ
表S3. 図3および図5に関連する相互変換フラックス
ダウンロード .zip (.77 MB)
zipファイルのヘルプ
データS1。図2、3、4、5、6およびS3～S6に関連する、すべてのプロットとグラフの基礎となる未処理のソースデータ。
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スコープス (36)
クロス
グーグル奨学生
Zhang Z.
テスラーT.
Xu X.
Zeng X.
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Xing G.
テス G.J.
Clasquin M.F.
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スコープス (27)
PubMed
クロス
グーグル奨学生
メクラムR.
ベン・シャバットS.
ハヌスL.
リグムスキーM.
カミンスキー N.E.
シャッツA.R.
ゴーファー A．
アルモグ S．
マーティン B.R.
コンプトン D.R.
イヌの腸内に存在し、カンナビノイド受容体に結合する内因性2-モノグリセリドの同定。
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スコープス(2410)
PubMed
クロス
グーグル奨学生
クロット L.M.
ピシテッリF.
ハイネM.
ボリーノS.
シェジャ L.
シルベストリ C.
ヒーレンJ.
ディマルツォV.
発熱活性化後の白色および褐色脂肪組織におけるエンドカンナビノイド制御。
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PubMed
要旨
全文
全文PDF
グーグル奨学生
クアルタC.
ベロッキオL.
マンチーニ G.
マッツァ R.
セルヴィーノ C.
ブラウケ L.J.
フェケテ C．
ラトーレ R．
ナンニ C．
ブッチ M．
他
前脳および交感神経ニューロンにおけるCB(1)シグナル伝達は、エネルギーバランスに対するエンドカンナビノイド作用の重要な決定因子である。
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全文
全文PDF
グーグル奨学生
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スコパス (398)
PubMed
概要
全文
全文PDF
グーグル奨学生
ホワイトヘッド A.
クラウス F.N.
モラン A.
マッカネル A.D.V.
スクラッグ J.L.
マクナリー B.D.
ボアテング E.
マーフィット S.A.
ヴァーチュ S．
ライト J．
他
褐色脂肪組織とベージュ脂肪組織は、代謝産物間のシグナル伝達軸を介して全身の代謝を調節している。
Nat. Commun. 2021; 121905
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スコープス (60)
クロスリファレンス
グーグル奨学生
ニルセン M.S.
イェルシン R.Å.
ウルヴィク A.
マドセン A.
マッキャン A.
スヴェンソン P.A.
スヴェンソン M.K.
ネドレボ B.G.
グッドブランセン O.A.
テル G.S.
他
3-ヒドロキシイソ酪酸、白色および褐色脂肪細胞代謝を調節する2型糖尿病および肥満におけるインスリン抵抗性の強力なマーカー。
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PubMed
クロス
グーグル奨学生
シュー・W.Y.
シェン Y.
Zhu H.
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Zhang C.
Tang L.
Lu S.Y.
シェン C.L.
Zhang H.X.
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et al.
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チャンツリヤ T.
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アニル K.G.
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Wongsiriroj N.
アブデラティフ M.
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グーグル奨学生
中川博之
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グーグル奨学生
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クロス
グーグル奨学生
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コーワン A.J.
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Yang L.
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Li X.
バートマン C.
チャン Z.
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グーグル奨学生
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ウー P.C.
Koves T.R.
イルカエワ O.
スティーブンス R.D.
ワトキンス S.M.
ムオイオ D.M.
コールマンR.A.
脂肪アシル-CoA合成酵素-1は脂肪酸をβ酸化に向かわせ、寒冷熱発生に必要である。
Cell Metab. 2010; 12: 53-64
https://doi.org/10.1016/j.cmet.2010.05.012
論文で見る
スコープス (242)
パブコメ
概要
全文
全文PDF
グーグル奨学生
リー J.
エリス J.M.
ウォルフガング M.J.
脂肪脂肪酸酸化は熱発生に必要であり、酸化ストレス誘発性炎症を増強する。
Cell Rep. 2015; 10: 266-279
https://doi.org/10.1016/j.celrep.2014.12.023
論文で見る
スコープス (135)
PubMed
要旨
全文
全文PDF
グーグル奨学生
シューラーA.M.
ガウアーB.A.
マテルンD.
リナルドP.
ヴォックリーJ.
ウッド P.A.
ミトコンドリア脂肪酸β酸化の遺伝性酵素欠損マウスにおける相乗的ヘテロ接合性。
Mol. Genet. Metab. 2005; 85: 7-11
https://doi.org/10.1016/j.ymgme.2004.09.006
論文で見る
スコープス (49)
PubMed
クロス
グーグル奨学生
ゲラ C.
コザ R.A.
ウォルシュ K.
カーツ D.M.
ウッド P.A.
コザックL.P.
遺伝性脂肪酸酸化欠損マウスにおける非シバリング性熱発生異常。
J. Clin. Invest. 1998; 102: 1724-1731
https://doi.org/10.1172/JCI4532
論文で見る
スコープス (111)
PubMed
クロス
グーグル奨学生
トルワニ R.J.
ハム D.A.
ティアン L.
シャラーJ.D.
ヴォックリーJ.
リナルド P.
マターン D.
ショーブ T.R.
ウッド P.A.
遺伝子標的マウスにおける中鎖アシル-CoAデヒドロゲナーゼ欠損。
PLoS Genet. 2005; 1e23
https://doi.org/10.1371/journal.pgen.0010023
論文で見る
スコープス (89)
クロスリファレンス
グーグル奨学生
ゴンザレス・フルタード E.
リーJ.
チェ J.
ウォルフガング M.J.
脂肪酸の酸化は、褐色脂肪組織の活性および休止期の維持と発熱プログラミングに必要である。
Mol. Metab. 2018; 7: 45-56
https://doi.org/10.1016/j.molmet.2017.11.004
論文で見る
スコープス (74)
PubMed
クロス
グーグル奨学生
サンチェス-グルマチェスJ.
タン Y.
イェスパーセン N.Z.
ウォレス M.
マルティネス・カレイマン C.
グジャ S．
リー・H．
エドワーズ Y.J.K.
ウォルフラム C．
メタロ C.M.
ほか
褐色脂肪AKT2は、ChREBPを介したde novo脂肪生成を刺激し、燃料貯蔵と熱発生を最適化する寒冷誘導キナーゼである。
Cell Metab. 2018; 27: 195-209.e6
https://doi.org/10.1016/j.cmet.2017.10.008
論文で見る
スコープス (126)
PubMed
要旨
全文
全文PDF
グーグル奨学生
グレコ-ペロットR.
ザニネッティD.
アッシマコプロス-ジャンネF.
ボビオーニ E.
ジャンローB.
褐色脂肪組織によるグルコース利用に対する寒冷適応の刺激効果。グルコーストランスポーター系の変化との関係。
J. Biol. Chem. 1987; 262: 7732-7736
https://doi.org/10.1016/s0021-9258(18)47629-6
論文で見る
パブコメ
要旨
全文PDF
グーグル奨学生
ヴィルタネン K.A.
リデル M.E.
オラバ J.
ヘグリンド M.
ウェスターグレン R.
ニエミ T.
タイトネン M.
ライネ J.
サヴィスト N.J.
エネルバクS.
ら。
健康成人における機能的褐色脂肪組織。
N. Engl. J. Med. 2009; 360: 1518-1525
https://doi.org/10.1056/NEJMoa0808949
論文で見る
スコープス (2396)
PubMed
クロス
グーグル奨学生
ファン・マルケン・リヒテンベルトW.D.
ヴァンホメリグJ.W.
Smulders N.M.
ドロッサーツJ.M.A.F.L.
ケメリンクG.J.
ブービーN.D.
シュラウエン P.
テューレG.J.J.
健康な男性における寒冷活性化褐色脂肪組織。
N. Engl. J. Med. 2009; 360: 1500-1508
https://doi.org/10.1056/NEJMoa0808718
論文で見る
スコープス (2694)
PubMed
クロス
グーグル奨学生
オイエレV.
ラベS.M.
ブロンダンD.P.
フェニックス S.
ゲラン B.
ハマーン F.
ターコット E.E.
リシャール D．
カルペンティエA.C.
褐色脂肪組織の酸化代謝は、ヒトの急性寒冷曝露時のエネルギー消費に寄与する。
J. Clin. Invest. 2012; 122: 545-552
https://doi.org/10.1172/JCI60433.The
記事で見る
スコープス (0)
パブコメ
クロス
グーグル奨学生
齋藤雅人
岡松-小倉
松下正樹
渡辺和男
米代 毅
仁尾・小林 J.
岩永 毅
宮川雅史
亀谷 毅
中田和彦
他
健常成人における代謝活性の高い褐色脂肪組織の高発生率：寒冷曝露と脂肪率の影響。
Diabetes. 2009; 58: 1526-1531
https://doi.org/10.2337/db09-0530
論文で見る
スコープス (1486)
PubMed
クロス
グーグル奨学生
チェン K.Y.
サイペス A.M.
ローフリン M.R.
ハフト C.R.
フー・エイチ・エイチ
ブレデラ M.A.
エネルベック S.
キナハン P.E.
リヒテンベルト W.v.M.
リン F.I.
他
画像研究における褐色脂肪報告基準（BARCIST 1.0）： ヒトにおける標準化されたFDG-PET/CT実験のための推奨事項。
Cell Metab. 2016; 24: 210-222
https://doi.org/10.1016/j.cmet.2016.07.014
論文で見る
スコープス (205)
PubMed
概要
全文
全文PDF
グーグル奨学生
スミス O.L.
デビッドソン S.B.
正常または糖尿病ラットの筋肉による震え熱発生とグルコース取り込み。
Am. J. Physiol.
https://doi.org/10.1152/ajpregu.1982.242.1.r109
論文で見る
スコパス (33)
クロスリファレンス
グーグル奨学生
ブロンダン D.P.
ラベS.M.
フェニックス S.
ゲラン B.
ターコット É.E.
リシャール D.
カルペンティエ A.C.
ハマーン F.
健康男性における急性寒冷誘発代謝反応に対する白色および褐色脂肪組織と骨格筋の寄与。
J. Physiol. 2015; 593: 701-714
https://doi.org/10.1113/jphysiol.2014.283598
論文で見る
スコープス（175）
PubMed
クロス
グーグル奨学生
ジャン C．
チェン・L.
ラビノウィッツ J.D.
メタボロミクスと同位体トレーシング。
Cell. 2018; 173: 822-837
https://doi.org/10.1016/j.cell.2018.03.055
論文で見る
スコープス (438)
PubMed
概要
全文
全文PDF
グーグル奨学生
Wang Y.
クォン・エイチ
スー X.
ウォンディスフォードF.E.
マウスにおける短期および長期絶食時の糖新生の主要な正味炭素源は乳酸ではなくグリセロールである。
Mol. Metab. 2020; 31: 36-44
https://doi.org/10.1016/j.molmet.2019.11.005
論文で見る
スコープス (28)
PubMed
クロス
グーグル奨学生
Li F.
黄楊P.
バローズM.
Guo K.
リスカール R.
ゴッドフリー J．
リー K.E.
リン N．
リー P．
ブレア I.A.
他。
FBP1欠損は肝代謝を破壊し、肝星細胞老化セクレトームを通じて腫瘍形成を促進する。
Nat. Cell Biol.
https://doi.org/10.1038/s41556-020-0511-2
論文で見る
スコープス (82)
PubMed
クロス
グーグル奨学生
米代 毅
王 Q.
田島和彦
松下正樹
牧浩二
五十嵐和彦
戴 Z.
ホワイト P.J.
マクガラーR.W.
イルカエワ O.R.
ほか
褐色脂肪におけるBCAA異化は、SLC25A44を介してエネルギー恒常性を制御する。
Nature. 2019; 572: 614-619
https://doi.org/10.1038/s41586-019-1503-x
論文で見る
スコープス (257)
PubMed
クロス
グーグル奨学生
マー Q.X.
Zhu W.Y.
Lu X.C.
Jiang D.
Xu F.
Li J.T.
Zhang L.
Wu Y.L.
Chen Z.J.
Yin M.
ら
BCAA-BCKA軸はPRDM16のアセチル化を介してWATの褐変を制御する。
Nat. Metab. 2022; 4: 106-122
https://doi.org/10.1038/s42255-021-00520-6
論文で見る
スコープス (25)
PubMed
クロス
グーグル奨学生
Jang C.
オー S.F.
和田 聡
ロウ G.C.
リウ L.
チャン M.C.
Rhee J.
Hoshino A.
キム B.
イブラヒム A.
他。
分岐鎖アミノ酸代謝物が血管内脂肪酸輸送を促進し、インスリン抵抗性を引き起こす。
Nat. Med. 2016; 22: 421-426
https://doi.org/10.1038/nm.4057
論文で見る
スコープス (357)
PubMed
クロス
グーグル奨学生
Xu Y.
Jiang H.
Li L.
Chen F.
Liu Y.
Zhou M.
Wang J.
Jiang J.
Li X.
ファン X.
et al.
分岐鎖アミノ酸の異化は、血小板におけるトロポモジュリン-3のプロピオニル化を促進することによって血栓症リスクを促進する。
Circulation. 2020; 142: 49-64
https://doi.org/10.1161/CIRCULATIONAHA.119.043581
論文で見る
スコパス (43)
PubMed
クロス
グーグル奨学生
Czumaj A.
シュレジンスキーT.
Mika A.
分岐鎖脂肪酸は、ヒト脂肪細胞における脂質合成と炎症を担う遺伝子の発現を変化させる。
栄養素。2022; 142310
https://doi.org/10.3390/nu14112310
記事で見る
スコープ (11)
クロスリファレンス
グーグル奨学生
プチャルスカ P.
クロフォードP.A.
燃料代謝、シグナル伝達、治療におけるケトン体の多次元的役割。
Cell Metab. 2017; 25: 262-284
https://doi.org/10.1016/j.cmet.2016.12.022
論文で見る
スコープス (771)
PubMed
概要
全文
全文PDF
グーグル奨学生
オルセン J.M.
佐藤正樹
ダルナー O.S.
サンドストレム A.L.
ピサニ D.F.
シャンバールJ.C.
アムリ E.Z.
ハッチンソンD.S.
ベングトソンT.
褐色脂肪細胞におけるグルコースの取り込みは、mTOR複合体2が促進するGLUT1のトランスロケーションに依存している。
J. Cell Biol.
https://doi.org/10.1083/jcb.201403080
論文で見る
スコパス(117)
PubMed
クロス
グーグル奨学生
オラバ J.
ヌーティラ P.
リデル M.E.
オイコネン V.
ノポネン T.
ヴィリヤネン T.
シャイニン M.
タイトンネン M.
ニエミ T.
エネルバク S.
ヴィルタネン K.A.
寒冷とインスリンによる活性化に対するヒト褐色脂肪組織の異なる代謝反応。
Cell Metab. 2011; 14: 272-279
https://doi.org/10.1016/j.cmet.2011.06.012
論文で見る
スコープス (550)
パブコメ
概要
全文
全文PDF
グーグル奨学生
ハンキル M.K.
クリンゲンスポールM.
褐色脂肪細胞のグルコース代謝：白熱したテーマ。
EMBO Rep. 2018; 19e46404
https://doi.org/10.15252/embr.201846404
論文で見る
スコープス（76）
クロスリファレンス
グーグル奨学生
ユング S.M.
ドクシー W.G.
ル J.
ヘイリー・J.A.
マズエコス L.
ルシアーノ A.K.
リー・H．
ジャン C．
ゲルチンD.A.
褐色脂肪組織基質としてのグルコースの多様性を明らかにするin vivo同位体トレーシング。
Cell Rep.
https://doi.org/10.1016/j.celrep.2021.109459
論文で見る
スコープ (19)
要旨
全文
全文PDF
グーグル・スカラー
ファン・デル・ランス A.A.J.J.
ホークスJ.
ブランズB.
ヴィジェンG.H.E.J.
ヴィッサー M.G.W.
ヴォッセルマン M.J.
ハンセン J.
ヨルゲンセン J.A.
ウー J．
モッタギー F.M.
ほか
寒冷馴化はヒト褐色脂肪を動員し、非震動熱発生を増加させる。
J. Clin. Invest. 2013; 123: 3395-3403
https://doi.org/10.1172/JCI68993
記事で見る
スコープス (610)
パブコメ
クロス
グーグル奨学生
ジャンギョーム C．
メトラールG.
リキエD.
ルグラス P.
ブーシェ F.
ラコイユ F.
ヒンドル F.
モレル O.
ラコトニリーナH.
マウスにおける活性化BATのFDG-PETによる可視化とUCP1との関連。
Adv. Mol. Imaging. 2013; 03: 19-22
https://doi.org/10.4236/ami.2013.33004
論文で見る
クロスリファレンス
グーグル奨学生
パニック V.
ピアソン S.
バンクスJ.
ティペッツ T.S.
ベラスコ・シルバ J.N.
リー S．
シムコックス J.
ゲーガン G．
ベンサード C.L.
バン・ライT.
他。
ミトコンドリアのピルビン酸キャリアは、最適な褐色脂肪熱産生に必要である。
ELife. 2020; 9e52558
https://doi.org/10.7554/eLife.52558
記事で見る
クロス
グーグル・スカラー
キャノン B.
ネデルガードJ.
ハムスター褐色脂肪組織におけるピルビン酸カルボキシル化の生理的役割。
Eur. J. Biochem. 1979; 94: 419-426
https://doi.org/10.1111/j.1432-1033.1979.tb12909.x
論文で見る
スコープス (43)
PubMed
クロス
グーグル奨学生
老温U.
クリフ T.S.
ダルトン S.
ジトラパクディー S.
ピルビン酸カルボキシラーゼは、ヒト多能性幹細胞由来の褐色脂肪細胞におけるATP連動基礎呼吸をサポートする。
Biochem. Biophys. Res. Commun. 2021; 569: 139-146
https://doi.org/10.1016/j.bbrc.2021.06.096
論文で見る
スコープス(2)
クロスリファレンス
グーグル奨学生
マウラー J.
ホーネM.
ヴァイガート C.
サークルからのシグナル：ミオメタボカインとしてトリカルボン酸サイクル中間体。
代謝物。2021; 11474
https://doi.org/10.3390/metabo11080474
論文で見る
スコパス (6)
クロスリファレンス
グーグル奨学生
ミルズ E.L.
ピアース K.A.
ジェドリチョウスキー M.P.
ガリティ R.
ウィンサー S.
ヴィドーニ S.
ヨネシロ・T.
スピネリ J.B.
ルー G.Z.
カザックL.
ほか
コハク酸の蓄積は脂肪組織熱発生の活性化を制御する。
Nature. 2018; 560: 102-106
https://doi.org/10.1038/s41586-018-0353-2
論文で見る
スコープス (307)
PubMed
クロス
グーグル奨学生
パークG.
ヘイリーJ.A.
Le J.
ユング S.M.
フィッツギボンズ T.P.
コロブキナ E.D.
リー H．
フルハーティ S.M.
チェン Q.
スピネリ J.B.
et al.
褐色脂肪と骨格筋における熱発生時の代謝フラックスの定量的解析。
Nat. Metab. 2023; 5: 1204-1220
https://doi.org/10.1038/s42255-023-00825-8
論文で見る
スコープス (4)
クロスリファレンス
グーグル奨学生
ハンキル M.K.
クランツ M.
カイペルトS.
ヴァイナー J.
アンドレアセン S.G.
カーン M．
パット M.
クレッティング N.
ハイカー J.T.
ブルストP.
他
アンカップリングプロテイン1欠損マウスにおける褐色脂肪組織18F-FDG取り込みと熱産生との解離。
J. Nucl. Med. 2017; 58: 1100-1103
https://doi.org/10.2967/jnumed.116.186460
論文で見る
スコープス (65)
PubMed
クロス
グーグル奨学生
オルセン J.M.
チカシュR.I.
デフバリN.
Lu L.
サンドストレム A.
Öberg A.I.
ネデルガードJ.
ストーン・エランダー S.
ベングトソンT.
褐色脂肪組織におけるβ3-アドレナリン誘発性グルコース取り込みは、UCP1の存在や活性とは無関係である：mTOR経路を介した仲介。
Mol. Metab. 2017; 6: 611-619
https://doi.org/10.1016/j.molmet.2017.02.006
論文で見る
スコープス (72)
PubMed
クロス
グーグル奨学生
アルバート V．
スヴェンソンK.
下林正樹
コロンビ M.
ムニョス S.
ヒメネス V.
ハンシン C.
ボッシュ F．
ホール M.N.
mTORC2は、褐色脂肪組織におけるAkt誘導性のグルコース取り込みと解糖を介して熱発生を維持する。
EMBO Mol. Med. 2016; 8: 232-246
https://doi.org/10.15252/emmm.201505610
論文で見る
スコープス (94)
PubMed
クロス
グーグル奨学生
チョン J.H.
チャン J.S.
Jo Y.H.
褐色脂肪組織における細胞内解糖は、光遺伝学的に誘導されたマウスの非シバリング熱発生に必須である。
Sci. Rep. 2018; 86672
https://doi.org/10.1038/s41598-018-25265-3
論文で見る
スコープス (44)
クロスリファレンス
グーグル奨学生
ガネーシャン K.
チャウラ A.
マウスを温めてヒトの病気をモデル化する。
Nat. Rev. Endocrinol. 2017; 13: 458-465
https://doi.org/10.1038/nrendo.2017.48
論文で見る
スコープス (117)
PubMed
クロス
グーグル奨学生
パッソノーJ.V.
ローダーデール V.R.
組織中のグリコーゲン測定の3つの方法の比較。
Anal. Biochem. 1974; 60: 405-412
https://doi.org/10.1016/0003-2697(74)90248-6
論文で見る
スコープス (630)
PubMed
クロス
グーグル奨学生
Zhang P.
マウス肝グリコーゲン含量の解析。
Bio Protoc. 2012; 2e186
https://doi.org/10.21769/BioProtoc.186
論文で見る
クロスリファレンス
グーグル
論文情報
出版履歴
出版 2023年10月5日
受理 受理：2023年9月11日
改訂版受理 2023年7月14日
受理：2023年7月14日 受理：2023年1月23日
出版段階
インプレス、修正校正
識別
DOI: https://doi.org/10.1016/j.cmet.2023.09.002
著作権
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図3絶食マウスにおける寒冷が誘発する全身炭素フラックスの変化の定量化
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図6肝臓の糖新生はBATのアナプレローシスを促進し、寒冷耐性に必要である。
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