高血糖は十二指腸内細菌叢の異常と十二指腸微小環境の変化と関連している
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出版：2023年7月7日
高血糖は十二指腸内細菌叢の異常と十二指腸微小環境の変化と関連している
https://www.nature.com/articles/s41598-023-37720-x
Aarti Darra, Vandana Singh, ...Usha Dutta 著者一覧を見る
サイエンティフィックリポーツ13巻、論文番号：11038（2023） この記事を引用する
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メトリクス詳細
概要
腸内細菌叢は、糖尿病などの代謝性疾患の病態や経過に影響を及ぼす。十二指腸粘膜に関連する微生物叢が、糖尿病前段階を含む血糖上昇の発生および進行に寄与している可能性は高いが、便に比べて研究ははるかに少ない。我々は、高血糖（HbA1cが5.7％以上、空腹時血糖が100mg/dl以上）の患者を正常血糖の患者と比較し、便と十二指腸の微生物叢をペアで調査した。その結果、高血糖患者（n = 33）は正常血糖患者（n = 21）と比較して、十二指腸細菌数が多く（p = 0.008）、病原性細菌が増加し、有益な細菌叢が減少していた。十二指腸の微小環境は、T-Statを用いた酸素飽和度の測定、血清炎症マーカー、腸管透過性のゾヌリンによって評価した。細菌過剰は血清ゾヌリンの増加（p = 0.061）およびTNF-αの上昇（p = 0.054）と相関することが観察された。さらに、酸素飽和度の低下（p = 0.021）と全身性の炎症性状態（総白血球数の増加（p = 0.031）とIL-10の減少（p = 0.015））が高血糖の十二指腸を特徴付けた。便細菌叢とは異なり、十二指腸細菌プロフィールの変動は血糖値と関連しており、バイオインフォマティクス解析により栄養代謝に悪影響を及ぼすことが予測された。本研究で得られた知見は、高血糖の初期症状として十二指腸内細菌叢の異常と局所代謝の変化を同定することで、小腸内細菌叢の組成変化について新たな理解を与えるものである。
はじめに
2型糖尿病（T2DM）は、体内の糖レベル調節機構の障害を特徴とする慢性進行性代謝疾患である。T2DMは、先進国のみならず発展途上国においても、急速に医療上の大きな負担となっている1。この疾患は、初期糖尿病または糖尿病予備軍として知られる中間的な高血糖状態に先行して発症する。これはしばしば診断されないが、ヒトの生物学的健康に対する疾患の初期影響を理解する機会を提供する。疾患の正確なメカニズムはよくわかっていないが、実験および臨床研究から、腸内細菌叢が糖尿病を含む代謝性疾患の病因と経過を決定することが明らかになっている2。腸内細菌叢の変化は、マウスにおいてインスリン抵抗性（IR）を誘発する可能性があり、糖尿病の発症における微生物叢の重要な役割を示唆している。同様に、痩せたドナーからメタボリックシンドローム患者に便微生物叢を移植すると、腸内細菌の多様性が増大し、インスリン感受性（IS）が改善した3。このような微生物に起因する影響は、少なくとも部分的には、微生物の代謝産物の変化によるものであり、ISを促進または改善する。例えば、インスリン感受性の低下は、腸内の酪酸産生菌の減少に相関している4。
実際、腸内における宿主-共生細菌-病原体の相互作用は、慢性代謝疾患の根底にある特徴である腸透過性亢進の決定因子でもある5。リポ多糖6を介した炎症反応が引き金となり、タイトジャンクションタンパク質の機能を低下させ、IRを引き起こす。物理的バリア以外に、組織の酸素化もあまり研究されていない要因であり、低酸素状態が炎症やインスリン抵抗性を促進する。
長い間、マイクロバイオーム研究は腸内細菌プロファイルの研究に便サンプルに大きく依存してきたが、便微生物群集は遠位腸に類似した微生物相を反映しており、上部腸の粘膜関連微生物相（MAM）を捉えていない。これまでの研究で、上部腸のMAM群集が糖代謝障害の危険因子であることが指摘されている7。内視鏡的十二指腸粘膜表面置換術（DMR）や十二指腸スリーブ挿入術といった、おそらく「病的な十二指腸」をバイパスする手技が、血糖コントロールの有益な改善8,9と代謝恒常性の回復を示しているため、上部消化管に焦点を当てた研究はほとんど行われていない。糖尿病における十二指腸の役割に関する既存のエビデンスは、腸ホルモン軸10を介した局所的な栄養効果に焦点が当てられているが、ディスバイオシスや免疫刺激を介した間接的な効果も十分に考えられる。最近では、メトホルミンが小腸内細菌を変化させることにより糖質調節作用を誘導するという知見11や、レスベラトロールが十二指腸に特異的なSirt1を介して作用し、インスリン感受性を高めるという作用機序12が報告されており、このような研究は極めて重要である。
高血糖と上述した因子との関連は、腸の生理機能が血糖に影響を与え、血糖状態が腸の生理機能を変化させるというように、双方向的である可能性が高い。このような関係は、MAM、低酸素、あるいは上皮透過性に関連するが、表面積が大きく、栄養シグナル伝達が腸-ホルモンおよび腸-神経軸に結合し、宿主-微生物間のバリアが大腸ほど強くない上部消化管で最もよく調べられる13。糖尿病前症から始まる関連は、腸液の生理的グルコースレベルがマイクロバイオームの変化を引き起こすという因果関係のバイアスに悩まされる可能性は低い。
本研究では、十二指腸細菌異常症と微小環境の変化が、糖尿病前症および糖尿病の高血糖（HbA1c 5.7％以上、空腹時血糖値100mg/dl以上）と関連するという仮説を検討した。先行研究では、主に機能性ディスペプシア14、喫煙者15、小腸細菌の過剰増殖16、セリアック病17、膵臓がん18、腸疾患19,20における十二指腸細菌が検討されている。このように、腸内上部微生物の変化が、免疫と代謝のシグナル伝達を乱し、疾病を引き起こす原因となっている可能性があることを示す証拠が増えてきている。高血糖における十二指腸近位部および対になった便サンプルのマイクロバイオーム全体の特徴を明らかにすることは、初期の疾患状態における十二指腸および関連する微小環境の役割に関する知識の不足を補うものである。このような研究はインド人では初めてである。十二指腸微生物群集と微小環境（酸素化、透過性、全身性炎症）が高血糖の人とそうでない人とで異なるかどうかという具体的な疑問に取り組むため、PGIMERで消化器症状の標準的スクリーニングの一環として上部消化管内視鏡検査を受けた被験者を募集し、16S rRNA遺伝子マイクロバイオーム解析のための十二指腸生検と一対の便サンプルを得た。全体として、我々は、dysbiotic duodenal microbiome signatureを同定し、高血糖における微小環境の変化と微生物叢の関連について新たな知見を提供した。
研究結果
被験者とサンプルの特徴
合計116検体の塩基配列が決定され、そのうち108検体は54人の被験者から得られた便と生検のペア検体であり、残りの8検体は陰性対照検体であった。陰性対照とは、DNA抽出に必要な試薬はすべて含むが、生物学的物質を含まないサンプルである。各被験者の対になった生検サンプルと便サンプルを16S微生物分析のために分析した。高血糖33名、正常血糖21名で、内視鏡検査前の過去6～8週間に抗生物質を服用した被験者はいなかった。十二指腸の内視鏡的特徴は両群とも正常であった。病理組織学的検査では、重度の炎症や十二指腸に関連した病変を認めた者はいなかった。16SrRNA遺伝子のV3-V4の標的化増幅法を用いて、108検体の便および十二指腸サンプルの微生物学的特徴を解析した結果、9,926,256個の塩基配列が得られ、795個のASV（Amplicon Sequence Variants）に割り当てられた。
十二指腸の微生物特性および便細菌プロファイルとの比較
16Sアンプリコンデータの解析は、高血糖および正常血糖の両者における十二指腸マイクロバイオームの細菌組成を研究するために実施された。高血糖群と正常血糖群の十二指腸マイクロバイオームにおいて、優勢な系統は、プロテオバクテリア（Proteobacteria）、バクテロイデーテス（Bacteroidetes）、ファーミキューテス（Firmicutes）、アクチノバクテリア（Actinobacteria）、フソバクテリア（Fusobacteria）であった。また、Lentisphaerae、Tenericutes、Epsilonbacteraeota、Chlamydiae、Verrucomicrobia、Patescibacteriaなどの少数門も存在し、高血糖群と正常血糖群ではそれぞれ微生物叢の1％未満と5％未満を占めた（図1a）。多くのリードがBacteroidiaとGammaproteobacteriaに割り当てられ、クラスレベルで十二指腸マイクロバイオームの60％を占めた。その他の顕著なクラスは、Clostridia、Bacilli、Alphaproteobacteria、Actinobacteria、Campylobacteria、Fusobacteria、Negativicutes、Erysipelotrichiaであった。存在量が3％未満のクラスは、Lentisphaeria、Coriobacteriia、Mollicutes、Chlamydiae、Deltaproteobacteria、Verrucomicrobiae、Saccharimonadiaであった（図1b）。さらに、十二指腸検体では36の目に分類され、その中で最も多かったのは、βプロテオバクテリア目、バクテロイデス目、シュードモナデス目、乳酸桿菌目、パスツレラデス目、セレノモナデス目、ミクロコッカス目、バチルス目、腸内細菌目、フソバクテリア目であった（図1c）。最後に、十二指腸内細菌叢には70の細菌ファミリーが存在し、Burkholderiaceae、Prevotellaceae、Pasteurellaceae、Pseudomonadaceae、Neisseriaceae、Veillonellaceae、Carnobacteriaceae、Succinivibrionaceae、Lachnospiraceae、Streptococcaceaeが大きな割合を占めていた（図1d）。
図1
図1
十二指腸の微生物組成の特徴と便プロフィールとの比較。(a)門、(b)綱、(c)目、(d)科レベルでの高血糖被験者と正常血糖被験者の十二指腸微生物群の分類学的プロファイルのヒストグラム。(e)便と十二指腸のβ多様性の違いを示すBray-Curtis距離に基づく主座標分析（PCoA）プロット。分散の割合は最初の2つの主成分で説明され、ペアサンプルの色はサンプルの部位、すなわち生検（ピンク）と便（茶）を示す。(f)十二指腸サンプルと便サンプル（n = 108）における生物種存在量の推定log2-fold変化のボルケーノプロット。x軸はlog2（fold変化）を表し、y軸は各細菌の統計的有意性を表す。
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次に、十二指腸の微生物組成が便と異なるかどうかを調べた。主座標分析（PCoA）のためにサンプル間でシーケンス深度を変化させるためにフィロセックデータセットをダウンサイジングしたところ、便と十二指腸を表す2つの異なるクラスターが見つかった（PERMANOVA、R2 = 0.381、p = 0.001）。PCoAデータは軸1に沿って分離し、サンプルのクラスタリングのばらつきの38.1％を説明した（図1e）。便サンプルと十二指腸生検サンプルの間の微生物の違いを門レベルで解析した結果、十二指腸マイクロバイオームでは、MAMの70％近くを占めるプロテオバクテリア（Proteobacteria）とファーミキューテス（Firmicutes）の相対存在量が高いことが示された。便中の微生物プロフィールと比較すると、十二指腸では、プロテオバクテリアが約4倍（47.9％対13.0％、p < 2.2e-16）多かったのに対し、ファーミキューテスは有意に減少していた（25.6％対33.4％、p = 1.4e-04）。フソバクテリア（Fusobacteria）とアクチノバクテリア（Actinobacteria）の相対的な割合はMAMの8％を占め、前者は便中未検出（3.0％ vs 0.0％、p < 2.2e-16）のままであったが、後者（6.0％ vs 1.6％、p = 1.3e-09）は便中1.6％を占めるに過ぎなかった。一方、バクテロイデーテス（Bacteroidetes）属は、便微生物データの約80％を占め、十二指腸では、バクテロイデーテス属の割合は便微生物叢の3分の1（15.9％対50.1％、p < 2.2e-16）であった（補足図1a）。便と十二指腸の細菌プロファイルの間にも、クラス、目、ファミリーレベルで同様の有意差が観察された（補足図1b-d）。
次に、DESeq2を用いて、便サンプルと生検サンプル間の分類学的差異を種レベルで同定したところ（p.adj < 0.05, log2 FoldChange > 2.0）、153の分類群が2つのサンプルタイプで異なる存在量を示した（図1f）。十二指腸の群集の特徴に寄与した97属があり、上位の特徴はDelftia sp.、Granulicatella sp.、Pseudomonas sp.、Carnobacterium maltaromaticum、Serratia sp.、Granulicatella elegans、Stenotrophomonas sp.、Acinetobacter sp.、Prevotella nanceiensis、Sphingomonas sp.であった（補足表1）。一方、便中ではMegasphaera sp.、Bacteroides uniformis、Faecalibacterium prausnitzii、Ruminococcus bromii、Bifidobacterium longum、Dorea longicatena、Bacteroides thetaiotaomicron、Alistipes putredinis、Faecalibacterium sp.、Lactobacillus delbrueckiiが有意な分類群であった（補足表2）。
代謝状態の予測因子としての十二指腸粘膜関連マイクロバイオーム
次に、Bray-Curtisを用いて便サンプルと十二指腸サンプル間の微生物の不均一性を調べたところ、十二指腸の細菌組成は便サンプルのそれよりも個人差が大きいことがわかった（0.68 vs 0.57, p = 1.3e-11）（図2a）。次に、観察されたβ多様性のばらつきが、血糖値と関連しているのか、あるいは血糖値とは無関係なのかを調べた。多変量解析（PERMANOVA）を行ったところ、高血糖群と正常血糖群の間で、十二指腸サンプルの細菌組成全体（R2＝2.35、p＝0.055）およびコア（R2＝3.6、p＝0.027）に差が認められた。対照的に、便サンプルの微生物プロファイルは研究グループ間で差がなかった（全体：R2＝1.98、p＝0.318、コア：R2＝1.75、p＝0.527）。これらの所見をより良く解釈するために、群内分散（p = 0.172）も計算したところ、PERMANOVAの結果とは無関係であった。したがって、高血糖群と正常血糖群の十二指腸検体における細菌の差は、群内で観察された差よりも有意に大きかった（図2b）。
図2
図2
高血糖における十二指腸マイクロバイオームの変動（a）便サンプルと十二指腸サンプル間のBray-Curtis内距離の比較を描いた箱ひげ図。(b) PERMANOVA分析の分散プロット。(c）高血糖群と正常血糖群における生検サンプルと便サンプル間のファーミキューテス／バクテロイデーテス比の比較。 d）十二指腸サンプルにおける高血糖群と正常血糖群間のα多様性（Observed richnessとShannon Diversity）の比較を示すボックスプロット。
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上記のデータから、生検のマイクロバイオームが血糖値の状態を見分けるのに適していることが示唆されたので、次に、腸内プロフィールの変化を決定する重要な因子であるファーミキューテス（Firmicutes）とバクテロイデーテス（Bacteroidetes）の比率（F/B）を計算した。F/B比は2つの研究グループ間で差がなかったが（補足図2）、高血糖者（1.43対0.58、p = 1.5e-08）および正常血糖者（1.57対0.63、p = 1.7e-06）の便と比較すると、十二指腸生検では有意に高かった（図2c）。また、多様性指標を測定したところ、正常血糖値と比較して高血糖者では、十二指腸細菌の豊富性（p = 0.085）と十二指腸細菌の多様性（p = 0.099）がわずかに高かったが、これは統計学的に有意ではなかった（図2d）。一方、便中マイクロバイオームでは、2群間で群集の豊富さ（p = 0.456）および多様性（p = 0.173）に差は認められなかった（補足図3）。
高血糖における十二指腸細菌負荷と細菌プロファイル
上記の所見に基づき、さらに定量的に微生物の変化を探るために、q-PCRを用いて高血糖者における総細菌数を評価した。その結果、高血糖者の十二指腸では、正常血糖者よりも高細菌量（103個/ng DNA以上）の有病率が有意に高いことが示された［33人中18人（54.5％）対21人中3人（14.3％）、p = 0.008］（図3a）。
図3
図3
高血糖と十二指腸細菌量およびプロファイルの関連性（a）正常血糖と比較した高血糖被験者の十二指腸細菌数のドットプロット。(b)十二指腸細菌量の少ない群と多い群における血糖値マーカー（HbA1c、FPG、PPG）のレベルを示す棒グラフ。(c)高血糖被験者と正常血糖被験者でDESeq2を用いて得られた十二指腸細菌叢の豊富な特徴の違いを、目、科、属種レベルで示したヒストグラム。
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われわれの知見を検証するために、細菌負荷が高い患者と低い患者でHbA1c、FPG、PPGレベルを調査した。細菌量の多い患者では、HbA1cが高値（6.3％ vs. 5.45％、p = 0.023）、FPGが高値（114 mg/dl vs. 102 mg/dl、p = 0.055）、PPGが高値（213 mg/dl vs. 121 mg/dl、p = 0.002）であった（図3b）。
次に、DESeq2解析を用いて、血糖値と関連する特定の十二指腸の変化を同定しようとしたところ、20種の異なる菌種が同定された。これらのうち7種は高血糖者に多く、残りの13種は正常血糖者の十二指腸に豊富であり、変化倍率（FC）は様々であった。特に、高血糖者では、Akkermansia muciniphila（FC=23.587、p.adj=1.5E-11）のような有益な細菌の存在量が23倍減少していた。この微生物の変化は、Acinetobacter haemolyticus（FC = 30, p.adj = 8.38E-27）やEscherichia/Shigella_NA（FC = 30, p = 2.63E-18）の30倍増加といった病原性種の濃縮によって悪化した。 63E-18）、Dolosigranulum pigrum（FC＝18.138、p.adj＝2.79E-08）が18倍、Streptococcus cristatus（FC＝3.830、p.adj＝0.003）が4倍近く高血糖者の十二指腸で急増した。ファミリーレベルでは、正常血糖値で濃縮された6ファミリーが存在した。すなわち、コリオバクテリウム科（FC = 24.962, p.adj = 1.96e-12）、アッカーマン科（FC = 23.842, p.adj = 1. 41E-11）、Nocardiaceae（FC = 15.173, p.adj = 6.58E-05）、Tannerellaceae（FC = 8.122, p.adj = 0.03E-02）、Caulobacteraceae（FC = 10.602, p.adj = 0.002）、Pseudonocardiaceae（FC = 4.511, p.adj = 0.038）であった。さらに、Pseudomonadales（FC＝1.721、p.adj＝0.001）、Pseudonocardiales（FC＝5.170、p.adj＝0.014）、Caulobacterales（FC＝11.640、p.adj＝0.001）などの目では、正常血糖値で高かった。高血糖者と正常血糖者の十二指腸マイクロバイオームにおいて、門やクラスレベルでの違いは認められなかった（図3c）。
高血糖における酸素供給の低下と免疫状態の変化
高血糖の十二指腸プロフィールで観察された病原性微生物の濃縮に対応して、これらの被験者の炎症状態を評価した。その結果、高血糖者は正常血糖者よりも総白血球数（TLC）が多いことがわかった（p = 0.031）。さらに、炎症解決サイトカインであるインターロイキン10（IL-10）のレベルが有意に低下していることがわかった（p = 0.015）（図4a）。高血糖者では、炎症性サイトカインである腫瘍壊死因子α（TNF-α）レベルのわずかな上昇（13.9pg/ml対11.9pg/ml、p = 0.162）が認められ、これはHbA1cと正の相関傾向を示した（rs = 0.26、p = 0.066）（図4b）。さらに、炎症状態と十二指腸細菌量の増加との関係を明らかにしたところ、TNF-αが十二指腸細菌量と正の関連を示した（rs = 0.27, p = 0.054）（図4c）。
図4
図4
高血糖における微小環境の変化 (a) 高血糖群と正常血糖群の炎症マーカー（TNF-α、IL-10、TLC）の比較を示すボックスプロット。(b）血清TNF-αレベルとHbA1cの間のスピアマン相関を示すグラフ。(c)血清TNF-αと十二指腸細菌数とのスピアマン相関を示すグラフ。(d) 高血糖群と正常血糖群の十二指腸粘膜酸素飽和度を比較したBoxplot。(e）十二指腸酸素飽和度とBMIの間のスペアマン相関を示すグラフ。
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さらに、微小環境の変化に寄与する炎症と十二指腸細菌負荷の関係を理解するために、十二指腸粘膜の酸素化と透過性を定量した。組織の酸素化はT-Statを用いて評価され、正常血糖値と比較して高血糖被験者の十二指腸粘膜の酸素飽和度は有意に低いことが示された（59.8％対63.7％、p = 0.021）（図4d）。興味深いことに、十二指腸酸素化率はBMI（rs = -0.35、p = 0.017）とも負の相関を示した（図4e）。
次に、小腸透過性が血糖値と関連しているかどうかを調べるために、血清ゾヌリン濃度を測定した21,22。その結果、正常血糖の被験者と高血糖の被験者とでは、ゾヌリンレベルに差はなかった（41.5ng/ml vs 40.3ng/ml、p = 0.830）（補足図4）。しかし、ゾヌリン濃度が高いほど十二指腸細菌量が増加する（rs＝0.36、p＝0.061）という正の傾向を示し、ゾヌリン相関は肥満度（rs＝0.65、p＝0.01E-02）、ウエスト周囲径（rs＝0.47、p＝0.009）、ヒップ周囲径（rs＝0.53、p＝0.003）といった肥満に関連するパラメータにも及んだ（補足表3）。
血糖マーカーと十二指腸代謝経路との関連
十二指腸マイクロバイオームが果たす役割をより深く理解するために、高血糖者と正常血糖者の16S十二指腸細菌プロファイルデータを用いて、Tax4Funを用いて代謝パスウェイを予測した。その結果、高血糖者と正常血糖者で代謝パスウェイに差のあるKEGGパスウェイが11個存在した（補足図5）。その結果、プリン／ピリミジン代謝と翻訳のパスウェイは、細胞のエネルギー必要量と核酸修復を制御しており、高血糖群で発現が高いことがわかった。しかし、芳香族アミノ酸生合成経路（フェニルアラニン、チロシン、トリプトファン）とTCAサイクル経路の存在量は、高血糖群で有意に減少していた（図5a）。
図5
図5
十二指腸16Sデータを用いて予測された血糖マーカーと代謝経路の変化との相関。(a）高血糖と正常血糖の間の重要な代謝経路の比較を示す箱ひげ図。x軸はサンプルの血糖値を示し、y軸は代謝経路の相対的な存在量を示す。(b）血糖マーカー（FPG：空腹時血糖、PPG：食後血糖、HbA1c：糖化ヘモグロビン）と予測代謝経路（TCA経路、AAA（芳香族アミノ酸合成）経路、プリン代謝、リボソーム）の間の有意な相関を明らかにするスピアマンの順位相関行列。上段は統計的に有意な相関係数を星印で表したもの（p≦0.05）。対角線は変数の分布を表し、下図は変数間の関係を詳細に示した散布図である。
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次に、予測された十二指腸代謝経路と血糖値マーカーとの関係を、スピアマン相関分析を用いて調べた（補足図6）。特にTCAサイクル経路は、血糖値マーカーであるHbA1c（rs = -0.42、p < 0.05）、FPG（rs = -0.34、p < 0.05）、PPG（rs = -0.35、p < 0.05）と負の相関を示した。同様に、芳香族アミノ酸の合成に関与するもう一つの重要な経路は、HbA1c（rs＝-0.38、p＜0.05）、FPG（rs＝-0.41、p＜0.05）、PPG（rs＝-0.29、p＜0.05）と好ましくない関係を示した。これらの負の関連に加えて、プリン代謝とHbA1c（rs＝0.38、p＜0.05）、FPG（rs＝0.28、p＜0.05）、PPG（rs＝0.37、p＜0. 05）であった（図5b）。これは、翻訳に関連する経路、HbA1c（rs＝0.31、p＜0.05）、FPG（rs＝0.30、p＜0.05）、PPG（rs＝0.29、p＜0.05）にも及んでいた（図5b）。
考察
過去20年間にわたり、便は入手が容易で細菌量も多いことから、腸内マイクロバイオーム研究において注目されるサンプルとなってきた。この分野が発展するにつれて、便を腸全体の代用品として使用することの限界が明らかになってきた。便は、小腸上部に存在する、量は少ないが代謝活性の高い微生物を捉えることができない。これらの微生物は栄養吸収システムに関与しており、代謝による健康リスクを理解する上で非常に重要である。発展途上国では、衛生状態や衛生状態といった修正可能な有害環境因子が、遺伝的リスクよりも大きな役割を果たす可能性があるため、上部腸内細菌叢と潜在的な腸内細菌叢異常を明確に研究することが重要である。しかし、インド人集団における上部腸内細菌叢の系統的研究は行われていない。この横断研究では、十二指腸MAMと微小環境を調べ、高血糖との関連を検討した。また、ペアになった十二指腸マイクロバイオームと便マイクロバイオームの差異についても解析を行った。
予想されたように、便と十二指腸の微生物プロファイルの間には、以前に見られたような明確な分離があった23。十二指腸生検では、正常血糖値群24でもプロテオバクテリア（Proteobacteria）、バクテロイデーテス（Bacteroidetes）が主要な門を占め、便微生物叢ではファーミキューテス（Firmicutes）が支配的であった。一方、十二指腸におけるファーミキューテスの構成は便とは異なり、主にカルノバクテリウム科、バチルス科、アシダミンコッカス科であった（補足図7）。十二指腸サンプルの属レベルの分類では、Delftia sp.、Granulicatella sp.、Pseudomonas sp.、Carnobacterium maltaromaticum、Serratia sp.、Granulicatella elegans、Stenotrophomonas sp.、Acinetobacter sp、 一方、便検体にはMegasphaera sp.、Bacteroides uniformis、Faecalibacterium prausnitzii、Ruminococcus bromii、Bifidobacterium longum、Dorea longicatena、Bacteroides thetaiotaomicron、Alistipes putredinis、Faecalibacterium sp.、Lactobacillus delbrueckiiが多く含まれていた。このデータから、便サンプルからは近位上部腸内細菌叢の近似値は得られないことが示唆された。我々の知見の多くは、十二指腸の管腔細菌と粘膜細菌を分析し、粘膜の多様性が独自の微生物シグネチャーを伴ってより高いことが示されたLiら25の結果と一致している。
我々は、十二指腸の微生物叢は便の微生物叢よりも、宿主の代謝の健康状態を理解する上で臨床的により適切である可能性があることを発見した。高血糖被験者と正常血糖被験者のHbA1c値の有意差は1.3％と小さいにもかかわらず、便では差が検出されなかったのに対し、十二指腸粘膜細菌プロファイルでは識別シグナルが検出された。十二指腸では、コリオバクテリウム科とアッカーマンシア科が、高血糖者に比べて正常血糖者で有意に多く検出された。これらの細菌ファミリーは、それぞれ胆汁酸26の変換と酸プール27の維持に関与しており、どちらもグルコース代謝を制御する微生物駆動型メカニズムの重要な一部である。さらに、有益な微生物の存在量の不均衡が糖尿病と関連している。アシネトバクター・ヘモリチカス28、ドロシグラヌム・ピグラム29、エシェリヒア/シゲラ属30、ストレプトコッカス・クリスタトゥスなどの日和見病原体は、正常血糖者と比較して高血糖者の十二指腸で有意に多かった。これとは逆に、Pellegriniら31の以前の報告では、T1DMは免疫学的および十二指腸微生物学的プロフィールが特異的であり、病原性微生物の有病率が低下していることが報告されている。このことは、T1DMとT2DMの病態生理が異なることを示しているのかもしれない。
このことは、正常血糖値における腸内環境と代謝の改善に関連する属が有意に豊富であったことで、さらに証明される。例えば、ラクトコッカス属は、いくつかの潜在的日和見微生物を減少させることが示されており32、アッケマンシア属は、抗炎症効果をもたらし、粘膜の構造と完全性を維持することが示されている33,34。もう1つの属はアトポビウム属で、硫化水素（H2S）産生菌35であり、血糖値の重要な決定因子37である小腸の運動性36に寄与する。
この便のプロフィールは、すでに得られているインド人の腸のデータと一致していた38。Prevotellaceae、Succinivibrionceae、Lachospiraceae、Ruminococcaceaeのファミリーは、正常血糖値と高血糖の両方で優勢であった。クラスレベルでは、Bacteroidia、Clostridiaが顕著で、Gammaproteobacteria、Actinobacteria、Negativicutesクラスもわずかに存在した。便の微生物群集はグループ間で類似していたが、十二指腸のプロフィールでは、血糖値に関連した重要な微生物の違いが認められた。これは、十二指腸と膵臓が発生学的、機能的、血管的、構造的に共通の関係にあり、グルコースのホメオスタシス39を維持するのに重要な腸-島間シグナル伝達に影響を与える可能性があるためと考えられる。
私たちは、Vagaら40の所見と同様に、粘膜微生物組成の個人間変動が大きいことを発見した。さらに、腸内細菌分布異常の特徴のひとつであるF/B比41は、高血糖と正常血糖の間で変化しなかったが、十二指腸ではより高いことが判明した。これは、疾患特異的な手がかりが、便よりも十二指腸でより高い信号強度で検出されることを示している。
ヒトの健康を調節する上部腸内微生物の可能性をよりよく理解するためには、粘膜微生物とその環境との相互作用に影響を与える因子を探求する価値がある。実際、顕著なのは、その下に存在するリンパ濾胞の集合体42による十二指腸粘膜細菌の量である。過剰な細菌は、糖尿病の病因的役割を持つ免疫活性化に関係している可能性がある43。高血糖で観察される明らかに高い十二指腸細菌負荷、および細菌負荷と炎症マーカーとの相関（rs = 0.054、p < 0.05）は、上記の観察を支持するものである。さらに、TNF-αとHbA1cとの間に正の相関がみられたことも、このような関連を裏付けた。また、インスリン感受性を高め、末梢の糖代謝に影響を及ぼすことが示されている抗炎症性IL-10レベルの低下も認められた44,45。これらの結果から、十二指腸の微小環境は炎症性であり、細菌が過剰に存在し、高血糖状態では抗炎症シグナルが減少することが示唆された。
腸内細菌の影響を受けるもう一つの重要な微小環境パラメータは腸管透過性である。本研究では、小腸透過性のマーカーである血清ゾヌリンを測定した。Asmarらの研究46では、ゾヌリン経路は、静水圧勾配を利用して微生物を水で洗い流す、自然防衛のメカニズムとして説明されている。我々のデータでは、以前の報告47で観察されたようなグループ間のゾヌリンレベルの差や、分類群との関連は見られなかった。興味深いことに、ゾヌリンレベルが高いほど、粘膜細菌量の増加と関連する傾向を示した。ゾヌリン測定のデータセットが比較的小さかったため、透過性と微生物マーカーとの関係が過小評価された可能性が高い。われわれの観察では、ゾヌリンと肥満に関連する人体計測値との間の関連について以前に取り上げられたことがあるが、われわれのデータは少なくともその検証を行うには十分であった48。
RYGB手術後の溶存酸素量の増加がプロテオバクテリア（Proteobacteria）属の増殖を促進する49。一方、微生物は粘液を分解したり、AMP産生を誘発したりすることで、粘膜環境の形成にも積極的に関与している50。我々の観察では、高血糖状態では十二指腸組織の酸素化が低下することが示された。この低下は、腸の灌流が減少したためか、あるいは酸素の局所的利用が増加したためか51、データでは区別できなかった。したがって、酸素飽和度の低下が、十二指腸における微生物プロフィールや代謝の変化の原因なのか、あるいは結果なのかという疑問は、まだ解明されていない。両群の酸素飽和度の値が、欧米の研究で報告された値よりも低いことは興味深い52。このような研究は南アジアでは初めてであることから、中低所得の熱帯諸国では細菌過剰と酸素飽和度の低下が頻繁に起こっている可能性が考えられる。今後の多施設共同研究では、この点をさらに調査する必要がある。
代謝性疾患の病因を上部腸内細菌やそれに関連する環境の乱れと関連づける臨床データはあまりない。本研究では、この関係を調査し、高血糖状態における十二指腸の代謝状態を予測した。十二指腸では、主なエネルギー源はアミノ酸であり、アミノ酸の30〜50％は門脈循環に入らない53。我々の観察によると、高血糖状態では芳香族アミノ酸（フェニルアラニン、チロシン、トリプトファン）の合成能力が低下し、宿主の生理機能に影響を及ぼす可能性があることがわかった。これらの芳香族アミノ酸からは、強力な生物学的作用を持つ低分子が誘導される。例えば、トリプトファン由来の代謝産物（トリプタミン、インドール3酢酸など）は、上皮の完全性と粘膜免疫反応の重要な調節因子である54。β細胞代謝の変化に関与するもう一つの重要な経路はTCAサイクル経路55であり、これは高血糖者の十二指腸で減少していることが判明している。高血糖状態における十二指腸局所代謝のこのような急激な変化は、微生物代謝の変化によってもたらされる可能性がある。代謝状態の変化は、グルコースのホメオスタシスを維持するために重要な、栄養感知と腸-島シグナリングの十二指腸経路を混乱させる可能性もある56。
この研究にはいくつかの重要な限界がある。第一に、正常血糖群の年齢が高血糖群より有意に低かったことである。これは、加齢に伴って高血糖の有病率が増加することに起因している可能性がある。年齢の影響を考慮するため、小腸マイクロバイオーム研究57で以前に報告されたように、DESeq2を用いてデータを解析する際に年齢変数を調整した。第二に、この研究は限られた被験者数で行われたため、データから関連性の方向性を結論づけることはできなかった。第三に、ゾヌリンレベルは小腸透過性を表し、十二指腸だけに特異的ではなく空腸にも存在するため、十二指腸マイクロバイオームと直接関連付けることはできない。第四に、この研究は横断的なものであり、一時点での腸内細菌組成を捉えている。
この研究の長所を定義する要因は複数ある。第一に、先行する多くの十二指腸マイクロバイオーム研究とは異なり、マイクロバイオームと並行して微小環境変数（酸素化、透過性、炎症）を含めたことである。第二に、DNA抽出の際にネガティブコントロールを使用したことで、低バイオマス生検サンプルはコンタミネーションが起こりやすいため、本研究の結果にさらなる信頼性を与えることができた。第三に、糖尿病患者だけに限定することなく高血糖を分析し、糖尿病につながる可能性のある疾患関連微生物の初期変化を研究したこと、そして最も重要なことは、登録患者について十二指腸と便の細菌プロファイルのペア評価を行ったことである。
結論として、十二指腸粘膜関連微生物叢プロファイルの変動は、血糖値と関連を示した。定量的なアプローチを取り入れた小腸粘膜関連微生物叢の評価は、健康決定因子としてより深く検討する価値がある。小腸細菌集団の組成変化を理解することは、特にヒトの栄養の文脈において、またヒトの健康と疾患との将来的な関連性を見出すために重要な研究分野である。
材料と方法
研究対象者
この横断研究では、1975年のヘルシンキ宣言のガイドラインに従って2018-19年にインフォームドコンセントを得た後、69名の被験者を募集した。本研究は、インド医学研究評議会のガイドラインである「インドにおける臨床研究のための適正実施（Good Practices for Clinical Research in India）」に準拠して実施した。本研究はPGIMERの倫理委員会の承認を得た（IEC番号：PGI/IEC/2018/000237、日付：2018/12/03）。研究参加者全員から書面によるインフォームドコンセントを得た。
組み入れ基準には、GI症状、貧血だけでなく、セリアック病やGI出血を除外するための標準的なスクリーニングの一環として上部GI内視鏡検査を受けた成人被験者（18～64歳）を含めた。妊娠中、授乳中、セリアック病、大腸癌、胃腸（GI）出血のある被験者は除外された。過去6〜8週間に抗生物質の服用歴がある者、十二指腸/便のペアサンプルがない者、シーケンシング深度が低い者（2000未満）を除外し、最終的にペアサンプルのある54名を解析対象とした。血液パラメータ；空腹時血糖（FPG；mg/dl）、食後血糖（PPG；mg/dl）、糖化ヘモグロビン（HbA1c；％）に基づいて、FPG＞100mg/dl、HbA1c≧5.7％の被験者を高血糖、FPG≦100mg/dl、HbA1c＜5.7％の被験者を正常血糖と分類した58。全体として、33人が高血糖、21人が正常血糖であった。表1に示すように、各群の年齢と臨床的特徴には統計学的に有意な差があり、BMIは不変であった。
表1 研究対象者の人口統計学的および臨床的特徴。
フルサイズの表
臨床サンプルのDNA抽出と配列決定
D2領域からの十二指腸生検は、Olympus内視鏡GIF-HQ190を用いて内視鏡的に行った。生検は微生物分析用にRNAlaterに、組織検査用に10％ホルマリンに採取した。便サンプルはポリプロピレン製容器に採取し、防腐剤なしで-80℃で保存した。血液サンプルは無添加の赤色キャップ付きバキュテーナーで採取し、血清を得た。便および生検検体からのDNA抽出は、それぞれQiagen Stool Mini kitおよびDNeasy Blood and Tissue kitを用い、ビーズビーティング59の工程を追加して行った。DNA抽出の各バッチで陰性対照を維持した。ライブラリー調製のために、16S rRNAのV3-V4領域を選択し、MiSeqプラットフォーム（V3、600サイクル、Illumina）でIlluminaが承認した16s rRNAマーカー遺伝子調査60のプロトコールに従ってペアエンドシーケンスを行った。最終ライブラリーは4 nMのTrisバッファーを用いて再構成した。ライブラリーのローディング濃度は8 pM、PhiXは15-20%であった。
シーケンス解析
DADA2パイプライン61を使用し、生配列を以下のパラメータでフィルターした; maxEE = c(2,3), trunclen = c(275,220), trimleft = c(17,21), maxN = 0, truncQ = 2, rm.phix = T, 残りのステップの設定はデフォルト。次に、2つの十二指腸と便の各実行から得られたアンプリコン配列バリアント（ASV）テーブルを結合し、SILVAデータベース（リリース132）を使用して分類学を割り当てた。その後、Neighbor joining法を用いて構築した系統樹を含むphyloseqオブジェクトを、キメラ除去後に "decontam "パッケージを用いて除染した。decontamには、頻度ベースと有病率ベースの2つのアプローチがある。便には頻度法と有病率法を併用し、バイオマスの少ない十二指腸サンプルには有病率法を推奨した。サンプル間で3回以上出現し、5％以上の有病率を示した分類群を総マイクロバイオーム解析に含め、50％以上の有病率を示した分類群をコア微生物解析に用いた。
計算と統計解析
統計解析にはRを使用し、データの可視化にはggplot2、ggpubrパッケージを使用した。分布に基づき、臨床パラメータは四分位範囲[Q1-Q3]付き中央値または平均値（標準偏差）で表した。十二指腸および便サンプルにおいて、異なる分類学的レベルで最も割合の高い上位10分類群を表すヒストグラムを作成した。13,188ASV/サンプルの希薄深度において、アルファ多様性指標（Observed SpeciesおよびShannon Diversity）を算出した。一対の定量サンプルを比較するために、ノンパラメトリックのウィルコクソン符号順位検定を適用した。β多様性については、希薄化対象をヘリンジャー変換し、主座標分析（PCoA）を用いてグループ化パターンを発見した。veganパッケージ62のadonis関数を用いた並べ替え分散分析（PERMANOVA）により、群集構造のばらつきを評価した。サンプル間のBray Curtis測定値は、microbiomeパッケージを使用して計算した。門レベルでの相対存在量を用いて、便および生検サンプルにおけるファーミキューテス/バクテロイデーテス比を算出した。
DESeq2パッケージを用い、未変換の種レベルのphyloseqオブジェクトについて、便サンプルと生検サンプル間の存在量の差分解析を行った。また、便および十二指腸サンプルの血糖値に関する分類学的レベルの異なる特徴を見つけるために、高血糖と正常血糖の間でも存在量の差分解析を行った。年齢およびシーケンスバッチの影響は必要に応じて調整し、p＜0.05を統計的に有意とみなした。
細菌量の定量
組換えプラスミド（pRS315ベクターにクローニングされた大腸菌の全長16S rRNA遺伝子）の一連の10倍希釈液を使用して標準曲線を作成した。ユニバーサル 16S プライマーである eubF (GTGSTGCAYGGYTGTCGTCA) および eubR (ACGTCRTCCMCACCTTCCTC)63 を 15 ng の鋳型とともに Roche LightCycler 480 で反応させた。増幅条件は、95℃で3分、95℃で15秒、60℃で20秒のサイクルを40回繰り返した。小腸内細菌過剰増殖の判定に以前推奨された正規化103菌のカットオフ値64を用いて、高血糖と正常血糖の細菌数データを「高細菌負荷」と「低細菌負荷」に分類し、Yates補正を加えたカイ二乗検定を用いて比較した。さらに、HbA1c、FPG、PPGの値を「高細菌負荷」群と「低細菌負荷」群で比較した。
炎症マーカーの測定
インターフェロン-γ、インターロイキン-1β、腫瘍壊死因子-α、インターロイキン-8、インターロイキン-4、インターロイキン-5、およびインターロイキン-10の濃度を測定するために、MILLIPLEX MAP Human Cytokine/Chemokine HCYTOMAG-60 K-8 Panelを用いてLuminexアッセイを行った。xPONENT 3.1（Luminex corp.）というソフトウェアを用いてデータを調べ、炎症マーカーのレベルを2つの研究グループ間で比較した。これらの因子と人体計測値、血糖値マーカー、細菌負荷量との関係をSpearman相関検定により調べた。
腸管灌流と透過性の測定
十二指腸粘膜酸素飽和度（D2）の測定には、FDA認可のT-Stat（Spectros）を用いた。技術的な問題から、粘膜酸素飽和度を測定できたのは47例のみであった（高血糖29例、正常血糖18例）。ヒヨスチンブチルブロミド（ブスコパン-10mg/ml）を1回投与して蠕動運動を抑制した後、複数回の測定を行い、1人当たり3回の測定値の平均値を解析に用いた。血清ゾヌリンを用いた腸管透過性アッセイはELISAキット（Immundiagnostik AG, Bensheim, Germany）を用いて行った65。ゾヌリンの測定には、内視鏡検査前の血清サンプルのみを使用した（高血糖16例、正常血糖12例）。ゾヌリンと人体計測値および細菌負荷量との関連を調べるために、スペアマン相関検定が用いられた。
代謝経路の予測
十二指腸細菌の代謝能力を予測するために、16S配列データに基づき、"themetagenomics "パッケージのTax4Fun（t4f.） 分類学的アバンダンスをマッピングし、KEGGオルソログ（https://www.genome.jp/kegg/ko.html）を用いて機能的内容をアノテーションした。サンプルは（サンプル間で予測されたパスウェイの相対的な存在量を比較するために）全体的な機能的存在量で正規化され、予測された機能的プロファイルは16Sコピー数の変動で調整された。シーケンスのバッチ効果と未使用の分類単位の割合の変動（参照データベースでヒットしない）を調整した線形回帰モデルを用いて、血糖値と関連するパスウェイを検索した。データのサブセットはpsychパッケージを用いて相関グラフとしてプロットし、データ全体はpheatmapパッケージを用いてヒートマップとして表現した。
データの利用可能性
生配列と関連するメタデータはNCBIの公開リポジトリ[Bio project- PRJNA793189, Study ID: SRP352925]に登録されている。
略号
T2DM：
2型糖尿病
MAM：
粘膜関連微生物叢
DMR
十二指腸粘膜表面置換術
ASVs：
アンプリコン配列変異
IL-10
インターロイキン10
TNF-α：
腫瘍壊死因子α
TLC
総白血球数
F/B比：
ファーミキューテス/バクテロイデーテス比
FPG
空腹時血糖値
PPG
食後血糖値
HbA1c
糖化ヘモグロビン
GI
胃腸
IS：
インスリン感受性
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資金提供
本研究は、DBT（NER-BPMC）-プロジェクトコードの支援を受けた： (BT/PR25611/NER/95/1265/2017).
著者情報
著者および所属
CSIR- Institute of Genomics and Integrative Biology、ニューデリー、インド
アーティー・ダラ、ヴァンダナ・シン、アヌラグ・アグラワル
科学革新研究アカデミー（AcSIR）、ガジアバード、201002、インド
Aarti Darra、Vandana Singh & Anurag Agrawal
インド、160012、チャンディーガル、セクター12、医学教育・研究大学院大学、消化器科
Anuraag Jena、Priyanka Popli、Anupam Kumar Singh、Vishal Sharma、Usha Dutta
インド、チャンディーガル医学教育研究大学院組織病理学部門
リタンブラ・ナダ
インド・チャンディーガル医学教育研究大学院放射線診断科
パンカジ・グプタ
インド・チャンディーガル医学教育研究大学院内分泌科
サンジャイ・クマール・バダ
インド・チャンディーガル医学教育研究大学院核医学科
アニッシュ・バッタチャリヤ
筆者
Usha Duttaまで。
倫理申告
競合利益
著者らは、競合する利益はないと宣言している。
追加情報
出版社からのコメント
シュプリンガー・ネイチャーは、出版された地図の管轄権の主張および所属機関に関して中立を保っている。
補足情報
補足情報。
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この記事の引用
Darra、A.、Singh、V.、Jena、A.ら、高血糖は十二指腸dysbiosisと変化した十二指腸微小環境と関連している。Sci Rep 13, 11038 (2023). https://doi.org/10.1038/s41598-023-37720-x
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受理
2022年7月27日
受理
2023年6月26日
出版
2023年07月07日
DOI
https://doi.org/10.1038/s41598-023-37720-x
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サイエンティフィック・リポーツ（Sci Rep） ISSN 2045-2322（オンライン）
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