ヒト腸内マイコバイオームの腸型

2023年8月14日 20:03

発行：2023年8月11日
ヒト腸内マイコバイオームの腸型

https://microbiomejournal.biomedcentral.com/articles/10.1186/s40168-023-01586-y

ライ・セニン, ヤン・ヤン, ...ザオ・シンミン著者を表示する
マイクロバイオーム第11巻、論文番号：179（2023）この記事を引用する

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指標詳細

概要
背景
マイコバイオームとも呼ばれるヒト腸内細菌叢の真菌構成要素は、腸内生態系とヒトの健康に重要な役割を果たしている。しかしながら、腸内マイコバイオームの全体的な構造や真菌組成の個体間変動については、依然として不明な点が多い。本研究では、中国から新たにプロファイリングした572検体を含む、3大陸にまたがる16のコホートから合計3363検体の真菌配列決定検体を収集した。

結果
16のコホートから得られた3363検体のITSプロファイリングを用いて、4つの菌叢腸型を同定し、その特徴を明らかにした。これらの菌糸型は、集団や地理的な場所によって安定性を示し、細菌の菌糸型と有意な相関を示した。特に、真菌のエンテロタイプには強い年齢選好性があり、カンジダが優勢なエンテロタイプ（すなわち、Can_typeエンテロタイプ）は、高齢者集団で濃縮され、腸管バリアの障害に関連する複数の疾患のリスク上昇をもたらすことがわかった。さらに、双方向性媒介解析により、Can_type腸型に関連する真菌が寄与する好気呼吸経路が、腸管バリアの低下と加齢との関連を媒介する可能性が明らかになった。

結論
ヒトの腸内マイコバイオームは、個人間で安定した組成パターンを有しており、疾患や宿主の年齢など、複数の宿主因子と有意に相関していることが示された。

ビデオ要約

背景
ヒトの腸内細菌叢は、原核生物、ウイルス、原生生物、真菌類などの多領域の微生物から構成されており、ヒトの健康にとって不可欠である[1]。現在の研究では、主に腸内生態系の原核生物とウイルス成分に焦点が当てられている[2,3,4]。しかし、他の種類の微生物、特に真菌類とヒトの健康との複雑な関連は、ほとんど解明されていない。真菌類はマイコバイオームとも呼ばれ、ヒトの腸内細菌叢全体の1％にも満たないが [5]、疾患の発症に関与し、宿主の免疫系に大きな影響を与えることが示されている [6, 7]。例えば、カンジダ・アルビカンスは免疫力の低下したヒト宿主に感染症を引き起こす可能性があり [8]、腸内マイコバイオーム組成の変化は複数のヒト疾患において報告されている [9, 10]。特定の表現型に関連する微細な真菌分類学的マーカーが報告されているが [9, 11, 12]、腸内マイコバイオームの全体構造や真菌組成の個体間変動については不明な点が多い。

ヒトの腸内微生物の特徴を要約するために提唱されている腸内細菌型は、集団を層別化し、腸内細菌組成の個体間変動の全体像を概観するのに有効である [13, 14]。複数の研究により、宿主の年齢、地理、性別の分布に依存しない腸内細菌型が一貫して同定されている [13,14,15,16] 。原核生物の構成パターンに基づいて定義された腸内細菌型は、ヒトの健康に関する理解を深め、介入を促進する可能性がある [17] 。ヒトの腸内に存在する多種多様な微生物群の不可欠な一部として、真菌類は腸内の原核微生物群と、相互作用、共生、競合といったさまざまなタイプの相互作用を通じて、マイクロハビタットを共有している [18] 。注目すべきことに、ヒトの腸内におけるいくつかの真菌と細菌の相乗的相互作用が、ヒトの疾患と関連していることが報告されている。例えば、Hoarauら[19]は、クローン病の患者において、カンジダ・トロピカシスと2つの細菌種（セラチア・マセッセンスと大腸菌）の間に正の菌界間相関があることを発見した。これら3菌種間の物理的相互作用により強固なバイオフィルムが形成され、これが宿主の組織障害を引き起こし、特異的な免疫反応を引き起こす可能性がある [20] 。したがって、ヒトの腸内における真菌と細菌の相互作用は、腸内微生物群集の生態系を形成する上で重要な役割を果たしている [18, 21]。しかしながら、ヒト腸内マイコバイオームのランドスケープや、ヒト腸内に真菌腸型様構造が存在するかどうかは不明である。

本研究では、ヨーロッパ、北米、アジアの16のコホートから3,363の真菌配列決定サンプルを収集した。4つの真菌腸型が、コホートや地域とは無関係に同定され、細菌腸型と密接に相関していた。我々は、宿主の表現型（年齢や疾患を含む）が真菌の腸型に強く影響していることに気づいた。特に、カンジダ（Can_type）腸内細菌型は、高齢者集団で濃縮され、年齢による影響を超えて、複数の疾患を有する患者において高い有病率を示し、重篤な腸管バリア障害と関連していた。さらに、Can_typeに富む好気呼吸経路が、腸管バリアの低下と加齢との関連を媒介した。全体として、我々の発見は、腸内マイコバイオームの高度に構造化された性質と、ヒトの健康に対するその臨床的関連性を明らかにした。

研究結果
ヒト腸内マイコバイオームの組成と多様性のランドスケープ
ヒトの腸内真菌の多様性と構成を明らかにするために、15件の発表されたプロジェクトから内部転写スペーサー（ITS）配列データを収集した（補足表S1）[12,22,23,24,25,26,27,28,29,30]。さらに、17歳から89歳の中国人参加者572人（Chinese Gut Mycobiome cohort、CHGM）を募集し、ITS1配列決定で糞便マイコバイオームをプロファイリングした。3大陸（ヨーロッパ、北米、アジア）をカバーする16のコホートから、ITS1-（960サンプル、以下ITS1-結合）またはITS2-（2403サンプル、以下ITS2-結合）のシーケンスデータを持つ糞便サンプル3363件を本研究に組み入れた（図1a）。

図1
図1
a 研究集団と関連する真菌腸内型の地理的分布（データセットがITS1またはITS2バーコードで配列決定されている場合） b 3大陸（北米、ヨーロッパ、アジア）における属レベルの腸内マイコバイオーム構成 c 異なる研究集団からの配列決定サンプル数に応じた検出属数の累積曲線 d 研究集団間の真菌シャノン多様性の分布。e, Zuoら[22]のコホートにおける細菌のシャノン指数と真菌のシャノン指数との相関。

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組み合わされたデータセット（3363サンプル）には、合計1,120の属レベルの分類群が含まれ、354の真菌が少なくとも10サンプルに存在し、ほとんどのコホートの配列決定深度は、腸内マイコバイオームの多様性を捕捉するのに十分であった（図S2）。サンプルの希少化解析により、ドイツ（Andreaら[28]）および中国（CHGM）の集団で検出された属の数は、サンプル数が増加するにつれて劇的に増加し、我々のCHGMコホートで検出された真菌属の数は、他のコホートのものをはるかに上回っていることに気づいた（図1c、図S1b）。しかしながら、すべてのデータセットを組み合わせても、真菌属の数は推定飽和レベルを大幅に下回っており（図S1c）、包括的な腸内真菌の多様性を明らかにするためには、サンプル数をさらに増やす必要があることが示唆された。属レベルでは、Saccharomyces属とCandida属が全サンプルで最も多く、次いでPenicillium属とAspergillus属であった（図1b）。これらの属は、皮膚、肺、口腔など、ヒトの他の部位でも最も一般的な常在菌であり[31, 32]、ヒトとバランスのとれた共生関係にある可能性を示している。

腸内マイコバイオーム組成と真菌多様性はコホート間で有意に異なっており、これは部分的に地理的要因や配列決定方法などの生物学的・技術的要因に起因している可能性がある（図1b-d、図S1a-d、図S3-4）。Permutational MANOVA分析によると、地理的位置は腸内マイコバイオーム組成の約3％の分散を説明することができ（p < 0.001, R2 = 0.03, PERMANOVA）、大陸によって特定の真菌分類群の存在量が異なることが観察された。具体的には、ヨーロッパの集団のマイコバイオームでは、サッカロマイセスとペニシリウムが増加し、カンジダが減少していたのに対し、アジアの集団のマイコバイオームでは、カンジダが比較的多く、サッカロマイセスが少なかった。北米の個体群では、カンジダが比較的多く、サッカロマイセスが少なかった（ウィルコクソン順位和検定でp＜0.05；図S1a、図S4）。さらに、真菌の多様性は地理的な場所によっても異なり（Kruskal-Wallis検定でp < 0.05；図S1d）、ヨーロッパの集団は他の大陸の集団に比べて真菌の多様性が相対的に低いことがわかった。これらの結果から、ヒトの腸内真菌叢の組成は、腸内細菌叢における以前の知見と同様に、地理的な場所によって大きく異なることが示された [33]。さらに、ITS1シーケンスに基づくサンプルでは、ITS2シーケンスに基づくサンプルと比較して高い多様性が観察された（図S1c）。真菌の分類群のかなりの割合（〜38%）がITS1またはITS2のいずれかに固有であり、約45%の真菌属が両方の方法で検出された（図1d）。

腸内真菌叢はバクテリオームと比較して、シャノン多様性は有意に低かったが、個体間の非類似性は高かった（ウィルコクソン順位和検定でp < 0.05；図S1e）。この観察は、腸内細菌叢と比較して、腸内真菌叢は多様性は低いが、より個体特異的であることを示した先行研究と一致している[24, 34]。さらに、マイコバイオームとバクテリオームのデータセットを一致させた研究間で、菌類群集と細菌群集のペアワイズ非類似度の間に正の相関が見られたが弱かった（p < 1e - 08, Spearmanのr: 0.12-0.16;図S1f）。また、2つの群集のα多様性指数の間に有意な正の相関が見られた（p < 5.5e - 05, Spearmanのr = 0.39; 図1e; 補足表S3）。これらの結果は、腸内における2つの王国の相互作用の可能性を示唆している。

ヒト腸内真菌叢の腸型タイプ
ヒト腸内真菌叢の全体的な構造および組成パターンを調べるため、3363検体の属レベルの真菌組成を異なるグループ、すなわち腸型に層別化した（「材料と方法」のセクション）。クラスタリング解析の結果、ITS1とITS2を合わせたデータセットが4つの異なるクラスターを形成することが明らかになった（図2a, b, 図S5a）。また、異なる分類レベルでもクラスタリングを行ったところ、同様の結果が得られた。例えば、科レベルの腸型は属レベルの腸型と非常に一致した（調整rand index > 0.5, 図S5e; 補足注参照）が、他の分類レベルでは最適なクラスタリング数が変化する可能性があった（図S4f）。さらに、無作為にダウンサンプリングしたデータセットで腸型分析を繰り返し、データセットからサンプルを除去した場合の全体的なクラスタリング挙動への影響を評価した。腸型クラスタリングの結果は、サンプルの半分を除去しても変わらず（図S5b、c；補足注参照）、真菌の腸型クラスタの頑健性がさらに示された。これらの真菌腸型のうち3つがITS1-およびITS2-シーケンスの両方のデータセットで見つかり、それぞれSaccharomyces属（主にS. cerevisiae）、Candida属（主にC. albicans）、Aspergillus属が最も多かった（図S6a）。そこで、Saccharomyces属が支配的な腸型をSacc_type、Candida属とAspergillus属が支配的な腸型をそれぞれCan_typeとAsp_typeと定義した。これら3つの腸型に加え、ITS1とITS2の両方で第4の腸型も観察された（図2a）。しかし、ITS1における第4の腸型は分類されていない子嚢菌門（Ascomycota.sp、ITS1サンプルの15.1%に存在）に支配されていたのに対し、ITS2では分類されていない子嚢菌目（Saccharomycetales.sp、ITS2サンプルの5.5%に存在）に支配されていた。第4腸型についてITS1とITS2でこのような違いが見られたのは、ITS1とITS2でアンプリコンターゲットされた領域が異なるためと考えられ[35]、Ascomycota.spとSaccharomycetales.spがそれぞれITS1とITS2のシーケンスデータセットで濃縮されていることがわかった（ウィルコクソン順位和検定でp < 0.05、図S7）。ITS1とITS2を合わせたデータセットを階層的にクラスタリングした結果、これら2つの腸型はグループ化できることが示され、これら2つの腸型は類似した構造を持っていることが示唆された（図S5d）。したがって、以下では4番目の腸型をAsc_typeと定義する。

図2
図2
a ITS1およびITS2データセットにおける真菌腸内型のクラスタリング結果と主座標分析（PCoA）による可視化。クラスター間距離の中央値（黒線）と比較した各クラスター内のサンプル間距離を各パネルの右下に示す。b ITS2配列データセットで学習した4腸型分類器をITS1配列データセットの腸型予測に適用し、対応するAUC（Area Under the Receiver Operating Characteristic Curve）値を示した。「c 異なるコホート間での腸型に関連する真菌属の一致度と濃縮傾向を示し、log(FC)はそれぞれの腸型内の属の平均相対存在量の対数変換したフォールド変化を他の属の相対存在量と比較して示す。プレースホルダーの付いた分類群名は、既知の分類群に自信を持って割り当てることができなかったことを意味する。アスタリスクは多重検定補正片側ウィルコクソン順位和検定の統計的有意性を示す（*補正後 p < 0.05, **補正後 p < 0.01, ***補正後 p < 0.001）。 d CHGMコホートにおける真菌腸型と細菌腸型の相関。色はO/E比（観察された数と予想された数の比）を反映し、アスタリスクは各対の比較についてフィッシャーの正確検定の統計的有意性を表す： *p < 0.05、**p < 0.01

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さらに、LASSOロジスティック回帰モデルを用いて、ITS1とITS2を合わせたデータセット間のクロスデータセット検証分析を行い、エンテロタイプの頑健性を確認した（「材料と方法」のセクション）。最初の例では、このモデルの高い予測精度（図2b、図S8）が、真菌の腸型が頑健であることを裏付けていた。また、これらのエンテロタイプのドライバー属が存在しない場合にも、クロスバリデーションで良好な結果が得られ、エンテロタイプが主要なドライバー属に依存せず、菌類群集全体の構造を特徴づける能力を持つことが明らかになった（図2b、図S8）。さらに、腸型特異的な真菌属の濃縮傾向が一貫していることから、異なるコホートの真菌腸型は、真菌組成のパターンが類似していることが示された（図2c）。

次に、真菌腸内細菌の地理的・生態学的特徴を調べた。ITS1：p=4.67e-14、オッズ比：0.20；ITS2：p=3.92e-09、オッズ比：0. 44; Fisherの正確検定）、一方、Sacc_type腸型は北米の集団では比較的まれであった（ITS1: p < 2.2e - 16, オッズ比: 0.04; ITS2: p = 1.8e - 02, オッズ比: 0.67; Fisherの正確検定）。この差は、ヨーロッパの個体群ではCandidaが、北米の個体群ではSaccharomycesが有意に減少していることに一部起因していると考えられる（ウィルコクソン順位和検定でp < 0.05、図S1a）。さらに、Sacc_typeとCan_typeはともに多様性が最も低く（ウィルコクソン順位和検定でp < 0.05、図S6b）、真菌アルファ多様性指標とそれぞれのドライバー属の存在量の間には強い逆相関が見られた（p < 2.2e - 16、ピアソンのr < - 0.3）。

さらに、CHGMコホートでは両方のデータが利用可能であったため、真菌プロファイリングにはITS1を、細菌プロファイリングにはメタゲノミクスデータを用い、真菌と細菌の腸型間の関係を調べた（「材料と方法」のセクションを参照）。属レベルのメタゲノミクスデータを用いて、真菌の腸内細菌型と同じ手順に従って同定された4つの細菌腸内細菌型（図S9）は、それぞれバクテロイデス（Bacteroides）に支配されていた（2つの細菌腸内細菌型で20.2％と37. 4％）、Prevotella属（prok_bac_E3腸型では42.5％、特にP. copri属）、腸内細菌科（prok_bac_E4では34.9％）であった。このような観察結果は、アジアの集団で以前に報告されたものと一致していた [15, 36]。さらに、真菌と細菌の腸型には有意な相関が認められた（p = 9.6e = 03, χ
2 = 21.8、カイ二乗検定；図2d）。例えば、Can_type真菌腸型はprok_bac_E1腸型に濃縮され（p = 3.6e - 03、オッズ比：2.41、Fisherの正確検定）、prok_bac_E3腸型では枯渇した（p = 0.024、オッズ比：0.49、Fisherの正確検定）。また、Asp_typeの腸型はprok_bac_E2の腸型で濃縮される傾向を示し、Asc_typeの腸型はprok_bac_E4の腸型で濃縮された（p = 0.05、オッズ比 = 1.56、Fisherの正確検定）。他の研究からの一貫した結果（p = 3.4e - 07, χ
2 = 40.6、カイ二乗検定；図S10）、このような証拠は、真菌群集と細菌群集の間に有意な相関があることを示唆した。

年齢が真菌の腸内タイプに大きな影響
次に、真菌の腸内型と宿主の基本的特徴（年齢、性別、BMIなど）との関連を調べた。我々は、CHGMコホート、Limonら[12]、Zuoら[22]を含む、年齢メタデータが利用可能な4つのコホートのうち3つにおいて、年齢がヒト腸内マイコバイオームの個人間変動を有意に説明し、真菌の腸内型に強く影響していることに気づいた（p < 0.05, R2 0.04-0.15, PERMANOVA; 図3a, 補足表S4）。他の2つのコホート（Gaoら[23]およびLimonら[12]）における真菌腸型に対する年齢の影響が小さいのは、サンプルサイズが小さい（Gaoら[23]のコホートでは31サンプルのみ）か、真菌腸型の構成が単調である（Limonら[12]のコホートではサンプルの72％がAsc_type腸型に割り当てられている）ためと考えられる。図3aに示すように、Can_type（38.8％）とAsc_type（34.0％）は高齢者（60歳以上）で有意に濃縮され、Sacc_type（37.3％）とAsp_type（44.9％）は若年者（30歳未満、p＜0.05、オッズ比＞1、Fisherの正確検定）で有意に濃縮された。さらに、真菌のシャノン多様性と年代との間に有意な逆相関が観察された（p = 3.34e - 08、ピアソンのr = - 0.19）。さらに、これら4つのコホートの健康な参加者531人を対象とした多変量線形回帰分析では、性別とコホートの潜在的交絡効果を調整することにより、21の加齢関連真菌属が同定された（図3b；「材料と方法」のセクション）。注目すべきことに、9つの加齢関連真菌属が、3つの真菌腸型間で存在量分布が異なることが観察された（補足表S5）。これらの属のうち、Can_typeのドライバー属の1つであるCandida属は、年齢と正の相関を示した（p = 4.0e - 06, β
= 4.0e - 03）、他の2属、Saccharomyces（p = 1.6e - 06, β
β = 4.0e - 06、β = 4.0e - 03）であった。
β = - 1.9e - 03）は逆傾向を示した。この観察は、それぞれの真菌腸型の年齢分布傾向と一致していた（図3a）。したがって、真菌類腸型と年齢との関連は、少なくとも部分的にはそれぞれの優占菌属によってもたらされていると考えられた。どのコホートにおいても、真菌腸型とBMIや性別との有意な関連は認められなかった（補足表S4）。

図3
図3
a 中国の2つのコホートにおける真菌腸内細菌型の年齢分布と、腸内細菌型間の年齢差に関するWilcoxon順位和検定のp値（左2パネル）。右のパネルは、この2つのコホートにおける若年（18-30歳）、中年（31-60歳）、老年（> -60歳）の各年齢群における真菌腸型の割合をそれぞれ示し、アスタリスクは多重検定補正フィッシャーの正確検定の統計的有意性を示す（*補正p < 0.05、**補正p < 0.01、***補正p < 0.001）。 05であり、赤い棒は正の相関を、青い棒は負の相関を示す。 c 年齢データが入手可能な4つのコホート（CHGMコホート、Gaoら[23]、Limonら[12]、Zuoら[22]）について、各真菌腸型についてLOESS平滑化後の腸老化指数（GAI）と年齢との相関。Sacc_type：p＝2.1e-03、Pearsonのr＝0.30；Can_type：p＝8.4e-10、Pearsonのr＝0.45；Asp_type：p＜3.0e-06、Pearsonのr＝0.36；Asc_type：p＝1.3e-02、Pearsonのr＝0.27．ウィルコクソン順位和検定のp値は箱ひげ図の上に表示されている。

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利用可能な年齢メタデータがない他のコホートにおける真菌腸型と年齢との関連をさらに示すために、年齢に関連する21の真菌属に基づいて各サンプルの腸老化指数（GAI）を算出した。GAIは、腸内マイクロバイオーム健康指数（GMHI）[37]を定義する考え方と同様に、年齢陽性関連真菌属と年齢陰性関連真菌属のバランスを定量化することで定義され、GAIスコアが高いほど腸内老化のレベルが高いことを示す（「材料と方法」のセクション）。その結果、GAIは各腸内細菌型における参加者の年齢と強い相関を示した（Sacc_type: p = 2.1e - 03, Pearson's r = 0.30; Can_type: p = 8.4e - 10, Pearson's r = 0.45; Asp_type: p < 3.0e - 06, Pearson's r = 0.36; Asc_type: p = 1.3e - 02, Pearson's r = 0.27；図3c）。注目すべきは、Can_typeとAsc_typeの腸型の被験者は、生涯を通じて一貫してGAIスコアが高かったのに対し、Sacc_typeとAsp_typeの被験者は、相対的にGAIスコアが低かったことである（図3c）。GAIスコアと真菌の腸型との有意な関連は、年齢メタデータがない他のコホートの健常者でも同様の結果が得られ、さらに検証された（図3d）。その結果、年齢陽性の関連真菌を年齢陰性の関連真菌よりも多く含むCan_type腸内細菌型の参加者は、腸内年齢が高い傾向にあり、Sacc_type腸内細菌型の生理学的状態は若い状態を示した（図3c、d）。さらに、異なる腸内細菌型を持つ被験者のGAIスコアの分布は、真菌と細菌の腸内細菌型間の相関を支持するもう1つの証拠となった。例えば、prok_E3_bac腸型（Sacc_typeに富む）の参加者は、Sacc_typeの参加者と同様にGAIスコアが最も低かった（ウィルコクソン順位和検定でp<0.05；図S11d）。がん患者の機能的状態を評価するのに用いられる指標であるEastern Cooperative Oncology Group（ECOG）スコアとGAIスコアとの間に相関がCHGMコホート内で観察された（p = 0.04、ピアソンのr = 0.17；図S11c）。さらに、腸内細菌異常症の患者で観察されたように、対照群と比較してGAIスコアが高いことは、腸の老化に関連した病理学的変化の発生を示しているのかもしれない（ウィルコクソン順位和検定でp＜0.05；図S11e；補注）。

真菌の腸型による機能的変異
真菌類腸型の生理活性の可能性を明らかにするために、CHGMコホートにおけるペアショットガンメタゲノミクスデータに基づいて、真菌類が寄与するパスウェイをアノテーションした（「材料と方法」のセクション）。そのうち 48 種類は真菌のみが寄与しており、104 種類は細菌と真菌の両方が寄与していた（以下、真菌寄与パスウェイ）。機能的豊かさ（真菌が寄与したパスウェイの観察数）は、真菌または細菌の腸型間で変わらなかった（図 S6c）。しかし、菌類が関与するパスウェイのうち、腸型によって分布が異なるパスウェイを合計31個同定した（ウィルコクソン順位和検定で調整したp＜0.05；補足表S6）。さらに、これらのパスウェイの相対量は、14の真菌属のパスウェイとも有意に相関していた（調整後p＜0.05、ピアソンの相関；図4a；補足表S6）。Asc_type腸内細菌型では、糖質分解に関連する経路の過剰発現が観察され、糖質分解およびタンパク質分解の可能性が高まっていることが示唆された（図4a）。注目すべきことに、Sacc_typeに濃縮されたほとんどの経路は、Saccharomycesの相対的存在量と正の相関があった（図4a）。このことは、これらの生物学的経路におけるSaccharomyces属の重要な役割を示唆している。ヘム生合成に関与する2つの経路（PWY-5920とHEME-BIOSYNTHESIS-II）は、Can_型腸内細菌で濃縮され、その支配的な属、すなわちCandidaと関連していた。

図4
図4
a 異なる真菌腸型（下）と関連する真菌属（上）に濃縮された真菌経路。Log(FC)は、それぞれの真菌腸型におけるパスウェイの平均相対存在量の、他のパスウェイに対する変化を対数変換したものである。アスタリスクは、多重検定補正ピアソン相関検定（上）と多重検定補正ウィルコクソン順位和検定（下）の統計的有意性を示す： *調整後p < 0.05、**調整後p < 0.01、***調整後p < 0.001。星印は糖質分解に関与する代謝経路を示す。 b 真菌寄与経路PWY-7279と年齢の関係。 c 真菌寄与経路PWY-2723とBMIの関係。

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次に、これらの腸型関連経路と宿主の特性との関連を調べた。Can_type関連経路PWY-7279（好気呼吸）の相対的存在量と被験者の年齢との間に有意な正の相関が観察され（調整後p = 2.0e - 23、ピアソンのr = 0.45；図4b）、高齢者集団では微生物の呼吸に関与する経路の存在量が高いという以前の観察結果と一致した[38, 39]。以前に検出された加齢陽性属の1つであるParacremonium属も、好気性呼吸経路と関連していることが示された（調整後p = 2.0e - 04、ピアソンのr = 0.26；図3b、図4a）。さらに、宿主のBMIとトレハロース分解経路であるPWY-2723との間に有意な正の相関（調整後p = 5.9e - 04、ピアソンのr = 0.29；図4c）を見いだしたが、これはAsc_type腸型（図S11f）を持つ参加者のBMIレベルがわずかに高いことを説明するかもしれない。PWY-2723が濃縮されたAsc_type腸型では、エネルギー代謝に関連する生物学的経路が同様に濃縮されていた（図4a）。このように、真菌の腸型間で観察された機能的な違いは、真菌の腸型間の宿主表現型の違いを部分的に説明することができる。

Can_type腸内細菌型は疾患集団に多い
我々はさらに、真菌の腸型とヒトの疾患との関連を評価することによって、真菌の腸型の臨床的関連性を調べた。年齢を調整した上で、健常者と患者の真菌腸型構造を比較したところ、Can_type腸型は、2型糖尿病、クロストリジウム・ディフィシル感染症、アルコール性肝炎、アルツハイマー病などの疾患患者に有意に多いことがわかった（図5a、p＜0.05、オッズ比＞1、フィッシャーの正確検定）。真菌の腸型と他のヒト疾患との間に有意な相関は認められなかったが、これらの疾患の患者ではCan_type腸型の有病率が高いという同様の傾向が観察された（図5a、オッズ比＞1）。対照的に、他の2つの腸型（すなわち、Sacc_typeとAsp_type）は、2つのウイルス性感染症（H1N1とCOVID-19；図5a）でSacc_typeが濃厚であったことを除いて、主に健康な参加者で濃厚であった（図5a；オッズ比＜1）。真菌類腸型間の疾患関連をさらに定量化するために、以前に記載されたように腸内マイクロバイオーム健康指数（GMHI）を計算した[37]。予想通り、Can_typeの腸内細菌型の参加者はGMHI値が最も低く（図5b）、Asp_typeとSacc_typeの腸内細菌型の参加者はGMHI値がより高かった。したがって、Can_type腸型は腸の老化を促進することに加えて、疾患リスクの上昇にも関係している可能性がある。

図5
図5
a 年齢をコントロールした後の対照群と比較したヒト疾患における真菌腸型の濃縮度；オッズ比（OR）とフィッシャーの正確検定のp値を示す。AUD：アルコール使用障害；T2D：2型糖尿病；CDI：クロストリジウム・ディフィシル感染症；ALHP：アルコール性肝炎；CD．クローン病；IBS：過敏性腸症候群；COVID-19：コロナウイルス疾患2019；AD：アルツハイマー病： b, c CHGMコホートにおける真菌腸型間の腸内細菌叢健康指数（GMHI）（b）およびヒトDNA含有量（HDC）（c）の中央値および四分位値を示すバイオリンプロット。d, e HDC（Y軸）と好気呼吸に関連する2つの経路（X軸）、すなわちPWY-7279（d）とPWY-7279（e）の相対的存在量との相関。f年代、パスウェイPWY-7279、HDCの間の媒介連関。p媒介は、1000ブートストラップによる双方向媒介分析によって推定された。

フルサイズ画像
Can_type腸型と疾患リスクとの関連に寄与する潜在的な分子メカニズムを探るため、CHGMコホートにおいてヒトDNA含有量（HDC）で示される腸管バリア機能を調べた（「材料と方法」のセクション）。HDCは腸管バリア機能低下の指標となる。先行研究では、いくつかの腸疾患患者においてHDCが有意に上昇していることが示されている[40]。我々は、Can_typeおよびAsc_typeの腸型患者の糞便中では、Sacc_typeおよびAsp_typeの腸型患者の糞便中よりもHDCが有意に高いことを見出した（Wilcoxon順位和検定でp < 0.05；図5c）。この所見は、これらの腸型のGAIスコア（図3c）と一致していた。従って、腸管バリア機能が低下していることが、Can_型における疾患リスクの上昇を説明するのに役立っているのかもしれない。さらに、HDCと好気呼吸に関与する2つの真菌寄与経路との間にも有意な相関が観察された（調整p＜0.05、spearmanのr＞0.3；図5d、e）。これらの結果は、腸管バリアーの低下（したがってHDCの増加）、腸の老化、および真菌の腸内タイプの分布と生理活性ポテンシャルの間に有意な関係があることを強く示している。さらに、2つの変数と媒介変数との間の相互関係を調べることができる統計的手法である双方向媒介分析を用いて、好気性呼吸経路が加齢による腸管バリアへの影響の媒介因子として機能するかどうかを調べた。図5fに示すように、加齢は好気性呼吸経路の存在量に影響を与えることでHDC上昇に寄与している可能性があることがわかった（69％、pmediation < 1e - 04；図5f）。つまり、好気性呼吸レベルの上昇は、加齢と腸管バリア機能低下の関係を有意に媒介することがわかった。

考察
我々は、年齢、真菌の腸内タイプ、疾患リスクの間に注目すべき関連を発見した。真菌の多様性は年齢が高くなるにつれて減少し、これは以前の研究で報告された腸内原核微生物叢と同様の傾向であった［39, 41］。多様性の低下は一般に腸内細菌異常症を示すが、一方で種の多様性が高い腸内生態系は外部環境の干渉に対してより耐性がある可能性がある [37, 42]。これらの知見と一致し、疾患リスクが高いCan_type腸内細菌型は、真菌の多様性が最も低く、外的擾乱に対してより脆弱であった。したがって、加齢に伴う多様性の低下は、腸内生態系における恒常性の漸進的な喪失を反映しているのかもしれない。さらに、非健康な参加者ではGAIスコアが上昇しており、加齢に関連する真菌属が病因に関与している可能性が示唆された。これらの知見は、腸内細菌叢における加齢に関連した悪化と疾患に関連した悪化の重複に関する以前の結論を支持するものである [43] 。共有されたマイコバイオームの変化は、虚弱や認知機能低下といった加齢に伴う障害に部分的に起因しているかもしれない。加齢に伴う病理学的変化に加えて、腸内細菌叢に大きな影響を与える食習慣、ライフスタイル、抗生物質の投与 [44, 45] も、ヒトのライフステージによって異なる [46] 。このように、加齢は複数の要因の組み合わせと関連しており、その結果、真菌の腸内タイプに影響を及ぼす。ヒトの腸内マイコバイオームとバクテリオームの両方に加齢に関連した変化が見られることから、加齢過程における腸内細菌叢の基礎的メカニズムに関する今後の研究においては、両者を組み合わせることを推奨する。

マイコバイオームとバクテリオームの間の領域間相互作用は、ヒトの腸内ではしばしば観察され、真菌の腸内タイプと宿主の生理学との間に観察される関係を媒介する可能性がある。例えば、カンジダ腸型（Can_type）に関連した炎症の増加は、カンジダ属と大腸菌やクロストリジウム・ディフィシルなどの様々な細菌性病原体との相互作用によって部分的に媒介されている可能性がある。具体的には、カンジダ属菌が産生する病原性因子は、毒素の産生を介して腸炎を誘発することが知られているこれらの細菌病原体の増殖に対する宿主の感受性を高める可能性がある [19, 47,48,49] 。さらに、S. cerevisiaeが過剰に存在することを特徴とするSacc_type腸型は、腸管バリア機能の亢進を示した。S.セレビシエは腸管バリアの完全性を保護する効果がある [50]。この効果の正確なメカニズムはまだ完全には解明されていないが、一つの可能性として、S. cerevisiaeがいくつかの乳酸菌、例えばLactococcus lactisの増殖を促進し、その乳酸菌がムチン産生を増強する乳酸を産生し、腸のタイトジャンクションの完全性を強化することが考えられる［51, 52］。真菌と細菌の双方向の相互作用、およびヒト宿主との共生関係を考慮すると、真菌と細菌の両方のコミュニティを考慮したより精緻な集団層別化は、疾患診断により効果的である可能性がある。

また、真菌の分類学的変異に起因する機能的差異は、真菌の腸内細菌型間で観察される宿主の表現型変異の別の説明となるかもしれない。注目すべきは、Can_type腸型（図4a）で濃縮されたヘム生合成に関与する2つの経路（PWY-5920とHEME-BIOSYNTHESIS-II）が、宿主に悪影響を及ぼす可能性があることである。ヘムは病原性細菌にとって重要な鉄源であり、腸粘膜を損傷する可能性があるため、大腸がん（CRC）のリスク上昇に関連している [53, 54]。興味深いことに、加齢に伴う変化は、微生物の呼吸に関与する代謝経路の増加によって明らかになった。考えられる説明のひとつは、加齢に伴う炎症によって酸素濃度が高くなると、腸内細菌叢の好気性呼吸が促進されるというものである［55］。さらに、BMI値が高いAsc_type腸内細菌型の参加者は、エネルギー代謝に関連する生物学的経路が濃縮されていた。これは、肥満者の微生物叢はエネルギー収穫能力が高まっているという以前の知見と一致している [56]。したがって、観察された真菌の腸内タイプによる機能的な違いは、宿主の表現型の変化に重要な意味を持つと考えられる。

また、本研究にはいくつかの限界があった。第一に、便サンプルから検出された真菌の多くは食物や口腔内でも一般的に検出されるため、便サンプルから検出された真菌の存在が必ずしも腸内における長期的なコロニー形成を示すとは限らない。42人を対象としたある縦断的研究では、真菌はヒトの腸内では一過性であり、長期間にわたって腸内に定着することはないと論じている [57]が、別の大規模研究では逆の結論が出ており、長期にわたって安定したいくつかの中核的な真菌分類群が同定されている [58]。腸内における真菌のコロニー形成をより明らかにするためには、ITS cDNA解析による活性真菌群集のプロファイリングが今後必要である。第二に、ここでは細菌と真菌の相互作用は調査されていない。多領域間相互作用のランドスケープは、腸内マイコバイオームの構造や宿主の生理的条件との関連性の基礎となるメカニズムに洞察を与える可能性がある。最後に、メタゲノミクスデータに基づいて腸内真菌の機能を探索した。しかし、メタゲノミクスデータは細菌が圧倒的に多いため、腸内マイコバイオームの機能プロファイリングが十分に行われていない。菌類を濃縮したメタゲノミクスシーケンスは、将来的に菌類バイオームの完全な機能プロファイリングを推測するのに役立つと考えられる。

結論
本研究では、世界11カ国にまたがる16のコホートから得られた広範なITS配列決定サンプルを用いて、ヒト腸内真菌群集構造の特徴を明らかにした。その結果、分類学的および機能的組成が異なる4つの真菌腸型が存在することが確認された。これらの腸内細菌型は、年齢や疾患と密接な関連を示し、特にカンジダを主成分とする腸内細菌型は高齢者に多く、腸管バリア機能の低下を伴うヒトの複数の疾患と関連していた。さらに、双方向媒介解析により、Can_typeに関連する真菌が寄与する好気呼吸経路が、加齢と腸管バリア機能の低下との関連を媒介する可能性があることが明らかになった。これらの知見は、真菌腸型の生物学的および臨床的意義を明らかにし、宿主と微生物の相互作用に新たな視点を提供するものである。

材料と方法
データ収集
National Center for Biotechnology Information (NCBI) sequence read archive (SRA)やChina National GeneBank database (CNGBdb)などの公開データベースから糞便サンプルのITS配列データをダウンロードした。リード数が10,000未満のサンプルは破棄された。乳児のヒト腸内マイコバイオームは不安定で違いが大きいため、乳児のサンプルは除外した。人口統計学（年齢、性別、BMI、国など）およびヒト疾患の表現型を含むメタデータも、対応する出版物またはデータベースから検索した。その結果、クロストリジウム・ディフィシル感染症（CDI）、アルコール使用障害（AUD）、コロナウイルス疾患2019（COVID-19）、2型糖尿病（T2D）、過敏性腸症候群（IBS）、アルコール性肝炎（ALHP）、クローン病（CD）、および黒色腫を含む複数のヒト疾患表現型を網羅する、11カ国から合計2791の公開サンプルを収集した。サンプル数、国、関連する疾患表現型、使用したアンプリコンターゲットを含む各プロジェクトの詳細は、補足表S1に記載した。

さらに、新たに募集した18歳から89歳までの中国人ボランティア572人（CHGMコホート）からヒト糞便サンプルを採取し、ITS1増幅法を用いて糞便マイコバイオームのプロファイリングを行った。これらのサンプルのうち74は、上海第六人民病院に登録されたアルツハイマー病（AD）患者から採取されたもので、その他のサンプルは武漢、上海、鄭州で募集された健康なボランティアから採取された。サンプル採取の1ヵ月前までに抗生物質、抗真菌薬、プロバイオティクスを服用している被験者は本研究から除外した。本研究プロトコルは、復旦大学生命科学学院人間倫理委員会（No.BE1940）および華中科技大学同済医学院倫理委員会の承認を得た。すべての被験者は、参加前にインフォームド・コンセントを行い、アンケートに回答するよう求められた。合計16コホート、3363検体からなり、ヨーロッパ（615検体）、北米（344検体）、アジア（2404検体）を含む3大陸11カ国をカバーする。

糞便サンプルからのDNA抽出
サンプル採取後、CHGMコホートの糞便サンプルは直ちにドライアイス上で保存し、5時間以内に-80 ℃の冷蔵庫に移した。製造者の指示に従って、半自動DNeasy PowerSoil HTP 96 Kit (Qiagen, 12,955-4)を用いて糞便サンプルから全DNAを抽出した。精製したDNAは1％アガロースゲルで品質チェックし、DNA濃度と純度はNanoDrop 2000 UV-vis分光光度計（Thermo Scientific, Wilmingtom, USA）で測定した。

ITS配列決定とプロセシング
CHGMコホートの菌叢は、Internal Transcribed Spacer (ITS)の配列決定によってプロファイリングされた、 ITS1超可変領域は、プライマーペアITS1F (5′-CTTGGTCATTTAGAGGAAGTAA-3′) およびITS2R (5′-GCTGCGTTCTTCATCGATGC-3′) [59] を用いて、BI GeneAmp® 9700 PCRサーモサイクラー (ABI, CA, USA) で増幅した。PCR 増幅は以下のように行った：95 ℃で 3 分間の初期変性、95 ℃で 30 秒間の変性、55 ℃で 30 秒間のアニーリング、72 ℃で 45 秒間の伸長、72 ℃で 10 分間の最終伸長を 27 サイクル行った。PCR混合物（総量20μL）は、4μLの5×FastPfuバッファー、2μLの2.5mM dNTPs、0.8μLの各プライマー（濃度5μM）、0.4μLのFastPfu DNAポリメラーゼ、および10ngの鋳型DNAを含んでいた。PCR産物を2%アガロースゲルから抽出し、AxyPrep DNA Gel Extraction Kit (Axygen Biosciences, Union City, CA, USA)を用いてメーカーの指示に従って精製し、さらにQuantus™ Fluorometer (Promega, USA)を用いて定量した。精製したアンプリコンをプールし、Illumina MiSeq PE300プラットフォーム（Illumina, San Diego, USA）でMajorbio Bio-Pharm Technology Co. Ltd.（中国、上海）の標準プロトコールに従って行った。(Ltd.（中国、上海）の標準プロトコルに従って行った。

生のITSリードをまずデマルチプレックスし、fastpバージョン0.20.0 [60]で品質フィルターをかけ、FLASHバージョン1.2.7 [61]で以下の基準でマージした： (i)300bpのリードは、50bpのスライディングウィンドウで平均品質スコアが20未満の部位で切断され、50bpより短い切断リードは破棄された。(ii)10bpより長いオーバーラップ配列のみが、そのオーバーラップ配列に従ってアセンブルされ、オーバーラップ領域の最大ミスマッチ比は0.2である。ダウンストリーム解析にはQIIME2（バージョン2019.7）を用いた[62]。品質フィルターされたITSリードは、DADA2 [63]を用いてノイズ除去され、アンプリコン配列バリアント（ASV）にクラスタリングされ、キメラ配列が同定され除去された。その後、UNITE参照データベース[64]で学習させたナイーブベイズ分類器を用いて、個々のASVの分類を行った。α

およびβ
-多様性解析は、Rパッケージ "vegan"（バージョン2.5-7）[65]および "phyloseq"（バージョン1.34.0）[66]を利用して、サンプリング深度10,000のサンプルに対して実施した。α
-多様性は、Shannon指数（サンプル内の群集の均一性と豊かさ）、Simpson指数（特徴の数と豊富さの両方を考慮した群集の多様性の質的指標）、Faithの系統的多様性（またはFaithのPD；観察された特徴の系統的関係と豊富さの両方を組み込んだ群集の多様性の質的指標）、および豊かさ（観察された特徴の数）によって推定された。10サンプル未満の真菌属は下流の解析から除外した。

メタゲノム解析と処理
CHGMコホートの糞便細菌マイクロバイオームは、Illumina HiSeq 2000プラットフォーム（Novogen、北京、中国）を用いた全ゲノムショットガンシーケンスによりプロファイリングした。DNAライブラリーは前述したように調製した[67]。生のシーケンスリードは、fastpバージョン0.20.0を使用して品質フィルターを行い、続いてBowtie2 [68]を使用してヒト参照ゲノム（hg38）にマッピングすることにより宿主由来のリードを除去した。微生物群集の分類学的組成の定量的プロファイリングは、MetaPhlAn2 [69]を用いて行った。微生物パスウェイのプロファイリングは、HUMAnN2 v2.8.1[70]を用いて、リードをUniref90[71]およびMetaCyc[72]参照データベースにマッピングすることにより行った。MetaPhlAn2とHUMAnN2のアバンダンス出力はともに相対アバンダンスに正規化された。下流の解析のために、腸内真菌の代謝経路を抽出した。10 サンプル未満の代謝経路または細菌種は、下流解析から除外した。CHGMコホート内のヒトDNAコンテンツ（HDC）の割合を推定するために、クリーンリードをbowtie2を用いてヒトリファレンスゲノムにアライメントし、クリーンリードの総数に対するマッピングリードの割合としてHDCを算出した。

16S rRNAシーケンスデータの処理
Lemoinneら[27]、Vitaliら[73]、Prochazkovaら[30]、およびZuoら[22]を含む4つのコホートで利用可能な16S rRNAシーケンスデータをNCBI SRAからダウンロードした。生の16Sリードを品質フィルターし、ASVにクラスタリングし、上記のようにQIIME2（バージョン2019.7）を用いて分類学的アノテーションを行った。ASVの分類学的アノテーションはSILVAデータベース[74]を用いて行った。α

およびβ
-多様性解析は、サンプリング深度25,000のサンプルについて実施した。10サンプル未満の細菌属は検討から除外した。

真菌腸型クラスタリング
ITS1およびITS2増幅の糞便サンプルは、細菌腸型発見[13, 14]のために以前に記述されたものと同様に、partitioning around medoid (PAM)クラスタリング法[75]を用いて真菌腸型に別々にクラスタリングした。簡単に言うと、サンプルは、属レベルで計算されたサンプル間Bray-Curtis距離に基づいて、medoid周りの分割（PAM）でクラスタにグループ分けされた。Jaccard、Kulcxynski、Jensen-Shannon距離（JSD）を含む他の3つの広く使用されている距離行列も、真菌腸型の頑健性を検証するために考慮された（図S4a）。最適なクラスター数はシルエット指数によって決定された。各腸型のドライバー属は、その腸型における相対存在量が最も高い属として決定した。

さらに、ITS1とITS2を結合した真菌データセットから別々に得られた真菌腸型の構造的類似性を検証した。具体的には、一方のデータセットをLASSOロジスティック回帰モデル[76]のトレーニングに用い、もう一方のデータセットにおける真菌の腸型を予測するために、ITS1とITS2のデータセット間でクロスデータセットバリデーションを行った。真菌類腸型が、ドライバー属の違いだけでなく、全体的な群集構造を反映しているかどうかを調べるため、ドライバー属であるCandida属、Saccharomyces属、Aspergillus属、Saccharomyces sp属、Ascomycota sp属をデータから除外し、上記のようにクロスバリデーションを再度行った。

腸老化指数
加齢に関連する21の腸内真菌属の相対存在量を用いて、腸老化指数（GAI）を算出した。疾患または18歳未満の被験者はこの解析から除外した。加齢に関連する真菌を同定するために、4つのコホート（すなわち、CHGMコホート、Gaoら[23]、Limonら[12]、およびZuoら[22]）から得られた18歳から90歳までの健康な被験者531人について多変量線形回帰分析を採用し、性別およびコホートを調整した上で、年齢と真菌属の相対存在量との関連を検討した。線形回帰検定でp値＜0.05となった真菌属を「年齢関連」とみなした。これらの年齢関連腸内真菌属を2つのセットMP
とMN
に分類した。
は年齢と正の相関を示す真菌属の集合であり、MN
. 次に、この2つの真菌属セットを計算手順（下記参照）と組み合わせて、菌叢サンプルの腸老化指数（GAI）を定義した。サンプルiのGAIは次のように定義される。

GAI=log10(RMP,i|MP|∑j∈MPxj,i/RMN,i|MN|∑j∈MNxj,i)、
ここで、RMP,i
はMP
(の豊富度（または試料iに存在するMP
の現存菌属数）を表し、｜MP｜｜は集合MPのサイズである。
は集合MP
(のサイズ（または MP
)、xj,i
は試料 i における真菌 j の相対量を表し，RMN,i
および｜MN｜についても同様である。
. GAIの計算では、MPと｜MN｜の間のバランスを定量化するために、年齢に関連する腸内真菌属の豊富さと相対存在量の両方を考慮した。
とMN
. MPとMNのセットサイズの違いにより
とMN
のセットサイズが異なるため、各サンプルについて、これら2つのセットの現存菌の割合（RMP|MP|およびRMN|MN|）を計算した。
と RMN|MN|
)を算出した。
と RMN
. その結果、GAIが高い、あるいはGAI > 0であればあるほど、1つのサンプルにおいて、加齢に関連する真菌のプロファイルが、加齢に関連する真菌のプロファイルが陰性であるよりもむしろ陽性であることを示し、したがって、腸の老化の程度が高いことを示唆する。

統計解析
すべての統計解析はRStudio内のRバージョン4.0.5を用いて行い、すべての図は "ggplot2 "パッケージバージョン3.3.5 [77]を用いて可視化した。因子（例えば、大陸、アンプリコンターゲット）によって説明される分散の定量化は、Rパッケージ "vegan "の "adonis "関数によって実装されるように、並べ替え多変量分散分析（PERMANOVA、並べ替え＝999、距離＝"bray"）を使用して計算した。α
-多様性と年齢との相関は、スピアマンの相関を用いて評価した。真菌腸型間の腸型特性（多様性など）、宿主表現型（BMI、年齢、性別、疾患など）、健康関連指標（HDC、GAI、GMHIなど）の比較は、カテゴリー変数についてはフィッシャーの正確検定またはカイ二乗検定を、連続変数についてはウィルコクソンの順位和検定を用いた。各腸型に濃縮された経路は、他の3つの腸型を1つのグループにまとめたWilcoxon順位和検定を用いて決定した。双方向媒介分析は、Rパッケージ "mediation"（バージョン4.5.0）[78]内の "mediate "関数を用いて、1000回のブートストラップサンプリング回数を用いて行い、真菌が寄与する好気呼吸経路を介した腸管バリアの低下に寄与する加齢の因果的役割を推論した。多重比較に関する分析では、多重検定を補正するためにBenjamini-Hochberg偽発見率（調整p） [79]を採用した。調整p＜0.05の結果は、特別な記述なしに有意とみなした。

データおよび資料の入手
CHGMコホートのITS1シーケンスおよびメタゲノムシーケンスの生データは、China National Center for Bioinformation (CNCB)のアクセッション番号PRJCA010668で入手可能である。）解析に使用したその他のデータセットは、対応する著者から入手可能であり、NCBIデータベースから直接ダウンロードできる（補足表S1参照）。本研究で使用したすべてのカスタムコードは、以下のGitHubリポジトリで入手可能である：https://github.com/ZhaoXM-Lab/Mycobiome_cohort_analysis。

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謝辞
該当なし。

資金提供
本研究の一部は、中国国家重点研究開発計画（No.2020YFA0712403）、中国国家自然科学基金（NSFC）（No.T2225015および61932008）、上海市科学技術専攻プロジェクト（No.2018SHZDZX01をX.M.Zに、No.2019SHZDZX02をY.Yに）の支援を受けた。

著者情報
著者および所属
中山病院神経科、復旦大学脳知能科学技術研究所、中国、上海市

頼世英・趙興明

中国科学院（CAS）分子ウイルス学・免疫学重点実験室（中国・上海市

ヤン・イェン

復旦大学生命科学学院ヒトゲノム研究所・遺伝子工学国家重点実験室（中国・上海

ヤンニ・プー＆ヤン・チェン

中国・鄭州・鄭州大学医学科学院

林淑春、邱建哥、江炳華

ドイツ・ハイデルベルグ、欧州分子生物学研究所、構造・計算生物学ユニット

マリサ・イザベル・ケラー & ピア・ボーク

文部省分子生物物理学重点実験室、湖北省バイオインフォマティクス・分子イメージング重点実験室、人工知能生物学センター、華中科技大学生命科学技術学院バイオインフォマティクス・システム生物学科、中国、湖北省武漢市

王明宇・陳偉華

マックス・デルブリュック分子医学センター（ドイツ・ベルリン

ピア・ボーク

ドイツ、ヴュルツブルク、ヴュルツブルク大学バイオセンター、バイオインフォマティクス部門

ピア・ボーク

河南師範大学生命科学学院（中国・河南省新郷市

陳偉華

中国・浙江省湖州大学附属湖州中央病院

趙興明

中国・復旦大学脳科学フロンティアセンター・計算神経科学・脳知能MOE重点実験室

趙興明

復旦大学脳科学研究所・医学神経生物学国家重点実験室（中国・上海

趙興明

国際ヒトフェノーム研究所（上海）、中国・上海

趙興明

貢献
XMZ、YZ、WHC、PBが本研究を発案し、プロジェクトを監督した。YY、YNP、SCL、JGQ、BHJがサンプリングの管理および実験の大半を行い、SYL、XMZ、YZ、WHC、PBが方法の設計と解析を行った。S.Lは原稿の第1稿を執筆した。最終原稿は著者全員が読み、承認した。

対応する著者
Peer Bork、Wei-Hua Chen、Yan ZhengまたはXing-Ming Zhaoまで。

倫理申告
倫理承認と参加同意
本研究は、復旦大学生命科学学院人間倫理委員会（BE1940号）および華中科技大学同済医学院倫理委員会（S1241号）の承認を得た。

発表の同意
該当なし。

競合利益
著者らは競合する利益はないと宣言している。

追加情報
出版社ノート
シュプリンガー・ネイチャーは、出版された地図の管轄権の主張および所属機関に関して中立を保っている。

補足情報
追加ファイル1：
図S1. ヒト腸内真菌叢の構成と多様性。a, 3大陸にわたる4つの高濃度真菌分類群の分布。b, 研究集団にわたるサンプルあたりの総リード数の分布。c, 異なるアンプリコンターゲットの配列決定サンプル数に応じた検出属数の累積曲線。e, バクテリオーム(16S)とマイコバイオーム(ITS)の属レベルでのシャノン多様性(左)とBray-Curtisペアワイズ非類似度(右)の比較。 f, 真菌Bray-Curtis距離(FBCD)と細菌Bray-Curtis距離(BBCD)の相関。グレーの斜線部分は、線形回帰の95%信頼区間を表す。箱ひげ図では、箱ひげは第1分位数から第3分位数を表し、黒い水平線は中央値を表し、ひげは四分位範囲（IQR）の1.5倍である。両側Mann-Whitney U検定のp値を示す。図S2. 異なる研究集団から得られたシーケンスリード数に応じた検出属数（真菌の豊富さ）の累積曲線。図S3. Bray-Curtis非類似度指数に基づく真菌群集組成の主座標分析（PCoA）プロット。各ポイントはサンプルを表し、データセット（a）、大陸（b）、表現型（c）で色分けされている。図S4. a,3大陸（北米、ヨーロッパ、アジア）にわたる属レベルの腸内マイコバイオーム構成。 b,3大陸にわたる4つの高濃度真菌分類群の分布。 c,ITS1-およびITS2-結合データセットにおける大陸間の真菌腸内タイプの構成。北米のLimon（2019）のデータセット（このデータセットにはSacc_type腸型が欠落している）によってもたらされるバイアスを避けるために、Limon（2019）のデータセットを除去した後、異なる大陸にわたる菌糸体組成を再調査した。図S5. a,Silhouetteスコアによって決定された各距離行列内で計算された最適クラスタリング数。 b,ITS-およびITS2-シーケンシングデータセットについて、それぞれSilhouetteスコアによって決定されたサンプリングサイズを変化させた場合の最適クラスタ数。 c,ITS1-およびITS2-シーケンシングデータセットについて、それぞれデータセットからサンプルを除去した場合の全体的なクラスタリング挙動への影響。各反復で異なるランダムサンプルを除去して100回繰り返した。d,ITS1とITS2を組み合わせたデータセットにおける階層的クラスタリング。 e,ITS1とITS2を組み合わせたデータセットにおける真菌の腸内細菌型のクラスタリング結果を、FamilyレベルとOrderレベルに基づく主座標分析によって可視化したもの。e,異なる分類学的レベルにおけるシルエットスコアによって決定された最適クラスタリング数。サンプル間Bray Curtis距離に基づいて、メドイド周辺分割（PAM）クラスタリングが採用された。図S6. a, ITS1-データセット（上）とITS2-データセット（下）内の各菌類腸型の主な寄与者の存在量。 b, ITS1-データセット（上）とITS2-データセット（下）内の菌類腸型間の菌類多様性の分布（共通のアルファ多様性指標で測定）。箱ひげ図では、箱ひげは第1分位数から第3分位数を表し、黒い水平線は中央値を、ひげは四分位範囲（IQR）の1.5倍を表す。図S7. ITS1およびITS2シーケンスデータセットにおける未分類の子嚢菌門（Ascomycota.sp）と未分類の子嚢菌目（Saccharomycetales.sp）の分布。箱ひげ図では、箱ひげは第1分位数から第3分位数を表し、黒い水平線は中央値を、ひげは四分位範囲（IQR）の1.5倍を表す。図S8. a-c、ITS1-シーケンスデータセット（a）、ITS2-シーケンスデータセット（b）、ITS1とITS2を組み合わせたデータセット（c）に対する4腸型分類器の5重クロスバリデーション結果。d-e、ITS1とITS2-シーケンスデータセットに対する4腸型分類器のクロスデータセットバリデーション結果。「ドライバなし」とは、分類器の学習時にドライバ属であるCandida属、Saccharomyces属、Aspergillus属、Saccharomycetales.sp属、Ascomycota.sp属を除いたものである。「平均」はROC曲線の微小平均を意味する。図S9. a-b,Silhouetteスコア（a）およびCH-index（b）によって決定された各距離行列内で計算された最適クラスタリング数。図S10. a,一対の16Sシーケンスデータを持つコホートにおける真菌腸型と細菌腸型の相関。色はO/E比（観察された数と予想された数の比）を表し、アスタリスクは各対の比較についてフィッシャーの正確検定の統計的有意性を表す： *p＜0.05、**p＜0.01。 b, 4つの真菌腸型におけるバクテロイデス属とプレボテラ属の分布。箱ひげ図では、箱ひげは第1分位数から第3分位数を表し、黒い水平線は中央値を表し、ひげは四分位範囲（IQR）の1.5倍である。両側Mann-Whitney U検定のp値を示す。図S11. 宿主の表現型がヒトの腸内マイコバイオームに及ぼす影響。a, 50回繰り返しで無作為にダウンサンプリングしたデータセット（年齢層別にサンプリング）の腸型クラスタリング結果。左のパネルは、それぞれのSilhouetteスコアを用いて各距離マトリックス内で計算された最適クラスター数を示し、その内側のパネルは、各繰り返しの元の腸型クラスターと比較した調整済みランドスコア（ARI）を示す。右側のパネルは、ダウンサンプリングデータセットで再クラスタ化された腸型間の年齢の分布を示す。 c, 腸老化指数（GAI）とEastern Cooperative Oncology Group（ECOG）スコアとの相関。d, 細菌腸型（E1_bac, E2_bac, E3_bac, E4_bac）間のGAIの分布。 e, 非健常者（Case）と健常者（Control）間の腸老化指数（GAI）の分布。 f, 真菌腸型間のBMI値の分布。g, ヒト腸内マイコバイオームのシャノン多様性の非健常者（Case）と健常者（Control）間の分布。 h, 中国のCHGMコホートにおける非健常者（AD）と健常者（Control）間の細菌シャノン多様性の分布。AUD：アルコール使用障害；T2D：2型糖尿病；CDI：クロストリジウム・ディフィシル感染症；IBS：過敏性腸症候群；COVID-19：コロナウイルス疾患2019；AD：アルツハイマー病：アルツハイマー病。箱ひげ図では、箱ひげは第1分位数から第3分位数を表し、黒い水平線は中央値を表し、ひげは四分位範囲（IQR）の1.5倍である。両側Mann-Whitney U検定のp値を示す。図S12. 健常人の腸型クラスタリング結果 a., ITS1-およびITS2-シーケンシング健常人データセットにおける真菌腸型のクラスタリング結果と主座標分析（PCoA）による可視化 b., ITS1-およびITS2-シーケンシング健常人データセットについて、それぞれSilhouetteスコアで決定したサンプリングサイズを変化させた場合の最適クラスタ数 c., ITS1-およびITS2-シーケンシング健常人データセットについて、健常人データセットからサンプルを除去した場合の全体的なクラスタリング挙動への影響。各反復で異なるランダムサンプルを除去して100回繰り返した。再クラスタリングの結果、様々なサンプルサイズで腸型は概ね安定にクラスタリングされ、サンプルの半分を除去しても、誤って分類されたサンプルは10%未満であった。補足表S1. 研究集団の統計的要約。補足表S2. 並べ替えMANOVAを用いた真菌群に対する各種要因の影響度。補足表S3. 腸内真菌と細菌のα多様性指標間の関連、スピアマンの係数と対応するp値を表に示した。Vitaliら（2021）の結果は、相関を計算するためのサンプルサイズが小さいため、示していない。補足表S4. Rパッケージ "vegan "内の "envfit "関数で測定した各コホート内のヒト腸内マイコバイオーム変動におけるメタデータ変数の効果量（*p < 0.05, **p < 0.01, ***p < 0.001）。補足表S5. 21の年齢関連真菌属（p値 < 0.05）。これらの属と真菌腸型との関連性のp値も示した。p値は、性別および研究を調整した重回帰によって決定された。補足表S6. 31の真菌腸型に関連する代謝経路。p値はWilcoxon-Rank Sum検定によって決定され、多重検定を補正するためにBenjamini-Hochberg偽発見率（調整p）が採用されている。Log(FC)は、他の3つの腸型に対するそれぞれの真菌腸型内の経路の対数変換された倍数変化を示す。補足。真菌類腸型のクラスタリング結果の頑健性。

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この記事の引用
Lai, S., Yan, Y., Pu, Y. et al. ヒト腸内マイコバイオームの腸内タイプ. Microbiome 11, 179 (2023). https://doi.org/10.1186/s40168-023-01586-y

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受領
2023年01月03日

受理
2023年5月31日

発行
2023年8月11日

DOI
https://doi.org/10.1186/s40168-023-01586-y

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