軽症COVID-19患者の公開cTfhクロノタイプを拡大する保存型SARS-CoV-2スパイクエピトープの同定

2022年12月7日 11:44

論文|2021年10月14日
軽症COVID-19患者の公開cTfhクロノタイプを拡大する保存型SARS-CoV-2スパイクエピトープの同定
呂秀元
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細野祐樹
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長江正道
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石塚重成
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石川恵理
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本岡大輔
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尾崎祐樹
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ニコラス・サックス
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前田裕一
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加藤康弘
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森田孝義
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新中須亮
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井上毅
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小野寺大志
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松村貴之
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新海征治
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佐藤隆
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中村翔太
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森俊介
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神田輝
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中山恵美
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塩田達生
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黒崎智宏
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武田清
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熊野古宇篤史
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荒瀬久
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中神宏典
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山下和夫
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高橋義正
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山崎翔
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著者・論文情報
J Exp Med (2021) 218 (12): e20211327.
https://doi.org/10.1084/jem.20211327
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適応免疫は、COVID-19を制御するための基本的な要素である。この過程において、濾胞性ヘルパーT（Tfh）細胞は、防御抗体の産生を仲介するCD4+ T細胞のサブセットである。しかし、Tfh細胞を活性化するSARS-CoV-2エピトープは十分に解明されていない。ここで我々は、軽度の症状から回復した患者において拡大する公的循環Tfh（cTfh）クロノタイプのTCRを同定し、結晶化させた。これらのクロータイプは、SARS-CoV-2のスパイク（S）エピトープを認識し、出現した変異型間で保存されていた。最も一般的なcTfhクロノタイプのエピトープであるS864-882は、ほとんどの健康なドナーの複数のHLAおよび活性化T細胞によって提示されており、このS領域はブースター抗原として有用なユニバーサルT細胞エピトープであることが示唆された。また、SARS-CoV-2特異的なパブリックcTfhクロノタイプは、特定の常在菌と交差反応した。本研究では、軽度の症状に関連するpublic cTfh clonotypeを活性化する保存されたSARS-CoV-2 Sエピトープを同定した。

担当：COVID-19、感染症、宿主防御
研究紹介
重症急性呼吸器症候群コロナウイルス2型（SARS-CoV-2）は、コロナウイルス感染症2019（COVID-19）を世界的に発生させた。B細胞（抗体）と細胞傷害性（CD8+）およびヘルパー（CD4+）T細胞は、身体がCOVID-19を制御しようとするプロセスである適応免疫の基本的構成要素である（Ni et al.、2020；Rydyznski Moderbacher et al.、2020）。B細胞は中和抗体を産生し、その重要なエピトープはスパイク（S）タンパク質内で決定される（Liuら、2020）；これらのエピトープは、Sタンパク質を抗原として用いる現在のワクチンの開発に貢献している（Badenら、2021；Walshら、2020；Sadoffら、2021；Voyseyら、2021；Shindeら、2021）。一方、COVID-19に対する防御免疫に寄与する主要なT細胞エピトープは、十分に特徴付けられていない。CD8+T細胞の重要性に加えて（SetteおよびCrotty、2021）、CD4+T細胞の急速な誘導は、軽度のCOVID-19症状と関連している（Pengら、2020; Tanら、2021; SetteおよびCrotty、2021）。CD4+T細胞のうち、濾胞ヘルパーT（Tfh）細胞はB細胞が保護抗体を産生するのを助け（Liuら、2013；Vinuesaら、2016；Crotty、2019）、Tfh細胞の非効率な誘導はより重症で致命的なCOVID-19と相関がある（Kanekoら、2020；Zhangら、2021；Gongら、2020）。SARS-CoV-2のTCRクロノタイプが広範囲に検討されているが（Shomuradovaら、2020；Dykemaら、2021）、COVID-19回復と関連する公的Tfhクロノタイプは、まだ報告されていない。このようなパブリッククロノタイプとその共通エピトープを同定することは、防御的T細胞免疫に不可欠なS領域を解明し、それによって新興変異体に対する将来のワクチン設計に貴重な情報を提供することになる。さらに、このようなクロノタイプの交差反応性抗原があれば、COVID-19の重症化に寄与している可能性がある。

本研究では、COVID-19患者T細胞の単一細胞ベースのペアおよびバルクTCRシークエンス（TCR-seq）と世界規模のTCRデータベースを用いて、軽症に関連する公的循環Tfh（cTfh）クロノタイプとそのS領域のエピトープを同定した。これらのエピトープは、新たに出現したSARS-CoV-2亜種間で保存されている。

研究成果
回復期のCOVID-19患者におけるSARS-CoV-2のSタンパク質特異的なcTfhクローンの同定
我々はまず、SARS-CoV-2特異的T細胞サブセットとそのクロノタイプを、単一細胞ベースのRNA-seqプラットフォームを用いて解析した。健康なドナーおよび回復期のCOVID-19患者（表S1および表S2）から分離した末梢血単核細胞（PBMC）を、不活性化ウイルス、組み換えSタンパク質、Sタンパク質由来の重複ペプチドプール（Sペプチドプール）、膜（M）およびヌクレオカプシド（N）タンパク質（MNペプチドプール）などSARS-CoV-2に由来する抗原で刺激した。活性化マーカー陽性T細胞を選別し、単細胞TCR-seqおよびRNA-seq解析により、RNA発現とともにTCR配列を解析した（図S1 A）。Uniform manifold approximation and projection（UMAP）埋め込みおよびクラスタリングにより、CD200、PDCD1、ICOS、CXCL13、CD40LG、およびCXCR5などのTfh関連遺伝子（図1、AおよびB；Crotty、2019；Schmittら、2014）、および活性化シグネチャー遺伝子を発現しているCD4+細胞からなるクラスタ（#8）を特定することができました（図S1 B）。実際、クラスター#8は、報告された遺伝子セットに基づく高いTfhスコアも示し（Meckiff et al.、2020）、cTfh細胞を含むことが示唆された（図1、CおよびD）。このクラスター内では、1,735個のTCRを同定することができた（表S3）。患者5名（Ts-002, -016, -017, -018, -020）と健常者1名（Oo-001）からなる第一陣の147個のTCRの中から、抗S抗体と中和抗体を示す患者Ts-017とTs-018に共通のTCRαβ対を持つS反応性クローンを検出した（Table S1）。Single-cell TCR-seqの細胞数を考慮すると、これらは頻度の高いTCRである可能性が高く、それぞれをTCR-017およびTCR-018と名づけた。TCR-017と-018はVα、Jα、Vβ、Jβの使用率が同じで、相補性決定領域3（CDR3）の配列はCDR3βの1アミノ酸を除いて同一だった（図1、EおよびF）。TCR-018は、患者Ts-018において、3つの異なるバーコード付クローンとして検出された（表S3）。

TCR-017と-018は、同じHLAによって制限された同一のSエピトープを認識する
TCR-017および-018の抗原特異性を調べるために、それぞれのTCRαおよびβ鎖を、NFAT-GFPレポーターを有するTCR欠損T細胞ハイブリドーマで再構成した（図1 G）。TCRトランスフェクタントを、自己APCとして同じ患者由来の形質転換B細胞の存在下で、SARS-CoV-2抗原で刺激した。TCR-017および-018を発現する細胞は、組換えSタンパク質およびSペプチドプールに反応したが、MNペプチドプールには反応しなかった（図2 A）。これは、単一細胞分析で明らかになった初期の抗原特異性と一致する（表S3）。プールされた2つの半分のSペプチド、#1 (S1-643) と#2 (S633-1273) のうち、#2プールだけが両方のTCRに反応した (図2 B)。しかし、別のSARS-CoV-2 Sペプチドプール（S304-338, 421-475, 492-519, 683-707, 741-770, 785-802, 885-1273; selected S poolと呼ぶ）はどちらのクローンも活性化しなかった（図S2 Aおよび図2 B）。これらの結果は、TCR-017および-018の抗原エピトープが、Sタンパク質の領域633-682、708-740、771-784、または803-884に位置することを示唆している（図S2 A）。

エピトープ候補の数をさらに減らすために、TCR-017と-018を制限するHLA対立遺伝子を決定した。患者Ts-017からの異種APCはTCR-018を活性化でき、またその逆も可能であり、これらのAPCが交換可能であることが示された（図S2 B）。したがって、共有のHLAクラスII対立遺伝子、DRA-DRB1＊15：01、DQA1＊01：02-DQB1＊06：02、またはDPA1＊02：02-DPB1＊05：01（表S2において赤で示す）は、この認識を制限すると考えられている。DRB115:01およびDQB106:02は連鎖不平衡にあり、互いに分離しないであろうから（Begovichら、1992）、これらのHLA対立遺伝子は、TCR-017および-018にSペプチドを提示する能力を調べるためにHEK293T細胞に個別にトランスフェクトされた。DRAおよびDRB115:01をトランスフェクトした細胞のみが、Sペプチドの存在下でこれらのTCRを活性化できた（図2 C）。NetMHC Serverソフトウェア（Reynissonら、2020）を用いて、2つのエピトープ、S828-846およびS864-882が、上記の候補S領域内でDRA-DRB115:01に対する強い結合体として予測された（図S2 A）。それらのうち、S864-882は最終的にTCR-017と-018の両方のエピトープとして同定された（図2 D）。用量反応曲線から判断すると、このペプチドに対するTCR-017と-018の相対的な親和性は同等であるように見えた(図2 E)。さらに、連続的に重なったペプチドから、S870-878 が両 TCR の最小エピトープとして決定された (Fig. 2 F)。同じHLA上の同じエピトープが類似の親和性を持つことから、TCR-017と-018は異なる患者に共有される一つのクロノタイプ、クロノタイプ-017/018として考えられている。DRB115:01との類似性から予想されるように、DRB115:02/*15:03/*15:04もこのエピトープを持ち、clonotype-017/018を活性化している（図S2 C）。

COVID-19回復患者で増殖したパブリッククローノタイプは、保存されたSエピトープを優先的に認識する
日本人の33%が共有するDRB115の高い頻度と一致し（http://hla.or.jp）、プレパンデミックな健康な日本人ドナーのバルクTCR-seqは、クロータイプ017/018のTCRαおよびβ鎖が普及していることを明らかにした（図2G）。DRB115は世界的にマイナーアレルではないため（Gonzalez-Galarzaら、2020）、様々な民族のドナーを含む健常者と回復期のCOVID-19コホートのTCRデータベースを解析したところ、ドナーの約1/5がTCRβ-017/018を持っていました（図2のH）。これらの結果は、クロノタイプ-017/018がパブリックなクロノタイプであることを示唆している。

我々のサンプルで同定された1,735個のTCRのうち855個がこれらのコホートでも検出されたので、TCR-017/018は例外的なパブリッククローノタイプではない(表S3)。その中で、健常者コホートと比較して、回収されたCOVID-19患者で有意に拡大した10のパブリックcTfhクロノタイプを同定した（図3 A、J列、アスタリスク）。注目すべきは、そのようなクロノタイプの半分が、単一細胞TCR-seqによって我々のサンプルプールの複数の患者で実際に検出され（図3 A、A列、#）、TCR-017/018は5番目に拡大したクロノタイプだった（図3 A、A列およびJ列）。

これらのクロノタイプのエピトープをより効率的に決定するために、我々は迅速なエピトープ決定プラットフォームを確立し（図S3 A）、TCR-017/018を用いて検証した（図3 B、クロノタイプ5）。このプラットフォームを用いることで、患者において拡大した追加のパブリックcTfhクロノタイプのエピトープを決定することができた(図3 B)。これらのエピトープの制限HLAは、形質転換B細胞およびHLAトランスフェクタントを用いて決定した（表S2および図S3、B-G）。同定されたエピトープはすべて、Sタンパク質の保存された三量体形成界面内の2つの主要領域に位置し、低い変異率を示した（図3 C; Singer et al., 2020,Preprint; Elbe and Buckland-Merrett, 2017）。これらの結果は、SARS-CoV-2感染時に拡大したパブリックcTfhクロノタイプがS領域内に位置するエピトープを優先的に認識し、これらの領域は出現した変種間で保存されていることを明らかにした（Emersonら, 2017; Nolanら, 2020 Preprint）。注目すべきは、これらのクロノタイプを保有するドナーの血清は、抗受容体結合ドメイン（RBD）および中和抗体に対して陽性であったことである（表S1）。

TCR-017の結晶構造から、CDR3の配列の柔軟性がSARS-CoV-2特異的なクロノタイプの公開を拡大することが明らかになった
TCR-017と-018の唯一の違いは、94位のアミノ酸である（それぞれ、Q94とP94）。この2つの残基は異なる特徴を持つので、この位置のどのアミノ酸でもエピトープ認識を可能にするのではないかと考えた。実際、D94を除く17個のアミノ酸置換のいずれもが、DRA-DRB1*15:01のS864-882エピトープに対して反応性を保持していた（図4 A）。そこで、TCR-017の結晶構造を解き、CDR3βの94位の残基はCDR3αから離れた位置にあり、抗原認識に寄与する可能性が低いことを見出した（図4のB、C）。C90、A91、S92、およびS93もCDR3αから離れた位置にあり（図4 C）、このTCRβは主にCDR3βのC末端半分を認識に用いて、多様なTCR配列変異体、あるいは他のVβ遺伝子を許している可能性を示唆している。

このCDR3β配列の柔軟性を考慮すると、拡張型クロノタイプ5の出現頻度が増加し（図4 D）、回収患者における拡張率をより正確に把握することができる。実際、図3 Aの健常者と比較して、COVID-19患者個体におけるこの拡張型クロノタイプの頻度の増加は、より顕著になった（図4 E）。また、COVID-19のコホートでは、ICU患者ではなく、集中治療室に入院していない患者において、その頻度は健常対照コホートのそれよりも有意に高かった。さらに、ICU患者よりも非ICU患者で有意に高かった（図4 E）。これらの結果から、COVID-19における本クローノタイプの拡大は軽度の症状と関連しており、したがってそのエピトープは防御免疫誘導のための抗原として機能する可能性が示唆された。

公開cTfhクローン型はHCoVsとは交差反応せず、共生細菌とは交差反応した
次に、これらのクロノタイプの交差反応性抗原について検討した。"Common cold" HCoVsは、SARS-CoV-2の交差反応例として報告されている（Grifoni et al, 2020; Mateus et al, 2020; Braun et al, 2020）。しかし、TCR-017/018は、HCoV-OC43由来のSタンパク質と反応しなかった（図S4、AおよびB）。さらに、図3で特徴付けられたSARS-CoV-2特異的公開クロノタイプはいずれもHCoVペプチドに反応しなかった（図3 B；および図S4、CおよびD）。したがって、これらのクロノタイプは、COVID-19の発生以前に存在した報告されているHCoVと交差反応を起こす可能性は低い。その代わりに、最も一般的なクローン型5であるS870-878を活性化するコアエピトープの相同性検索を行ったところ、口腔常在菌であるSelenomonas noxiaが、multidrug and toxic compound extrusion (MATE) family efflux transporterというタンパク質に同じエピトープを持っていた（図5 A）。実際、このエピトープを含む対応するペプチド（MATE241-260とMATE242-256）は、DRB1*15:01のTCR-017と-018の両方で認識された（図5 B）。

他のエピトープのうち、最も拡大したクロノタイプ2（5.9倍；表S3）のエピトープであるS753-759は、BacteroidalesおよびKlebsiella pneumoniaeなどの腸内共生微生物に含まれていた（図5 A；Atarashi et al.、2017；Sefik et al.、2015）。対応する合成ペプチドは、クロノタイプ2TCRを発現するT細胞を活性化することを確認した（図5 C）。さらに、これらのタンパク質の発現ベクターで形質転換した大腸菌は、HLA適合樹状細胞の存在下でパブリッククロノタイプを活性化でき（図5 D）、交差反応性抗原性エピトープの処理と提示が確認された。これらの観察結果は、これらの細菌がSARS-CoV-2感染に対する防御免疫に影響を与える可能性を示唆している。

S864-882は、複数のpublic cTfh clonotypeを活性化する可能性がある。
S864-882は、最も一般的なクロノタイプを活性化するエピトープである（図4 D）。このエピトープが複数のcTfhクロノタイプを活性化する能力を調べるために、DRB115ドナーのT細胞をシングルセルTCR-およびRNA-seqにかけた（図6 Aおよび表S4）。2つの基準でフィルタリングした後、S864-882に反応する104の公開cTfhクロータイプを同定した。(1)単細胞配列決定に基づいて刺激中に拡大した（全CD4+ T細胞の0.1%超）、及び(2)コホートデータベースで検出された（表S4、列P-S）。バルクTCR-seqは、104個のすべてのクロノタイプのαおよびβ鎖の両方が、S864-882刺激後に実際に拡大したことを確認した（表S4、JおよびKの欄）。これらの結果は、S864-882ペプチドが、DRB115ドナーにおいて複数の公的cTfhクローンを拡大できることを示す。これと一致して、我々は実際に、クローン型5とは異なるTCRを通して同じHLA上の同一のエピトープS864-882を認識するTfhクラスタ内の別のクローン型（表S3）を確認した（図6、B-D）；このクローン型も公開されていた（表S3、Seuratバーコード、DB2_CAAAGAGTGCGGTAA）。

回復期の患者におけるこれらのS864-882反応性クローンの存在と寿命を調べるために、非刺激末梢T細胞のバルクTCR-seqを用いて104個のクロノタイプをすべて組み立てた（図6 A、0日目）。これらの104個のクロノタイプのうち19個が、回復期の患者の末梢に存在していた（図6 E）。これらのデータは、S864-882反応性パブリックcTfhクローンのかなりの頻度が、感染後少なくとも3ヶ月間メモリープールとして維持されていたことを示唆している(Table S1)。

S864-882は複数のHLAアレルによって提示されるプロミスキャスエピトープである。
DRB115対立遺伝子は頻度が高く、世界の人口の25%に共有されている(Gonzalez-Galarza et al., 2020)。しかし、S864-882がDRB115を欠く個体によって提示されるかどうかを調べることも重要である。インシリコ解析では、77の主要なHLA対立遺伝子がS864-882に対する潜在的な結合体として予測され、世界の人口のほとんどがこのエピトープを含むペプチドを提示できることを意味する（表S5；Vita et al.、2019年）。これに伴い、ランダムに収集した健康なドナーのほとんどが、これらの予測される結合アレルのいくつかを有していた（表S6）；これは、ビオチン化エピトープの直接結合を評価することによって確認された（図S5）。実際、これらのドナーからの末梢T細胞は、S864-882に応答して活性化マーカーを発現した（図6 F）。活性化されたCD4+CXCR5+細胞の数もまた、エピトープ刺激により増加した（図6 G）。これらの結果は、S864-882が複数のHLAに提示されると複数のCD4+ T細胞を活性化するユニバーサルエピトープであり、したがってSARS-CoV-2感染においてT細胞抗原として機能するSタンパク質の重要な領域であることを示唆するものであった。

考察
本研究は、COVID-19に対する防御的T細胞応答に寄与すると考えられるSARS-CoV-2 Sタンパク質内のcTfhエピトープを同定したことを報告するものである。COVID-19の発生を受けて、最近SARS-CoV-2を認識するいくつかの公開TCRが報告されている（Shomuradovaら、2020；Dykemaら、2021）。本研究では、まず、軽度のCOVID-19症状に関連するCD4+T細胞のSARS-CoV-2特異的パブリックTCRを同定し、その結晶構造を決定した。このようなパブリックcTfhクロノタイプを持つ個体は、Sタンパク質を認識し、免疫保護のためにこの同族抗原に対する抗体の産生を誘導すると予想される（Kaneko et al., 2020; Zhang et al., 2021; Gong et al.）この見解と一致して、我々のサンプルプールでパブリックcTfhクロノタイプを発現した回復期の患者は、抗S中和抗体を有し、COVID-19から回復した（表S1）。

これらのパブリッククロータイプは多人種で広く検出されているので、特異的なプローブを開発してパブリックTfhクロータイプの頻度を正確にモニターすることは、予後予測のための新しいオプションになると思われる。S864-882は複数のHLAが提示する普遍的なエピトープであることから、SARS-CoV-2に対するTfhの防御応答を促進する抗原として期待される。

同定されたエピトープのほとんどは、非RBD領域に位置し、現在の完全長Sワクチンに含まれているため、本研究は、世界中で投与されているワクチンの分子的肯定とさらなる根拠を与える（Badenら、2021；Walshら、2020；Sadoffら、2021；Voyseyら、2021；Shindeら、2021）。これらのエピトープはSARS-CoV-2変種間で保存されているため（図3 C; Singer et al., 2020,Preprint; Elbe and Buckland-Merrett, 2017）、これらのペプチドはアルファに対するT細胞メモリを生成すると予想される。B.1.1.7（英国）、Beta: B.1.351（南アフリカ）、Gamma: P.1（ブラジル）、Delta：B.1.617.2（インド）、および中和抗体から逃れる将来の変異体（Wangら、2021；Collierら、2021；Celleら、2021）に対するT細胞メモリを生成することが期待される。ユニバーサルTエピトープS864-882は、適切な線形B細胞エピトープとの結合によりペプチドワクチンの候補となり得る（Sauerら、2021）；実際、そのような結合ペプチドはポストワクチン時代の変異体に対して「調整可能な」ブースターとなる可能性がある。さらに、本研究で確立したプラットフォームを使用して、追加のパブリッククロノタイプとそのエピトープを同定することは、T細胞抗原候補の数を拡張するための興味深い次のステップとなるであろう。さらに、交差反応性共生細菌はSARS-CoV-2特異的T細胞のプライミングに寄与している可能性があり、予後や予防に新たな視点を提供するものである。このように、SARS-CoV-2特異的T細胞のプライミングに寄与している可能性がある。さらにグローバルなメタゲノム解析により、交差反応性常在菌の存在とCOVID-19に対する抵抗性の関係が明らかになり、病気の重症度の地域・民族差の説明やこのウイルスと戦うための別のルートが提供される可能性がある。

本研究では、PBMCからT細胞を採取しているため、Tfh細胞の定義に限界がある。末梢の循環Tfh細胞は胚中心Tfh細胞を反映しているが（Locciら、2013；Hillら、2019；Heitら、2017；Schmittら、2014；Crotty、2019）、生検サンプルを用いた組織在住Tfh細胞の分析が理想的である。異なるTCR-seq法にも利点と限界がある。シングルセルTCR-seqはαβペアを決定することができるが、スループットは限られている。バルクシークエンシングはより多様なクロノタイプを検出できるが、ペア情報を得ることができない。まとめると、本研究は、シングルセルおよびバルクTCR-seq、グローバルTCRデータベース、およびTCR再構成／エピトープ決定プラットフォームを組み合わせることで、有益なパブリックヘルパー／細胞傷害性クロノタイプおよびエピトープを特定する効率的なワークフローとなることを示している。この方法論は、将来、他の感染症のアウトブレイクに強力なツールを提供する可能性がある。

材料と方法
対象者
大阪大学（承認番号898-4）および国立感染症研究所（承認番号1237）の施設審査委員会は、回復期のCOVID-19および健常者の採血プロトコルを承認した。健常者の血液サンプルを用いたKOTAIバイオテクノロジーズでの解析は、NPO法人MINSの機関審査委員会（承認番号190210）に承認された。本研究は、関連するすべてのガイドラインおよび規制を遵守して実施されました。すべての参加者、または参加者がインフォームドコンセントを提供できない場合は指定された医療代理人から、書面によるインフォームドコンセントを取得しました。研究参加基準には、疾患の重症度や性別に関係なく、20歳以上の被験者が含まれている（表S1）。この研究に参加する前に、すべてのCOVID-19ドナーは、鼻咽頭スワブ検体を用いたPCRによってSARS-CoV-2が陽性であることが確認された。回復期のCOVID-19ドナーと健康なドナーの血液は，東京品川病院と大阪大学で入手した．試料は分析前に非識別化した．PBMC調製のために，全血をヘパリンコートチューブに採取し，遠心分離して細胞画分と血漿を分離し，密度勾配沈降を行った．中和抗体測定には，患者血漿を56℃で30分間熱不活性化したものを使用した．血漿を1：5で希釈し、さらに2倍連続希釈したものを、SARS-CoV-2の組織培養感染量の中央値100を含む等量の溶液と37℃で1時間インキュベートし、VeroE6/TMPRSS2細胞に添加した。5日間培養後、細胞を100％細胞死から守った最高血漿希釈率を中和価として採った。重症度は、日本版COVID-19診療ガイドライン第2.2版（厚生労働省、2020年）に準拠し、軽度、中等度I、中等度II、重度と定義された。健康なドナーからの試料を用いた研究は、大阪大学医学部附属病院の倫理委員会の承認を得ている（承認番号20483）。包括的なインフォームドコンセントを事前に取得し、大阪ユニバーサル病院の施設審査委員会で承認された（承認番号209008-B）。残留サンプルの二次解析に関わるプロジェクトについてはインフォームドコンセントの放棄が承認されており、本研究ではオンラインによる告知で同意を得るオプトアウト方式が適用された。

SARS-CoV-2
不活化SARS-CoV-2の調製には、高崎智彦博士（神奈川県衛生研究所、日本）の好意によりSARS-CoV-2（KNG19-020）を提供された。このウイルスをVeroE6/TMPRSS2細胞（JCRB1819）で増殖させ、スクロース勾配遠心分離により精製した（Dent and Neuman, 2015）。その後、濃縮したウイルスを紫外線（0.6J/cm2）により不活性化した。

抗原について
不活性化ウイルスは、2.9×106個/mlのウイルス粒子（約1μg Sタンパク質/ml）で刺激に使用した。SARS-CoV-2 Sタンパク質の調製には、Sタンパク質のエクトドメインを哺乳類発現ベクターpCMVにクローニングし、C末端にfoldon配列と9×His-tagおよびStrep-tagを付加した。Sタンパク質の多塩基性切断部位（RRAR）を単一のアラニンに置換し、K986PおよびV987P変異を導入して、以前に記載したようにコンフォメーションを安定化した（Amanatら、2021年）。Expi293F細胞（Gibco）に一過性にトランスフェクションした後、TALON Metal Affinity Resin（Clontech）とAmicon Ultra 10K Centrifugal Filter Device（Millipore）を用いてトランスフェクションから4日後に培養上清から分泌タンパク質を精製した。SARS-CoV-2およびHCoV-OC43のSタンパク質の抗原提示のための発現は、各タンパク質のpME18S発現ベクターをHEK293T細胞にトランスフェクトした。大腸菌での菌体タンパク質の発現は、MATEファミリー排出トランスポーター、TonB依存性受容体、TonB依存性受容体プラグドメイン含有タンパク質のcDNAをpCold発現ベクターにクローニングし、大腸菌BL21 (DE3) 能力細胞、Champion21 (SMBIO Technology) に形質転換させた。0.5 または 1.0 mM イソプロピル-β-D-チオガラクトピラノシドの添加により、37°C でタンパク質の発現を誘導した。細菌ペレットを洗浄し、PBSで再懸濁した後、95℃で5分間インキュベートして不活性化した。タンパク質の発現は、SDS-PAGEとクマシーブリリアントブルー染色で確認した。プール#1および#2を含むPepMix SARS-CoV-2 (Spike Glycoprotein) は、JPT Peptide Technologies社から購入した。S、M、Nタンパク質用のPepTivator SARS-CoV-2は、Miltenyi Biotec社から購入した。図S2 Aに示すSARS-CoV-2 Sタンパク質のドメインは、以前に記載した（Wrapp et al.、2020）。その他のペプチドは全てGenScript社製である。SARS-CoV-2 Sタンパク質の三次元構造（Protein Data Bank accession no.6XR8）は、プログラムPyMOL（The PyMOL Molecular Graphics System, Version 2.0; Schrödinger, LLC）で描かれた。

PBMCのin vitro刺激
凍結保存したPBMCを解凍し、5％ヒトAB血清（Gemini Bio）、ペニシリン（Sigma）、ストレプトマイシン（MP Biomedicals）、および2-メルカプトエタノール（Nacalai Tesque）を添加したRPMI 1640培地で洗浄した。5×105個のPBMCを、不活性化SARS-CoV-2、1又は10μg／mlの組み換えSタンパク質、1μg／mlのSペプチドプール、又は1μg／mlのMNペプチドプールで同じ培地で20時間刺激し、その後、抗ヒトCD3、CD69、CD137、CD154、及びTotalSeq-C Hashtag抗体で染色をした。CD3+ゲート集団内のCD69+、CD137+、またはCD154+細胞をSH800S Cell Sorter (Sony Biotechnology) で選別し、単一細胞TCRおよびRNA-seq分析に使用した。エピトープ特異的クローン拡大のために、1-5×105個のPBMCを1μg/mlのS864-882で10日間刺激し、組換えヒトIL-2（1ng/ml、PeproTech）を4日目と7日目に添加した。CD4+T細胞を選別し、単一細胞のTCR-およびRNA-seqによって解析した。

単一細胞ベースのトランスクリプトームおよびTCRレパートリー解析
シングルセルのキャプチャーとライブラリ作成は、以下の試薬を用いて行った。シングルセルのキャプチャーとライブラリ調製は、以下の試薬を用いて行った：Chromium Next GEM Single Cell 5′ Library & Gel Bead Kit v1. 1, 16 rxns, PN-1000165; Chromium Next GEM Chip G Single Cell Kit, 48 rxns, PN-1000120; Chromium Single Cell V(D)J Enrichment Kit, Human T Cell 96 rxns, PN-1000005; Single Index Kit T Set A, 96 rxns, PN-1000213; Chromium Single Cell 5′ Feature Barcode Library Kit, 16 rxns, PN-1000080; and Single Index Kit N Set A, 96 rxns, PN-1000212を使用し、単細胞をキャプチャしました。2×104個の細胞を含む単細胞懸濁液をChromiumマイクロ流体チップにロードし、Chromium Controller（10x Genomics）を用いて単細胞ゲルビーズインエマルジョンを製造者の指示に従って生成した。その後、各サンプルのバーコード付き細胞からのRNAをVeriti Thermal Cycler (Thermo Fisher Scientific)を用いてゲルビーズインエマルジョン内で逆転写し、その後のシングルセルライブラリーの生成はすべてメーカーのプロトコルに従って行い、cDNA増幅には14サイクルを使用した。その後、TCRライブラリーのcDNA濃縮とライブラリー構築と並行して、∼50 ngのcDNAを14サイクルによる遺伝子発現ライブラリー増幅に使用した。ライブラリーのフラグメントサイズは、Agilent 2100 Bioanalyzerで確認した。ライブラリーはIllumina NovaSeq 6000でペアエンドモード（リード1、28 bp; リード2、91 bp）として配列決定された。生リードをCell Ranger 3.1.0 (10x Genomics)で処理した。遺伝子発現に基づくクラスタリングは、Seurat Rパッケージ（v3.1；Hafemeister and Satija, 2019）を用いて実施した。簡単に言うと、ミトコンドリア含量が10％を超える細胞、および200未満または4,000以上の遺伝子が検出された細胞は、外れ値（死にゆく細胞および空のドロップレットおよびダブレット、それぞれ）とみなされ、フィルターで除外された。正規化にはSeurat SCTransform関数を用い、全サンプルを同時に処理したため、バッチ効果補正を行わずにデータを統合した。ハッシュタグオリゴのdemultiplexingは、中心対数比で正規化したハッシュタグのユニーク分子識別子カウントで行い、クロノタイプはPythonスクリプトを使用して、液滴バーコードを通して遺伝子発現データとマッチングさせた。単一のハッシュタグとβ鎖クロノタイプを割り当てられた細胞のみが、下流の解析に保持された。Tfhスコア及び活性化スコアは、Tfh-enriched転写物の公開リスト（Meckiffら、2020）及び4つのよく知られた活性化遺伝子（CD69、TNFRSF9、TNFRSF4、及びCD40LG）を用いてそれぞれ生成した。計算は、RでSeuratのAddmoduleScore関数を用いて、デフォルトのパラメータを使用して行った。簡単に言うと、遺伝子リストの全遺伝子の平均発現レベルを計算し、同様の集約発現レベルビンからランダムに選択した対照遺伝子の平均発現で差し引いたものである。

バルクTCR-seqおよび解析
1〜3×105個のPBMCをQIAzol（QIAGEN）中で溶解した。その後、SMARTer技術（タカラバイオ）を用いて全長cDNAを合成し、TCRαおよびβ遺伝子の可変領域をTRAC/TRBC特異的プライマーを用いて増幅した。可変領域アンプリコンの配列決定後、MiXCRソフトウェア（Bolotin et al., 2015）を用いて、リードの各ペアをクロノタイプ（TR（A/B）VおよびTR（A/B）J遺伝子およびCDR3として定義）に割り当てた。各α/βクロノタイプについて、拡張は、そのクローンのリードの割合をα/β鎖のリードの総数で割ったものとそれぞれ定義し、プロットおよび統計解析のために割合をlog10に変換した。

HLAクラスIIタイピング
HLA class IIタイピングのために、ゲノムDNAサンプルはQIA DNA Mini Kit（QIAGEN）を用いてPBMCから分離された。AllType FASTplex NGS 11 Loci Flex Kit（One Lambda）を用いて、製造者のプロトコルに従ってDNA配列ライブラリ（DPA1、DPB1、DQA1、DQB1、DRB1、DRB3/4/5）を調製した。配列決定は、MiSeq System (Illumina) を用いて行った。DNA配列の解析には、TypeStream Visual version 2.0 (One Lambda)を使用した。DRB115:01/02タイピングのために、ゲノムDNAをDRB115/16特異的フォワードプライマー（5′-CGTTTCCTGTGGCAGCCTAAGG-3′）およびDRB1*15特異的リバースプライマー（5′-CGCGCCTGCTCCAGGAT-3′）で増幅してDNA配列を解析した。

APCs
組換えEBVは、以前に報告されたように製造した（Kanda et al.、2015）。ウイルスストックは、ウイルス含有培養上清を32,000rpmで1時間超遠心分離することにより濃縮して得た。3×105個のPBMCを、ウイルスストックのアリコートと37℃で1時間インキュベートした。感染細胞を、0.1μg/mlのシクロスポリンA（Cayman Chemical）を含む20％FBS（Capricorn Scientific GmbH）添加RPMI 1640培地で培養した。EBV不死化Bリンパ芽球系細胞株を3週間培養後に得て、APCとして使用した。特定のHLAを発現するAPCを生成するために、HEK293T細胞を、以前に記載されたようにHLAクラスII対立遺伝子をコードするプラスミドでトランスフェクトした（Jiangら、2013）。EBV実験は、文部科学省（承認番号539）および大阪大学（承認番号04658）の施設審査委員会の承認を得ている。単球由来樹状細胞を作製するために、CD14 MicroBeads, human (Miltenyi Biotec) を用いてPBMCからCD14+細胞を分離し、10% FBS, 0.1 mM Non-Essential Amino Acids Solution (Gibco), 1 mM pyruvate sodium (Gibco), 10 ng/ml human GM-CSF (PeproTech) 及び IL-4 (PeproTech) 添加RPMI1640培地で6d培養をした。

TCR 再構成と刺激
TCRαおよびβ鎖cDNA配列を合成し、レトロウイルスベクターpMX-IRES-ラットCD2およびpMX-IRES-ヒトCD8にそれぞれクローン化した。対のTCRαおよびβ鎖を含む2つのベクターを、PEI MAX（Polysciences）を用いてPhoenixパッケージング細胞に一緒にトランスフェクトした。レトロウイルスを含む上清を、NFAT-GFPレポーター遺伝子（Matsumotoら、2021）を有するマウスT細胞ハイブリドーマへの感染に使用して、TCRαβ対を再構成した。TCRβ変異体は、部位特異的変異導入により構築した。抗原刺激のために、TCR再構成細胞は、特に指示しない限り、不死化自己B細胞の存在下で刺激剤と共培養された。20時間後、T細胞の活性化はGFPまたはCD69の発現によって評価した。

迅速なエピトープ決定プラットフォーム
SARS-CoV-2のSタンパク質全長をカバーする11アミノ酸オーバーラップの15merペプチドを個別に合成し、プールしたペプチドマトリックスを作成した（GenScript）。ペプチドを12mg/mlでDMSOに溶解し、2-12個のペプチドを混合して、図S3 Aに示すように75種類のセミプールを作り、水平および垂直プールに対する細胞反応性から責任エピトープを決定することができるようにした。プールされたペプチドをDMSOで1mgの各ペプチド／mlに調整し、続いて水で10×希釈し、その溶液の1μlを対応する各ウェルに添加した。また、コントロールとして市販のSペプチドプールおよびS864-882ペプチドをロードした。交差反応性を評価するために、4つの一般的な風邪のHCoV（229E、NL63、OC43、およびHKU1）のSペプチドプールをロードした。レポーター細胞アッセイでは、T細胞とAPCを含む培地100μlをウェルに添加し、T細胞が各ペプチドで1μg/mlで刺激されるようにした。20時間後、Attune NxTフローサイトメーター（Thermo Fisher Scientific）を用いて、T細胞ゲート集団におけるGFPレポーター誘導を評価した。

HLA判定の制限
サンプルプールから2人以上のドナーで検出されたクロノタイプについては、ドナーに共通する対立遺伝子の個々のペアを発現するHEK293T細胞の存在下でレポーター細胞を刺激した。それ以外の場合、レポーター細胞は、そのクローン型のオリジナルのドナーと部分的に重複するHLAを持つ様々なドナーの形質転換B細胞の存在下で刺激された。

データベース解析
米国、イタリア、およびスペインからの様々な民族のプレパンデミック健康なドナー（n＝786、Adaptive ImmuneACCESS；Emersonら、2017）またはCOVID-19回復期ドナー（n＝1，413、Adaptive ImmuneRACE；Nolanら、2020，プレプリント）の公開レパートリーデータセットをAdaptive Biotechnologiesウェブサイトからダウンロードして、V-遺伝子名をIMGT命名法に合わせてリネイムした。最後に、社内バルクTCR-seqと同じ方法で、クロノタイプとその拡張を定義した。データセットにおけるTCRの出現率は、その拡張にかかわらず、与えられたTCRをレパートリーに含む患者の割合として定義された。展開値の比較には、両側スチューデントのt検定を使用した。観察されたTCRクロノタイプ配列の極めて高い多様性を考慮し、多重検定のための従来のP値調整は当該分野では行われておらず（Emersonら、2017）、したがってP値は特に明記しない限り非調整である。

可溶性TCRαβヘテロダイマーの発現および精製
TCRα-017（成熟タンパク質中のQ1-D207）およびTCRβ-017（G1-G241）サブユニットの細胞外ドメインをコードする発現構築物を、6×Hisタグおよびタバコエッチウイルスプロテアーゼ切断部位を含むpColdベクトルに組み込んだ。結晶化のために、点変異（αのT159CおよびβのS166C／C184A）を、以前に記載されたように人工ジスルフィド結合を形成するために導入した（Boulterら、2003）。このプラスミドを大腸菌BL21コンピテントセルChampion21およびRosetta2 (DE3; Novagen)にそれぞれ形質転換した。タンパク質の発現は、0.5 mM イソプロピル-β-D-チオガラクトピラノシドの添加により、18℃で誘導した。細胞は500 mM NaCl含有Tris-HCl緩衝液（pH 8.0）で懸濁し、超音波処理で破砕した。標的タンパク質を含む封入体を遠心分離により回収した。その後、6 M グアニジン塩酸、10 mM EDTA、2 mM ジチオスレイトールを含む 50 mM Tris-HCl バッファー (pH 8.0) により室温で包接体を可溶化した。可溶化した等量のTCRαとTCRβ（各35 mg）を混合し、5 M尿素、0.4 M L-アルギニン、5 M還元グルタチオン、0.5 M酸化グルタチオンを含む1リットルの100 mM Tris-HCl buffer (pH 8.0) で4℃において急速に希釈した。この希釈液を5 mlのニッケルニトリロ三酢酸アガロース（富士フイルム和光）に塗布し、溶出液（50 mM Tris-HCl [pH 8.0], 300 mM NaCl, 250 mM imidazole）でHisタグ付きTCRαβを溶出させた。タバコエッチウイルスプロテアーゼによるHis-tagの除去後、溶出したタンパク質を濃縮し、さらに100 mM NaClを含む20 mM Tris-HCl (pH 8.0) バッファーで平衡化したスーパーデックス75 (GE Healthcare) にアプライした。TCRαβヘテロダイマー画分は、Amicon Ultra（分子量カットオフ、10kD）により1.2mg/mlまで濃縮された。タンパク質の純度は、SDS-PAGEおよびクーマシーブリリアントブルー染色によって評価した。TCRのCDR3配列のアミノ酸の番号付けは、成熟タンパク質に基づいたものである。

TCR-017エクトドメインの結晶化、データ収集、および構造決定
結晶化の試みはすべて座位滴下気相成長法により行った。初期結晶化条件は、Index (Hampton Research), SG1 Screen, SG2 Screen (Molecular Dimensions)を用いてスクリーニングした。0.1 M Hepes-Na (pH 7.0) および 1.1 M マロン酸ナトリウムの条件下で、20℃において最良の回折結晶を得ることができた。X線回折実験の前に、結晶は20%のエチレングリコールを含むリザーバーに浸し、液体窒素で急速冷却した。X線回折データセットはPhoton FactoryのビームラインBL-1Aで収集した。回折データはXDSプログラム（Kabsch, 2010）で統合され、SCALAプログラム（Evans, 2006）でスケーリングされた。データセットの位相は、1E6 TCR（Protein Data Bank accession no. 5C0B; Cole et al., 2016）の座標で、プログラムMOLREP（Vagin and Teplyakov, 2010）を用いて分子置換法により決定した。初期位相決定後、プログラムCOOT（Emsley et al.、2010）を用いて手動でモデルビルドを行った。洗練は、初期段階ではプログラムREFMAC5 (Vagin et al., 2004)を、最終モデルではPhenix.refine (Afonine et al., 2012)を用いて行われた。最終モデルの立体化学的品質は、プログラムMolProbity（Williamsら、2018）により評価された。データ収集と精密化の統計は、表S7にまとめられている。TCRαβ-017エクトドメインの構造因子および原子座標は、アクセッション番号7EA6の下、Protein Data Bankに寄託された。全ての立体構造の図は、PyMOL (The PyMOL Molecular Graphics System, Version 2.0; Schrödinger, LLC) で描かれた。

抗体
抗ヒトCD3（HIT3a）、抗ヒトCD8（RPA-T8）、抗ヒトCD69（FN50）、抗ヒトCD137（4B4-1）、抗ヒトCD154（24-31）、抗ヒトCD4（OKT4）、抗ヒトCXCR5（J252D4）、TotalSeq-C Hashtags（LNH-94； 2M2）、抗マウスCD3（17A2）、抗マウスCD69（H1. 2F3）、および抗ラットCD2（OX-34）抗体は、BioLegendから購入した。Rat IgG2b κ Isotype Control (eB149/10H5)はeBioscience社から購入した。

統計解析
図3 Aおよび図4 Eの統計解析は、両側スチューデントのt検定で展開値を比較し、P値を示した。図6のFとGの解析は、paired t testで行い、P値を示した。

オンライン補足資料
Fig. S1は、SARS-CoV-2反応性T細胞のシングルセルベース解析のワークフローである。図S2は、クロノタイプ017/018のエピトープペプチドと制限HLAを示す。図S3は、公開されているクロノタイプのエピトープと制限HLAの同定を示す。図S4は、他のHCoVsに対するclonotype-017/018の交差反応性を示さないことを示す。Fig. S5は、S868-880エピトープが複数のHLAアレルに発現していることを示している。表S1は、ドナーの特徴を示す。表S2は、関与した献血者のHLA class IIの型を示す。表S3は、単細胞解析で同定されたcTfhのクロノタイプを示す。表S4は、S864-882反応性パブリックcTfhクロノタイプを示す。表S5は、パブリッククロータイプのエピトープを提示すると予測される日本人集団のHLA頻度を示している。表S6は、健康なドナーにおけるS864-882に対する予測される結合対立遺伝子を示す。表S7は、TCRαβ-017の結晶構造解析のデータ収集と精製の統計値を示す。

データの入手方法
組換えSARS-CoV-2 Sタンパク質、TCR再構成細胞、および可溶性TCRαβヘテロダイマーは、標準物質譲渡契約に基づいて、対応する著者から要求に応じて入手可能である。単一細胞ベースのトランスクリプトームデータは、Gene Expression Omnibus datasetsにアクセッション番号GSE184806で寄託されている。GSE184806)に寄託している。TCRαβ-017エクトドメインの構造因子と原子座標は、Protein Data Bankにアクセッション番号7EA6で寄託されている)。本研究の結論を裏付けるために必要なその他のデータは、本文およびオンライン補足資料に含まれている。

謝辞
伊藤忠男、豊永和彦、足立康史、森山聡、播磨勇夫、D. Azizah、H. Hayashi、J. Sun には実験的支援を、C. Schutt, W. Ise, J. B. Wing, D. Okuzaki, D. Standley, S. Teraguchi, S. Futami, T. Sasazuki、および T. Kobayashi にはディスカッションの機会をいただいたことに感謝している。

本研究は、日本医療研究開発機構（20fk0108542, 20fk0108403 [H. Arase], 20fk0108265, 20nk01602, 20fk0108454, 21nf0101623, 21gm0910010, 21ak0101070, 20fk0108075, 20fk0108104, 21fk0108608, および21fk0108534 [S. YAMASAKI] ）の助成により行われたものである。Yamasaki])、日本学術振興会科学研究費補助金 JP18H05279 (H. Arase) および JP20H00505 (S. Yamasaki)、関西経済連合会、三菱財団 (S. Yamasaki). 健康開発医学講座は、AnGes、ダイセル、FunPepの支援を受けた寄附講座である。

著者の貢献 S. Yamasaki が研究の構想を練り、X. Lu, Y. Hosono, S. Ishizuka, E. Ishikawa, M. Nagae, Y. Ozaki が調査を行い、R. Shinnakasu, T. Inoue, T. Onodera, T. Matsumura, M. Shinkai, T. Sato, S. Mori, T. Kanda, E.E. Nakayama, T. Shioda, T. Kurosaki, H. Araise, Y. Y. が研究資源を提供した。D. Motooka, N. Sax, Y. Maeda, Y. Kato, T. Morita, S. Nakamura, M. Nagae, K. Takeda, A. Kumanogoh, H. Nakagami, and K. Yamashita, S. Yamasaki supervised the research, and X. Lu, Y. Hosono, S. Yamasaki wrote the manuscript.

利害関係者
開示事項さらに、N. Saxは、「SARS-CoV-2ウイルスに特異的な濾胞性ヘルパーT細胞」に関する特許を出願中、「濾胞性T細胞を用いた新規医療技術」に関する特許を出願中であることを報告している。中上博史氏は、健康開発医療学科がアンジェス、ダイセル、ファンペプの支援を受けた寄附講座であることを報告した。山下紘一氏は、投稿論文以外では、KOTAI Biotechnologies, Inc.からの個人報酬を報告した。さらに、山下紘一氏は、「SARS-CoV-2ウイルスに特異的な濾胞ヘルパーT細胞」特許を出願中であり、「濾胞T細胞を用いた新規医療技術」特許を出願中であることを報告した。その他の開示情報はない。
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© 2021 Lu et al.
この記事は、出版日から最初の6ヶ月間はAttribution-Noncommercial-Share Alike-No Mirror Sitesライセンスの条件で配布されています（http://www.rupress.org/terms/ を参照）。6ヶ月以降はクリエイティブ・コモンズ・ライセンス（Attribution-Noncommercial-Share Alike 4.0 International license、https://creativecommons.org/licenses/by-nc-sa/4.0/ 参照）のもとで利用可能です。
補足データ
表S1
はドナーの特徴を示す。

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表S2
は関与した献血者のHLAクラスII型を示す。
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表S3
は、単細胞解析で同定されたcTfhクローン型。
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表S4
は、S864-882反応性パブリックcTfhクロノタイプを示す。
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表S5
は、パブリッククロータイプのエピトープを提示すると予測される日本人集団のHLA頻度である。
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表S6
健康なドナーにおけるS864-882に対する予測される結合対立遺伝子を示す。
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表S7
TCRαβ-017の結晶構造解析のデータ収集と精密化の統計データを示す。

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