ヒト腸内細菌バクテロイデスを誘導性CRISPRで「ノックダウン」すると、糖鎖利用戦略が明らかになる

2023年9月27日 17:48

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ヒト腸内細菌バクテロイデスを誘導性CRISPRで「ノックダウン」すると、糖鎖利用戦略が明らかになる

https://www.pnas.org/doi/10.1073/pnas.2311422120?utm_source=TOC&utm_medium=ealert&TOC_v120_i39=&ref=d5697564

Zachary W. Beller https://orcid.org/0000-0003-3965-9147, Darryl A. Wesener, Timothy R. Seebeck, +16, and Jeffrey I. Gordon jgordon@wustl.eduAuthors Info & Affiliations
寄稿：Jeffrey I. Gordon；2023年7月10日受領；2023年8月8日受理；査読：Laurie Comstock、Gary D. Wu
2023年9月21日
120 (39) e2311422120
https://doi.org/10.1073/pnas.2311422120
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第120巻｜第39号
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意義
ヒトの腸内細菌がどのように競争し、協力して栄養素を代謝しているかを知ることは、より栄養価の高い食品を開発し、より健康的な腸内微生物群集を促進するための重要な一歩である。ヒトの腸内バクテロイデス科細菌は、複雑な食物多糖類の主要な消費者である。ここでは、腸内細菌群集における標的生物の存在量の減少を意図的に誘導するための遺伝子システムについて述べる。ノトバイオティクスマウスにヒトの餌を与え、ゲノム配列が決定された培養ヒト腸内細菌群集（バクテロイデス科の複数種を含む）をコロニー形成させた。定着した群集内の様々なバクテロイデス属細菌を "ノックダウン "すると、他の細菌の存在量が特異的に増加し、群集全体の炭水化物代謝能力を維持しながら、利用可能な多糖類を利用する優先順位を動的に変化させる様子が明らかになった。
要旨
ヒトの腸内細菌叢の構成員がどのように栄養資源に優先順位をつけるかを理解することは、健康および疾患における微生物群集の頑健性と回復力を規定するメカニズムを解読するための、より大きな努力の一要素である。この知識は、微生物指向の治療法を開発するための基礎となる。細菌が腸内でどのように糖鎖を優先するのかをモデル化するため、無菌マウスに、糖分解性バクテロイデス科7種を含む13種のヒト腸内細菌株をコロニー形成させた。マウスにはエンドウ豆繊維を添加した西洋食を与えた。群集形成後、誘導可能なCRISPRベースのシステムを用いて、バクテロイデス・テタイオタミクロンまたはバクテロイデス・セルロシリティカスの絶対量を選択的かつ一時的に10～60倍減少させた。それぞれのノックダウンの結果、他のバクテロイデス科細菌の存在量が特異的かつ再現性よく増加し、糖鎖利用に関与する遺伝子の発現がダイナミックに変化した。これらの「代替消費者」の出現は、群集の糖分解活性の維持と関連していた。我々は、試験管内でCRISPR塩基編集を行う誘導可能なシステムを用いて、B. cellulosilyticusノックダウン応答性分類群であるPhocaeicola vulgatusにおいて、食餌性多糖の利用に重要なトランスポーターの翻訳を阻害した。得られたP. vulgatus変異体のin vitroおよびin vivo試験により、ノックダウン後のP. vulgatusの体力増強に関連するメカニズムをさらに明らかにすることができた。原理的には、このアプローチは、さまざまな栄養素の利用を研究したり、微生物群集を精密に操作する治療戦略を開発するための前臨床研究に応用することができる。
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食餌性多糖類の処理は、腸内細菌叢に "委託 "されている作業である。ヒトゲノムは97のグリコシド加水分解酵素をコードしているが、多糖リアーゼはコードしていない。一方、マイクロバイオームには何万ものこれらの遺伝子が存在し、一つの腸内細菌株が何十種類ものグリコシド加水分解酵素（GH）と多糖リアーゼ（PL）のファミリーを持つこともある（1, 2）。このような微生物の糖鎖活性酵素（CAZymes）は、単糖、グリコシド結合、分岐パターン、修飾の大きな組み合わせ空間を示す食餌性糖鎖構造を分解する役割を担っている。
ヒトの腸内細菌バクテロイデス科細菌は、食物繊維糖鎖の主要な消費者として広く知られており、腸内細菌叢における栄養資源配分に関するメカニズム的な疑問を解決する魅力的なモデルとなる。バクテロイデス科のゲノムにはCAZymesが豊富に存在し、その大部分は多糖利用遺伝子座（PULs）と呼ばれる超オペロニック遺伝子クラスターに組織化されている。PULは異なるタイプの糖鎖構造を利用する機能的単位であり、より大きな糖鎖を分解する細胞外および細胞内のCAZymes、細胞周囲の分解によって生じた糖鎖断片を結合して取り込むSusC-およびSusD-様タンパク質、そして糖鎖由来のエピトープを感知して遺伝子座を制御する転写因子をコードする(3)。原理的には、ある細菌ゲノムにコードされているCAZymesとその発現量から、その生物が利用する糖鎖を推定することができる。しかしながら、比較ゲノム解析とin vitro増殖アッセイにより、異なるバクテロイデス科細菌はしばしば多糖を利用する重複した能力を持つことが強調され、微生物群集の文脈における糖鎖配分の予測を複雑にしている(4, 5)。
最も単純なケースとして、単一の栄養資源が利用可能な場合、その栄養条件下で体力的に有利な生物が勝つと予測できるかもしれない(6)。しかし、代替的な栄養資源が豊富で、多様で潜在的に競争の激しい微生物が生息する腸内生態系では、何が起こるかはあまり明らかではない。すなわち、利用可能な栄養資源を逐次的に利用することで成長を最大化するのである(7)。Diauxieは単糖類について古典的に証明され、最近では多糖類混合物の文脈でバクテロイデス科細菌について証明された(8, 9)。このような資源利用の逐次的パターンが種間で異なる場合、あるいは生物に明確な動的利用パターン（例えば、資源の迅速な切り替え）がある場合、それぞれの単一の栄養資源では1つの生物が優勢であっても、複数の種が一緒に繁栄することがある（9, 10）。加えて、in vivoでの増殖中や混合培養におけるin vitroでの増殖中、細菌は、他の方法ではアクセスできない栄養源を近隣の細菌が異化することによって提供される「公共財」から利益を得ることがある（11, 12）。これらの考察は、ヒトの腸内微生物群集による栄養素利用の根底にあるメカニズムや、食物繊維補給食を含む臨床試験で観察される微生物叢（および宿主）の反応における個人間および個人内のばらつきの要因を明らかにしようとする際に直面する複雑さを物語っている（例えば、文献13および14）。
我々は以前、培養ヒト腸内細菌の定義されたコンソーシアムを無菌マウスに導入して糖鎖利用をモデル化した。マウスには、米国の食事習慣に関するNHANESデータベース(15)における飽和脂肪消費量の上位3分位と果物・野菜消費量の下位3分位に相当する食事を、異なる植物繊維製剤の添加の有無にかかわらず与えた。食物繊維がコンソーシアムメンバーの体力（存在量）と遺伝子発現パターンに及ぼす影響を記録することで、彼らの糖鎖利用パターンを推測することができた。全ゲノムトランスポゾン変異導入により、繊維に応答するバクテロイデス科細菌の体力を決定する鍵となる特定の遺伝子座、特にPULの構成要素が明らかになった（16, 17）。さらに、糖鎖を粒子表面に共有結合させた常磁性微小ガラスビーズを経口摂取させることで、糖鎖の利用が直接監査された(17-19)。このような「人工食品粒子」（または微生物機能活性バイオセンサー；MFAB）は、それぞれ所定の糖鎖調製物とユニークな蛍光色素「バーコード」を含み、異なる種類が同時に投与された：その後、ビーズを糞便または腸の異なる領域から（磁気によって）回収し、（FACSによって）精製し、最後に糖鎖含量の質量分析によってコミュニティーの糖分解活性を定量した（17-19）。
我々はこの方法を、後にヒトのスナック菓子のプロトタイプに組み込まれたエンドウ豆の食物繊維の研究に応用した(13)。この食物繊維調製物の主要な生理活性成分が単離された：その主成分は、小さなラムノガラクツロナン-Iペクチン断片（2-置換および2,4-置換ラムノース）および小さなガラクタンオリゴマー（4-置換ガラクトース）に結合した2-O-分岐アラビナン、さらに線状キシラン（4-置換キシロース）およびグルコース（残存デンプンの形）である(19)。培養され、ゲノム配列が決定されたヒト腸内細菌のコンソーシアムでコロニー形成されたgnotobioticマウスでの研究では、高飽和脂肪・低果実・野菜（HiSF-LoFV）食に未分画エンドウ豆繊維またはこの精製エンドウ豆繊維アラビナン画分のいずれかを加えると、コミュニティ内に存在するバクテロイデス科細菌のサブセットの存在量が選択的に増加することが示された。すなわち、B. ovatusはB. cellulosilyticusが存在するとそのアラビノキシラン処理PULを低レベルで発現し、B. cellulosilyticusが存在しないと有意に高レベルで発現するのである(17)。
このような「1つまたは複数の生物を残す」実験は、ヒト腸内細菌叢のメンバーによる栄養素の優先順位付け／利用をモデル化する方法であるが、既に確立された群集が摂動に反応する際のダイナミックな挙動を捉えることはできない。これとは対照的に、確立された決まった群集において、標的生物の存在量を意図的に減少させる（「ノックダウン」）ことで、与えられた食餌の文脈における群集適応の基礎となるメカニズムや、これらの適応が作用するタイムスケールを特徴付ける機会が得られる。このような摂動を達成するための一つのアプローチとして、ファージを用いてヒト腸内細菌を攻撃する方法がある（例えば、文献20と21）。今回の研究では、7種のバクテロイデス科細菌を含む13種のモデルヒト腸内細菌叢を確立し、B. thetaiotaomicronまたはB. cellulosilyticusのいずれかを標的とする別のアプローチを用いた。B. thetaiotaomicron株またはB. cellulosilyticus株は、誘導可能な自己標的型SpCas9からなる遺伝的に組み込まれた「キルスイッチ」を含むように操作され、細菌染色体に有害な二本鎖切断を作ることで機能した(22)。エンドウ豆繊維を添加したHiSF-LoFV飼料を摂取したマウスを用い、標的バクテロイデス株のノックダウンを誘導することが、他のコンソーシアムメンバーの絶対量に及ぼす影響を明らかにした。微生物RNA-Seqを用いて、群集メンバー内の遺伝子発現の変化を明らかにした。群集の糖分解活性は、回収されたMFABおよび糞便内容物に存在する残留糖鎖の質量分析によって測定された。さらに、我々の遺伝子システムをCas9-シチジンデアミナーゼ変異誘発（23, 24）に適応させ、B. cellulosilyticusノックダウンに対するPhocaeicola vulgatus（以前はBacteroides vulgatusとして知られていた）の反応に関連する遺伝子の翻訳を破壊するために使用した。B. cellulosilyticusのノックダウンがP. vulgatus変異体の体力と遺伝子発現パターンに及ぼす影響を経時的に調べ、これら2つの分類群と群集の他のメンバーが相互作用し、糖鎖を奪い合うメカニズムをさらに明らかにした。
結果
ノックダウン株。
複数の細菌種における研究から、Cas9ヌクレアーゼを細菌染色体を標的とするガイドRNA（gRNA）とともに発現させると、おそらく修復不可能なゲノム損傷により致死的であることが示されている（25, 26）。この殺菌活性を利用して、病原性細菌や抗生物質耐性細菌を除去する試みがなされているが（26-28）、我々は、このツールを、ヒト腸内細菌の定義されたコンソーシアムでコロニー形成されたgnotobioticマウスの標的バクテロイデスの絶対量を減少させるために適応できると考えた。はじめに」のセクションで述べたこれまでの研究から、我々はB. cellulosilyticus WH2とB. thetaiotaomicron VPI-5482をこのノックダウン実験のターゲットとした。
Cas9の誘導性発現のためにこれら2つの生物の株を構築するために、i）テトラサイクリン誘導性プロモーター（30）によって駆動されるSpCas9遺伝子、ii）構成的に発現される自己標的gRNAまたは対照スクランブルgRNA、およびiii）抗生物質選択マーカー（B. cellulosilyticus WH2またはB. thetaiotaomicron の場合はエリスロマイシン [ermG]、B. cellulosilyticus WH2 の場合はセフォキシチン [cfxA]）。遺伝子組換え株は、スクランブルgRNA（BT-M1またはBC-M1と表記）、susC様遺伝子を標的とするgRNA（BT-S#またはBC-S#）、またはtdkを標的とするgRNA（BT-T#またはBC-T#）を有していた。抗生物質活性を持たないテトラサイクリン誘導体であるアンヒドロテトラサイクリン（aTc）を含むBrain Heart Infusion（BHI）培地にプレーティングした場合、自己標的化gRNAを導入した株の生存率は、aTcを含まない培地にプレーティングした細胞に比べて103～105倍低下した（3回培養/株、P < 0.05、二元配置分散分析、Tukey's HSD、SI Appendix、Fig. S1C）。対照的に、aTcはスクランブルgRNAを含む株のコロニー形成単位（cfu）数を統計的に有意に減少させなかった。各生物について、2つの異なるセルフターゲットgRNA配列を含む2つの株を用いたテストでは、各バクテロイデス属のcfuの減少の大きさに対する異なるgRNAの効果はわずかであった（平均限界差 = 3倍[P > 0. 05]、B. thetaiotaomicron [BT-S1 vs. BT-T1]では3倍[P < 0.0001]、B. cellulosilyticus [BC-S19 vs. BC-S6]では14倍[P < 0.0001]であった（二元配置分散分析、Tukey HSD; SI Appendix, Fig. S1C）。
図1.

B. cellulosilyticusとB. thetaiotaomicronのノックダウン。(A）ヒト腸内細菌コンソーシアムとCRISPRノックダウンカセットの図。ノックダウン株は、aTc誘導性SpCas9遺伝子と構成的に発現するgRNAを含むpNBU2ベースのベクターを組み込むことによって構築された。(B）B.cellulosilyticusノックダウンの実験デザイン。胚フリーマウスにHiSF-LoFV食を4日間与え、B. cellulosilyticus野生株（WT）またはノックダウン変異株（BC-S19）を含む13メンバーのコンソーシアムをコロニー形成させた。経口投与後、マウスは10%(w/w)のエンドウ豆繊維(PEF)を添加したHiSF-LoFV飼料を単回的に自由摂取させ、dpg 4から8まで飲料水にaTcまたはエタノールを添加した。連続的に採取した糞便サンプルにおいて、指定された群集メンバーの絶対量を定義した。平均値±SDを示す（n＝5～10マウス／処理群）。(C) B. thetaiotaomicronノックダウンの実験デザイン。マウスは、野生型（WT）またはノックダウン変異株（BT-T1）を含む13メンバーの細菌コンソーシアムでコロニー形成された。示された群集メンバーの絶対量を示す（平均±SD；n＝5～10／処置群）。
液体LYBHI培地における染色体標的gRNAを含む株の増殖は、スクランブル(M1)gRNAを含む対照株と比較して、aTc含有培地で培養した場合と非添加培地で培養した場合では、最大密度の半分を達成するのに必要な時間が有意に遅延した（P < 0.001；二元配置分散分析、Tukey's HSD；SI付録、図S1D）。致死からの「脱出」のゲノム相関を調べるために、自己標的化gRNAを元々持っていたB. cellulosilyticus株とB. thetaiotaomicron株のゲノムの塩基配列を決定した（n = 2株/バクテロイデス科、一方は自己標的化gRNAを持ち、もう一方はスクランブルgRNAを持つ［合計8培養/株］）。その結果、B. cellulosilyticusの場合、組み込まれたプラスミドの始まりから、2つのパラロガスセリンtRNA遺伝子を含む44～80kbの領域まで、シーケンスカバレッジが失われていることが明らかになった（SI Appendix, Fig.） B. thetaiotaomicronの場合、そのメカニズムはあまり明らかではなかった。B. thetaiotaomicronの分離株の塩基配列を解析した結果、プラスミド領域の塩基配列カバレッジは維持され、驚くべきことに、300kbに及ぶ2つのrRNA遺伝子クラスターに挟まれた離れた領域のカバレッジが2倍になっていた（SI Appendix、図S2B）。B. cellulosilyticusの場合とは異なり、CRISPRカセット全体のカバレッジの低下は観察されず、CRISPRを破壊する小さな一塩基変異体や挿入/欠失変異体も見られなかった（大腸菌のCRISPRキルスイッチについて記載されている；文献31）。
標的バクテロイデスをin vivoでノックダウンするモデル系の開発。
逃避の可能性があるにもかかわらず、我々は、すでに確立された微生物群集から、一過性ではあるが、ノックダウン株の顕著なin vivo枯渇を誘導できると仮定した。この仮説を検証するため、我々は、ゲノム配列が決定されたヒト腸内細菌13株（バクテロイデス科7種を含む）を培養したコンソシアムで成体無菌マウスをコロニー形成させるパイロット実験を行った。B. thetaiotaomicronは、tdk-targeted BT-T1 gRNAを用いた人工ノックダウン株で代表された。
これらの細菌群集のゲノムに含まれるグリコシド加水分解酵素と多糖リアーゼ遺伝子のレパートリーは、細菌群集の糖分解能を説明する一つの方法となる。データセットS1Hは13ゲノムのそれぞれに含まれるGHとPL酵素の数を要約したものである。合計309のGHとPLを持つB. thetaiotaomicronは、それぞれ379と442のGHとPLをコードするB. ovatusとB. cellulosilyticusに次いで第3位であるが、他の10株よりは上位である。13のコミュニティメンバーのグローバルなCAZymeプロファイルを比較するために、GHsとPLsファミリーの表現に基づいてヒートマップを作成した（SI Appendix, 図S3）。GHsとPLsの数が最も多い3株は一緒にクラスター化していた。これらのクラスター化は、CAZyファミリーのGH2（グリコシド加水分解酵素の多機能グループ）とGH43（そのメンバーが主にペクチン糖鎖を標的とするファミリー）の大きな拡大によって駆動されているようである。糖分解性バクテロイデス科以外にも、CFB（Cytophaga、Fusobacterium、Bacteroides）グループ（O. splanchnicus）、ファーミキューテス（Ruminococcaceae sp.）、放線菌（C. aerofaciens）、シュードモナドータ（E. coli）に属する菌株がコンソーシアムに含まれ、多様な代謝能力を持つ簡略化された腸内微生物群集の形成を目指している。加えて、この微生物群集は同胞性のマウスに確実かつ安定的にコロニー形成することが示されており、細菌間相互作用が食物繊維の認識と利用にどのように関係しているかを探るための舞台を整えている（16, 17, 19）。
SI AppendixのFig. S1Eに示すように、10%(w/w)のエンドウ豆食物繊維を添加したHiSF-LoFV飼料を摂取したマウスを3群に分けた（n = 5匹/群）。これらの群には、i) 早期治療群（コンソーシアム投与1日後[day post gavage 1; dpg 1]からdpg 8まで、飲水中に10 µg/mL aTc [エタノールで調製]）、ii) 後期治療群（dpg 4からdpg 8まで、10 µg/mL aTc）、またはiii) エタノールビヒクル（飲水中の最終濃度0.5% v/v;dpg1からdpg8まで）だけで治療した対照群が含まれた。各群の各マウスから1～2日間隔で糞便サンプルを採取し、B. thetaiotaomicronの絶対量を群集DNAのショートリードショットガン配列決定により決定した(32-34)。SI Appendix, Fig. S1Fによると、どちらのaTcレジメンも、ビヒクルコントロールと比較して、最大効果の中央値が「初期」治療群で100倍、「後期」治療群で35倍の一過性のノックダウンをもたらした（Dataset S2D）。これらの結果に基づき、13メンバーからなるコミュニティからB. cellulosilyticusまたはB. thetaiotaomicronのいずれかを標的ノックダウン誘導する前に、コミュニティの集合が起こったことを確認するために、後期処理レジメンを選択した。
誘導性ノックダウンが群集構成に及ぼす影響。
成体の無菌C57BL/6Jマウスに13メンバーの群集を導入した：この群集には、12種の野生型株と、野生型株の代わりにsusC様遺伝子を標的とするBC-S19 gRNAを持つB. cellulosilyticusノックダウン株が含まれていた。マウスには、HiSF-LoFV飼料にエンドウ豆繊維を加えた飼料を自由摂取させ、dpg 4から8まで、飲料水に10μg/mLのaTcを添加するか、エタノールビヒクルのみで処理した（n = 10マウス/処理群）（図1 AおよびB）。各処置群の5匹はdpg 6で安楽死させ、5匹はdpg 20で安楽死させた。第3の群は、すべて野生型で13匹のコンソーシアムをコロニー形成したマウスで、dpg 6で安楽死させるまでビヒクルのみを投与した（n = 5匹）。これらの異なる処理群のマウスは、安楽死の4時間前にMFABの採取を受け、微生物群集の糖分解活性を明らかにすることができた。実験全体は、若干の変更を加えて繰り返した（早期安楽死時点はdpg 6ではなくdpg 5であり、実験期間は20日ではなく12日であった（n = 5から13匹/処置群））（SI Appendix, 図S4A）。両実験の全マウスからdpg 2から採取した糞便サンプル中のコンソーシアムメンバーの絶対量を測定した。
最初の実験では、aTc処理によってB. cellulosilyticusの絶対量が84±65倍（平均±SD）減少した（FDR補正P<0.05；線形混合効果モデル；データセットS2A）。この菌のレベルは、aTc処理開始の2日後（dpg 6）から上昇し始め、dpg 20までに、エタノールビヒクルのみで処理した動物で記録された値の90.1％（95％CI：59.2～125％）の平均値に達した（図1B）。連続的に採取した糞便サンプルから単離したDNAをショットガン配列決定したところ、dpg 6にはB. cellulosilyticusノックダウンカセットのカバレッジは、ビヒクル対照群で記録されたカバレッジの29.9％（95％CI：24.2～35.7％）まで低下していた（ゲノム全体のカバレッジの中央値と、エタノールビヒクル投与対照群のマウスから採取したサンプルのカバレッジの平均値で正規化した値）。この結果は、B. cellulosilyticus株の亜集団がプラスミド配列を欠失させることで殺傷スイッチを回避したことを示唆した。aTcで処理したマウスのdpg 6糞便サンプルでは、カセット組み込み部位と、その30kb下流に位置する2つのセリンtRNA遺伝子のうちの1つ（attB）の間の領域のカバレッジは、エタノールだけで処理した場合と比較して23.6％（95％CI：17.7～29.4％）に低下した。dpg8（30.3％[95％CI：18.6〜42.1％]）およびdpg10（46.1％[95％CI：29.4〜62.9％]）で採取されたサンプルでは、これらの領域（カセットおよびフランキング領域）のカバレッジ深度はほぼ同じであった（SI Appendix, Fig.S2C）。別の機会に他のマウスを用いた2回目のB. cellulosilyticusノックダウン実験でも同等の結果が得られた。最大ノックダウン率（14±9.3倍、平均±SD）はdpg 5に生じた；ノックダウンは一過性で、その後dpg 6から12まで生物の絶対量は漸増した（SI Appendix, Fig.S4 A and B and Dataset S2B）。
dpg6に採取した糞便内容物の単糖分析では、aTc処理動物では遊離アラビノース、ガラクトース、グルクロン酸、キシロースがビヒクル処理動物に比べて有意に減少していたが（FDR補正 P < 0.05；二元配置分散分析）、糞便中の単糖総量には変化がなかった（Dataset S3A）。上述したように、B. cellulosilyticusノックダウンによる群集の糖分解活性への影響を明らかにするため、dpg 6の安楽死の4時間前に、各処置群の10匹中5匹にMFABを経口投与した。投入した常磁性ガラスビーズは蛍光色素で標識され、ビーズ表面のアミン基を介してエンドウ繊維アラビナンまたはブナノキシランと共有結合していた。これらの表面アミン基は、結合した糖鎖を含まない対照ビーズではアセチル化されていた（材料と方法）。ビーズは磁気によって糞便内容物から回収し、FACSで精製し、酸加水分解によってビーズから遊離した単糖のガスクロマトグラフィー質量分析（GC-MS）により結合糖鎖量を定量した。MFABのインプット調製で得られた値と比較すると、ノックダウン直後および対照群のマウスから回収したビーズに結合したままのエンドウ豆繊維アラビナン（アラビノース）またはブナノキシラン（キシロース）の量は統計的に有意に減少した（P < 0. 05；一元配置分散分析、Tukey HSD）であったが、aTc処理動物とビヒクル処理動物の間でMFABからの糖鎖枯渇の程度に有意差はなかった（SI Appendix, Fig.）この基準からすると、ノックダウンの直前で生じた変化は、エンドウ豆繊維アラビナン（またはブナノキシラン）を消化する群集の能力を損なわなかったと結論づけられる。
上述のように、B. cellulosilyticusはコンソーシアムに含まれる細菌の中で、糖質分解酵素をコードする遺伝子のレパートリーが最も多い：そのゲノムには、103のCAZymeファミリーを代表するグリコシドヒドロラーゼモジュールをコードする394の遺伝子、19のCAZymeファミリーを代表する多糖リアーゼをコードする30の遺伝子、そして94のPULが含まれている(2)。線形混合効果モデルを適用すると、B. cellulosilyticusのノックダウンが絶対量に及ぼす主な影響は、B. thetaiotaomicronとP. vulgatusの2つの生物群集メンバーであることが観察された。これらの生物はいずれも、B. cellulosilyticusのノックダウンが限界に達した1～2日後に最大増加を示した（FDR補正 P < 0.05；線形混合効果モデル；n = 2独立実験）（図1B、SI Appendix、図S4 BとD、Dataset S2 AとB）。
類似のB. thetaiotaomicronノックダウン実験から得られた結果は、B. cellulosilyticusノックダウンの効果の特異性を説明する一つの方法となった（図1C）。2つの独立したB. thetaiotaomicronノックダウン実験におけるノックダウンの頂点も、aTc投与開始後2日以内に達成され（54.9±24.1倍および41.5±22.3倍減少［平均±SD］）、一過性であった（図1C、SI Appendix、図S4 G-L、およびDataset S2 EおよびF）。ノックダウンの主な効果は、B. cellulosilyticusのノックダウン実験では有意な変化を示さなかったB. finegoldiiというコミュニティメンバーの存在量に対するものであった。B. thetaiotaomicronの存在量が頭打ちになった1-2日後に、B. finegoldiiはエタノール処理したコントロールのレベルと比較して最大増加を達成した（FDR補正 P < 0.05；線形混合効果モデル；SI Appendix, Fig.）
B. cellulosilyticusの誘導性ノックダウンが他の微生物群集メンバーの機能発現に及ぼす影響。
dpg5およびdpg6（ノックダウン誘導から1および2日後）に採取した糞便サンプルを用いて微生物RNA-Seqを実施し、コミュニティ遺伝子発現に対するaTc処理対エタノールビヒクル単独の効果を比較した。各時点で、DESeq2（35）を用いて各生物からの転写産物の存在量をモデル化し、発現の有意差について検定した（FDR補正P < 0.05）。mcSEEDプラットフォーム(37, 38)を用いて、i)CAZymes(2)、ii)予測されるPULとCAZyme遺伝子クラスター(36)、iii)炭水化物利用、発酵最終産物、アミノ酸、ビタミン生合成の推定代謝経路について、13のコミュニティメンバーのゲノムをアノテーションした(Datasets S1G, S5-S7)。その後、DESeq2で推定したlog2-fold-changeを用いて遺伝子セット濃縮解析（GAGE; 参考文献39）を行い、aTcまたはエタノール処理群で有意に濃縮されたPULまたは推定代謝経路を同定した。
その結果、aTc処理マウスとエタノール処理マウスにおけるB. cellulosilyticusノックダウン実験のdpg 5における発現に統計学的に有意な差が認められたP. vulgatus遺伝子は合計191個同定された。これらの遺伝子のうち80個は20種類のPULの構成要素であり、さらに4つの「CAZyme遺伝子」クラスター（後者は隣接するsusC/Dペアを持たないCAZyme密度の高い領域として定義される）が存在した。P. vulgatus PUL BVU:1はキシロオリゴ糖(XOS)の利用に関連しており、P. vulgatus PULの中で最大の発現増加を示した(Fig. 2A and Dataset S5 C and I)。大腸菌で発現されるオルソログ遺伝子座は、6単糖単位までの骨格鎖長を持つXOS上での生育に十分であることが知られている(40)。
図2.

B. cellulosilyticusのノックダウンがP. vulgatusとB. ovatusの発現機能に及ぼす影響。(A) P. vulgatusのオリゴキシランPUL BVU:1（遺伝子BVU_0028-0044にまたがる）の図。dpg5および6におけるaTcノックダウン群とエタノールビヒクル投与群に属するマウスの糞便群集におけるP. vulgatus転写産物の発現差（それぞれn = 8および5マウス）。アラビノキシランのモデル構造。P. vulgatusは重合度（DP）が6までのアラビノキシランを異化できるが、B. cellulosilyticusとB. ovatusはより大きなポリマー（DPが1,000以上）を分解できる。(B) B. ovatusのガラクト/グルコマンナンPUL Bovatus:52A（Bovatus_02923-02932を包含）の図。aTc投与マウスとエタノールビヒクル投与マウス（それぞれn = 8および5）の糞便微生物叢におけるdpg 5および6でのB. ovatus転写産物の発現差。B. cellulosilyticusとB. ovatusの両方が利用する多糖であるガラクトマンナンのモデル構造。
B. ovatusは75遺伝子を発現し、うち62遺伝子はPULsおよびCAZyme遺伝子クラスターと関連していた。PULsのBovatus:26とBovatus:81はともにB. cellulosilyticusのノックダウンによって誘導される：これらのPULはどちらもアラビノキシランとキシランの分解に関連している(41)（図2B、Dataset S5 C and G）。この発見は、アラビノキシランをめぐるB. ovatusとB. cellulosilyticus WH2の競合を記録した、我々の以前の「leave-one-out」実験の結果を支持するものである(17)。これらの観察に基づき、B. ovatusとB. cellulosilyticusのin vitro培養の上清をアッセイしたところ、両者ともアラビノキシラン上で培養するとかなりの量のオリゴ糖断片を生成することがわかった。
B. cellulosilyticusのノックダウンはまた、B. ovatusのもう一つのPUL、Bovatus:52の発現を統計的に有意に増加させた（FDR補正P < 0.05; GAGE; Dataset S5A）。B. ovatusのこの遺伝子座は、B. cellulosilyticusの遺伝子座（BcellWH2:27）と部分的にシンテニックである（図2B）。これらの観察結果は、B. cellulosilyticusのノックダウンに応答して、B. ovatusはBovatus:52Aの発現を増加させることにより、HiSF-LoFV飼料に含まれるグアーガムおよび／または他のマンナンベースの増粘剤の利用を優先させる可能性があるという考えと一致する（Dataset S1E）。
B. thetaiotaomicronはB. cellulosilyticusのノックダウンに反応し、dpg 5で11の予測されるPULからの転写物の濃縮または枯渇を伴う131遺伝子の差次的発現を示した（エタノール処理対照と比較）。ペクチン利用に関連する2つのPUL、BT:75 (rhamnogalacturonan I, RGI)とBT:13A (rhamnogalacturonan II, RGII) (44, 45)は、コントロールと比較して発現が有意に減少していた（FDR補正 P < 0.05; GAGE; Dataset S6 A and C）。興味深いことに、その1日後（dpg 6）には、BT:75の発現が濃縮され、ビヒクル処理したコントロールよりも有意に高いレベルになった。この変化が、生物が基質としてRGIを利用するようになったか、あるいはRGIを優先的に利用するようになったかを確認することはできなかったが、エンドウ豆の食物繊維の糖鎖組成が知られていることから、このRGIの供給源である可能性が高いと推測された(19)。
図3は、B. cellulosilyticusのノックダウンが他の群集メンバーの遺伝子発現に及ぼすこれらの影響が、2つの独立したB. thetaiotaomicronノックダウン実験で記録されたものとどのように異なるかをまとめたものである。我々は糞便微生物群集に焦点を当てた。しかし、個々の動物から得られた糞便内容物の質量が大きいため、群集の糖分解活性のMFABアッセイと単糖およびグリコシド結合レベルの質量分析が容易であった。糞便群集内の遺伝子発現の変化が、糞便微生物叢内で起こった変化と類似していたことから（図3、データセットS5とS6）、これら2種類の生物試料から得られた結果を統合する根拠となった。上述したように、B. thetaiotaomicronのノックダウンによって絶対量が統計的に有意に増加したのは、B. finegoldiiだけであった。体力におけるこの変化は、PUL BFTSDC17:46内の遺伝子の発現の有意な増加を含む、258の遺伝子の発現における統計的に有意な変化を伴っていた（Dataset S6 A, C, and F）。このPULは、α-マンノシドを分解する酵素を含むB. thetaiotaomicron PUL BT:68と部分的にシンテニックであることから、B. thetaiotaomicronの枯渇後、B. fingoldiiがこれらの糖鎖の適応的採食を行うかどうかが問題となる(46)。さらに、PUL BFTSDC17:46に加え、B. thetaiotaomicronのノックダウンによって統計的に有意な発現の濃縮を示した他のPULの多くは、i）実験的に決定された、あるいは予測された多糖基質とB. thetaiotaomicron (BcellWH2:43 [glycosaminoglycans]; BcellWH2:17 [arabinogalactan]; Bovatus:100 [RGI]) (47)、またはii) 共鎖性(BcellWH2:5, Bovatus:12)(予測される基質特異性と共鎖性PULsについては図3を参照)。主成分分析（PCA）は、図3に示したノックダウン実験について、すべての非標的コミュニティメンバーにおける各PULの発現の平均log2倍変化の行列に対して行った。その結果、B. cellulosilyticusとB. thetaiotaomicronのノックダウン実験では、PUL発現の差のプロファイル（aTc対エタノール処理）が分離し、また、ノックダウンの種類ごとにdpg 5とdpg 6の時点が分かれた（SI Appendix, Fig S7A）。
図3.

B. cellulosilyticusとB. thetaiotaomicronのノックダウンと「放置」が、他の群集メンバーのPUL発現に及ぼす影響。B.cellulosilyticusとB. thetaiotaomicronのノックダウン実験（aTc処理vs.ビヒクルコントロール）および "leave-out "実験（leave-out vs.完全群集）から得られたPULを示す。dpg4で、ノックダウン実験の動物群にはaTcまたはエタノールビヒクルが投与され、放置実験の動物群にはエタノールビヒクルのみが投与された。カラースケールはGAGE(Generally Applicable Gene set Enrichment)で作成した-Sign(change)×log2(FDR補正P値)に対応する。正の値はaTc処理または放置条件での濃縮を示す。有意でない濃縮（FDR補正P値＞0.05）を示すPULに対応するセルは白で着色されている。PUL「オルソログ」はPULデータベース（PUL-DB）のPULアライナーツール（36, 48）によって定義され、不正確な一致または部分的な一致にはアスタリスクが付けられている。各 PUL の推定基質は、生化学的研究の文献報告、または特徴的な酵素/PUL との配列/ドメインの類似性に基づいている（データセット S5 と S6）。
これらの結果を総合すると、ノックダウンは、以前はノックダウン株によって利用されていた糖鎖へのアクセスを、標的でないコミュニティーメンバーに増加させるという考えと一致する。我々の解析では、主にバクテロイデス科細菌間の糖質利用に焦点を当てた。これらの分類群や他の分類群では、糖鎖を含まない代謝経路の発現の変化が観察されたが、ノックダウン後の最も顕著な変化は、わずか数種の糖鎖を標的とする代謝経路であった（SI Appendix, Supporting Information Text and Datasets S5-S7）。
菌株脱落実験との比較。
上述したB. cellulosilyticusノックダウン実験には、B. cellulosilyticusを細菌コンソーシアムから排除してから投与し、レシピエントマウスにはエタノールビヒクルを投与する独立したアームも含まれていた（SI Appendix, Fig.）ノックダウン実験と同様に、除菌された群集は無傷の群集と比較して、P. vulgatusとB. thetaiotaomicronの絶対量が統計的に有意に高かった（n = 5 mice/群; FDR補正P < 0.05; Welchのt検定; SI Appendix, Fig. S7B and Dataset S2 A and B）。上述したPCAには、B. cellulosilyticusの離脱群対無傷群の比較も含まれていた。この比較から得られたPUL発現プロファイルは、ノックダウン実験におけるdpg 5 aTc対エタノール比較から得られたプロファイルとクラスター化した（SI Appendix, Fig. S7A）。P. vulgatus（およびB. ovatus）におけるキシラン遺伝子座の発現における有意差は、ノックダウン実験で記録されたものであり、12メンバーの脱離株と13メンバー（「非脱離株」）のコントロールの比較で記録されたものと類似していた（SI Appendix, Fig.）興味深いことに、B. ovatusのガラクトマンナン遺伝子座転写産物の存在量に差は見られなかった（SI Appendix、Fig. S7D）。これは、微生物群集の「履歴」（すなわち、コロニー形成後にB. cellulosilyticusが枯渇した場合と、B. cellulosilyticusに暴露された履歴がない場合）が、その代謝状態に影響を与えることを示す証拠のひとつである（49）。
これらの結果に触発され、我々はP. vulgatusとB. cellulosilyticusの代謝競争の根底にあるメカニズムをさらに解明するために、一連の実験を計画した。そのために、CRISPR塩基編集に基づく遺伝学的アプローチを用いた。
B. cellulosilyticusノックダウンに対するP. vulgatusの反応をさらに調べるために、シチジンデアミナーゼ変異誘発を応用した。
我々は、P. vulgatusのXOS利用経路（PUL BVU:1）の機能を欠損させることで、B. cellulosilyticusノックダウン後のP. vulgatusの拡大を抑制し、その基礎体力を変化させない可能性があると仮定した。逆に、P. vulgatusのアラビナンPUL, BVU:27の発現は、エンドウ豆繊維添加HiSF-LoFV食を与えたマウスでは、無添加食を与えたマウスに比べて有意に増加することが以前に示されていることから、アラビナン利用能を破壊することは、全体的な体力の低下をもたらすと仮定した(17, 19)。これらの仮説を検証するために、我々は遺伝子ツールを活用し、バクテロイデス科細菌にCRISPR塩基編集システムを適用した。このシステムは、aTc誘導性のdCas9-PmCDA1遺伝子と、構成的に発現するガイドRNAから構成される。複合体が結合すると、PmCDA1ドメインはプロトスペーサー隣接モチーフ（PAM）部位の5′にある15から20bpのウィンドウ内のシトシン塩基を脱アミノ化することができる(50, 51)。脱アミノ化されたシトシン（ウラシル）はDNA複製の際にチミンとして "読まれ"、C→T転移が起こる。
このシステムをpNBU2統合ベクター（pNBU2_CDA）と安定発現プラスミド（pMob_CDA）に組み込んだ（図4A）。pMobベクターで変異を誘導した後、菌株はLYBHI培地上で1-4継代以内にプラスミドを選択することなく治すことができ、その時点では試験したどの培養物もErm耐性増殖はなく、菌株は各gRNAに相補的な予測部位内にシチジンデアミナーゼで誘導された変異を含んでいた。このCas9誘導シチジン脱アミノ化の2段階aTc誘導による突然変異誘発効率を調べるため、ベクターバックボーンpMobおよび/またはpNBU2を用いて、P. vulgatus（BVU_0038, BVU_0043, BVU_1005）およびB. thetaiotaomicron（BT_0362, BT_0364）の遺伝子座を標的とした。分離株は、シチジン変換率を推定するためにアンプリコンシークエンシングを行った。非誘導単離株（n＝3）を、aTc誘導を1ラウンドまたは2ラウンド受けた培養由来の単離株と比較した（材料と方法）。最初の誘導サイクルの後、誘導された単離株から収集したリードの36%が目的の変異対立遺伝子を有していた（範囲：3〜66%）が、2サイクル後には、リードの平均52%が目的の対立遺伝子を有していた（範囲：13〜92%）（SI Appendix, Fig.）
図4.

B. cellulosilyticus、P. vulgatus、およびB. thetaiotaomicronのin vitro増殖における、選択したPUL関連糖質トランスポーターの必要性に関するシチジンデアミナーゼ変異誘発試験。(A、左）バクテロイデス科細菌に適用したシチジンデアミナーゼ変異誘発ワークフローの図。SpCas9-PmCDA1タンパク質はgRNAおよびDNAと複合体化し、シトシンをウラシルに脱アミノ化する。(右）シチジンデアミナーゼ変異誘発コンストラクトを含む株は、i）gRNAインサートを含む親pMobまたはpNBU2ベクターのIIS型アセンブリー、ii）コンピテント大腸菌細胞へのコンストラクトの1つの形質転換、iii）これらの細胞とレシピエントバクテロイダスとのコンジュゲーションによって作製された。得られた株をaTcに曝露することにより、SpCas9-PmCDA1を発現するように誘導した。(B-G) Bacteroides Minimal Medium (BMM)中における各菌株の増殖。網掛け領域は95% LOESS CIを包含する（各条件につきn = 3複製培養）。P. vulgatus ∆BVU_0043（オリゴキシランPULのMFSトランスポーター）および ∆BVU_1005（アラビナンPULのSusCトランスポーター）は、図5およびデータセットS7ではそれぞれ ∆XOSおよび∆Abnと表記されている。
gRNA配列を挿入するためにIIS型制限酵素アセンブリーを用いて、pNBU2_CDAまたはpMob_CDAベクターを構築し、形質転換し、3種の標的バクテロイド科細菌に結合させた；得られた菌株をaTc添加液体培地で培養し、aTc添加寒天培地にプレーティングした。この方法により、B. cellulosilyticus（PUL BcellWH2:5、BcellWH2_00924）、B. thetaiotaomicron（PUL BT:7、BT_0364）、P. vulgatus（PUL BVU:27、BVU_1005）の間でシンテニックで保存されているアラビナンPUL内のsusC-ホモログに停止コドンを導入することができた。
すべての生物において、停止コドン変異体の増殖は、非誘導のpNBU2_CDAインテグレート体または非インテグレート変異体の野生型コントロールと比較して、テンサイアラビナンを含むBMM上で著しく制限された（図4 B-D）。P. vulgatus PUL BVU:1（BVU_0043、Q157*）の主要ファシリテータースーパーファミリー（MFS）遺伝子を破壊すると、キシロテトラオースを含むBMM上での生育が阻害された（図4 EおよびG）。逆に、PUL BVU:1に存在するSusC様トランスポーターBVU_0038（W456*）を破壊しても、キシロテトラオースを含むBMMでの増殖への影響はほとんどなかった（図4F）。これらの結果は、MFSトランスポーターがキシロテトラオースまたはその分解産物のインポートに関与していることを示唆している。これらの菌株について、他のオリゴキシラン種（例えば重合度2〜6のもの）を用いても同様の結果が得られた。ブナノキシラン上での増殖は、両変異体によって阻害されるか、著しく遅延した（SI Appendix, Fig. S8B）。
続いて、P. vulgatusが野生型（WT）であるもの、BVU_0043破壊株（Q157*）を持つもの、およびBVU_1005破壊株（Q256*）を持つもの（図5ではそれぞれ∆XOSおよび∆Abnと略記）の3つの異なる13メンバーのコミュニティーコンテクストで、B. cellulosilyticusノックダウン実験を行った。これらの各コミュニティを保有するマウスをdpg 4からaTcまたはエタノール-ビヒクル対照（n = 5/処理/コミュニティタイプ）で処理し、dpg 12に安楽死させた（図5A）。糞便中の∆Abn変異体および∆XOS変異体の絶対量は、エタノール対照群間で野生型P. vulgatusと有意差はなかった（P > 0.05; 線形混合効果モデル, Tukey HSD; Fig.）しかし、∆Abn株よりも野生型P. vulgatusの絶対量が増加した（12.51 ± 2.98 vs. 4.61 ± 1.46 106 genomes/mg feces; P < 0.05; 線形混合効果モデル）ことから、B. cellulosilyticusのノックダウン期間中、アラビナン利用が（野生型）P. vulgatusの適性を決定する要因になることが示唆された（図5B）。PUL BVU:1におけるXOS利用遺伝子の発現の増加と、B. cellulosilyticusノックダウン中のP. vulgatusのフィットネスの増加との間には強い相関があるにもかかわらず、P. vulgatusにおいてこの経路を遺伝的に破壊しても、その絶対量に有意な影響は見られなかった（P > 0.05；線形混合効果モデル；図5B）。はじめに」で述べたように、また後述するように、これらの知見は、糖鎖分解微生物群集のメンバーが共存するメカニズムとして仮定されてきた逐次的な利用ではなく、むしろクチリゼーションに基づく糖鎖優先順位付けの戦略を支持するものである（8, 9）。
図5.

遺伝子操作したP. vulgatus株に対するB. cellulosilyticusのノックダウン効果。(A）実験デザイン。無胚葉マウスにHiSF-LoFV飼料をコロニー形成前に4日間摂取させ、13種類の腸内細菌コンソーシアムをコロニー形成させた。B. cellulosilyticusは誘導性ノックダウン変異体（BC-S19）を用いた。P. vulgatusは野生型株またはプラスミドで培養したシチジンデアミナーゼ変異株（∆XOS [BVU_0043 disruption (Q157*)]または∆Abn [BVU_1005 disruption (Q256*)]）を用いた。経口投与後、マウスにはHiSF-LoFV+10%PEF(w/w)を与え、dpg 4-8まで飲料水にaTcまたはエタノールビヒクルを投与した。マウスは12日目に安楽死させた。(B) P. vulgatusの野生型、∆XOS株、または∆Abn株を含む実験群における標記生物の絶対量。平均値±SDを対数スケールでプロットした（生の値についてはデータセットS2Cを参照）（n = 5 mice/群）。
野生型および変異型P. vulgatus株を含む群集におけるB. cellulosilyticusノックダウンに対する転写応答。
B. cellulosilyticusノックダウンが群集の遺伝子発現に及ぼす影響を経時的に調べた。まず、野生型P. vulgatus株を含む群集を保有するマウス（n = 5匹）に焦点を当て、aTc処理動物とビヒクル処理対照動物を、経口摂取後4日目から8日目、10日目、12日目に比較した。この群集環境において、5つのバクテロイデス科の28のPULが、dpg 5、6、8でB. cellulosilyticusのノックダウンを開始した後、その発現に統計的に有意な差を示した（FDR補正P < 0.05; GAGE; Dataset S7）。差次的発現を示したPULの25％は、dpg 5でノックダウンを開始してから1日後に最大差次的発現を示した。例えば、オリゴキシラン代謝に関与するP. vulgatusのPUL（BVU:1）、およびB. ovatusの2つのキシラン利用PUL（Bovatus:26およびBovatus:81）のそれぞれは、dpg 5の時点でエタノール対照と比較してaTc処理動物で有意に高いレベルで発現していた。これら3つのキシランPULの発現レベルは、dpg 7までにエタノール対照で記録されたレベルに戻った（SI Appendix, Fig. S9 A and B and Dataset S7 G and I）。対照的に、B. ovatusのガラクトマンナンPULであるBovatus:52Aの遺伝子は、dpg 6で差次的発現が最大となり、dpg 8-9まで高いレベルを維持した。B.ovatusのキシロース利用遺伝子（xylRBAE）は、dpg 5-6の間に発現が増加するという同じパターンを示した。dpg10までに、aTc処理群（GAGE）では1つのPUL（Bovatus:13）のみが差次的に濃縮された；すなわち、その発現レベルはエタノール対照と比較して有意に高いままであった。一方、5つのバクテロイデス科における他の27の以前は差次的に発現していたPULは、対照群と有意差のないレベルを示した（Dataset S7G）。
P. vulgatusの∆XOS変異体および∆Abn変異体を含む群集について、dpg 4-6、8、10においてaTc処理動物をビヒクルコントロール動物と比較し、並行して遺伝子発現解析を行った。これらのコミュニティーのいずれにおいても、P. vulgatus変異株およびB. ovatusのdpg 5と6における差次発現遺伝子は、P. vulgatus WTとの比較で有意な重複を示した（P < 5 × 10-10；カイ二乗検定）。全体として、P. vulgatusの∆XOS変異体および∆Abn変異体を含む群集において、B. cellulosilyticusのノックダウンを開始した後に有意に濃縮された、群集のバクテロイデス科に属する最大75のPULから転写物を同定した（FDR補正 P < 0.05; GAGE; Dataset S7）；特に、このPUL発現差のパターンは、野生型のP. vulgatusを含む群集で観察されたものと類似していた。例えば、キシラン利用PUL（BVU:1、Bovatus:26、Bovatus:81）およびB. ovatusガラクトマンナンPUL（Bovatus:52A）の転写産物は、3つのP. vulgatus株のいずれかを含む各コミュニティにおいて、dpg 5および/または6において、aTc処理動物でビヒクル対照に対して有意に高いレベルで存在した。
これらの結果から、P. vulgatusの遺伝子操作はB. cellulosilyticusのノックダウンに応答してP. vulgatusのフィットネスを低下させたが、他のコミュニティメンバーの糖質利用はほとんど影響を受けなかったことが示唆され、コミュニティの糖質分解活性の回復力と頑健性が明らかになった。
考察
ヒトの腸内細菌叢のメンバーがどのように栄養資源に優先順位をつけているかを理解することは、健康状態および様々な疾患状態における群集の頑健性と回復力を決定するメカニズムを解読するための重要な一歩である。この知識を得ることは、微生物指向性の治療法を開発するための基礎となる。ここでは、飽和脂肪酸が多く、果物や野菜は少ないがエンドウ豆の食物繊維を補充した代表的な西洋（米国）食を単調に摂取させたgnotobioticマウスに定着させた13メンバーの培養ヒト腸内細菌コンソーシアムから、B. cellulosilyticusまたはB. thetaiotaomicronをノックダウンする誘導可能なCRISPR変異体を作製した。この細菌群集には、合計7種のバクテロイデス科細菌が含まれていた。ノックダウン実験を繰り返し行った結果、B. cellulosilyticusまたはB. thetaiotaomicronの絶対量の減少は急速で、1〜2日で頭打ちになった。ノックダウンは、他のコミュニティメンバーの絶対量の再現性のある変化と、コミュニティ全体の多糖類利用遺伝子座（PULs）の発現のシフトを伴った。発現量の変化はノックダウン後1日目には明らかであったが、他の群集メンバーの存在量のシフトは、ノックダウン効果が最大になるまでにさらに1〜3日遅れ、このモデル系では群集組成の変化の速度論が比較的遅いことを示している。
群集レベルでは、ノックダウン後の糖分解活性の機能的冗長性は、経口投与され、その後gnotobioticマウスの腸から回収された微細な「人工食物粒子」の表面に残存する糖鎖のレベルを測定することによって、また腸内容物に存在するグリコシド結合の質量分析によって示された。我々は、B. cellulosilyticusのノックダウンに応答して最も存在量の増加を示した生物であるP. vulgatusのオリゴキシランPULの機能を遺伝的に無効にすることによって、単一の生物群集メンバーにおけるこの機能的冗長性を撹乱することを試みた。このPULの遺伝子操作により、定義された（オリゴ）キシラン炭素源上でのin vitroでの増殖は制限されたが、in vivoでのP. vulgatusのフィットネスには測定可能な影響を与えなかった。一般的に、この結果は、P. vulgatusによる栄養資源の共利用、あるいは少なくともこの群集と食餌環境におけるオリゴ-キシランとアラビナンを標的としたPULの共発現のスキームと一致する。むしろ、PULの逐次的かつ階層的な発現と、利用可能なさまざまな糖鎖の利用スキームと一致する(8, 9)。栄養資源の "切り替えの早さ "と資源の "利用 "は、連続的な現象の一部と見なすことができる。「より速い切り替え」は、急速に変化する資源環境においては、P. vulgatusにとって他の「遅い切り替え」株に対する競争上の優位性となりうるが（10, 52, 53）、より静的な資源環境においては、フィットネスコストとなる可能性がある。栄養利用を調節するこれらの戦略は、腸内や他の生息域へのコロニー形成時に観察される優先効果にも寄与している可能性がある（54）。優先効果の根底にあるこれらのメカニズムや他のメカニズムは、本報告で述べたようなノックダウン実験や、「侵入」生物によって生物群集が挑発されるノックダウン実験によって明らかにされるであろう。
結論として、特定の標的生物のCRISPRノックダウンを誘導するアプローチは、腸内細菌叢における細菌間相互作用のモデルを改良する機会を提供する。ノックダウン後の非標的メンバーの発現機能の変化を観察することで、減少した菌株が他の群集構成要素に与える影響／効果を観察することができる。原理的には、ある種の複数の野生型株（あるいはある親株に由来するストップコドン変異株プール）を含むコミュニティを定義した実験を計画することができる。この後者の特徴は、ある生物種をノックダウンし、別の生物種の応答の株レベルでの決定因子を解析する機会を提供する。この能力は、プレバイオティックスクリーンと相まって、ヒトの腸内細菌叢における菌株レベルの多様性の意義をより広い次元で理解し、プレバイオティックス、プロバイオティックス、共生治療薬の開発を促進する機会を提供する。さらに、この実験的パラダイムを拡張・修正することで、現在あまり理解されていない優先効果や群集形成の決定因子を調べることができる。
本研究の限界
ここで説明した誘導性ノックダウンシステムは、CRISPR標的生物を群集から絶滅させるものではない。これは、ヒトの腸内細菌叢が、一過性あるいは周期的な事象（例えば、食事の変化、薬剤への曝露、腸内病原体による侵襲など）に伴って、その存在量や発現機能が動的に変化するような、多くの「現実世界」の摂動に対する反応に似ているため、望ましい特徴であると考えている。このように、ノックダウンからの脱出（回復）は、摂動と再平衡化の動態を特徴づける機会を提供し、偶然にも、コミュニティの回復力と頑健性の根底にあるメカニズムについての洞察を得る機会となる。多くの反応はノックダウン直前の平均効果の比較によって明らかになったが、このシステムは回復過程における細菌間相互作用のより詳細な動態モデリングに利用されるべきである。CRISPRノックダウンからの脱出のゲノム相関を解明するためには、さらなる研究が必要であるが、ノックダウンの期間をどの程度コントロールできるかは今のところ不明である。ノックダウンシステムの改良には、i）カセット欠失または破壊を回避するために複数の統合部位を使用すること、ii）早期の脱出につながる可能性のある非誘導性の「リーキー」Cas9タンパク質発現を低減するために、最適化されたプロモーター、デグロン、または誘導スイッチを介してCas9発現を改良すること、iii）冗長なエフェクター機構（例えば、自己標的化VI型分泌系または毒素／抗毒素タンパク質）を追加することが含まれ、ノックダウン効率および持続時間を増加させる可能性がある（30、31、55）。さらに、最初のノックダウン実験で記録された適応的な栄養利用戦略の知識に基づき、プレバイオティックな介入を加えることは、ノックダウン（摂動）に対する持続的な適応を促進する方法を試験する手段となりうる。現在のところ、シチジンデアミナーゼ変異誘発プロトコルの効率は限られており、ポジティブセレクションに依存している。効率を改善するために、将来的にはガイドRNAのターゲティングを改良したり、ウラシルグリコシラーゼ阻害ドメインをSpCas9複合体に共有結合させたりすることが考えられる。最後に、この種の実験結果を解釈するためには、さまざまな食餌条件下で、異なる組成と複雑性を持つバクテロイーダ菌の群集における、種／菌株を超えたPUL制御のネットワークをさらに特徴づける必要があるなど、さらなる研究が必要である。
材料と方法
プラスミドの作製。
プラスミドはGibsonクローニング（NEBuilder® HiFi DNA Assembly Master Mix, New England BioLabs [NEB]）により構築した。pNBU2ベースのプラスミド（pNBU2-CRISPR、pNBU2-CDA）は、pExchange-tdkプラスミドバックボーン（RP4-oriT、R6K ori、bla、ermG）とpNBU2-tetQbのNBU2インテグラーゼを用いて構築した。pMobA.repA-CDA（別名pMob_CDA）は、pLYL01プラスミドバックボーン（pBR322、bla、mobA、repA、ermF）を用いて構築した。すべてのプラスミドは、合成二本鎖オリゴヌクレオチドとStreptococcus pyogenes SF370株ゲノムDNAからのPCRアンプリコンから組み立てたアンヒドロテトラサイクリン（aTc）誘導性CRISPRカセット（P2-A21-tetR、P1TDPP-GH023-SpCas9またはP1TDPP-GH023-dSpCas9-PmCDA1、P1-N20 sgRNA scaffold）を用いて作製した。セフォキシチン耐性プラスミドを作製するために、合成DNAと従来の制限酵素クローニングを用いて、エリスロマイシン（ermG）抗生物質耐性遺伝子をセフォキシチン抗生物質耐性遺伝子（cfxA）に置換した。不活性化Cas9変異（D10AおよびH840A）は、部位特異的変異導入法により導入し、プラスミド増幅（Q5 High-Fidelity DNAポリメラーゼ、NEB）、プラスミド増幅、親プラスミド鎖消化（DpnI、NEB）、および細菌形質転換を行った。
シチジンデアミナーゼ変異体を作製するため、スペーサー配列はCRISPRseek（56）とカスタムRスクリプトを用いて設計し、標的遺伝子の前半にストップコドンを導入しうるDoench_2014スコアの高い配列をフィルターした。末端が粘着性のスペーサー配列（CAGTスペーサー、RCスペーサー-AAAC）のオリゴヌクレオチド（IDTから入手）をアニールし、リン酸化した（T4キナーゼ、NEB）。アニーリングしたオリゴと50 ngの親ベクター（pNBU2_CDAまたはpMob_CDA）を3：1のモル比で組み合わせ、AarI（ThermoFisher）とT4リガーゼ（NEB）で37℃、1時間処理した。形質転換のために、この反応混合物の4 µLアリコートを20 µLの化学的にコンピテントなS17細胞(57)に加えるか、または反応混合物の1 µLアリコートと24 µLのエレクトロコンピテントなS17細胞からなる混合物のエレクトロポレーション(NEBエレクトロポレーションプロトコールC2986)によって行った。形質転換細胞を50μg/mLカルベニシリンを含むLB培地で選択し、その後、既報の方法(58)を用いてバクテロイデス属細菌を結合させた。結合したバクテロイデス属細菌は、10％ウマ血液、200μg/mLゲンタマイシン、25μg/mLエリスロマイシンまたは20μg/mLセフォキシチンを含むBHI培地で選択した。変異の誘導は、200 ng/mL aTcを含むLYBHI培地で一晩増殖させ、その後10％ウマ血液と200 ng/mL aTcを加えたBHI培地でプレーティングすることで行った（プラスミド誘導にはエリスロマイシンを添加）。
シチジン-デアミナーゼ変異体の検証。
突然変異誘発の効率をアッセイするために、3つのコロニーをそれぞれの未誘導種について調べた。次に、3つのコロニーのうちの1つのコロニーをaTcで誘導し、この最初の誘導から10個のコロニーをプレーティングから集めた。10個のうち5個のコロニーについて、2回目のaTc誘導を行った。この最後のラウンドの各サブカルチャーから採取した3つのコロニーを、ゲノム標的から生成したPCRアンプリコンの塩基配列決定に供した。
変異は、ネステッドPCRプライミングスキーム（イルミナ文書#1000000002694 v10）を用いたアンプリコンシークエンシングにより確認した。そのために、まずターゲット領域をNEB HotStart Q5を用いて25サイクル増幅した。次に、反応液の5 µLを、NEB HotStart Q5を用いて、イルミナNextera指標に結合するプライマーで10サイクル増幅した。最後に、これらのアンプリコンをプールし、Ampureビーズセレクションを用いて精製し、Illumina MiSeqまたはNextSeq装置でシーケンスし、2x250ヌクレオチドリードを生成した。リードはBWA-mem（v 0.7.17-r1188；文献59）を用いて細菌ゲノムにアライメントした。これらのアラインメントを処理し（bcftools, v1.12、参考文献60）、アラインメントされた塩基間のパイルアップ統計を作成した。変異誘発効率は、シチジンデアミナーゼ活性が予測されるウィンドウ内の各位置で、目的の対立遺伝子を持つリードの割合として報告した。
Gnotobioticマウスの飼育。
Gnotobioticマウス実験は、Washington University Animal Studies Committeeによって承認されたプロトコールを用いて行った。無菌雄性C57BL/6Jマウスをプラスチック製フレキシブルフィルムアイソレーター（Class Biologically Clean Ltd）で23℃、12時間の厳密な光サイクル（0600時点灯）で飼育した。マウスはオートクレーブ可能なマウスチャウ（Envigo; Cat.No.2018S）で維持した。ケージには環境エンリッチメント用の紙製ハウスとオートクレーブ処理した敷料（Aspen Woodchips; Northeastern Products）を入れた。
HiSF-LoFV実験食は、National Health and Nutrition Examination Survey (NHANES)データベース(15)で報告された果物および野菜摂取量の最低三分位および飽和脂肪酸摂取量の最高三分位に近似したヒト食品（Dataset S1E）を用いて作製した。食事は粉砕して粉末にし（D90粒子径、980mm）、10％（w/w）のエンドウ豆繊維（Rattenmaier；カタログ番号 Pea Fiber EF 100）と混合した。粉砕した飼料±エンドウ豆繊維混合物をペレットに押し出した。ペレットは包装され、真空密封され、ガンマ線照射（20-50キログラム、Steris、Mentor、OH）により滅菌された。無菌性は、TYG培地中、好気的および嫌気的条件下（雰囲気：75％N2、20％CO2、5％H2）、37℃で培養し、ペレット化HiSF-LoFV飼料を摂取した無菌マウスから調製した糞便DNAのshort-read shotgun sequencingによって確認した。
塩酸アンヒドロテトラサイクリン（37919、Millipore Sigma）のストック溶液を調製し（エタノール中2 mg/mL）、フィルター滅菌した（Millipore Sigma SLGV033RSフィルター）。aTc（10μg/mL、0.5％エタノール）または0.5％エタノール単独を含む飲料水を、gnotobiotic isolatorで毎日または1日おきに調製した（SI Appendix、図S1 E、Fに実験結果を示す）。
マウスはコロニー形成の4日前からHiSF-LoFV飼料を与えられた。コロニー形成後、マウスは単独飼育され、HiSF-LoFV飼料±10％エンドウ豆繊維を与えられた。処理期間中（図1）、aTcまたはエタノールビヒクルを添加した飲料水で代用した。aTcまたはエタノール処理は、SI Appendix、図S1 EおよびFに記載した実験を除くすべての実験において、dpg 4で開始した。この4日間の「遅延」は、標的ノックダウンを開始する前に、コミュニティが動物間で一貫した方法で形成されていることを確認するのに役立つように設計された。処理期間終了後、aTcを回収し、寝具を交換した。新鮮な糞便サンプルを、各動物から1.8mLスクリュー・トップ・プラスチック・バイアル（Axygen社製）に、生産後数秒以内に採取した。
i)細菌培養、ii)細菌ゲノム配列決定、iii)細菌培養物中のオリゴ糖のMALDI-TOF MS、iv)群集DNAのショートリードシークエンシングを用いたgnotobioticマウスにおけるコンソーシアムメンバーの絶対量の決定、v)エスケープ変異体解析、vi)微生物RNA-Seq、vii)群集の糖鎖のMFAB解析。vii）群集の糖分解活性のMFAB解析、viii）糞便中の単糖およびグリコシド結合の質量分析。
データ、材料、ソフトウェアの入手
gnotobioticマウスから作成したショットガン微生物群集DNAシーケンスと微生物RNA-Seqデータセットは、European Nucleotide Archive (ENA; https://www.ebi.ac.uk/ena)にアクセッション番号PRJEB55384で寄託されている(61)。単糖およびグリコシド結合のLC-MSデータセットとMALDI-TOF MSデータは、GlycoPOST (ID: GPST000298 and GPST000284) (62, 63)にある。この原稿に使用したコードは、gitlab.com/zbeller31/knockdown_manuscript_v2（一般解析、(64)）、gitlab.com/zbeller31/metatranscriptomics_pipeline（RNA-Seq処理/マッピング、(65)）、およびgitlab.com/Gordon_Lab/COPRO-Seq（COPRO-Seq、(66)）からアクセス可能である。
謝辞
David O'Donnell、Maria Karlsson、Justin Serugoにはマウスの飼育について貴重な助力をいただいた。Martin Meierにはショットガンシーケンスおよび微生物RNA-Seq用ライブラリーの作製に不可欠な役割を担っていただいた。Jessica Hoisington Lopez、MariaLynn Crosby、およびWashington University School of MedicineのGenome Technology Access Coreのメンバーにはライブラリーのシーケンスにご協力いただいた。Michael Patnode氏、Matt Hibberd氏、Michael Barratt氏には、報告された研究の過程で多くの有益な示唆をいただいた。本研究は、NIHからの助成金（DK70977）およびMillipore-Sigma社との産学共同研究により行われた。Z.W.B.は、NIHからPredoctoral MD/PhD career development fellowship（F30 DK123838）を受けており、Washington University Medical Scientist Training Program（NIH助成金GM007200による）のメンバーである。D.A.W.はNIHからキャリア開発賞（K99 AT011374）を受けており、Damon Runyon Cancer Research Foundation（NDRG-2303-17）からDamon Runyonフェローとして支援を受けていた。Washington University in St. LouisのBiomedical Mass Spectrometry Resourceは、NIH助成金R24GM136766、P30DK020579、R21AI144658の支援を受けている。
著者貢献Z.W.B.とJ.I.G.が研究を計画し、Z.W.B.、D.A.W.、T.R.S.、J.L.G.、A.E.B.、C.S.、N.P.B.、Y.C.、G.C.、Z.Z.、C.H.M.、E.R.E.が研究を実施し、Z.W.B.、T.R.S.、Z.Z、 Z.W.B.、T.R.S.、Z.Z.、E.R.E.が研究を行い、Z.W.B.、D.A.W.、T.R.S.、S.H.、N.T.、B.H.、D.A.R.、A.L.O.、C.B.L.、E.R.E.、G.D.D.、J.I.G.がデータを解析し、Z.W.B.とJ.IG.が執筆した。
競合利益A.L.O.とD.A.R.は、微生物群集の予測的表現型プロファイリングのための計算ツールの開発を追求する会社Phenobiome Inc.の共同設立者である。C.B.L.はEvolve Biosystems社（現Infinant Health社）、interVenn Bio社、BCD Bioscience社の共同設立者であり、糖鎖の特性解析とヒトの健康に役立つ糖鎖アプリケーションの開発に携わっている。バクテロイデスのノックダウンと遺伝子操作の側面について記載した仮特許出願を行った。特許出願は2020年7月16日に出願され、米国仮出願第63/052,825号を譲渡された。
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研究論文2023年9月19日
環境的に頑健なシス調節変化が急速な気候適応を支える
マロリーA.バリンジャー、カーチャL.マック、[...]マイケルW.ナックマン
研究論文2023年9月18日
植物の形態は血管の最適性によって決定される
S. B. D. ソップ, R. ヴァルブエナ、
研究論文2023年9月18日
がん関連線維芽細胞は、ROR2の細胞膜拡散によって胃がん細胞のWnt/PCPシグナル伝達に影響を及ぼす
サリー・ロジャース, 張成廷, [...]ステフェン・ショルプ
トレンド
研究論文2023年9月18日
動物属の大量絶滅による生命樹の変異
我々は今、6回目の大量絶滅に突入している。これまでの5回とは異なり、今回はホモ・サピエンスという単一の種が増えすぎたことが原因である。このエピソードは、（進化の時間的な）異例の速さで種が失われたと見なされることが多いが、...過去5億年の間に起こった大量絶滅は、急速に生命の系統樹から枝を取り除き、絶滅した（EX）生物の機能的な代替物を進化が生み出すのに数百万年を要した。本論文では、5,400種の絶滅生物を調査することにより、絶滅生物の機能的な代替物を生み出すのに数百万年を要したことを明らかにする。
ジェラルド・セバロスポール・R・エールリッヒ
研究論文2023年9月18日
ヒトの細胞数とサイズ分布
ヒトの体内の細胞の一貫した包括的な定量的枠組みは、生物学の多くの分野に利益をもたらす可能性がある。われわれは、最小の赤血球から最小の細胞まで、約1,200の細胞群について、細胞質量、サイズ範囲、細胞数を推定するためのデータをまとめた。しかし、その関連性が広く知られているにもかかわらず、細胞の大きさと数の関係が、ヒトの体全体にわたって正式に調べられたことはない。ここでは、ヒトの体全体の細胞サイズと細胞数の関係を...
イアン-A-ハットン、エリック-D-ガルブレイス、[...]ジェフリー-A-シャンダー、
短報2023年9月18日
テレワークの気候緩和ポテンシャルは、ICT利用よりもむしろライフスタイルや職場の変化に敏感である
COVID-19のパンデミックに端を発したリモートワークやハイブリッドワークの増加は、環境に大きな影響を与える可能性がある。我々は、情報通信技術を含む要因を考慮しながら、この移行の温室効果ガス排出量を評価する。
Yanqiuタオ、Longqiヤン、[...]Fengqiあなた、
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