クラミドモナス葉緑体ゲノムのRNA温度計が温度制御遺伝子発現を促進する

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クラミドモナス葉緑体ゲノムのRNA温度計が温度制御遺伝子発現を促進する

https://academic.oup.com/nar/advance-article/doi/10.1093/nar/gkad816/7321988?login=false


　
キンパンチョン、F Vanessa Loiacono、Juliane Neupert、Mengting Wu、Ralph Bock
Nucleic Acids Research, gkad816, https://doi.org/10.1093/nar/gkad816
公開：2023年10月19日 記事履歴
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要旨
リボスイッチやRNAサーモメーターなどのリボレギュレーターは、転写後レベルで遺伝子発現を制御するための、タンパク質に依存しないシンプルなツールを提供する。細菌では、RNA温度計が温度変化に応答してタンパク質合成を制御する。細菌以外の世界では温度計はまれであり、オルガネラゲノムではこれまでRNA温度計は同定されていない。今回われわれは、単細胞の緑藻クラミドモナス（Chlamydomonas reinhardtii）の葉緑体遺伝子の中にRNA温度計を発見した。この温度計はpsaAメッセンジャーRNAの5′非翻訳領域に存在し、25℃ではShine-Dalgarno配列を覆い隠すヘアピン型二次構造を形成している。40℃では、二次構造の融解により、開始リボソームへのシャイン-ダルガルノ配列のアクセスが増加し、タンパク質合成が促進される。標的ヌクレオチドの置換と大腸菌への移入により、二次構造が温度計の特性を付与するのに必要かつ十分であることを示した。また、この温度計が、クラミドモナスプラスチドゲノムからの誘導可能な導入遺伝子発現のための貴重なツールになることを示し、藻類培養の単純な温度シフトによって組換えタンパク質の収量を大幅に増加させることができることを示した。

グラフィカルな要旨
グラフィカルアブストラクト
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問題のセクション 合成生物学とバイオエンジニアリング
はじめに
遺伝子発現の誘導は、通常、DNAまたはRNAレベルのシス作用因子と、トランス作用因子であるレギュレータータンパク質および／または低分子（代謝産物）からなる多成分系によってもたらされる。RNA温度計はこの一般的な概念とは異なり、トランス作用性誘導物質とは独立して機能する。ジッパー型とスイッチ型の2種類のRNAサーモメーターが報告されている(1)。どちらのタイプのRNAサーモメーターも、5′非翻訳領域（5′UTR）の温度感受性メッセンジャーRNA（mRNA）二次構造からなり、リボソーム結合部位を持ち、シャイン-ダルガーノ配列としても知られている(2)。RNA温度計は単純な熱力学的原理に従って機能すると考えられている。ジッパー状のRNAサーモメーターの例としては、ROSE（熱ショック遺伝子発現抑制）エレメントがある(3,4)。生育温度が低いと、5′UTRは相補的な塩基対形成を介して構造化され、その結果、リボソーム結合部位はマスクされる（すなわち、二本鎖構造に閉じ込められる）。翻訳開始のために30Sリボソームサブユニットがアクセスするには、シャイン-ダルガーノ配列が一本鎖である必要があるため、タンパク質合成は低い生育温度ではほとんど抑制される。より高い生育温度に移行すると、二次構造が溶けてリボソーム結合部位が露出し、より高い速度で翻訳が開始されるようになる。対照的に、スイッチのようなRNA温度計は低温での翻訳を可能にする。よく研究されている例として、コールドショック応答を担うcspAがある(5)。高温では、cspA mRNAは5′UTRとコード領域との相互作用を含む二次構造を形成する。この相互作用によってリボソーム結合部位が隠され、翻訳が抑制される。温度が下がると、cspA mRNAはリボソーム結合部位を露出させる構造変化を起こす。その結果、これらの交互かつ互いに排他的なコンフォメーション間のスイッチにより、シャイン-ダルガーノ配列のアクセス性が決定される。

天然のRNA温度計は主にバクテリアで発見されている。病原性細菌では、感染過程における宿主の温度変化に応答して、病原性遺伝子の発現に関与している可能性がある(6-9)。天然のRNA温度計の二次構造は複雑であることが多く、温度変化に伴うRNA構造の構造変化も複雑である(10-12)。潜在的なRNA温度計を同定するために、RNA構造特性の予測に焦点を当てたバイオインフォマティック・プラットフォームが確立されている(13)。しかし、比較的単純なステムループ型構造も温度計として働くことが分かっている(12)。さらに、最小サイズのRNAサーモメーターも合成的に設計されている。ステム-ループ構造の自由エネルギーを生理的な温度範囲に調整し、様々な関連パラメータ（ステムのサイズや配列、ループのサイズなど）をテストすることで、細菌の翻訳に温度応答性を付与する小型の合成温度計を構築することが可能になった(14-16)。最近では、熱力学的計算を用いて、多様な温度応答（感度と閾値が異なる）を持つ合成RNA温度計が開発されている(17)。合成RNA温度計はまた、幅広い発現宿主に適合し、その機能にはトランス作用性タンパク質因子や化学的誘導剤を必要としないことから、合成生物学における重要なパーツであり、魅力的なモジュールとなっている(18)。バイオテクノロジーや合成生物学に貴重なRNAのみのツールを提供する一方で、その作用機序から、天然および合成の温度計は通常ある種のリーク性を示すため、遺伝子発現の厳密なオン／オフスイッチとしては機能しない。とはいえ、RNA温度計は、大腸菌、エルシニア菌、シュードモナス・プティダなど、さまざまな細菌で組換えタンパク質の生産に使われてきた(14,19,20)。

葉緑体の小さなゲノムは細菌由来であり、翻訳の基本的なメカニズムは10億年以上の進化を経ても保持されている(21,22)。この保存性の高さには、葉緑体遺伝子の多く（全てではない）の翻訳開始にシャイン-ダルガーノ配列が使われていることも含まれる(23-25)。葉緑体（あるいはミトコンドリア）ゲノムにはRNAサーモメーターは見つかっていないが、シャイン-ダルガルノ依存的な翻訳開始が保持されていることを考えると、RNAサーモメーターが葉緑体の遺伝子発現にも機能している可能性が考えられる。というのも、操作された器官ゲノムの遺伝子や導入遺伝子の発現を誘導するツールは乏しいからである。というのも、オルガネラ工学の重要な利点のひとつである、オルガネラ遺伝子の母系遺伝による導入遺伝子の封じ込め性の向上が損なわれてしまうからである(32)。注目すべき例外は、Lacリプレッサーに基づく発現システム(33)、タバコプラスチドにおけるリボスイッチに基づく誘導システム(34-36)、クラミドモナスの葉緑体における翻訳リードスルーに基づく低温誘導システム(37)である。これらのシステムにはそれぞれ利点と欠点があり、後者には（しばしば有毒な）インデューサー分子の外部適用への依存や、非誘導条件下での実質的なリークなどがある。

プラスチド遺伝子発現制御のためのRNAサーモメーターの可能性を探るため、我々はモデル藻類クラミドモナス（Chlamydomonas reinhardtii）の葉緑体ゲノムで合成RNAサーモメーターをテストした。その結果、これまでに報告されている（バクテリア用に設計された）温度計では、葉緑体における生理的温度での遺伝子発現が不可能であることがわかった。驚くべきことに、我々は葉緑体psaA mRNAの5′UTRに、RNA温度計として働き、葉緑体とバクテリアの両方で導入遺伝子に温度依存性発現を与える内因性エレメントを発見した。

材料と方法
藻類株と生育条件
葉緑体形質転換のレシピエント株として、Chlamydomonas reinhardtii TN72株（ΔpsbH、細胞壁欠損）を用いた(38)。この株は寒天で固めたトリス-酢酸-リン酸(TAP)培地上で、22-25℃、連続弱光(10 μE m-2 s-1)の条件下、あるいは液体TAP培地中で、25℃、連続弱光(10 μE m-2 s-1)の条件下、ロータリーシェーカー(120 rpm)で維持した。葉緑体形質転換（トランスプラストミック）株を選抜し、高塩分最小（HSM）培地で維持した（39）。細胞密度は、Z2 Coulter Counter (Beckman Coulter, Krefeld, Germany)を用いた細胞計数により測定した。熱誘導実験では、培養液を液体TAP培地（15 ml）中、25℃で定常期まで増殖させた後、2本の三角フラスコ（各5 ml）に移し、40℃で6時間インキュベートした（120 rpmで振盪し、100 μE m-2 s-1で連続照明）。温度応答曲線を記録するため（20、25、30、35、40℃で増殖実験）、培養液を液体TAP培地（30 ml）で20℃で定常期まで増殖させた後、新しい三角フラスコ（各5 ml）に移し、指定温度で6時間培養した（120 rpmで振とう、100 μE m-2 s-1で連続照明）。

菌株と増殖条件
大腸菌One Shot™ TOP10株（Invitrogen, Karlsruhe, Germany）を形質転換実験のレシピエント株として用いた。ヒートショック形質転換を行い、得られた形質転換体を、アンピシリン（100μg/ml）を添加した寒天固化ルリアベルタニ（LB）培地上で、37℃で選択した。RNA温度計の機能を調べるため、遺伝子発現の温度依存的誘導をアッセイした。この目的のために、個々のコロニーを摘み取り、18℃の液体LB培地（100μg/mlのアンピシリン入り）にロータリーシェーカー（180rpm）で接種した。培養物の600 nmの光学密度（OD600）が0.6に達したら、新鮮なLB培地で希釈し、OD600が1.0になるまで指定温度（18、25、37、42℃）で培養した。その後、タンパク質を分離するためにサンプルを採取した。p24-Nefの蓄積に対する温度効果を調べるために、対応する形質転換株(40)の個々のコロニーを摘み取り、25℃の液体LB培地（100μg/mlアンピシリンを含む）にロータリーシェーカー（180rpm）で接種した。培養物のOD600が0.6に達したところで、新鮮なLB培地で希釈し、OD600が1.0に達するまで25℃または40℃で培養した。その後、タンパク質の単離のためにサンプルを採取した。

ベクターの構築
mVenus-HA、HMGB1-FLAG、Cpl-1-HAおよびp24-Nefコード配列は、かずさCAIテーブル(41)を用いてクラミドモナス葉緑体での発現にコドン最適化し、化学合成した（GeneArt, Regensburg, Germany）。形質転換プラスミドは、SapIおよびSphI制限部位を用いて、葉緑体発現ベクターpASapI（atpAプロモーターおよび5′UTR）およびpSRSapI（psaAプロモーターおよび5′UTR）に対応する導入遺伝子を挿入することにより作製した（38）。atpAプロモーターとpsaA 5′UTRを組み合わせたキメラ発現エレメント（PatpA：psaA）、psaAプロモーターとatpA 5′UTRを組み合わせたキメラ発現エレメント（PpsaA． atpA）、SRT_U0 5′ UTRを有するpsaAプロモーター、およびSRT_U6 5′ UTRを有するpsaAプロモーター（14）をPCRによって作製し、固有のMluIおよびNcoI制限部位を用いて対応する発現ベクターに挿入した。大腸菌用の緑色蛍光タンパク質（GFP）発現ベクターは、BamHIおよびNcoI制限部位を用いて、rRNAオペロンプロモーターとGFPコード配列との間にpsaA 5′ UTRのバージョン（WT、ΔHPおよびΔSD）を挿入することによって作製した。変異ヘアピン構造（m1-m4）を持つmVenus-HA発現ベクターは、HiFi DNAアセンブリークローニングキット（New England Biolabs）を用いて、psaAプロモーターとmVenus-HAコード配列の間にpsaA 5′ UTRの改変バージョンを挿入することにより作製した。PCR増幅は、Phusion High-Fidelity DNA Polymerase（Thermo Fisher）を用いて、製造者の指示に従って行った。本研究で使用したすべてのプライマーを補足表S1に示す。すべてのベクターのクローニングは大腸菌DH5α株で行った。大規模プラスミド調製は、NucleoBond Xtra Midiキット（Macherey-Nagel）を用いて行った。

Chlamydomonas reinhardtiiの葉緑体形質転換
葉緑体形質転換実験には、ガラスビーズ形質転換法を適用した(42)。TN72株を液体TAP培地で対数期初期（すなわち細胞密度1×106個/ml）まで培養した。その後、3000g、5分間の遠心分離で細胞を回収し、細胞ペレットをTAP培地に再懸濁し、細胞密度が1×108個/mlになるようにした。300μlの細胞懸濁液を、0.3gのガラスビーズ（Sigma-Aldrich）および5μgの形質転換ベクターの環状プラスミドDNAと混合した。混合物を最大速度で15秒間ボルテックスし、その後HSMプレートにまいた。このプレートを22～25℃のグロースチャンバー内で、連続光（100 μE m-2 s-1）下で4週間培養し、光独立栄養を選択した。

マイクロプレートリーダーによる蛍光測定
選択プレートから形質転換候補コロニーを摘出し、100μl の TAP 培地中で96ウェル透明プレート（Corning™ Costar™ 96 ウェル平底マイクロプレート；Thermo Fisher）で培養した。細胞を増殖チャンバー内で対数期中期まで増殖させ、CLARIOstar® マイクロプレートリーダー（BMG LABTECH GmbH, Ortenberg, Germany）を用いて蛍光測定を行った。mVenus 蛍光強度の測定には、494 nm（バンド幅 18 nm）での励起と538 nm（バンド幅 20 nm）での発光が用いられた。OD750は標準化のために決定された。バックグラウンドの減算とデータ解析は、MARS Data Analysis Software（BMG LABTECH GmbH, Ortenberg, Germany）で行った。

タンパク質の単離
クラミドモナスの全タンパク質抽出物をSDS-PAGEおよびウェスタンブロット分析用に調製した。この目的のために、3ml培養の藻類細胞を3000gで5分間遠心分離して回収し、細胞ペレットを200μlのタンパク質抽出バッファー［50mM HEPES/KOH pH7.5、10mM KAc、5mM MgAc、1mM EDTA、1% Triton X-100、1mM DTT、1×プロテアーゼ阻害剤カクテルcOmplete（Roche）］に再懸濁した。細胞溶解は、1mlシリンジ付き27G注射針を用いて再懸濁（15回）を繰り返すことにより誘導した。得られた細胞溶解液を氷上で30分間インキュベートし、続いて15,000gで15分間遠心した。上清をタンパク質抽出液として回収し、SDS-PAGEサンプルバッファーで95℃、5分間変性させた。大腸菌の全タンパク質抽出物は以下のように調製した。培養液を所定の温度でOD600が1.0になるまで培養した後、培養液の3mlアリコートを5000gで5分間遠心分離して回収した。細胞ペレットを液体窒素で凍結し、400μlの溶解バッファー（50mM HEPES、300mM NaCl、0.5% SDS、pH 8.0）に再懸濁した。その後、サンプルを氷上で30分間インキュベートし、続いて超音波処理（振幅10%、15秒；Sonifier, W-250 D, G. Heinemann Ultraschall und Labortechnik, Germany）を行った。その後、溶解液を5000gで10分間遠心し、上清をタンパク質抽出液として回収し、SDS-PAGEサンプルバッファーで95℃、5分間変性させた。

SDS-PAGEおよびウェスタンブロット分析
タンパク質サンプルを変性12% SDS-PAAゲルで電気泳動分離し、標準的なブロッティング技術を用いてPVDF（ポリフッ化ビニリデン）膜（HybondTM; GE Healthcare, UK）に転写した。その後、膜をブロッキングバッファー（1×TBS-T中5％粉乳）と共に室温で1時間インキュベートした。TBS-Tで数回洗浄した後、膜を一次抗体とともに4℃で一晩インキュベートした：抗GFP (JL-8; Clontech, 1:1000), 抗FLAG (F7425, Sigma-Aldrich, 1:1000), 抗HA (THETM HA Tag, GenScript, 1:1000), 抗p24 (ab9071, Abcam, 1:1000) および抗PsaA (AS06172, Agrisera, 1:1000)。その後、HRP標識二次抗体（マウス, AS111772, 1:25 000; ウサギ, AS09602, 1:10 000, Agrisera）を加え、膜を室温で1時間インキュベートした。化学発光シグナル検出にはECL PlusTM検出システムを用いた。ポンソーSによる膜の染色、またはクマシーブリリアントブルーによるゲルの染色を、等ローディングのコントロールとして行った。リコンビナントGFP（rGFP; Roche）を標準として用いた。相対的タンパク質量は、Fiji ソフトウェア（https://imagej.net/software/fiji/）を用いたバンド強度測定により定量した。統計解析はWelchのt検定を用いて行った。

共焦点レーザー顕微鏡
mVenus-HAの葉緑体発現を調べるために、TCS SP8装置（Leica）を用いて共焦点顕微鏡観察を行った。mVenus蛍光は、励起用アルゴンレーザー（514 nm）を用いて検出し、525-555 nmの蛍光発光を記録した。クロロフィル蛍光はアルゴンレーザーを用いて励起（514 nm）し、650-700 nmの発光を分析した。大腸菌のGFP検出には、488 nmのアルゴンレーザーで励起し、500-545 nmの発光を分析した。

RNA二次構造予測
合成温度計SRT_U0とSRT_U6のRNA二次構造は、以前に発表された研究(14)から採用した。atpAおよびpsaAの5′UTRのRNA二次構造の予測は、Mfoldウェブサーバー（v.2.3；43）およびViennaRNA RNAfoldウェブサーバー（44）のアルゴリズムを用いて行った。

RNA単離とノーザンブロット解析
TRIzol®試薬（Thermo Fisher Scientific）を用いて、指定温度（20、25、30、40℃）で培養した藻類から、製造元のプロトコールに従って全RNAを抽出した。RNA収量は、Nanodrop装置（Thermo Fisher Scientific）を用いて測定した。mVenus-HAおよびpsaAの発現は、以前に記載されたように実施したノーザンブロット分析によって評価した（45）。mVenusのコード配列に対応する放射能標識RNAプローブは、MAXIscript® Kit（Thermo Fisher Scientific）を用いて、製造業者のプロトコールに従い、[α-32P]-UTP（Hartmann Analytic GmbH）を用いて合成した。この鋳型を、補足表S1に示したプライマーoVL528とoVL529を用いてPCR増幅した。プライマーoKPC326およびoKPC327（補足表S1）を用いたPCR増幅により、psaAのエクソン3に対するハイブリダイゼーションプローブを作製し、[α-32P]-dCTPを用いたランダムプライミングにより放射性同定した。

結果
藻類プラスチドにおけるプラスチドpsaA遺伝子の5′UTRからの遺伝子発現の温度誘導性
我々は以前、Shine-Dalgarno配列を持つ5′UTRの単純なステム-ループ構造からなる一連の低分子合成RNAサーモメーターを開発した(14)。この温度計は、高温でRNA二次構造が融解することにより、大腸菌で遺伝子発現の温度誘導性を与えた。このような合成RNAサーモメーター（SRT）が葉緑体における遺伝子発現を温度依存的に変化させるのにも使えるかどうかを調べるため、mVenus蛍光タンパク質のHAタグ付きバージョンをコードするレポーター遺伝子に融合した合成サーモメーター（SRT_U0とSRT_U6; 14）を緑藻クラミドモナス（Chlamydomonas reinhardtii）の葉緑体ゲノムに導入した（補足図S1とS2）。最初のテストでは2つの対照構築物を用い、(i)psaAプロモーターと5′UTR、および(ii)atpAプロモーターと5′UTR（いずれもクラミドモナスプラスチド由来）によってレポーター発現を駆動した（図1A）。これらの発現エレメント（PatpA:atpAおよびPpsaA:psaA）は、クラミドモナス葉緑体における導入遺伝子の発現を駆動するために頻繁に用いられる(46,47)。

図1.
クラミドモナス（Chlamydomonas reinhardtii）葉緑体における温度制御トランスジーン発現のための推定RNA温度計の同定。(A）クラミドモナスの葉緑体ゲノムに導入されたmVenus-HA発現カセットのマップ。psaAプロモーターと5′UTR（PpsaA:psaA）およびatpAプロモーターと5′UTR（PatpA:atpA）によって駆動されるmVenus-HAコンストラクトは、安定形質転換によって葉緑体ゲノムに導入された。(B）mVenus-HAの発現レベルを決定し、RNAサーモメーター活性を試験するためのワークフロー。(C）25℃および40℃におけるトランスプラストミック株の葉緑体におけるmVenus-HAの発現を可視化するための共焦点レーザー走査顕微鏡。拡大挿入図（右下隅）は、個々の細胞におけるmVenus蛍光シグナルの葉緑体局在を示す（矢印で示す）。スケールバー、10μm。(D) レポータータンパク質発現の熱誘導性のイムノブロット解析。熱誘導の際、25℃と40℃で培養した培養物から全タンパク質サンプルを抽出した。レポータータンパク質mVenus-HAの免疫検出には、抗GFP抗体（α-GFP）を用いた（mVenusはGFP変異体であるため、抗GFP抗体で検出できる）。下のバンド（<25 kDa）はmVenus-HAの分解産物（C-末端HAタグを欠く）を表す。20μgタンパク質のサンプルを100%としてロードした。組換え緑色蛍光タンパク質(rGFP)の希釈系列を標準として用いた。サンプル（PpsaA:psaA、40℃）を2倍希釈系列（100%から6.25%まで）でロードし、タンパク質存在量の半定量的評価を行った。形質転換していないTN72株のタンパク質抽出物を陰性対照として用いた。タンパク質ゲルのクマシーブリリアントブルー（CBB）染色は、ローディングコントロールを提供するために行った。
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クラミドモナス（Chlamydomonas reinhardtii）葉緑体における温度制御導入遺伝子発現のための推定RNA温度計の同定。(A）クラミドモナスの葉緑体ゲノムに導入されたmVenus-HA発現カセットのマップ。psaAプロモーターと5′UTR（PpsaA:psaA）およびatpAプロモーターと5′UTR（PatpA:atpA）によって駆動されるmVenus-HAコンストラクトは、安定形質転換によって葉緑体ゲノムに導入された。(B）mVenus-HAの発現レベルを決定し、RNAサーモメーター活性を試験するためのワークフロー。(C）25℃および40℃におけるトランスプラストミック株の葉緑体におけるmVenus-HAの発現を可視化するための共焦点レーザー走査顕微鏡。拡大挿入図（右下隅）は、個々の細胞におけるmVenus蛍光シグナルの葉緑体局在を示す（矢印で示す）。スケールバー、10μm。(D) レポータータンパク質発現の熱誘導性のイムノブロット解析。熱誘導の際、25℃と40℃で培養した培養物から全タンパク質サンプルを抽出した。レポータータンパク質mVenus-HAの免疫検出には、抗GFP抗体（α-GFP）を用いた（mVenusはGFP変異体であるため、抗GFP抗体で検出できる）。下のバンド（<25 kDa）はmVenus-HAの分解産物（C-末端HAタグを欠く）を表す。20μgタンパク質のサンプルを100%としてロードした。組換え緑色蛍光タンパク質(rGFP)の希釈系列を標準として用いた。サンプル（PpsaA:psaA、40℃）を2倍希釈系列（100%から6.25%まで）でロードし、タンパク質存在量の半定量的評価を行った。形質転換していないTN72株のタンパク質抽出物を陰性対照として用いた。タンパク質ゲルのクマシーブリリアントブルー（CBB）染色は、ローディングコントロールを提供するために行った。

葉緑体形質転換は、確立されたガラスビーズ形質転換プロトコルを用いて行った(42)。形質転換（トランスプラストミック）藻類クローンは、葉緑体ゲノムに必須光化学系ⅡサブユニットPsbHの破壊された遺伝子を持つ非光合成レシピエント株（38,42）において光独立栄養成長を回復させることにより選択した（補足図S1）。ホモプラストミックなトランスプラストミック株を単離し（42）、2つの生育温度（25℃対40℃；図1B）でmVenus蛍光強度を比較することにより、温度誘導性を試験した。合成温度計（SRT_U0とSRT_U6）はレポーターの発現を示さなかったが（補足図S2C,D）、これはおそらく合成5′UTRの5′末端に安定化エレメントがなく、キメラmRNAがクラミドモナス葉緑体中で分解されやすいためであろう（48）。

驚いたことに、psaAプロモーターと5′UTRからは、期待された構成的な温度非依存性発現は観察されなかった。その代わりに、PpsaA:psaAトランスプラストミック株では、藻類培養を25℃から40℃に移すと、レポータータンパク質の蓄積とmVenus蛍光が強く増加することがわかった（図1C,D）。対照的に、atpA発現エレメントは温度に反応せず、mVenus蛍光（図1C）もタンパク質蓄積（図1D）も25℃と40℃ではほとんど変わらなかった。この発見は、温度誘導性がクラミドモナスにおける葉緑体遺伝子発現の一般的な性質ではなく、psaAプロモーターおよび／または5′UTRの特異的な性質である可能性を示唆している。

次に、psaA発現エレメントからのレポータータンパク質発現の温度誘導性が、プロモーターに由来するのか、5′UTRに由来するのかを調べたいと考えた。この目的のために、我々は2つの新しい葉緑体形質転換コンストラクトを設計した。(i) psaA 5′ UTRをatpA 5′UTR と交換し（PpsaA:atpA::mVenus-HA; 図2A）、(ii) psaAプロモーターをatpAプロモーターと交換した（PatpA:psaA::mVenus-HA; 図2A）。psaAプロモーターとatpA 5′ UTRの組み合わせは温度誘導性を示さなかったが、atpAプロモーターとpsaA 5′ UTRからレポーターを発現する株では、mVenus-HA発現の強い誘導が見られた（図2B）。これらの観察結果は、レポータータンパク質発現の温度誘導性がpsaA 5′ UTRによってもたらされることを強く示唆している。

図2.
psaA 5′ UTRはクラミドモナス葉緑体においてレポータータンパク質発現の温度誘導性を与える。(A）psaAプロモーターとatpA 5′ UTR（PpsaA:atpA）、またはatpAプロモーターとpsaA 5′ UTR（PatpA:psaA）の組み合わせによって駆動されるmVenus-HA発現カセットのマップ。(B）レポータータンパク質蓄積の熱誘導性のイムノブロット分析。熱誘導の際、全タンパク質サンプルを25℃または40℃でインキュベートした培養物から抽出した。抗GFP抗体（α-GFP）を用いてウェスタンブロッティングを行い、mVenus-HAの存在量を測定した。20μgタンパク質のサンプルを100%として負荷した。リコンビナントGFP（rGFP）の希釈系列を標準として用いた。サンプル（PatpA:psaA、40℃）を2倍希釈系列（100%から6.25%）でロードし、タンパク質量の半定量的評価を行った。形質転換していないTN72株のタンパク質抽出物を陰性対照として用いた。タンパク質ゲルのクマシーブリリアントブルー（CBB）染色は、ローディングコントロールを提供するために行った。
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psaA 5′ UTRはクラミドモナス葉緑体におけるレポータータンパク質発現の温度誘導性を与える。(A）psaAプロモーターとatpA 5′UTR（PpsaA:atpA）、またはatpAプロモーターとpsaA 5′UTR（PatpA:psaA）の組み合わせで駆動されるmVenus-HA発現カセットのマップ。(B）レポータータンパク質蓄積の熱誘導性のイムノブロット分析。熱誘導の際、全タンパク質サンプルを25℃または40℃でインキュベートした培養物から抽出した。抗GFP抗体（α-GFP）を用いてウェスタンブロッティングを行い、mVenus-HAの存在量を測定した。20μgタンパク質のサンプルを100%として負荷した。リコンビナントGFP（rGFP）の希釈系列を標準として用いた。サンプル（PatpA:psaA、40℃）を2倍希釈系列（100%から6.25%）でロードし、タンパク質量の半定量的評価を行った。形質転換していないTN72株のタンパク質抽出物を陰性対照として用いた。タンパク質ゲルのクマシーブリリアントブルー（CBB）染色は、ローディングコントロールを提供するために行った。

psaA 5′ UTRにおける推定RNA温度計の同定
psaA 5′ UTRは温度誘導性を与えるが、atpA 5′ UTRは与えないことを示したので、次にpsaA 5′ UTRからの温度依存性発現の構造的基礎を同定しようとした。既知のRNA温度計はすべて、RNA二次構造の温度による構造変化によって機能するため、psaAとatpA両方の5′UTRと開始コドン領域を含むmRNA配列の二次構造のインシリコ解析を行った。予想されたように、どちらのUTRも複雑な二次構造に容易に折り畳むことができた（補足図S3およびS4）。これは、葉緑体における翻訳制御とmRNA安定性の制御に構造化された5′UTR配列が関与していることを示唆する過去の多くの研究結果と一致している（49,50）。興味深いことに、atpA配列がAUG開始コドンのすぐ上流の領域に二次構造を示さなかったのに対し（補足図S4）、psaA 5′ UTRは開始コドンの上流にステムループ構造を示した（補足図S3）。注目すべきことに、この構造はシャイン-ダルガーノ配列を含み、以前に設計された最小サイズの合成RNA温度計について報告された二次構造を彷彿とさせる（14）。この発見は、成長温度を25℃から40℃に上げることで、シャイン-ダルガルノ配列を含むステムループ構造が融解し、リボソーム結合部位のマスクが外され、効率的な翻訳開始が促進される可能性を提起している。

psaAステムループ構造は大腸菌のRNA温度計として機能する
psaAの5′UTRに推定上のRNA温度計が同定されたこと、またそのサイズが小さく単純な構造である可能性があることから、観察された遺伝子発現の温度応答性が、葉緑体に存在するトランス作用タンパク質因子とは無関係であるかどうかを調べることになった。そこで我々は、大腸菌においてレポーター遺伝子発現の温度応答性を得るために、小さなステムループ構造が必要かつ十分であるかどうかを調べることにした。この目的のために、推定されるpsaA温度計構造を、大腸菌における5′UTRの温度応答性翻訳を調べるのに適した、以前に設計されたレポーター構築物（レポーターとしてGFPを使用）に組み込んだ(14)。RNAの二次構造が温度応答性に必要かどうかを調べるために、ステム構造における塩基対形成をなくす3つのヌクレオチド置換を導入してヘアピンを除去した（ΔHP構築体；図3A,B）。追加のコントロール構築物として、Shine-Dalgarno配列を除去するが、ステム-ループ構造は保持する4つの変異を導入した（ΔSD構築物；図3A,B）。

図3.
psaA 5′ UTRは大腸菌においてRNA温度計として機能する。(A）クラミドモナス由来のrRNAオペロンプロモーター（Prrn）と葉緑体psaA 5′ UTRの異なるバージョン（WT、ΔHP、ΔSD）によって駆動されるGFP発現カセットの模式図。Shine-Dalgarno配列を赤で示す。変異したヌクレオチドはアスタリスクで示す。HP、ヘアピン。SD、シャイン-ダルガルノ配列。(B）WT、ΔHPおよびΔSD psaA 5′ UTR配列の予測RNA二次構造。シャイン-ダルガルノ配列は赤で、翻訳開始コドンは青で示した。導入されたヌクレオチド置換はアスタリスクで示す。(C）レポータータンパク質GFPの温度依存的蓄積。熱誘導の際、18℃、25℃、37℃で培養した菌体から総タンパク質を抽出した。抗GFP抗体（α-GFP）を用いてイムノブロット検出を行った。サンプル（WT、37℃）と（ΔHP、37℃）の2倍希釈系列を負荷し、タンパク質量の半定量的評価を行った。タンパク質ゲルのクマシーブリリアントブルー（CBB）染色は、ローディングコントロールを提供するために行った。(D）共焦点レーザー走査型顕微鏡による、大腸菌における温度依存性GFP蓄積の可視化。GFP蛍光は、それぞれ18℃、25℃、37℃で培養した形質転換細菌培養で測定した。スケールバーは10μm。
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psaA 5′ UTRは大腸菌においてRNA温度計として機能する。(A）クラミドモナス由来の葉緑体psaA 5′ UTRの異なるバージョン（WT、ΔHP、ΔSD）とrRNAオペロンプロモーター（Prrn）によって駆動されるGFP発現カセットの模式図。Shine-Dalgarno配列を赤で示す。変異したヌクレオチドはアスタリスクで示す。HP、ヘアピン。SD、シャイン-ダルガルノ配列。(B）WT、ΔHPおよびΔSD psaA 5′ UTR配列の予測RNA二次構造。シャイン-ダルガルノ配列は赤で、翻訳開始コドンは青で示した。導入されたヌクレオチド置換はアスタリスクで示す。(C）レポータータンパク質GFPの温度依存的蓄積。熱誘導の際、18℃、25℃、37℃で培養した菌体から総タンパク質を抽出した。抗GFP抗体（α-GFP）を用いてイムノブロット検出を行った。サンプル（WT、37℃）と（ΔHP、37℃）の2倍希釈系列を負荷し、タンパク質量の半定量的評価を行った。タンパク質ゲルのクマシーブリリアントブルー（CBB）染色は、ローディングコントロールを提供するために行った。(D）共焦点レーザー走査型顕微鏡による、大腸菌における温度依存性GFP蓄積の可視化。GFP蛍光は、それぞれ18℃、25℃、37℃で培養した形質転換細菌培養で測定した。スケールバーは10μm。

熱誘導実験における3つの異なる温度（18、25、37℃）でのレポータータンパク質の蓄積の比較から、psaA 5′UTRの野生型ヘアピンは、大腸菌における遺伝子発現の顕著な温度応答性をもたらすことが明らかになった。これとは対照的に、ΔHPコンストラクトを保有する菌株では、温度シフトに伴うトランスジーン発現に対する温度の影響ははるかに小さい（図3C）。温度によるタンパク質の蓄積量の増加は、おそらくタンパク質合成過程の一般的な温度依存性（37℃で最適になる；51）と、高温でのプラスミドのコピー数の多さを反映している（52）。予想通り、シャイン-ダルガルノ配列の2つのヌクレオチド置換は、レポータータンパク質の蓄積を完全に消失させた。このことは、psaA 5′ UTRにおける翻訳開始がシャイン-ダルガルノ依存性であることを示唆している（図3C）。

大腸菌におけるRNA温度計としてのpsaAヘアピンの機能をさらに確認するため、共焦点レーザー走査型顕微鏡を用いて、3つの生育温度における細菌のGFP蛍光を分析した。ΔHPコンストラクトを保有する細菌は、培養を25℃に移すとすでに強い蛍光を示したが、野生型psaAヘアピン配列を保有する細菌は、培養温度を37℃に上げたときにのみ強い蛍光を示した（図3D）。

これらを総合すると、大腸菌における葉緑体psaA 5′ UTRの温度応答性とそのヘアピン構造依存性は、このエレメントが本物のRNA温度計であることを強く示唆している。

二次構造の改変が葉緑体における温度計の性質を変える
もしpsaA 5′ UTR内のヘアピン構造がRNA温度計の性質を担っているのであれば、その構造の安定性（すなわち融解温度）を変えるだけでスイッチ温度を変えることができるはずである(16)。この考えを検証するために、ヘアピン構造の一連の変異バージョンが構築された（図4）。psaAプロモーターとpsaA 5′UTRの異なるバージョン（psaA、m1、m2、m3およびm4）によって駆動されるmVenus-HA構築物が、安定形質転換によってクラミドモナス葉緑体ゲノムに導入された（図4A-E）。得られたトランスプラストミック株は、温度応答曲線を記録することによって解析された。

図4.
ヘアピン構造の改変は、psaA 5′ UTRの温度計特性を変化させる。(A-E）ネイティブなpsaA 5′UTRと修飾ヘアピンm1、m2、m3、m4のヘアピンのRNA二次構造。シャイン-ダルガーノ配列を赤で示し、開始コドン部位を青で示し、変異ヌクレオチドをアスタリスクで示す。m1では、導入された点変異により、シャイン-ダルガルノ配列は失われたが、ヘアピン構造は保持された。対照的に、変異体m2からm4では、ヘアピン構造の安定性が変化している。m2で導入された点変異はヘアピン構造を弱めるが、m3とm4では塩基対を追加挿入することで、より安定なヘアピン構造が作られる。(F-J)イムノブロッティングによって評価した、異なるトランスプラストミクス株の葉緑体における温度依存的なレポータータンパク質の蓄積。異なるpsaA 5′UTRバリアントの温度応答性を決定するために、トランスプラストミック株をまず20℃で培養し、次に新鮮な培地に移し（Methods参照）、指定した温度（20、25、30、35、40℃）で6時間インキュベートした。藻類培養物から全タンパク質を抽出し、レポータータンパク質mVenus-HAの蓄積を抗GFP抗体（α-GFP）を用いて測定した。40℃サンプルの2倍希釈系列を負荷し、タンパク質量の半定量的評価を行った。(F)と(H)では20μgのタンパク質を100%として、(G)、(I)、(J)では50μgのサンプルを100%としてロードした。リコンビナント GFP（rGFP）の希釈系列を標準として用いた。陰性対照として、形質転換していない TN72 株のタンパク質抽出物を用いた。タンパク質ゲルのクマシーブリリアントブルー（CBB）染色は、ローディングコントロールを提供するために行った。
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ヘアピン構造の改変は、psaA 5′ UTRの温度計の特性を変化させる。(A-E）ネイティブのpsaA 5′UTRと改変ヘアピンm1、m2、m3、m4のヘアピンのRNA二次構造。シャイン-ダルガーノ配列を赤で示し、開始コドン部位を青で示し、変異ヌクレオチドをアスタリスクで示す。m1では、導入された点変異により、シャイン-ダルガルノ配列は失われたが、ヘアピン構造は保持された。対照的に、変異体m2からm4では、ヘアピン構造の安定性が変化している。m2で導入された点変異はヘアピン構造を弱めるが、m3とm4では塩基対を追加挿入することで、より安定なヘアピン構造が作られる。(F-J)イムノブロッティングによって評価した、異なるトランスプラストミクス株の葉緑体における温度依存的なレポータータンパク質の蓄積。異なるpsaA 5′UTRバリアントの温度応答性を決定するために、トランスプラストミック株をまず20℃で培養し、次に新鮮な培地に移し（Methods参照）、指定した温度（20、25、30、35、40℃）で6時間インキュベートした。藻類培養物から全タンパク質を抽出し、レポータータンパク質mVenus-HAの蓄積を抗GFP抗体（α-GFP）を用いて測定した。40℃サンプルの2倍希釈系列を負荷し、タンパク質量の半定量的評価を行った。(F)と(H)では20μgのタンパク質を100%として、(G)、(I)、(J)では50μgのサンプルを100%としてロードした。リコンビナント GFP（rGFP）の希釈系列を標準として用いた。陰性対照として、形質転換していない TN72 株のタンパク質抽出物を用いた。タンパク質ゲルのクマシーブリリアントブルー（CBB）染色は、ローディングコントロールを提供するために行った。

ヘアピンの一次配列が温度誘導性に必要でないことを確認するために、2塩基対を反転させた（変異体m1；図4B）。これらの変異はヘアピンの配列を変えるが、野生型の熱力学的安定性は完全に保持する。やむを得ず、2つの塩基対が反転した結果、シャイン-ダルガーノ配列がなくなり、予想通り翻訳速度が強く低下した(23)。それにもかかわらず、温度誘導性は維持されており（図4F,G）、温度応答性がヘアピンの一次構造ではなく、二次構造によってもたらされることと一致している。ヘアピンのステムを、2つのGC塩基対をGU塩基対に変えて弱めた場合（変異体m2；図4C）、レポータータンパク質の実質的な蓄積はすでに30℃で観察された（図4H）。対照的に、ヘアピンのステムを1塩基対（変異体m3；図4D）または2塩基対（変異体m4；図4E）延長した場合、レポータータンパク質の発現は、20℃と30℃の間の温度では検出できないほど低かった（図4I,J）。塩基対を2つ追加したコンストラクトm4では、温度上昇に対する応答は完全に消失した（図4J）。これらの結果を総合すると、変異型m4の強固な二次構造は高温でも安定である（40℃では融解しない）ことが示唆される。m3およびm4温度計のスイッチ温度の上昇を考慮し、さらに高い増殖温度で培養することにより、その温度誘導性をテストしようと試みた。しかし、40℃以上の温度で培養した藻類では、熱による白化や細胞死が観察されたため（補足図S5; 53）、藻類細胞において、より高い生育温度でm3とm4のより安定な構造を試験することはできなかった。別の方法として、我々は細菌において、より高い増殖温度でのm3およびm4変異体の熱誘導性を調べた。mVenus-HAは42℃でm3およびm4形質転換体の両方から検出され（補足図S6）、これらの強力な温度計構造は、生育温度をさらに上げることで融解できることが示唆された。

温度依存的なタンパク質蓄積はmVenus-HA mRNAレベルとは相関しない
タンパク質レベルでさまざまな温度計構造体の温度応答性を示したので、次にノーザンブロット実験を行い、異なる生育温度におけるmVenus-HA転写産物の存在量を測定した（図5、補足図S7およびS8）。40℃で、mVenus-HA転写産物の蓄積の増加は、psaA 5′ UTRを保有する形質転換体で観察されたが、atpA 5′ UTRを保有する形質転換体では観察されなかった（構築物中に同じプロモーターが存在するにもかかわらず；図1Aと2A、および図5A,B参照）。転写産物量に対する温度効果をさらに調べるため、ネイティブPpsaA:psaAコンストラクトを保有する株と、変異体m1、m2、m3、m4を保有する株を20、30、40℃で比較した。すべての株で、20℃から30℃への温度シフトに伴うmVenus-HA転写産物の実質的な蓄積は観察されなかったが、40℃ではより高いmVenus-HA mRNAレベルが観察された（図5C）。40℃におけるmVenus-HA転写産物の蓄積は、レポータータンパク質の温度依存性発現に寄与している可能性があるため、次に転写産物量と温度計の特性がmVenus-HA発現に及ぼす影響を分離したいと考えた。この目的のために、異なる温度における転写産物量とタンパク質量の相対的な倍数変化を、すべての変異体について定量した。重要なことは、psaA株、m1株、m2株では30℃でタンパク質レベルが3倍以上増加したにもかかわらず、mVenus-HA転写産物の蓄積は20℃と30℃で同等であったことである（図6）（図6A-Cおよび補足図S9）。これらのデータは、RNA温度計は転写後に作用し、30℃におけるmVenus-HAタンパク質の蓄積の増加は転写産物量の増加によるものではないという結論を支持する。40℃では、転写レベルの上昇と翻訳の温度応答性の両方が、レポータータンパク質の発現増加に寄与している可能性がある（図6A-C）。注目すべきことに、m4株ではmVenus-HA転写産物の存在量が高いにもかかわらず（図5C）、40℃ではmVenus-HAタンパク質の蓄積は起こらず（図4J）、これは溶けない温度計構造が翻訳を許さないことを示唆している。

図5.
熱誘導に伴うトランスプラストミック藻類株におけるmRNAレベルでのmVenus-HAトランスジーンの発現解析。(A）25℃および40℃で培養したPatpA:atpAおよびPpsaA:psaAトランスプラストミック株におけるmVenus-HA転写産物の存在量を、それぞれノーザンブロッティングにより測定した： 各レーンに4μgの全RNAをロードした。(B）25℃および40℃で培養したPpsaA:atpAおよびPatpA:psaAトランスプラストミック株におけるmVenus-HA転写産物の存在量をノーザンブロッティングにより測定した：各レーンに10μgの全RNAをロードした。(C)PpsaA:psaA、PpsaA:m1、PpsaA:m2、PpsaA:m3、PpsaA:m4株におけるmVenus-HA転写産物の存在量をノーザンブロッティングにより測定した： 各レーンに4μgの全RNAをロードした。すべての実験において、メチレンブルーで染色したブロットをイコールローディングのコントロールとして示した。atpA 5′ UTRを持つmVenus-HA転写産物の予想サイズは1.1 kbで、psaA 5′UTRを持つmVenus-HA転写産物のサイズは0.9 kbである。この実験は4回行い、同様の結果が得られた。フルサイズのブロットを補足図S7とS8に示す。
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トランスプラストミック藻類株におけるmRNAレベルでのmVenus-HA導入遺伝子の熱誘導による発現解析。(A）25℃および40℃で培養したPatpA:atpAおよびPpsaA:psaAトランスプラストミック株におけるmVenus-HA転写産物の量を、それぞれノーザンブロッティングにより測定した： 各レーンに4μgの全RNAをロードした。(B）25℃および40℃で培養したPpsaA:atpAおよびPatpA:psaAトランスプラストミック株におけるmVenus-HA転写産物の存在量をノーザンブロッティングにより測定した：各レーンに10μgの全RNAをロードした。(C)PpsaA:psaA、PpsaA:m1、PpsaA:m2、PpsaA:m3、PpsaA:m4株におけるmVenus-HA転写産物の存在量をノーザンブロッティングにより測定した： 各レーンに4μgの全RNAをロードした。すべての実験において、メチレンブルーで染色したブロットをイコールローディングのコントロールとして示した。atpA 5′ UTRを持つmVenus-HA転写産物の予想サイズは1.1 kbで、psaA 5′UTRを持つmVenus-HA転写産物のサイズは0.9 kbである。この実験は4回行い、同様の結果が得られた。フルサイズのブロットを補足図S7とS8に示す。

図6.
20、30および40℃で6時間インキュベートした異なるトランスプラストミック株のmVenus-HAタンパク質と転写レベルの相対変化。(A-C）試験した温度におけるmVenus-HAタンパク質量（黒棒）の相対的な倍数変化をウェスタンブロット法で測定し、Fijiソフトウェアを用いてバンド強度を測定した。20℃で測定したmVenus-HAタンパク質のバンド強度は1.0とした（補足図S9参照）。(D,E）m3株とm4株では、20℃でmVenus-HAタンパク質は検出されなかった。したがって、m3株とm4株におけるmVenus-HAタンパク質量の相対的な倍数変化は、数学的に定義されていない（ゼロで除算、水平破線に達する破線の黒棒で表される）。(A-E)mVenus-HA転写物の存在量は、ノーザンブロット法により決定し、Fijiソフトウェアでバンド強度を測定した。20℃で測定したmVenus-HA転写物強度を1.0とした。データは平均値で示し、エラーバーは3反復（n = 3）の標準偏差を表す。アスタリスクは、対応する20℃サンプルに対する有意差（P < 0.05）を示す（Welchのt検定）。
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20℃、30℃、40℃で6時間インキュベートした異なるトランスプラストーム株のmVenus-HAタンパク質および転写レベルの相対変化。(A-C）試験した温度におけるmVenus-HAタンパク質量（黒棒）の相対的な倍数変化をウェスタンブロット法で測定し、Fijiソフトウェアを用いてバンド強度を測定した。20℃で測定したmVenus-HAタンパク質のバンド強度は1.0とした（補足図S9参照）。(D,E）m3株とm4株では、20℃でmVenus-HAタンパク質は検出されなかった。したがって、m3株とm4株におけるmVenus-HAタンパク質量の相対的な倍数変化は、数学的に定義されていない（ゼロで除算、水平破線に達する破線の黒棒で表される）。(A-E)mVenus-HA転写物の存在量は、ノーザンブロット法により決定し、Fijiソフトウェアでバンド強度を測定した。20℃で測定したmVenus-HA転写物強度を1.0とした。データは平均値で示し、エラーバーは3反復（n = 3）の標準偏差を表す。アスタリスクは、対応する20℃サンプルに対する有意差（P < 0.05）を示す（Welchのt検定）。

PsaAタンパク質の蓄積は生育温度に依存しない
psaA 5′ UTRがプラスミドとバクテリアの両方で温度応答性遺伝子発現を与えるRNA温度計を保持していることを示したので、クラミドモナスの葉緑体におけるPsaAタンパク質の蓄積に対する温度計の可能な影響を調べたいと考えた。PsaAタンパク質はPsaBとともに光化学系I反応中心を形成している。光化学系Iは、多数のタンパク質サブユニットと補因子（例えば、光吸収色素や鉄硫黄クラスターなど）からなる、大きなチラコイド膜包埋複合体である。光化学系Iの生合成は高度に制御されており(54,55)、すべてのサブユニットと補因子がタイムリーに利用できるかどうかにかかっている(56,57)。余分なサブユニットは速やかに分解され、必須タンパク質サブユニットの利用可能性が低下すると、光化学系Iの蓄積が制限されることはよく知られている(58)。さらに、未集合のPsaAはそれ自身の翻訳を抑制することが示されている(56)。これらのことを考慮すると、psaA 5′ UTRの温度応答性が、葉緑体におけるPsaAタンパク質および／または光化学系I複合体の蓄積の増加につながる可能性は非常に低いと思われた。それにもかかわらず、我々は25℃と40℃におけるpsaA mRNAの蓄積量とPsaAタンパク質の存在量の両方を比較分析した（補足図S10）。予想通り、psaAの転写産物量は温度によって大きく変化しなかった（補足図S10A）。PsaAタンパク質量も温度によって増加しなかったが（補足図S10B）、これはPsaA合成の緊密な自動調節機構（56）、およびPsaA蓄積の光化学系I複合体への組込み依存性（57-59）と一致している。

結論として、RNA温度計が温度上昇に反応してPsaAタンパク質の存在量を増加させるという証拠はない。実際、psaAの翻訳効率は、25℃から40℃に短期間（1時間）移行すると低下するが、長時間（24時間）熱処理すると回復傾向を示すことが報告されている（60）。

psaA温度計は、温度変化に応答して組換えタンパク質の発現を高めることができる
psaAプロモーターと5′UTRは、クラミドモナスの葉緑体ゲノムから組換えタンパク質発現を駆動するために頻繁に使用される(61-64)。クラミドモナスは好中性と考えられ、藻類は通常20〜30℃の生育温度で培養される。psaA 5′ UTRにRNA温度計があることが発見されたことで、藻類細胞を収穫する前に生育温度を40℃に上げるだけで、組換えタンパク質の蓄積を促進できる魅力的な可能性が開けた。

これが組換えタンパク質の収量を増加させる一般的に適用可能な戦略であるかどうかを調べるため、葉緑体での発現に成功している3つの医薬品タンパク質を試験した： (i)細胞増殖と細胞遊走を誘導することで創傷治癒を促進する高移動度グループタンパク質B1（HMGB1）(46)、(ii)肺炎の原因菌である肺炎球菌に対する抗菌剤であるファージ由来のエンドリジンCpl-1(65,66)、(iii)将来のエイズワクチンに不可欠な構成要素と考えられている2つのHIV抗原を組み合わせたp24-Nef融合タンパク質(40,67)。つの導入遺伝子の合成コドン最適化バージョンを、コード領域をpsaAまたはatpAプロモーターと組み合わせたpsaA 5′ UTRの制御下に置く葉緑体発現カセットに挿入した（図7Aおよび補足図S11A）。抗体がないHMGB1とCpl-1の免疫化学的検出を容易にするために、タンパク質はそれぞれFLAGタグとHAタグでエピトープタグを付けられた（図7A）。

図7.
クラミドモナス葉緑体における温度誘導性医薬タンパク質発現ブースト。(A）HMGB1-FLAGとCpl-1-HAの発現カセットのマップ。トランスジーンの発現はpsaA 5′ UTR（RNA温度計を保有）とpsaAプロモーター（PpsaA:psaA）またはatpAプロモーター（PatpA:psaA）によって駆動される。(B-D）生育温度に依存した組換えタンパク質の蓄積。総タンパク質は、25℃または40℃で6時間培養した培養物から抽出した。治療タンパク質のイムノブロット検出は、指示した抗体を用いて行った。40℃サンプルの2倍希釈系列を負荷し、タンパク質量の半定量的評価を行った。50μgタンパク質のサンプルを100%としてロードした。タンパク質ゲルのCoomassie Brilliant Blue（CBB）染色は、ローディングコントロールを提供するために行った。相対的タンパク質量は、バンド強度の測定によって定量した。25℃で増殖させたサンプルの平均バンド強度（3つの独立した実験から）を正規化し、1.0とした。データは平均値で示し、エラーバーは標準偏差を表す（n = 3）。アスタリスクは、25℃サンプルに対する有意差（P < 0.05）を示す（Welchのt検定）。
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クラミドモナス葉緑体における温度による医薬タンパク質の発現上昇。(A）HMGB1-FLAGとCpl-1-HAの発現カセットのマップ。トランスジーンの発現は、psaA 5′ UTR（RNA温度計を保有）とpsaAプロモーター（PpsaA:psaA）またはatpAプロモーター（PatpA:psaA）によって駆動される。(B-D）生育温度に依存した組換えタンパク質の蓄積。総タンパク質は、25℃または40℃で6時間培養した培養物から抽出した。治療タンパク質のイムノブロット検出は、指示した抗体を用いて行った。40℃サンプルの2倍希釈系列を負荷し、タンパク質量の半定量的評価を行った。50μgタンパク質のサンプルを100%としてロードした。タンパク質ゲルのCoomassie Brilliant Blue（CBB）染色は、ローディングコントロールを提供するために行った。相対的タンパク質量は、バンド強度の測定によって定量した。25℃で増殖させたサンプルの平均バンド強度（3つの独立した実験から）を正規化し、1.0とした。データは平均値で示し、エラーバーは標準偏差を表す（n = 3）。アスタリスクは、25℃サンプルに対する有意差（P < 0.05）を示す（Welchのt検定）。

トランスプラストミック株は、3つの治療用タンパク質すべてについて作製され、ホモプラスミーまで精製された。その後、藻類培養を25℃で増殖させ、25℃で維持するか、40℃に6時間シフトさせた。温度シフトの結果、HMGB1の組換えタンパク質発現が顕著に増加した（図7B,C）。予想されたように、収量の増加はプロモーターに依存せず、psaA温度計とpsaAプロモーターまたはatpAプロモーターを組み合わせると、40℃におけるHMGB1の蓄積量が同様に増加した（図7B,C）。

意外なことに、HMGB1は40℃で明らかに組換えタンパク質収量の増加を示したが（Cpl-1もわずかな蓄積量の増加を示した；図7D）、p24-Nefタンパク質は温度シフト後に蓄積量の減少を示した（補足図S11B）。RNA温度計機能の基礎にある単純な融解機構を考慮すると、この所見はp24-nefコード領域との組み合わせによる温度計機能の撹乱では説明できないと考えられた。その代わりに、40℃におけるタンパク質の蓄積の減少は、融合タンパク質が40℃で安定でなくなるという、翻訳後の原因があるのではないかと考えた。この仮説を検証するため、大腸菌でp24-Nefタンパク質を構成的に発現させ、25℃と40℃におけるタンパク質の蓄積レベルを比較した。これらの実験から、40℃でのタンパク質蓄積は25℃よりも大幅に低いことが明らかになった（補足図S12）。大腸菌におけるタンパク質合成は、25℃よりも40℃の方がはるかに高い速度で進行することから(68)、40℃におけるp24-Nefの蓄積量の減少は、翻訳後に原因があるに違いなく、最も可能性が高いのは、タンパク質の安定性の低下によるものである。

これらを総合すると、温度によるレポータータンパク質mVenus（図1、2、4）および医薬品タンパク質HMGB1およびCpl-1（図7）の発現促進は、psaA温度計が葉緑体における温度制御タンパク質発現を仲介し、藻類培養の生育温度を単純にシフトさせることで組換えタンパク質の生産を促進できることを示している。

考察
リボレギュレーターはオルガネラゲノムには存在しないと考えられている。この研究の過程で、我々は単細胞緑藻クラミドモナス（Chlamydomonas reinhardtii）の葉緑体ゲノムにRNA温度計を発見した。それは5′UTR内に存在し、シャイン-ダルガーノ配列を構成する単純なヘアピン型二次構造を形成するという点で、最小サイズのRNA温度計の典型的な構造的特徴を示している（図3B）。このようにして、シャイン-ダルガルノ配列は、翻訳開始のためにリボソームがアクセスできない二本鎖コンフォメーションに封じ込められる。二次構造は単純な温度変化で融解し、タンパク質合成を誘導することができる（図1、2、4）。

RNA温度計の特徴は、トランス作用因子に依存せず、物理的原理（すなわちRNA二次構造の融解）のみに基づいて機能することである。psaA 5′UTRがRNA温度計の性質を持っているという結論は、複数の証拠から支持されている。第一に、観察された温度応答性はプロモーターやコード領域とは無関係である（図1、2、7）。第二に、大腸菌において遺伝子発現を温度誘導するためには、ヘアピン構造が必要かつ十分である（図3）。第三に、ヘアピン構造の安定性を変化させる変異は、遺伝子発現の温度応答を予測可能な方法で変化させる（図4）。広い温度範囲にわたってすべての変異体における転写産物およびタンパク質の量を定量すると、転写調節と翻訳調節の影響が分離された（図6）。RNA温度計の特性は、20℃と30℃での発現を比較すると特に明らかである： 転写産物レベルに有意な変化は見られず、mVenus-HA蓄積の温度依存的増加が観察されたのは、ほぼ温度計を介した翻訳制御によるものであることが示唆された（図6A-C）。注目すべきことに、すべての変異体におけるmVenus-HA mRNAの蓄積の増加が、さらに高温で観察された（図5）。これは、翻訳の温度応答性に加えて、転写産物量の変化も40℃におけるレポータータンパク質の蓄積に寄与していることを示している（図6）。

葉緑体バイオテクノロジーは、誘導可能な導入遺伝子発現のためのツールの欠如に悩まされている(69)。内在性の制御システム（すなわち、プラスチドゲノムにコードされ、化学的誘導剤や環境刺激に反応するシステム）がないため、合成システムの設計が追求されてきた。合成リボスイッチの設計には一定の進展が見られたが（35,36,70）、適切なスイッチと誘導物質の同定は困難であった（34）。これは主に、(i)葉緑体遺伝子の発現が転写後（主に翻訳後）の制御に強く依存していること、(ii)プラスチド内部には大規模で多様な代謝産物プールが存在するため、外部からの代謝産物適用による制御が難しく、スイッチの実質的なリークを引き起こしていることに起因する(34)。RNAサーモメーターの魅力は、RNAのみの翻訳制御エレメントとして機能し、代謝物やタンパク質に依存しない点にある。今回紹介したpsaA RNAサーモメーターとその変異体は、葉緑体遺伝子や導入遺伝子の発現を誘導するための優れた制御エレメントとなる可能性がある。特に、25℃（実験室におけるクラミドモナスの通常の生育温度）では検出できないほど低い発現を示し、40℃ではかなりの発現誘導を示す（図4I）操作された変異体m3は、バイオテクノロジーにおける内因性葉緑体遺伝子の制御された発現や葉緑体導入遺伝子の誘導可能な発現のための有用なツールになると期待される。しかしながら、急性高温ストレス（40℃）下で藻類培養を長時間（すなわち24時間）インキュベートすることは、適用される熱ストレスが光合成効率を低下させ、細胞増殖を阻害するため、推奨されないことに注意すべきである(71)。

psaAプロモーターと5′UTRは、クラミドモナス葉緑体における導入遺伝子の発現を駆動するために広く用いられている(61-64)。組換えタンパク質の収量は、バイオテクノロジーにおけるあらゆる生産システムの費用対効果の鍵であるため（72,73）、藻類培養の収穫前に温度シフトを適用することによってタンパク質の発現レベルを高める可能性は、分子生物学的農業における製品の収量を向上させるための簡単で安価な方法を提供する。また、クラミドモナス由来のpsaA温度計を高等植物のプラスチドでテストし、種子植物における遺伝子や導入遺伝子の発現にも熱誘導性を与えるかどうかを調べるのも興味深い。

藻類や植物の葉緑体遺伝子の5′UTRにRNA温度計がより広く存在するかどうかは現在のところ不明であり、今後の研究で調べる必要がある。藻類と陸上植物のpsaA 5′ UTRは多様化している(74)。胎生植物では、psaA 5′UTRの保存領域が同定された(74)。興味深いことに、調べた種ではpsaA翻訳開始部位の上流にShine-Dalgarno配列が存在する(74)。シアノバクテリア（Synechococcus sp. PCC 7002）では、クラミドモナスのpsaA温度計に似たRNA二次構造が、MfoldウェブサーバーによってpsaA翻訳開始部位の上流に予測された。興味深いことに、シネココッカスの光合成活性と成長速度はともに温度とともに上昇する(75)。プロテオミクス研究では、温度が高くなるとPsaAタンパク質の存在量が増加することが示されている(75)。これらの知見は、シアノバクテリアにおけるpsaA温度計の役割の可能性を示唆している。しかしながら、シアノバクテリアにおけるpsaA温度計の活性を調べるには、より詳細な実験的研究が必要である。今回の研究では、温度上昇に対するRNA温度計のPsaAタンパク質量への影響は観察されなかった。最近のリボソームプロファイリング研究では、ニコチアナ・タバカムにおいて、熱ストレスによるpsaAの翻訳出力の低下が観察されている(60)。進化の過程で、光化学系Iの生合成に関わる制御の複雑さが大幅に増加したことは注目に値する(57)。例えば、光合成複合体の組み立てを制御する負のフィードバックループ（合成のエピスタシーによる制御、CES）が、シアノバクテリアではなくクラミドモナスで同定されている(56)。藻類や陸上植物におけるこのような複雑な制御の層を考えると、光化学系Iの生合成の制御におけるRNA温度計の影響は、進化の過程で減少したのではないかと推測される。

まとめると、今回報告した研究によって、オルガネラゲノムにリボレギュレーターが同定された。このリボレギュレーターは、生育温度を単純に変化させるだけで、葉緑体における導入遺伝子の発現を誘導し、組換えタンパク質の生産を促進する便利なツールとして利用できる。驚くべきことに、最近の研究で、シロイヌナズナの核内遺伝子発現を制御するRNA温度計が同定された(76)。温度が高くなると、PHYTOCHROME-INTERACTING FACTOR 7（PIF7）、HEAT SHOCK FACTOR A2（HSFA2）、WRKY22の翻訳が促進された。これらの転写因子の発現レベルは、植物の熱形態形成、暑熱順化、その他のストレス応答を制御している(76,77)。光合成真核生物におけるRNA温度計の発見は、植物や藻類における体温調節の新たな研究の方向性と新たなバイオテクノロジー応用を切り開くものである。

データの利用可能性
本論文の基礎となるデータは、論文およびオンライン補足資料で入手可能である。

補足データ
補足データはNAROnlineで入手可能。

謝辞
Natalia WulffとGloria Olar (MPI-MP)には藻類培養の維持管理を手伝ってもらい、Omar Sandoval-Ibáñez博士、Reimo Zoschke博士、Raphael Trösch (MPI-MP)には有益な議論をしてもらった。

著者貢献： K.P.C.、J.N.およびR.B.が実験をデザインし、K.P.C.、F.V.L.、J.N.およびM.W.が実験を行い、全著者がデータを解釈・分析し、R.B.がK.P.C.、F.V.L.およびJ.N.の意見を参考に論文を執筆した。

資金提供
本研究は、マックス・プランク協会および欧州研究会議（ERC）より、欧州連合（EU）の研究・イノベーションプログラム「ホライゾン2020」［ERC-ADG-2014；R.B.への助成金契約番号669982］の支援を受けた。オープンアクセスチャージへの資金提供： マックス・プランク協会。

利益相反声明。申告なし。

備考
現在の住所： Mengting Wu, Anhui Provincial Key Laboratory of Microbial Control, Anhui Agricultural University, Hefei 230036, China.

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