ラクトフェリンは微生物-腸-脳軸を通じて西洋食誘発認知障害を緩和する
食品科学における最新の研究
第7巻、2023、100533
ラクトフェリンは微生物-腸-脳軸を通じて西洋食誘発認知障害を緩和する
https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S2665927123001016?via%3Dihub
著者リンク オーバーレイパネルを開くQian He a, Li-Li Zhang a, Deming Li a, Jiangxue Wu a, Ya-Xin Guo a, Jingbo Fan a b, Qingyang Wu c, Hai-Peng Wang d e, Zhongxiao Wan a, Jia-Ying Xu d, Li-Qiang Qin a
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https://doi.org/10.1016/j.crfs.2023.100533Get 権利と内容
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ハイライト
西洋食は神経炎症と認知機能障害を誘発する。
ラクトフェリンは海馬の神経細胞とシナプスを改善した。
ラクトフェリンは脳のミクログリアの活性化と炎症を抑制した。
ラクトフェリンは、微生物-腸-脳軸を介して認知機能障害を緩和した。
概要
ラクトフェリン（Lf）は、いくつかの動物モデルにおいて認知機能を改善することが示されている。そのメカニズムを明らかにするため、雄性C57BL/6Jマウスを対照群（CON）、洋食群（WD）、ラクトフェリン群（Lf）、Lf＋抗生物質群（AB）に無作為に分けた。Lf群にはLfを胃内投与し、Lf＋AB群にはさらに抗生物質入りの溶液を飲ませた。16週間の介入後、Lfは行動テストで示されるように認知機能を改善した。Lfはまた、シナプス後密度の長さと曲率を増加させ、関連タンパク質の発現を上昇させたことから、海馬のニューロンとシナプスが改善したことが示唆された。免疫蛍光分析によって明らかになったように、Lfはミクログリアの活性化と増殖を抑制した。Lfは、海馬領域における炎症性サイトカインの血清レベルを低下させ、それらのタンパク質発現を低下させた。Lfはまた、海馬におけるNF-κB/NLRP3インフラマソームの活性化を抑制した。一方、Lfはタイトジャンクションタンパク質の発現を上昇させ、腸管バリアと認知機能に有益なバクテロイデーテス門のバクテロイデーテス（Bacteroidetes）とロゼブリア（Roseburia）属のバクテロイデーテス（Bacteroidetes）の存在量を増加させた。抗生物質は、Lf＋AB群の認知機能障害に対する長期Lf介入の効果を消失させ、腸内細菌叢がLf作用に関与していることを示唆した。短期Lf介入（2週間）は、行動変化を誘発することなく、WDによる腸内細菌叢の変化を予防し、腸内細菌叢が脳に移行するタイミングの順序を支持した。したがって、Lfの介入は、微生物-腸-脳軸を介してミクログリアの活性化と神経炎症を抑制することにより、認知機能障害を緩和した。
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キーワード
ラクトフェリン
欧米型食生活
神経炎症
認知機能障害
行動変化
海馬
腸内細菌叢
微生物-腸-脳軸
はじめに
脂肪と単純炭水化物に富む高エネルギー密度の欧米型食生活（WD）は、肥満と肥満に関連する慢性疾患の発症に寄与している（Fan et al.） 肥満は、アルツハイマー病（AD）やパーキンソン病（PD）などの神経変性疾患の危険因子である（Leigh and Morris, 2020）。慢性炎症は、神経変性疾患を含む肥満関連疾患の発症に寄与するメカニズムの一つである。ミクログリアは脳に常在する免疫細胞であり、その活性化は炎症性因子の分泌と海馬の炎症を誘導する（Farruggia and Small, 2019）。神経炎症は、これらの疾患の根底にある重要な病態生理学的特徴であると提唱されている（Kwon and Koh, 2020）。したがって、神経炎症の改善は、認知機能障害を予防するための任意の方法である。
安定した腸内細菌叢組成は、腸管バリアの完全性と炎症のバランスを維持する上で重要であり、その結果、微生物-腸-脳軸を通じて脳の発達と行動をポジティブに制御する（Diaz Heijtz et al.） 腸内細菌叢は神経変性疾患と強く関連し、行動を調節し、神経疾患に寄与する（Fungら、2017）。腸内細菌叢異常症は、ADの病態においてアミロイドβ凝集、神経炎症、酸化ストレスを促進する可能性がある（Liu et al.） AD患者の微生物叢をアミロイド前駆体タンパク質（APP）/プレセニリン-1（APP/PS1）マウスに移植すると、海馬におけるミクログリアの活性化と炎症反応が促進され、ADの病理学的進行がさらに悪化し、認知・行動能力の低下につながる可能性がある（Shen et al.） したがって、微生物の変化は神経炎症と認知障害に関与している（Bruce-Kellerら、2015年）。
これらの神経変性疾患は現在のところ治癒不可能であるが、ランセット委員会は、3分の1以上の症例は、食事を含む生活習慣要因に対処することで予防できる可能性があると報告している（Livingston et al.） 新たなエビデンスは、食事が腸脳軸を通じて脳機能を調節することにより、腸内細菌叢に影響を与える可能性があることを示唆している。ラクトフェリン（Lf）は乳清タンパク質の成分であり、抗炎症作用、抗菌作用、活性酸素種（ROS）調節作用、抗ウイルス作用、抗腫瘍免疫作用などの複数の機能を有する（Brimelow et al.） ある集団ベースの研究では、唾液中のLfが、加齢における皮質アミロイドベータ負荷、皮質の完全性、記憶と関連していることが判明した（Resecoら、2021年）。Lf投与は、主要な炎症性ストレスと酸化ストレスに影響を与えることで、AD患者の認知機能を改善する可能性がある（Mohamedら、2019年）。Lfは、APPトランスジェニック（APP-Tg）マウスやAD患者の老人斑や神経原線維変化（NFT）で検出された（Guoら、2017；Abdelhamidら、2020）。認知機能に対するLf投与の効果を調べるために、いくつかの動物モデルが用いられた。Lfおよび加水分解Lfはいずれも、APP-TgマウスにおけるAPPのアミロイド生成プロセシングを阻害することにより、記憶障害を減弱させた（Abdelhamid et al.） 同様に、Lfの経鼻投与はAPP/PS1マウスの認知機能を改善した（Guoら、2017）。さらに、Lfおよび他の乳清タンパク質の介入は、認知障害と強く関連する腸内細菌叢を調節することが観察された（Boscainiら、2019；Huら、2020）（Fungら、2017；Liuら、2020）。しかし、われわれの以前の研究では、Lfは若年および中年のAPP/PS1マウスにおいて認知機能には影響せず、腸内細菌叢ホメオスタシスには有益であることがわかった（Zhou et al.） このように、Lfと認知機能障害との関係は依然として結論が出ておらず、この関係の根底にあるメカニズムも完全には解明されていない。
本研究では、WDを16週間摂取させた肥満マウスにおいて、Lfが神経炎症と腸内細菌叢を介して認知機能障害を緩和するかどうかを調べることを目的とした。認知機能は行動テストで測定した。神経学的状態は、海馬シナプスの超微細構造の解析により観察した。神経炎症はミクログリアの活性化と増殖を調べることで検出した。さらに、海馬におけるToll様受容体4（TLR4）/核因子κB（NF-κB）シグナル伝達とNOD様受容体熱タンパク質ドメイン関連タンパク質3（NLRP3）インフラマソームが解析された。腸内細菌叢の役割に関する研究では、1群に広域抗生物質カクテルを投与して腸内細菌叢を減少させた。各群の一部のマウスを2週目に殺処分し、行動変化に先立って腸内細菌叢が変化しているかどうかを解析し、微生物-腸-脳軸を確認した。材料と方法
2.1. 動物とグループ分け
3ヵ月齢の雄性C57BL/6Jマウス66匹をShanghai Jihui Laboratory Animal Care Company（中国、上海）から購入し、標準的な特定病原体フリー動物実験室（温度20～26℃；相対湿度40～60％；12時間明暗サイクル）で飼育し、餌と液体は自由に摂取できるようにした。すべての処置はGuidelines in the Care and Use of Animalsに従い、スーチョー大学動物福祉委員会（No.202009A661）の承認を得て行われた。1週間の馴化後、マウスを無作為に4群に分けた：CON（n＝18）、WD（n＝18）、Lf（n＝18）、Lf＋抗生物質（AB）（n＝12）。CON群のマウスには標準食（AIN93G、kcal％：蛋白質20.3％、炭水化物63.9％、脂肪15.8％）を与え、他の3群にはWD（D18061501、kcal％：蛋白質17％、炭水化物43％、脂肪40％）を与えた。いずれの飼料もDyets社（中国江蘇省無錫市）から購入した（表A.1）。ネイティブウシLf（純度92.5%）はHilmar Cheese Company（米国カリフォルニア州）から入手した。以前の動物実験（Abdelhamidら、2020）に基づき、Lf群のマウスに約500mg/kg体重のLfを週5回胃内投与した。この量を達成するために、Lfは蒸留水中に65mg/mL溶液として調製され、約0.2mlの容量でマウス（25～30g）に経口投与された。Lf＋AB群のマウスには同量のLfを投与し、抗生物質（アンピシリン1g/L、メトロニダゾール1g/L、いずれも富士フイルム和光純薬株式会社、東京、日本；ネオマイシン1g/L、バンコマイシン0.25g/L、いずれもSigma-Aldrich Co. Ltd,MO,USA）から入手した。マウスは毎日約3gの水を飲む。そのため、約0.75mgのバンコマイシンと3mgのアンピシリン、メトロニダゾール、ネオマイシンを摂取した。飲料水は2日ごとに蒸留水で新しく調製した。体重、食餌、飲水量は毎週記録した。
2週間後、短期実験を行った。CON群、WD群、Lf群から無作為に6匹のマウスを選び、行動試験を行った。行動試験後、マウスを安楽死させ、腸内細菌叢解析のためにマウスの糞便内容物を採取した。4群の残りのマウス（各群n=12）は同じ条件で飼育した。実験は16週で終了し、以下の解析を行った。実験デザインと動物群を図A1に示す。
2.2. 行動試験
ネスティング行動試験、新規物体認識(NOR)試験、モリス水迷路(MWM)試験により、認識記憶とネズミの自発行動を検討した。結果はビデオ追跡システム(SuperMaze software, Shanghai Xinruan Information Technology Co., Ltd., China)で記録した。先行研究(Bevins and Besheer, 2006; Deacon, 2006; Vorhees and Williams, 2006)を参考に、試験手順を簡単に説明する。
営巣行動試験： 暗期の約1時間前に、マウスを一定の大きさの無香料ペーパータオルとともに個々の試験ケージに移した。翌朝、巣を1から5までの評価スケールで評価した：1) ペーパータオルが無傷、2) ペーパータオルがほぼ無傷のまま（90%以上完全）、3) ペーパータオルはほとんど切り刻まれているが、巣の位置が認識できない、4) 平らな巣が確認でき、ペーパータオルが一定方向に配置されている、5) 巣がマウスより高く作られ、周囲がマウスを完全に囲むことができる。
NOR試験： マウスは2日連続で10分間、2つの同じ物体を用いた実験場に慣らした。3日目、マウスはまずアリーナを10分間探索し、慣れの段階を行った後、ホームケージに戻した。30分後、片方の物体を同じような大きさの新しい物体と交換し、マウスをテストアリーナに入れた。短期物体記憶は、物体の周囲半径2cm以内に動物の鼻が物体に近づいたと定義される物体探索によって評価された。
MWMテスト： MWM試験は、直径150cm、高さ35cmの円形プールを備えた水迷路装置（XR-XM101、上海新如安信息技術有限公司、中国・上海）を用いてルーチンに実施した。マウスを1日ずつ個別に飼育し、1日4回の試行で5日間連続して獲得訓練を行った。6日目にプラットフォームを取り外し、マウスを装置に戻した。記憶定着の程度を示すため、プラットフォームへの到達時間、標的象限での滞在時間、プラットフォーム横断回数を記録した。
2.3. 生化学的分析
実験終了後、マウスは12時間餌を与えられず、生け贄に捧げられた。血清は遠心分離（3000g、4℃で15分間）で分離し、-80℃で保存した。血清総コレステロール（TC）、トリグリセリド（TG）、低比重リポ蛋白コレステロール（LDL-C）、高比重リポ蛋白コレステロール（HDL-C）は市販のキット（Applygen Technologies Inc.） 血清TNF-αおよびIL-6はELISAキット（MultiSciences（Lianke）Biotech Co.）
2.4. ヘマトキシリン・エオジン（HE）染色と免疫蛍光二重標識
CON群、WD群およびLf群のマウスを、リン酸緩衝生理食塩水（PBS、pH7.2）および4％パラホルムアルデヒドで心臓の先端から灌流した。その後、マウスの脳を4%パラホルムアルデヒドで48時間維持し、パラフィンブロックに包埋した。パラフィン包埋した脳を4μm厚の輪切りにした。病理組織学的検査では、大脳皮質と海馬（角状回（CA）と歯状回（DG））を含む切片をルーチンのHE染色で評価した。免疫蛍光二重標識では、切片をウシ血清アルブミンでブロックし、マウス抗BrdU（1:500、武漢服装生物科技有限公司、中国武漢市）とウサギ抗Ibα1（1:500、服装生物社）を含む一次抗体混合液で4℃で一晩インキュベートした。二次抗体とともに暗所、室温で1時間インキュベートした後、DAPI（Invitrogen, CA, USA）を対染色に用い、Pannoramic Midi（3D Histech Ltd., Budapest, Hungary）を用いて画像を撮影した。
2.5. 海馬におけるシナプス超構造の解析
生理食塩水で経心筋灌流を行った後、脳組織を取り出し、海馬から1 mm3の組織ブロックを切り出した。段階エタノール系列で脱水し、エポキシ樹脂に包埋後、2％パラホルムアルデヒド-2.5％グルタルアルデヒド混合液で24時間固定し、固定後に1％四酸化オスミウム（OsO4）で2時間処理した。切片（70 nm）を切り出し、4％酢酸ウラニルおよび0.5％クエン酸鉛で染色した。画像は、側面挿入型BioScanカメラ（Veleta, EMSIS GmbH, Germany）を装備したJEM-1230透過型電子顕微鏡（TEM）で観察した。シナプス形態計測（シナプス後密度、シナプス間隙の幅、シナプス界面の曲率）は、Image Jソフトウェア（Panら、2021）を用いて、既述の方法で解析した。
2.6. 結腸長および結腸粘液層の厚さの測定
遠位結腸を素早く摘出し、その長さを高精度電子デジタルノギス（Deli, dl-150, Ningbo, Zhejiang）を用いて測定した。結腸を洗浄し、結腸組織の一部を-80℃で保存した。残りの下行結腸はCarnoy's solutionで固定した。無水メタノールで洗浄後、組織をカセットに入れ、無水メタノール中で保存した。大腸粘液層の厚さを検出するために、組織をパラフィンに包埋し、5μm厚のスライスに切り出した。アルシアンブルー染色でスライドガラスにマウントした後、結腸粘液層の厚さを日食顕微鏡（Nikon, Tokyo, Japan）で観察した。
2.7. 定量的リアルタイムポリメラーゼ連鎖反応（qRT-PCR）解析
RNA quick purification kit（Yeasen Biotechnology、中国、上海）を用いて組織から全 mRNA を抽出し、Hifair®Ⅱ1st Strand cDNA Synthesis SuperMix（Yeasen Biotechnology、中国、上海）および GeneAmp PCR system 9700（Applied Biosystems）を用いて、製造元の指示に従い cDNA を合成した。qRT-PCR は、Hieff® qPCR SYBR Green Master Mix（Yeasen Biotechnology, Shanghai, China）と QuantStudio 6 Flex Real-Time PCR System（Thermo, USA）を用いて行った。相対mRNA発現レベルは、GAPDHを内部参照対照として2-ΔΔCt法を用いて決定した（Livak and Schmittgen, 2001）。表A.2に遺伝子特異的マウスプライマーを示す。
2.8. ウェスタンブロット分析
組織を氷冷したRIPA溶解バッファー（Beyotime, Shanghai, China）でホモジナイズし、完全なEDTAフリーのプロテアーゼインヒビターカクテルとPhosSTOPホスファターゼインヒビターを添加した。タンパク質サンプルを5×デュアルカラープロテインローディングバッファー（Fudebio, Hangzhou, China）と混合し、98℃で10分間煮沸した。等量のタンパク質（30 μg/lane）をSDS-PAGEゲルに一定電圧でロードし、ポリフッ化ビニリデン膜（Millipore, MA, USA）に転写した。一次抗体および二次抗体でブロッキングおよびインキュベートした後、FDbioFemto ECL（Fudebio, Hangzhou, China）を用いた化学発光画像解析システム（Tanon, Shanghai, China）を用いてバンドを可視化した。バンド強度はGel-Pro Analyzer software (Media Cybernetics, Maryland, USA)を用いて定量した。一次抗体には以下のものを用いた： シナプトソーム関連タンパク質25（SNAP-25; Abcam, ab109105）、シナプス後密度タンパク質95（PSD-95； CST、3450）、Ibα1（Abcam、ab178846）、TNF-α（Abcam、ab215188）、IL-6（Abcam、ab233706）、NLRP3（Abcam、ab263899）、IL-18（Abcam、ab243091）、IL-1β（Abcam、ab254360）、カスパーゼ-1（Abcam、ab207802）、TLR4（Abcam、ab22048）、骨髄分化因子88（MyD88； Abcam, ab133739）、NF-κB p65（Abcam, ab32536）、GAPDH（ABclonal, AC033）、ZO-1（ABclonal, A11417）、オクルディン（ABclonal, A12621）、β-アクチン（ABclonal, AC026）。
2.9. 16S rRNA遺伝子の配列決定と解析
DNAはPowerMax抽出キット（MoBio Laboratories, CA, USA）を用いて、製品紹介に従って抽出した。細菌の16S rRNA遺伝子のV3-V4領域をサーモサイクラーPCRシステムを用いて増幅した。PCR産物はAMPure XP Beads (Beckman Coulter, IN, USA)を用いて精製し、PicoGreen dsDNA Assay Kit (Invitrogen)を用いて定量した。最後に、Illumina HiSeq4000プラットフォーム上で、2×150 bpペアエンドコンフィギュレーションを用いてシークエンシングを行った。16S rRNAデータは、QIIME（Quantitative Insights into Microbial Ecology）とRパッケージ（v3.2.0）を用いて解析した。有効塩基配列を得るためにQuality Filteringを行い、Vsearchv2.4.4によって97%の信頼閾値でクラスタリングされた有効塩基配列を操作分類学的単位（OTU）にグループ化した。OTUの代表的な配列を選択し、SILVA128に基づいてアノテーションを行った。各サンプルの群集組成とOTUの存在量は、王国、門、綱、目、科、属、種のレベルでカウントした。アルファ多様性指数（Chao1、abundance-based coverage estimator (ACE)、Shannon指数、Simpson指数を含む）をQIIMEソフトウェアで計算し、OTUの存在量、均等性、グループ間の差を比較した。Linear discriminant analysis effect size (LefSe)を用いて、グループ間で比較するバイオマーカーを選択した（Bioproject PRJNA 982274）。
2.10. 統計解析
データは統計パッケージSPSS（Version 20, Chicago, USA）を用いて解析した。介入群間の差は、一元配置分散分析（ANOVA）に続いて、最小有意差（LSD、分散の均質性が満たされている場合）またはタムハネのT2（分散の均質性が満たされていない場合）を多重比較に用いて決定した。p値＜0.05を統計的に有意とみなした。本研究の結果については、データを定量化し、平均値±SEMとして報告した。16S rRNA遺伝子配列解析では、すべてのリードを寄託し、配列同一性97％でOTUにグループ化した。OTUの分類学的所属は、Greengenesデータベースバージョン13.8に対して、QIIME（Quantitative insights into microbial ecology、バージョン1.8.0）を用いて決定した。結果
3.1. Lf介入による体重減少と脂質プロファイルの改善
実験期間中、WDを与えたマウスの体重は標準食を与えたマウスよりも重かった。しかし、Lf群ではWD群と比較して体重が28.3%有意に減少した（図1AおよびB）。WD群では白色脂肪組織が有意に蓄積した。Lf群では、皮下脂肪、腎周囲脂肪、精巣上体脂肪の重量が有意に減少した（図1C）。WD群のマウスは摂餌量が少なかったが、3群間でエネルギー摂取量に有意差はなかった（図1D）。WD群では血清TC、TG、LDLが増加し、血清HDLが減少した。この現象はLf群では逆転した（図1E-H）。
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図1. Lfの介入により、欧米型飼料（WD）を与えたマウスの体重が減少し、脂質プロファイルが改善した。A.実験中の体重推移；B.実験終了時の体重増加；C.白色脂肪組織（WAT）重量；D.エネルギー摂取量；E-H.血中脂質プロファイル。E. 血清トリグリセリド（TG）；F. 血清総コレステロール（TC）；G. 血清低密度リポ蛋白コレステロール（LDL-C）；H. 血清高密度リポ蛋白コレステロール（HDL-C）。*P＜0.05対CON群；**P＜0.01対CON群。#P < 0.05 vs. WD群；##P < 0.01 vs. WD群。
3.2. Lf介入は認知機能障害を改善した
ネスティング行動は、ネスティングスコア（図2B）によって定量的に確認されるように、WD群で障害され、Lf群で改善した（図2A）。NORテストでは、WD群のマウスは頭部探索回数と新規物体への探索時間が有意に減少していた。これら2つの指標はLfの介入により回復し、新規物体認識記憶の改善を示唆した（図2C-E）。物体の総探索時間は3群間で同等であった（図2F）。MWMテストでは、3日目からWD群のマウスはプラットフォームを見つけるのに多くの時間と距離を費やした。しかし、Lf群ではWD群に比べ時間と距離が有意に減少した（図2G-I）。Lf群ではWD群に比べ逃避率が30.5％有意に減少し、プラットフォーム横断数が57.1％、目標四分円内の距離割合が27.7％増加した（図2J-L）。試験中、3群のマウスは同程度の速度で泳いだ（図2M）。このように、LfはWD誘発の認知機能障害を改善した。
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図2. Lfの介入は「欧米型」食（WD）誘発マウスにおける認知機能障害を改善した。A、B. ネスティング行動テスト。A.はテストの写真、B.は巣のスコア。C-F.新規物体認識（NOR）テスト。C.NOR図；D.頭部探索回数；E.全物体探索時間に対する新奇物体に費やした時間の割合；F.全物体探索時間；G-M. モリス水迷路（MWM）テスト。G.脱出台を取り除いた後の軌跡図；H.脱出潜時；I.脱出経路の長さ；J.脱出台を取り除いた後の脱出潜時；K.横断数；L.目標四分円の距離の割合；M.遊泳速度。*P＜0.05対CON群；**P＜0.01対CON群。#P < 0.05 vs. WD群；##P < 0.01 vs. WD群。
3.3. Lf介入は海馬ニューロンとシナプスを改善した
海馬と大脳皮質は、認知処理、学習、記憶に関与する主要領域である。HE染色により、CON群のマウスは海馬領域のニューロンの形態が正常であることが示された。WD群では、緩い構造を持つ膨潤した神経細胞、増加した核のピクノーシス、神経細胞の損傷が観察された。これらの神経細胞の病理学的変化は、Lf群では部分的に改善された（図3A）。TEM解析の結果、WD群では海馬領域のPSDの長さ、幅、曲率が減少していた（図3B）。定量的には、WD群と比較して、Lf群ではその長さが25.5％、曲率が79.1％有意に増加した（図3C-E）。一方、WD群では低下していたPSD-95とSNAP-25のタンパク質発現レベルは、Lf群では有意に上昇した（図3F-H）。このように、LfはWDによって誘発された海馬ニューロンとシナプスの障害を改善した。
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図3. Lfの介入により、欧米型飼料（WD）を与えたマウスの海馬の神経細胞とシナプスが改善した。A.マウスの脳の病理組織像；B.透過型電子顕微鏡（TEM）による海馬のシナプスの超微細構造の代表画像；C.シナプス後密度タンパク質（PSD）の幅；D. PSD length; E) PSD curvature (n = 6 mice each group); F. representative western blot of synaptosomal associated proteins 25 (SNAP-25) and PSD-95; G. quantitative measurement of SNAP-25; H. quantitative measurement of PSD-95 (n = 3 mice each group). *P＜0.05対CON群；**P＜0.01対CON群。#P<0.05対WD群；##P<0.01対WD群。
3.4. Lfの介入は脳のミクログリアの活性化と炎症を抑制した
海馬と大脳皮質は炎症に対して特に脆弱である（Jeonら、2012；Dinelら、2014）。Ibα1を脳におけるミクログリア活性化のマーカーとして用い（Litumaら、2021年）、免疫蛍光分析により、WDの摂食が海馬領域における活性化ミクログリアの数を増加させることが示された。しかし、Ibα1+を持つ活性化ミクログリアの数は、WD群と比較してLf群で16.7%有意に減少した（図4AおよびB）。BrdUは細胞周期のS期細胞に取り込まれ、細胞増殖を検出する（Chengら、2019）。二重染色ではさらに、WD群ではCON群よりもBrdU+ Ibα1+陽性細胞が有意に多く、これらの陽性細胞はLf群で31.5%有意に抑制された（図4AおよびC）。一方、WDの摂食は大脳皮質と海馬でTNF-αとIL-6のタンパク質発現レベルを有意に上昇させたが、Lfの介入により有意に抑制された（図4FとG）。同様に、TNF-αとIL-6の血清レベルは、CON群と比較して、WD群で有意に上昇したが、Lf群ではWD群よりも有意に低かった（図4HとI）。したがって、LfはWD誘発ミクログリアの活性化と神経炎症を予防した。
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図4. Lfの介入は、マウスの脳と血清における「西洋式」食事（WD）誘発ミクログリアの活性化と炎症を抑制した。A. Ibα1とBrdUの代表的な免疫蛍光二重染色；B. 海馬におけるIbα1の数；C. 海馬におけるIbα1/Brduの数。D.海馬におけるTNF-αとIL-6の代表的ウェスタンブロットとE.定量的測定；F.大脳皮質におけるTNF-αとIL-6の代表的ウェスタンブロットとG.定量的測定（各群3匹ずつ）；H.血清TNF-α；I.血清IL-6（各群6匹ずつ）。*P＜0.05対CON群；**P＜0.01対CON群。#P＜0.05対WD群；＃＃P＜0.01対WD群。
3.5. Lf介入は、海馬におけるNF-κB/NLRP3インフラマソームの活性化を抑制した。
海馬におけるNF-κB/NLRP3インフラマソームシグナル伝達経路をPCRおよびウェスタンブロットで検出した。その結果、WD群ではNF-κB p65およびMyD88レベルのmRNAおよびタンパク質発現が上昇していた。NF-κBはTLR4によって活性化されるが、これもWDによって発現が上昇した。対照的に、Lfの介入は、TLR4、MyD88、およびNF-κB p65のmRNAおよびタンパク質発現を低下させた（図5A-C）。NF-κBシグナル伝達経路の刺激は、NLRP3インフ ラマソーム活性化の初期イベントである（Bauernfeind et al.） その結果、NLRP3、カスパーゼ-1、IL-18、IL-1βのmRNAおよびタンパク質発現は、WD群でCON群より有意に高かった。それにもかかわらず、Lfはこれら4つのタンパク質、IL-18とIL-1のmRNAの発現を、WD群と比較して有意に低下させた（図5D-F）。したがって、Lfは海馬におけるWD誘発のNF-κB/NLRP3インフラマソームシグナル伝達経路の活性化を抑制した。
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図5. Lfの介入は、マウス海馬における「西洋式」食餌（WD）誘発のtoll様受容体4（TLR4）／核因子κB（NF-κB）シグナル伝達経路およびNOD様受容体熱タンパク質ドメイン関連タンパク質3（NLRP3）インフラマソームの活性化を抑制した。A. TLR4、MyD88、NF-κB p65の代表的ウェスタンブロット、B. 定量測定、C. mRNA発現。D. NLRP3、IL-18、IL-1β、カスパーゼ-1の代表的ウェスタンブロット、E. 定量測定、F. mRNA発現；（各群n = 3マウス）。*P＜0.05対CON群；**P＜0.01対CON群。#P<0.05対WD群；##P<0.01対WD群。
3.6. Lfの介入は大腸の完全性を維持し、炎症を緩和した
大腸の生理機能は大腸の長さに依存している。剖検時、WD群のマウスの結腸は有意に短縮していた。しかし、Lfの介入により大腸長は9.1％有意に延長し、CON群とほぼ同じ長さになった（図6AおよびB）。アルシアンブルー染色により、大腸粘膜の厚さはCON群に比べWD群で減少し、Lf介入により増加した（図6C）。腸管バリアの完全性に関しては、タイトジャンクションタンパク質であるオクルジンとZO-1の発現はWD群で有意に低下していたが、Lf群では上昇していた。ZO-1タンパク質はWD群と比較してLf群で有意差が認められた（図6DおよびE）。結腸の短縮と結腸の完全性の損傷は炎症と関連していることから、さらなる解析の結果、Lfの介入は結腸組織におけるTNF-α、IL-6、IL-1βのタンパク質発現のWD誘発性の上昇を有意に抑制した（図6FおよびG）。これらの結果は、Lfが腸内細菌叢の基盤となる大腸機能を維持していることを示していた。
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図6. Lfの介入は、「欧米型」食餌（WD）を与えたマウスの大腸の完全性を維持し、炎症を緩和した。A.大腸の代表的な画像とB.大腸の長さの定量；C.アルシアンブルー染色した大腸切片；D.マウスの大腸におけるZO-1とオクルディンの代表的なウェスタンブロットとE.定量；F.マウスの大腸におけるTNF-α、IL-1β、IL-6の代表的なウェスタンブロットとG.定量（各群n = 3マウス）。*P＜0.05対CON群；**P＜0.01対CON群。#P＜0.05対WD群；＃＃P＜0.01対WD群。(この図の凡例中の色に関する言及の解釈については、読者はこの論文のウェブ版を参照されたい)
3.7. Lf介入は腸内細菌叢の変化を改善した
腸内細菌叢の群集構造に対するLfの影響は、糞便微生物叢の16S rRNA遺伝子ベースのプロファイリングによって調査された。腸内細菌叢のα多様性は、種の豊かさを反映するチャオ1、シャノン指数、ACEによって評価した。CON群と比較して、WD群では腸内細菌叢のα多様性が減少した。一方、Lfの介入は、WD群と比較して、群集の平均多様性指標（Chao1およびShannon）を有意に増加させた（図7A-C）。大腸内細菌叢群集の主座標分析（PCoA）により、3群に分離した微生物クラスターが明らかになり、重み付けなしのユニフラック検定により、腸内細菌叢の存在量が全変動の42.33％と11.08％の差を占めることが示された。(図7DおよびE）。図A.2は、門、綱、科の各レベルにおける3群間の差異をそれぞれ示している。門レベルでは、ファーミキューテス属、バクテロイデーテス属、ディフェリバクテス属、プロテオバクテス属が優勢であった。クラスレベルでは、Clostridia、Bacteroidia、Deferribacteres、Deltaproteobacteriaが優勢であった。科レベルでは、Ruminococcaceae、S24-7、Lachnospiraceae、Desulfovibrionaceaeが優勢菌であった。WD給餌により、バクテロイデーテス（Bacteroidetes）とプロテオバクテリア（Proteobacteria）の相対量がCON群と比較して有意に減少し、ファーミキューテス（Firmicutes）が増加した。しかし、LfによりBacteroidetesとProteobacteriaはCON群と同レベルに回復した。WD給餌はファーミキューテス/バクテロイデーテス（F/B）比を増加させたが、これはLfの介入によって逆転した。LEfSe分析によると、CON群とWD群の腸内細菌群集は、ファーミキューテス門、テネリキューテス綱、クロストリジウム目、ロゼブリア属に属する細菌が異なって濃縮されていた（線形判別分析スコア＞3）（図7GおよびH）。Lfの介入は、Bacteroidetes門とRoseburia属の相対存在量を増加させることにより、WDによるマイクロバイオーム組成のシフトを制御した（図7IおよびJ）。さらに、スピアマンの相関を用いて、腸内細菌叢と行動検査結果との関係について解析を行った。認知機能はBacteroidetes門、Verrucomicrobia門、Odoribacter属と正の相関を示したが、Proteobacteria門、Actinobacteria門、AF12属とは負の相関を示した（図A2）。
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図7. 欧米型飼料（WD）を与えたマウスにおいて、Lfの介入は腸内細菌叢の変化に影響を与えた。A. Chao 1多様性指標；B. Shannon多様性指標；C. abundance-based coverage estimator（ACE）多様性指標；D. UniFrac距離による主座標分析（PCoA）；E. Unweighted uniFrac距離；F. Proteobacteria/Bacteroidetesの比率；G,H. CONとWDの微生物叢で濃縮された最も有意差のある豊富な分類群を示す線形判別分析効果量（LEfSe）；I,J. Lf群とWD群の微生物叢に濃縮された最も有意差のある豊富な分類群を示すLEfSe（各群n = 6マウス）; *P < 0.05 vs. CON群; **P < 0.01 vs. CON群。#P＜0.05対WD群；＃＃P＜0.01対WD群。
3.8. 抗生物質の投与は認知機能障害における長期的Lf介入の有益性を消失させた
経口抗生物質のカクテルは糞便細菌量を20倍減少させた（図8A）。WD給餌は体重と白色脂肪組織重量を増加させた。Lf群に比べ、Lf＋AB群のマウスは体重が増加し、剖検時の皮下脂肪が重くなった（図8BおよびC）。一方、Lf＋AB群の行動テストの指標はCON群と有意差があり、WD群と有意差はなかった。一方、ネスティングスコアはLf＋AB群でLf群より有意に低かった（図8D）。両群間に有意差は認められなかったが、Lf＋AB群では、新規物体での探索時間、頭部探索回数、交差回数が減少し、逃避潜時が増加した（図8E-H）。このように、腸内細菌叢を除去すると、Lfの認知改善効果は消失する傾向にあった。
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図8. 抗生物質は、炎症と認知機能障害の抑制におけるLf長期介入効果を消失させた。A.細菌レベル；B.体重増加；C.WAT体重；D-H.行動試験。D. ネスティング行動テストにおける巣のスコア、E. 新規物体認識（NOR）テストにおける新規物体とともに過ごした時間の割合、F. 頭部探索数、G. モリス水迷路（MWM）テストにおける交差数、H. 逃走潜時。(各群n = 6匹）。*P＜0.05対CON群；**P＜0.01対CON群。#P < 0.05 vs. WD群；##P < 0.01 vs. WD群。P < 0.05, $$P < 0.01 vs. Lf群。
3.9. 短期Lf介入は、認知行動変化の前にWD誘発の腸内細菌叢変化を予防した
行動テストと腸内細菌叢を介入後2週間で分析した。その結果、2週間のLf介入は、行動検査に基づくWD飼育マウスの認知機能には影響を及ぼさなかった（図9A-E）。しかし、WD飼育により腸内細菌叢のα多様性が減少し、Lf介入により一部回復した（図9F-H）。PCoA解析の結果、Lf群の腸内細菌プロフィールはWD群のそれとは別にクラスター化していた（図9H）。さらに、WD群におけるファーミキューテス類の割合の増加とバクテロイデーテス類の割合の減少は、Lfの介入によって回復した（図9J）。すなわち、Lfの短期介入は腸内細菌プロフィールを調節し、認知機能には影響しなかったことから、Lfは認知機能の変化の前に腸内細菌叢の変化をもたらしたことが示唆された。
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図9. 2週間のLf介入により、行動認知の変化に先立ち、「欧米型」食（WD）誘発の腸内細菌叢の変化が抑制された。A. ネスティング行動テストにおける巣のスコア、B. 新規物体認識（NOR）テストにおける新規物体とともに過ごした時間の割合、C. 新規物体認識（NOR）テストにおける頭部探索数、D. 逃走潜時、E. モリス水迷路（MWM）テストにおける交差数。(F.チャオ1多様性指数、G.シャノン多様性指数、H.ACE多様性指数、I.非加重UniFrac距離に基づくPCoA、J.相対存在量（各群3匹）。*P＜0.05対CON群；**P＜0.01対CON群。#P<0.05対WD群；##P<0.01対WD群。考察
脂肪と糖分の多いWDは認知機能を損なうという証拠が蓄積されている（O'Brienら、2017；Kendigら、2021）。微生物-腸-脳軸のアンバランスが認知機能に悪影響を及ぼす可能性がある（Buford, 2017; Leigh and Morris, 2020）。Lfは記憶障害を予防し、腸内細菌叢に影響を与えるが（Abdelhamidら、2020；Tsatsanisら、2021；Zhouら、2021）、認知障害における腸内細菌異常との関連はあまり確立されていない。本研究では、WDを16週間摂取させたマウスの認知機能障害と腸内細菌異常症を検討した。さらに、抗生物質の投与により、Lfの長期投与による認知機能障害への影響が一部消失したことから、腸内細菌叢がLfの作用に関与していることが示唆された。しかし、腸内細菌叢が認知機能にどの程度影響を及ぼすかについては、さらなる研究が必要である。一方、微生物-腸-脳軸の空間を解決するために、短期Lf介入を行った。その結果、2週間のLf介入により、行動変化を誘発することなくWDによる腸内細菌叢の変化が抑制されたことから、腸内細菌叢が脳に移行するタイミングの順序が支持された。したがって、Lfの介入は、腸-微生物-腸-脳軸を改善することによって認知障害を改善する可能性が高い。
まず、Lfのバイオアベイラビリティを考慮する必要がある。なぜなら、食事から摂取されたタンパク質は、消化器系で低分子のペプチドやアミノ酸に加水分解され、吸収・利用されるからである。(125)I標識Lfを経口投与したところ、Lfの機能的断片のみがタンパク質分解を免れ、マウス小腸で検出された(Kuwata et al., 2001)。しかし、別の動物実験では、Lfは腸管内腔での主要なタンパク質分解に抵抗し、抗原性の形態でマウス血液中に容易に吸収されることがわかった（Fischerら、2007）。一方、臨床試験では、Lfの摂取がボランティアの血清Lf含量に影響を及ぼさないことが観察され、ヒトはLfを循環系に直接吸収できないことが示唆された（Hayesら、2006年）。しかし、別の研究では、若年成人の胃で消化・分解されたLfは40％未満であったと報告している（Furlund et al.、2013）。このように、Lfの生物学的利用能に関しては、動物実験でもヒトでの試験でも一貫した結果は得られていない。胃および十二指腸消化後のLf分解とペプチド形成は、胃pHと胃腸環境に大きく依存していた。実生活では、経口摂取がより一般的であり、栄養素の介入には合理的である。今回の動物実験では、Lfの胃内投与を選択した。
本研究では、海馬依存性の認識記憶と日常生活動作能力を探るため、ネスティング行動試験、NOR試験、MWM試験を行った（Bevins and Besheer, 2006; Deacon, 2006; Vorhees and Williams, 2006）。その結果、LfはWDによる作業学習と記憶能力の害を抑制することが示された。加齢は空間学習能力を低下させ、空間記憶検索能力を損なう可能性がある。Zhengら（2020）は、MWMテストを用いて、Lfを3ヶ月間投与すると、16ヶ月齢のC57/BL6Jマウスにおいて空間認知能力が部分的に回復することを見出した。Abdelhamidらは、NOR試験で認知機能を測定するために嗜好性指標を用い、Lfと加水分解Lfの3ヵ月間摂食の両方が、APP-Tgマウスにおいて新規物体に対する嗜好性を誘導することを見出した（Abdelhamidら、2020）。Xuら（2019）はまた、Lfを1週間腹腔内注射することで、マウスモデルのPD様運動機能障害が大幅に改善することを見出した。このように、Lfは神経変性疾患の様々な動物モデルにおける認知機能障害を改善する。
この発見は、認知処理、学習、記憶に関与する海馬でさらに実証された。海馬におけるシナプス形成と可塑性の調節障害は、認知障害とADに関与している（Lamont and Weber, 2012）。予想通り、WDは海馬の超微細シナプス構造を破壊し、Lfはシナプス後密度の形態学的損傷を効果的に回復させた。PSD-95はPSDファミリーのメンバーであり、シナプス統合と神経機能回復に重要な役割を果たしている（Ugalde-Trivino and Diaz-Guerra、2021）。SNAP-25は可溶性N-エチルマレイミド感受性因子付着タンパク質の受容体ファミリーのメンバーであり、シナプス小胞の細胞外分泌を制御している（Shaabanら、2019）。本研究では、Lfが海馬においてシナプス機能タンパク質SNAP-25とPSD-95の発現を有意にアップレギュレートすることが示された。関連タンパク質の発現に関する結果と合わせて、この知見は、LfがWD誘発の認知機能障害を遅らせることを支持した。
肥満関連疾患は慢性炎症によって特徴づけられる。本研究では、Lfは体重と白色脂肪組織を有意に減少させ、WD誘発の脂質異常症を改善した。Lfによる肥満状態の緩和は、脳における炎症抑制と免疫調節に関連していた。ミクログリアは脳に常在する免疫細胞で、感染症やその他の傷害に反応して活性化する。ミクログリアが過剰に活性化すると、周囲の健康な神経組織にダメージを与える。さらに、死滅した神経細胞や死にかけた神経細胞から分泌される因子がミクログリアの慢性的な活性化を悪化させ、神経細胞の喪失を進行させ、その後の認知機能障害を引き起こす（Bao et al.） 免疫蛍光分析により、Lfは海馬領域におけるWD誘発ミクログリアの活性化を抑制することが示された。活性化したミクログリアは広範な炎症性サイトカインを産生し、最終的に神経細胞障害を誘発する（Banati, 2002）。同様に、Lfの介入は大脳皮質と海馬におけるTNF-αとIL-6の発現を低下させた。一方、循環サイトカインは、血液脳関門の内皮細胞によって発現されるサイトカイントランスポーターを介して脳に到達し、その後ミクログリアのサイトカイン産生を調節することができる（Bairamianら、2022）。Zhengら（2020）は、Lfが高齢マウスの海馬および血清中のIL-1β、IL-6、TNF-αレベルを低下させることを見出した。本研究では、LfがTNF-αとIL-6の血清レベルを同時に緩和したことから、末梢と中枢の炎症のクロストークが観察された。
ミクログリアの表面で侵入病原体に対する第一線の宿主防御として、TLR4はNF-κBシグナル伝達経路などの複数の下流シグナル伝達経路を活性化する（Luら、2008）。Aβとの結合後、TLR4はNF-κB複合体を活性化し、NLRP3およびプロIL-βの転写発現に関与する下流事象を活性化することができる（Zhouら、2014）。正常な炎症細胞では、活性化TLR4は細胞内タンパク質である骨髄分化因子MyD88に直接結合することができる。MyD88のアップレギュレーションは、TNF-αやIL-1βなどの炎症性サイトカインの発現をさらに増加させる可能性がある（Zhaoら、2014年）。一方、NF-κBはNLRP3インフラマソームの形成を仲介し、ASCをリクルートして重合させ、カスパーゼ-1の活性化につながる。活性化されたカスパーゼ-1は、炎症性サイトカインの成熟と放出を促進する（Yuら、2022年）。その結果、数多くの神経炎症プロセスが、認知機能障害を引き起こす病理学的プロセスをさらに悪化させる（Holmes, 2013）。本研究では、NF-κB/NLRP3インフラマソームの活性化が、WD摂食による神経炎症を媒介した。Lfの介入は、WDによって誘発されたNF-κB/NLRP3/カスパーゼ-1/IL-1β/IL-18軸のアップレギュレーションを抑制した。LfのNF-κB/NLRP3インフラムマソームに対する効果は、以前にも他の細胞や臓器傷害で観察された。Nematiらは、リポ多糖で活性化したマウスRAW264.7細胞において、LfがTLR4、MyD88、IL-6、およびTNF-αの発現をダウンレギュレートすることを示した（Nematiら、2021）。Madkourら（2022）は、Lf投与が、腎IL-1β、NLRP3およびNF-κBを減少させることにより、グリセロール誘発横紋筋融解症および急性腎障害を有意に改善することを見出した。我々が知る限り、Lfの抗炎症作用が、海馬におけるNF-κB/NLRP3インフラマソーム活性化の抑制に関連している可能性を示したのは、本研究が初めてである。
腸管透過性の障害は、有害物質の流入を可能にし、腸内細菌の生態系を乱す（Maleszaら、2021年）。肥満型微生物叢の移植は、腸管バリア機能を破壊し、マウスの認知機能低下を誘導する（Bruce-Kellerら、2015年）。本研究において、WD食摂取は腸の炎症を劇的に増加させ、腸バリアの完全性を低下させたが、これは先行研究（Tsatsanisら、2021）と一致していた。Lfの介入は結腸の長さを増加させ、結腸のタイトジャンクションタンパク質オクルディンを上昇させ、結腸の炎症を低下させた。同様に、Huら（2022）は、Lf投与が、オクルジンの発現を増強し、炎症性サイトカインの産生を減少させることによって、デオキシニバレノールによるマウスの腸の損傷を回復させることを見出した。
腸内細菌叢は、部分的には神経炎症を調節することによってその作用を発揮する。神経炎症の発症に関与するミクログリアは、腸内細菌叢に媒介されている（Bairamianら、2022年）。腸内細菌叢の変化は、ADモデルマウスにおけるミクログリオーシス、大脳NLRP3インフラマソームおよびIL-1βの増加と正の相関があった（Shuklaら、2021）。AD患者の腸内細菌叢を移植すると、マウスの腸管においてNLRP3インフラムマソームの活性化が誘導され、炎症因子の放出が引き起こされた（Shenら、2020年）。対照的に、健康な糞便微生物叢の移植は、神経炎症を抑制し、TLR4/TNF-αシグナル伝達経路を阻害することにより、PDマウスを保護した(Sun et al., 2018)。本研究において、LfはWDによって誘発された腸内細菌叢のα多様性の減少を回復させたが、これは哺乳子豚やAPP/PS1マウスを用いた他の研究結果（Huら、2020；Zhouら、2021）と一致していた。従って、認知障害、神経炎症、海馬のNF-κB/NLRP3インフラマソームに対するLfの効果は、腸内細菌叢と関連している可能性がある。
バクテロイデテスは腸のバリアに有益である（Desai et al.） 横断研究において、認知症患者の腸内細菌叢ではバクテロイデス類の存在量が低いことが判明した（Saji et al.） 本研究では、LfはWD誘発のバクテロイデテスの減少を回復させ、上皮障害と記憶障害を改善した。さらに相関分析により、認知機能はバクテロイデテスと正の相関があることが示された。したがって、Lfは微生物-腸-脳軸においてバクテロイデテスを制御し、認知機能障害を緩和することが示された。F/B比は肥満マウスで有意に増加する（Koliada et al.） ヒトでは、F/B比は加齢とともに数倍に増加し、神経変性疾患の主要なリスクとなる（Ley et al.、2006）。本研究において、Lfの介入はF/B比を低下させる傾向があり、これはLfを投与した高脂肪食マウスを用いた他の研究（Liら、2022）と一致していた。Roseburia属は肥満や神経変性疾患と関連している（Karlssonら、2013；Keshavarzianら、2015）。系統的な検索により、Roseburia属は東洋の集団における痩身関連属であることが判明した（Xuら、2022）。Huら（2020）は、Lf含有溶液を飲んだ哺乳期の子豚はRoseburiaの生息数が多いことを発見した。本研究では、Lfの介入によりRoseburiaの存在量が増加したことから、認知機能障害の改善と関連していると考えられる。結論
全体として、本研究で得られた知見は、シナプス損傷を緩和し、ミクログリアの活性化を抑制することにより、WD誘発肥満マウスの認知機能障害に対するLf介入の有益な効果を実証した。その根本的なメカニズムには、NF-κB/NLRP3インフラムソームの活性化を抑制することによる神経炎症の減少、および微生物-腸-脳軸を介した腸内細菌叢組成のシフトの改善が関与している可能性がある。腸内細菌叢、炎症、および認知機能の複雑な相互作用を解明するためには、より綿密に計画された実験が必要である。
CRediT著者貢献声明
Qian He： 概念化、データキュレーション、形式分析、調査、方法論、プロジェクト管理、執筆-原案、準備。Li-Li Zhang：調査、形式分析、検証、プロジェクト管理。デミング・リー：調査、プロジェクト管理。呉江雪： 調査。郭雅信：調査。范景波：調査。呉慶陽： 調査。王海鵬： 構想、調査、資金獲得。王忠孝： 方法論、執筆-校閲・編集。Jia-Ying Xu： 概念化、検証、資金獲得、執筆-校閲・編集。秦立強： 概念化、調査、方法論、データキュレーション、執筆-原案、執筆-総説・編集、監修、資金獲得。
利益相反宣言
全著者を代表し、責任著者は利益相反がないことを表明する。
謝辞
本研究は、中国国家自然科学基金（第82173502号、第81973024号）、中国放射線医学・防護国家重点実験室開放プロジェクト（GZK1202001）、中国江蘇省高等教育機関重点学術プログラム開発（PAPD）の支援を受けた。
付録
表A.1. 食事成分
成分標準飼料（グラム/kg）WD（グラム/kg）カゼイン200195DL-メチオニン（DL）3L-シスチン3スクロース100410コーンスターチ389.486マルトデキストリン1081デトロース132乳脂肪20エトキシキン0. 04コーン油10大豆油70セルロース50ミネラルミックス#200003535ビタミンミックス#3000501010酒石酸コリン2.52コレステロール12.66Kcal/g44.63
表A.2. qRT-PCR分析用ペアプライマー
遺伝子プライマー配列（5′-3′）ForwardReverseNLRP3GTGGTGACCCTCTGTGAGGTTCTTCCTGGAGCGCTTCTAAIL-18CAATGTTCCTTCATTGAGCAACAAACAGGAGAAGTTGGTIL-1βTCAGGCAGGCAGAGTATCACTCCATGAGTCACAGGATGGCaspase 1ACAAGGCACGGACCTATGTCCCAGTCAGTCCTGGAAATGTLR4CTGGGTGAGAAAGCTGTAAAGCCTTCCTGGATGTTGGMyD88TATACCAACCCTTGCACCAAGTCTCAGGCTCCAAGTCAGCTCATCNF- κBCCAAAGAAGGACGACAGAATCGGCAGGCTATTGCTCATCACAZO-1CACACGATCTCAGAGACGAAGGCTGTATGGGCTGCTCAAGGTCOccludinGACCTTGTCCGGATGACTTCAGCAGCAGCCATGTACTCTTCTNF- αGGCGTGTTCATCCGTTCTCCTTCAGCGTCTCGTGTTTCIL-6ATTGTATGAACAGCGATGCACCCAGGTAGAAACGGAACTCCAGapdhATGACTACCCACGGGCAAGGATCTCGCTCCTGGAAGATG
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図A1. 実験デザイン。
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図A2. A-C.門、綱、科レベルでの微生物叢の相対的存在量の分類学的分布；D.腸内細菌叢と行動検査結果との相関。
推奨論文
データの入手可能性
リクエストに応じてデータを提供する。
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