Gut Microbiome Wellness Index 2は腸内細菌叢の分類学的プロファイルから健康状態の予測を強化する

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Gut Microbiome Wellness Index 2は腸内細菌叢の分類学的プロファイルから健康状態の予測を強化する



Nature Communications 15巻、論文番号：7447（2024）この記事を引用する

概要

最近のトランスレーショナルな腸内マイクロバイオーム研究の進歩により、予測的なヘルスケアアプリケーションを形成する上で腸内マイクロバイオームが重要な役割を果たすことが明らかになってきた。ここでは、腸内マイクロバイオーム分類学的プロファイルに基づく標準化された疾患診断的健康状態指標として設計された、我々のオリジナルGMWIプロトタイプの強化版であるGMWI2（Gut Microbiome Wellness Index 2）を紹介する。我々の解析では、世界的な人口動態（26カ国、6大陸にまたがる）を網羅する54の発表研究から得られた既存の8069の便ショットガンメタゲノムデータをプールし、疾患の有無に関連する腸内分類学的シグナルを同定する。GMWI2は、健常者（病気なし）と非健常者（病気あり）の識別において、クロスバリデーションによるバランスのとれた80％の精度を達成し、より信頼度の高いサンプル（すなわち、「拒否オプション」の外）では90％を超える精度を達成した。この性能は、オリジナルのGMWIモデルや従来の種レベルのα多様性指標を上回り、複数の疾患にわたって健常者と非健常者の表現型を区別するためのより頑健な腸内細菌叢シグネチャーを示している。研究間検証および外部検証コホートを通じて評価した場合、GMWI2は平均75％近い精度を維持している。さらに、過去に発表されたデータセットを再評価することにより、GMWI2は、腸の健康に対する食事、抗生物質曝露、および糞便微生物叢移植の影響に関する新たな洞察を提供する。オープンソースのコマンドラインツールとして利用可能なGMWI2は、個人のユニークな腸内細菌組成を用いて健康を評価するためのタイムリーで極めて重要なリソースである。

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はじめに

最近の画期的な研究により、腸内細菌叢と様々な複雑な慢性疾患1,2,3,4,5,6,7,8,9との深い関連性が明らかになった。このような発見があるにもかかわらず、私たちはどのようにしてその人が腸内細菌叢異常症に罹患しているかどうかを見分けることができるのだろうか？どのようにすればユニークな微生物シグネチャーを効果的に利用し、私たちの健康を定量的に追跡できるのだろうか？これらの重要な疑問は、健康とウェルネスの正確なマーカーとして腸内細菌叢を活用するための最前線に立っている。

複雑な慢性疾患を解明するマーカーとしての腸内細菌叢の可能性は科学界を魅了し、私たちは最近、腸内細菌叢健康指標（GMWI）［以前は腸内細菌叢健康指標（GMHI）と呼ばれていた］10を開発しました。GMWIは、特定の疾患タイプに関係なく、臨床的に診断された疾患を保有する可能性を腸内細菌叢の組成のみから判定することで、健康状態を評価するための便メタゲノムに基づく世界初の指標である10,11。この疾患診断指標は、34の独立した研究から得られた4347の便ショットガンメタゲノムからなるプールデータセットの包括的解析から導き出された。GMWIは、健康な腸内細菌種と病気に関連する腸内細菌種の総存在量（種レベルの相対的存在量と複数のα多様性指標を含む用語）の対数比である。プールされたデータセットで評価したところ、GMWIは臨床的に診断された疾患の存在を予測する上で69.7％のバランスのとれた精度（すなわち、正しく分類された健常検体と非健常検体の割合の平均）を示した。具体的には、健常者（疾患なし）と非健常者（疾患あり）の正しい分類率は、それぞれ75.6％と63.8％であった。さらに、GMWIは、679の便メタゲノムからなる検証コホートにおいて、73.7％のバランスのとれた精度を達成し、健康なサブセットと非健康なサブセットの正しい分類率は、それぞれ77.1％（118人中91人）と70.2％（561人中394人）であった。2020年に発表されて以来、GMWIはヒト腸内細菌叢に対する環境要因12および遺伝的／社会経済的要因13の影響を調査する研究や、「Longevous Gut Microbiota Signature（長寿腸内細菌叢の特徴）」種セットの同定13に利用されてきた。

我々のオリジナルGMWIプロトタイプは有望であるにもかかわらず、その一般的な適用を妨げる限界がある。第一に、GMWIは健康な便メタゲノムを健康でない便メタゲノムよりも高い成功率で正しく分類する。このバイアスは、GMWIモデルの基本的な構成要素である、健康関連種と疾患関連種の同定に使用された有病率ベースの戦略に起因する可能性がある。非健常者グループにはさまざまな疾患を持つ患者が含まれるため、このグループは本質的に異質である。そのため、有病率に基づく戦略では、非健常者集団の部分集合（例えば、特定の疾患を持つコホート）にのみ見られる微妙な分類学的特徴を見逃す可能性がある。第二に、我々の既存のモデルは、個々の種の重要性における潜在的なばらつきを考慮することなく、それぞれの種に等しい重みを割り当てている。分類精度と一般的な適用性を向上させるためには、宿主の表現型との関連性の強さのばらつきを考慮した、より洗練された重み付けシステムが必要である。さらに、すべての分類学的ランクから腸内微生物の情報を含めることで、宿主の表現型を正確に予測する特徴をより多く発見できる可能性がある14,15。本研究では、上記の限界に対処し、健常表現型と非健常表現型の区別における分類精度を大幅に向上させた、オリジナルのGMWIの高度な反復であるGMWI2を提示する。

結果

健康表現型と疾患表現型にまたがる便メタゲノムのプール解析

以前の研究10と同様に、「健康な」被験者とは、報告された疾患や体重異常のない人（すなわち、報告されたBMIに基づいて低体重、過体重、または肥満に分類された人）と定義し、「健康でない」被験者とは、何らかの疾患の臨床診断が確認された人とした。(「健常」と「非健常」の定義を同じにすることで、今回の研究は、当初のGMWI法を継続的に改良したものであることが保証される)。26カ国、6大陸にまたがる54の独立した研究から得られた既存の8069個の便ショットガンメタゲノム（健常人5547個、非健常人2522個）のプール解析を行った（図1a、表1、補足データ1）。これらのプールされたメタゲノムは、12種類の健康および疾患表現型（Fig. 1a；健常人、強直性脊椎炎、アテローム性動脈硬化性心疾患、大腸がん、クローン病、バセドウ病、肝硬変、多発性硬化症、非アルコール性脂肪性肝疾患（あるいは代謝性機能障害関連脂肪性肝疾患[MASLD]とも呼ばれる）、関節リウマチ、2型糖尿病、潰瘍性大腸炎）、多様な地域、民族／人種、文化、バランスのとれた性表現（図1b）。(私たちの研究およびサンプル選択基準は「方法」のセクションにある。すべての被験者の表現型、年齢、性別、BMI、地域については、補足データ2に記載されている。このようにサンプルサイズが大幅に増加し、以前の研究で含まれていたメタゲノム数のほぼ2倍になったことが、GMWI2における1つの注目すべき改善点です。さらに、GMWI2では、分類学的プロファイリングにMetaPhlAn217の代わりにMetaPhlAn316を使用し、広範囲に拡張されたマーカーデータベースを活用して、微生物分類群のより包括的で正確な特徴付けを行っている（"Methods "のセクション）。

図1：多様な世界的代表者の複数の健康状態および疾患状態にわたる便メタゲノム解析のプール実施。

aPubMedとGoogle Scholarで調査を行い、健康な人（疾患のない人）とそうでない人（疾患のある人）のヒト便ショットガン・メタゲノム（腸内細菌叢）サンプルが公表されている研究を検索した。最初の便メタゲノム収集は、73の独立した研究から得られた12957サンプルで構成された。すべての生のメタゲノムサンプル（.fastqファイル）がダウンロードされ、同一のバイオインフォマティクス手法を用いて一様に再処理された。配列決定されたリードの品質管理後、MetaPhlAn3を用いて分類学的プロファイリングを行った。研究およびサンプルはいくつかの除外基準に基づいて削除された。最終的に、健常人と非健常人の表現型にまたがる54の研究から、合計8069サンプル（健常人からのメタゲノムは5547サンプル、非健常人からのメタゲノムは2522サンプル）がプールされたメタゲノムデータセットに集められ、下流の解析に供された。bメタゲノムサンプルがプールされたデータセットに含まれる研究対象者の人口統計学的概要。被験者の人口統計学的属性は、元の研究で報告されている通りであり、出身国（n= 8069）、年齢（n= 4670）、性別（n= 5247）を含む。

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表1 本研究で使用したヒト便ショットガンメタゲノムデータセット

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すべてのメタゲノムは、「方法」のセクションに記載されているように、同一のバイオインフォマティクスパイプラインを使用して均一な再処理を受けた。このような方法はバッチ効果を軽減するだけでなく18,19、強い交絡因子が存在する可能性があるにもかかわらず、健康および疾患に関連する腸内分類学的シグネチャーの同定を強化する。実際、これは主成分分析（PCA）でも裏付けられており、サンプルの出所や条件が異なるにもかかわらず、健常群と非健常群では腸内細菌叢プロファイルが有意に異なっている（AdonisR2= 1.2%,P= 0.001, PERMANOVA; 図2a）。とはいえ、メタゲノムデータのコンセンサス前処理は、バイオインフォマティクス解析に関連するバッチ効果の原因のひとつを効果的に低減するものの、このアプローチでは、異なる研究間の実験的・技術的手順に起因する潜在的なバッチ効果を完全に排除することはできないことを認識することが重要である。このような要因には、便サンプルの採取方法、保存方法、メタゲノムシーケンスの準備方法の違いが含まれる。

図2：健常者と非健常者の腸内細菌叢分類学的プロファイルは、Lasso-penalizedロジスティック回帰分類モデルに反映される。

a腸内細菌叢プロファイルの主成分分析（PCA）。健常者（青、n= 5547）と非健常者（赤、n= 2522）グループ間の分布に有意差が認められた（P< 0.05、PERMANOVA）。楕円は95％信頼区間を表す。PC1とPC2の大きさの上位10位までのローディングベクトルを示す。bラッソ-ペナルティ化ロジスティック回帰モデルの係数値。このモデルには、正の係数を持つ49の分類群、係数がゼロの3105の分類群、および負の係数を持つ46の分類群が含まれる。

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GMWI2でのLasso-penalizedロジスティック回帰の実装

健康なグループとそうでないグループを区別する分類タスクのために、GMWI2は、オリジナルのGMWIで利用された対数比方程式の代わりに、ラッソ検定されたロジスティック回帰モデルを使用します。したがって、GMWI2は基本的に予測に線形回帰を使用し、遺伝統計学における多遺伝子リスクスコアモデルに似ている20,21。このモデルは、測定可能なすべての分類学的ランクにまたがる腸内細菌叢の分類学的プロファイル（前述の8069個の便ショットガンメタゲノムからなるプールデータセットから得られた）で訓練され、疾患尤度を微生物分類群（すなわち、クレード）の有無の線形関数としてモデル化した。具体的には、個々のサンプルのGMWI2スコアは、そのサンプルが健康で疾患のない個人に由来する場合の予測対数オッズ（logit）として定義されます。GMWI2がどのように病気の可能性を推定するためにLasso-penalizedロジスティック回帰を使用するかのより包括的な説明は、"Methods "セクションに詳述されています。

オリジナルのGMWIアプローチは、健康および疾患に関連する微生物種を同定するために、有病率ベースの戦略を利用していた。我々の現在の方法は、可変的な特徴のインポータンスを学習し、手作業による種の同定の必要性をなくす。より具体的には、Lasso-penalizedロジスティック回帰モデルは、腸内マイクロバイオーム・プロファイルから直接得られた、係数がゼロでない95の微生物分類群を予測に利用した（図2bおよび補足データ3）。興味深いことに、係数が正および負であることを特徴とする分類群の大部分は、それぞれ健常群と非健常群で相対的存在量が高いことを示した（補足データ4）。これらの分類群には、1綱、3目、4科、19属、68種が含まれた。注目すべきことに、係数の値は-0.68から0.54の間で変動しており、各分類群がその相対的な関連強度に応じてGMWI2スコアに異なる寄与をしていることが確認された。これは、それぞれの種に等しい重みが割り当てられていた以前のGMWI対数比モデルからの変化を示している。

我々の分析において、いくつかの分類学的水準がゼロでない係数を示したことは注目に値する。これはおそらく、異なる分類階層間の相互依存性が多重共線性を引き起こし、回帰係数の解釈を複雑にしていることが一因であろう。しかしながら、すべての分類学的レベルを包含する我々のアプローチは、単一の分類学的レベルのみを使用した場合と比較して、より高い分類性能を示した（補足表1）。分類精度を最適化するという我々の主な目的を考えると、この点を優先することを選択し、多重共線性の懸念は脇に置くことにしました。

以下のセクションでは、健康な個体とそうでない個体の区別におけるGMWI2の熟練度を評価する。このプロセスは、概念的に4つのフェーズに分けることができる：

  1. 1.モデルのトレーニング： GMWI2は全トレーニングデータセットでトレーニングされ、評価される。このフェーズでは、ロジスティック回帰係数を計算し（図2bに描かれているように）、GMWI2スコアを決定するために8069サンプルすべてを利用する。

  2. 2.交差検証： GMWI2は、交差検証（CV）と研究間検証（ISV）戦略によってさらに評価される。初期段階とは対照的に、これらの戦略では、モデル学習に8069サンプルすべてを同時に活用することはない。その結果、このフェーズで生成されたモデルは、最初のフェーズで生成されたモデルとは本質的に異なる。標準的な交差検証プロトコルに沿って、ロジスティック回帰係数の計算を含むGMWI2モデルのトレーニングは、8069サンプルの各トレーニング-テスト分割のトレーニング分割に厳密に限定される。

  3. 3.外部データセットでの検証 第1フェーズで開発したGMWI2モデルを6つの外部データセットに適用し、独立したサンプルに対する識別力を確認する。

  4. 4.縦断的データセットでの実証： 第1フェーズのGMWI2モデルを、さらに4つの外部データセットに適用する。これらの評価は、縦断的シナリオにおけるGMWI2の適用性を実証することに重点を置いている。

GMWI2による健康な腸内細菌叢とそうでない腸内細菌叢の分類の強化

GMWI2スコアは、予測対数オッズを計算する際に学習された係数を適用することで、メタゲノムに対して計算された。GMWI2値が正であれば、そのサンプルは健康であり、疾患が存在しないことを示す。一方、GMWI2値が負であれば、そのサンプルは非健康であり、疾患が存在することを示す。GMWI2が0の場合、正の係数分類群と負の係数分類群が等しく重み付けされて存在することを意味し、それによってサンプルは健康でも非健康でもないと分類されます。訓練用データセット（8069サンプル）で評価したところ、GMWI2は79.9％のバランスのとれた精度を示した（健常者における正しい分類率： 79.2％、非健常者正答率80.6％）： これは、オリジナルのGMWIモデル（71.8%、d=0.63）や従来の種レベルのα多様性指標（シャノン指数、シンプソン指数、リッチネス）で報告されたバランスのとれた精度とクリフのデルタ（d）効果量0.75を大幅に上回るものであった（図3aおよび補足データ5）。その結果、GMWI2はGMWIよりもはるかに効果的に健常群と非健常群を区別することが示されたが、両指標には強い相関があった（ピアソンのr= 0.81；補足図1）。さらに、健常人の腸内細菌叢は、11の疾患表現型のそれぞれと比較して、有意に高いGMWI2スコアを示すことがわかった（図3b）。最後に、GMWI2と、年齢、BMI、空腹時血糖、血中コレステロール、中性脂肪などの臨床的／人口統計学的特性（｜スピアマンのρ｜＜0.3；補足図2a～g）との間に弱い相関が観察され、これらの因子が腸内細菌に基づく分類結果に有意な影響を与えないことが示された。

図3：Gut Microbiome Wellness Index 2（GMWI2）を用いた健康な便とそうでない便のメタゲノム分類の強化。

aGMWI2は、GMWIおよびα多様性指標と比較して、健常群（n= 5547）と非健常群（n= 2522）を最もよく層別化する（両側Mann-WhitneyU検定によるP値；dはCliff's Delta効果量）。b健常群（青、左端）は、11の非健常表現型すべてよりも有意に高いGMWI2スコアを示す（両側Mann-WhitneyU検定によるP値）。非健康表現型には、多発性硬化症（MS、n=24）、強直性脊椎炎（AS、n=95）、関節リウマチ（RA、n=151）、潰瘍性大腸炎（UC、n=250）、非アルコール性脂肪性肝疾患（NAFLD、n=86）が含まれる、 2型糖尿病（T2D、n= 377）、クローン病（CD、n= 284）、バセドウ病（GD、n= 100）、大腸がん（CC、n= 789）、肝硬変（LC、n= 152）、アテローム性動脈硬化性心血管病（ACVD、n= 214）。cGMWI2とGMWIスコアのビン（x軸）。黒棒と灰色棒の高さは、それぞれ各GMWI2とGMWIビン内のメタゲノム・サンプル数を示す（y軸、左）。d大きさのカットオフ値を大きくすると、GMWI2の分類性能が向上し、保持サンプル数が減少する（オレンジ、y軸、右）一方で、トレーニングセットのバランス精度が向上する（青、y軸、左）。GMWIとGMWI2のスコアのカットオフの大きさ（0、0.5、1.0）を変えながら、トレーニングセット、LOOCV（leave-one-out cross-validation）、10-fold CVで両グループの精度（y軸、左）を描いている。バランスのとれた精度は、それぞれ健常群と非健常群を表す青とピンクのバーの間で示される。オレンジ色の点は、対応するインデックスの大きさのカットオフに対して保持されたサンプルの割合（y軸、右）を表す。10-fold CVについては、ランダムサブサンプリングを10回繰り返し、その平均結果を表示。標準的な箱ひげ図（すなわち、中心線は中央値、箱の限界は上下の四分位数、ひげは1.5×四分位範囲、点は外れ値）は、(a,b)の数値データのグループを描写するために使用される。

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続いて、GMWI2値が高いほど（または高いほど）、便メタゲノムが健康であると分類される信頼性が高いことを示すかどうかを調べた。逆に、GMWI2スコアが低い（またはより否定的な）場合、サンプルが非健常と分類される可能性が高まるかどうかを調べた。実際、GMWI2スコアが次第にプラスになるメタゲノム試料では、健康な人の割合が徐々に増加することが観察された（図3cおよび補足表2）。同様に、GMWI2スコアがマイナスになるにつれて、非健康的な被験者の割合が増加した。注目すべきことに、GMWI2の正と負のビン内の実際の健康なサンプルと非健康なサンプルの割合は、それぞれ同じGMWIビンと比較して両方とも高かった（図3cのポイントを参照）。GMWI2とGMWIビンの間のサンプル分布のこの違いは、健康なサンプルとそうでないサンプルを区別するGMWI2の改善された能力を強調している。

図3cの結果から、興味深い傾向が明らかになった。具体的には、GMWI2（およびGMWI）スコアがより正または負の値を示す場合、実際の健常および非健常サンプルの割合がそれぞれ増加する。この傾向は、表現型分類の信頼性が高まる可能性を示唆している。対照的に、これらの値がゼロに近づくにつれて、疾患の有無を正確に判定する信頼度は低下する。この点をより詳しく調べるため、次にGMWI2の最小閾値またはカットオフ・パラメーターを設定することで、表現型予測の分類精度がどのように向上するかを調べた。GMWI2スコアの大きさに対するカットオフ値を増加させることを考慮した場合、分類性能の顕著な向上が観察され、それによって、保持されたサンプルにおけるより高い予測信頼性が示された（補足表3）。例えば、GMWI2の大きさが0.5以上（すなわち、GMWI2スコアが-0.5以下または+0.5以上）および1.0以上（すなわち、GMWI2スコアが-1.0以下または+1.0以上）のサンプルを保持する場合、それぞれ85.8％および91.0％のバランスのとれた精度を達成した（図3d）。(これらのカットオフはGMWI2の大きさのカットオフの概念を説明するための例である）。しかし、このアプローチでは、GMWI2の大きさがこれらのカットオフ値以下のサンプルを除外する必要があり、それぞれ6364（全8069サンプルの78.9%に相当）と4712（8069サンプルの58.4%）のサンプルしか残らない。これは重要なトレードオフを浮き彫りにしている：カットオフ値を上げると精度は向上するが、潜在的に価値のあるサンプルが分析から除外される。

重要な観察として、GMWI2はサンプル数が不均衡であるにもかかわらず、健康な便とそうでない便のメタゲノムをほぼ同じ割合（それぞれ79.2%と80.6%）で正しく分類した。これは、健康なサンプルでより高い正答率を達成したオリジナルのGMWIとは著しく対照的である（図3e）。また、GMWI2モデルの性能は、1回きりのクロスバリデーション（LOOCV）と10回きりのクロスバリデーション（10-fold CV）の両方を用いて評価した（図3e）。興味深いことに、GMWI2は79.1%（健常者正答率78.6%、非健常者正答率78.6%）というほぼ同じバランス精度を達成した： 78.6％、非健常者正答率79.5％）： 79.5％）、79.0％（健常者正解分類率：78.6％、非健常者正解分類率：79.5％）を達成した： 79.3％）であった： LOOCVと10-fold CVでは、それぞれ79.0%（健常者正答率：78.6%、非健常者正答率：79.3%）となり、訓練データセットで達成された性能（79.9%）とほぼ一致した。

次に、2つのクロスバリデーション法について、異なる大きさのカットオフ値を用いて分類精度を計算した（図3e）。驚くべきことに、GMWI2は、-1.0以下または+1.0以上のサンプルにおいて、LOOCVと10倍CVでそれぞれ90.4%と90.2%のバランスのとれた精度を達成した。これらのバランスされた精度は、トレーニングセットで観察された精度（91.0%）に非常に近いものであった。対照的に、同じ基準をGMWIに適用した場合（すなわち、カットオフ1.0）、バランスされた精度は78.6％と大幅に低下した。これらの結果は、GMWI2がGMWIよりも顕著な改善を達成したことを強調している。

さまざまなサンプルサイズの研究集団におけるGMWI2の頑健性の評価

サンプルサイズが小さい研究はトレーニングセットから除外されたが（図1aおよび「方法」のセクションの研究除外基準を参照）、一般的に、サンプルサイズの異なるデータセットで分類モデルを検証することは極めて重要である19。この目的のため、バッチ効果（すなわち、研究集団または施設特性に関連する技術的または生物学的変動）がGMWI2の性能の安定性に及ぼす影響を評価するために、研究間検証（ISV）を実施した。このアプローチでは、1つの研究を繰り返し除外し、残りの研究でGMWI2モデルを訓練し、除外した研究でその分類性能を評価した22。(除外された研究は、実質的に独立した検証（またはテスト）コホートになる）。ISVの重要な側面は、検証セットの選択によって生じうる分類性能の大きな変動を示すことができることである。我々の研究では、54の独立した検証セットにわたってGMWI2を適用したときに達成可能な分類精度の範囲を提供します。

図4aは、サンプル・サイズの詳細とともに、保留された研究の全範囲にわたるGMWI2の性能を具体的に示している。異なる研究間で分類性能にばらつきがあるにもかかわらず（図4aおよび補足表4の研究ごとのISV分類精度を示すゴールドポイントを参照）、平均的なバランスのとれた精度は75.8%でした。この性能は、GMWI2スコアが-1より低いか1より高いサンプルを考慮した場合、86.9％に上昇した（補足表4）。全体として、我々の分析では、モデルの予測性能とホールドアウトデータセットのサンプルサイズとの間に明確な相関関係は見られなかった。

図4：研究間検証（ISV）は、多様な研究集団にわたるGMWI2の効果的な一般化を示す。

aISVで除外された各研究の分類精度は、ゴールドポイント（y軸、右）で表示される。x軸の研究は、単一の表現型（健常または非健常）または両方の表現型の場合のバランスのとれた精度のいずれかに基づいてランク付けされている。積み重ねた棒グラフは、各研究における健常（青色）と非健常（ピンク色）の便メタゲノムサンプル数を示している（y軸、左）。bトレーニングセット、10倍CV、ISVにおける健常と非健常の表現型を区別する分類性能の受信動作特性曲線。

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ISVで得られた分類性能は、研究の境界を考慮しないLOOCVや10-fold CVで達成された性能と比較して、最小限の格差を示した。これらのストラテジー間のわずかな不一致は、バッチ関連のバイアスに対するGMWI2の回復力を示し、GMWI2が被験者の起源に関係なく、便メタゲノム全体で効果的に一般化することを示している。この頑健性のさらなる証拠は、トレーニングセット、10倍CV、およびISVにおける曲線下面積（AUC）メトリクスによって示され、それぞれ0.88、0.87、および0.84のAUCを達成した（図4b）。

独立したサンプル・セットにおけるGMWI2の予測能力の実証

健康な人とそうでない人を区別するためのGMWI2の予測能力を確認するために、6つの発表済み研究から得られた1140の便メタゲノムサンプルからなる外部検証データセットをコンパイルした（補足データ6）。このデータセットには、健常人と強直性脊椎炎、膵臓がん、パーキンソン病と診断された患者のサンプルが含まれている。この検証データセット（補足データ7）のすべてのメタゲノムサンプルは、上記で示したのと同じ方法で、健常群と非健常群に分類された。

発見コホート（またはトレーニングデータ）から得られた知見と一致して、健常検証グループ（n= 494）の便メタゲノムから得られたGMWI2スコアは、非健常検証グループ（n= 646）のものよりも有意に高かった（P= 1.6 ×10-43、両側Mann-WhitneyU検定；Cliff's Delta = 0.48；図5a）。達成されたバランス精度は72.1%で、これはISV分析で観察された平均バランス精度75.8%に匹敵する。マグニチュードのカットオフを0.5と1.0にすると、バランスされた精度はそれぞれ75.4%と80.1%に向上しましたが、それでもサンプルの74.3%と49.3%は保持されました。

図5：健常者と非健常者の外部検証コホートにおけるGMWI2の性能。

a健常者グループ（494サンプル）と非健常者グループ（646サンプル）のGMWI2スコア。健常群では非健常群と比較してスコアが有意に高い（P= 1.6 ×10-43; 両側Mann-WhitneyU検定）。効果の大きさはクリフのデルタ（d= 0.48）で表される。b5つの健常者コホート（H1-H5）と3つの非健常者コホート（AS4強直性脊椎炎、PD6パーキンソン病、PC5膵臓がん）にわたるGMWI2スコア。表現型の略号に隣接する上付き数字は、補足データ6に詳述されている特定の研究に対応している。アスタリスク（*）は、対応する非健常者コホートと比較して、健常者コホートで有意にスコアが高いことを示す（P< 0.01、両側Mann-WhitneyU検定。正確なP値は補足データ6に記載）。各アスタリスクの横の数字は、各非健康状態と比較した健康コホートを示す。各群またはコホートのサンプルサイズは括弧内に示した。標準的な箱ひげ図（すなわち、中心線は中央値；箱の限界は上下四分位数；ひげは1.5×四分位範囲；点は（a）の外れ値または（b）の個々のGMWI2スコア）は、数値データのグループを描写するために使用される。

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外部検証データにおけるGMWI2の性能をさらに調べるために、5つの健常表現型と3つの非健常表現型にまたがる8つのコホート（研究ごとにユニークな表現型によって定義される）を分析した。図5bに示すように、5つの健常コホートのうち4つ（H1-H4）は、3つの非健常表現型コホートすべてよりもGMWI2分布が有意に高いことがわかった（P< 0.01、両側Mann-WhitneyU検定）。5つの健常コホートの分類精度は以下の通りであった： H1は96.3％（135人中130人）、H2は91.2％（57人中52人）、H3は83.3％（30人中25人）、H4は56.8％（37人中21人）、H5は28.1％（235人中66人）であった。また、3つの非健康コホートの分類精度は、膵臓がん（PC5）で90.7％（43人中39人）、パーキンソン病（PD6）で81.2％（490人中398人）、強直性脊椎炎（AS4）で80.5％（113人中91人）であった。注目すべきは、GMWI2がパーキンソン病における有害な健康状態の予測において良好な結果（81.2%）を示したことであるが、この神経変性疾患患者の便メタゲノムは当初の発見セットには含まれていなかった。さらに、H5コホートにおける分類性能は比較的低かった（28.1％）にもかかわらず、H5のGMWI2スコアは、同じ研究のPC5膵臓がんグループのスコアよりも有意に高かった。全体として、外部検証データセットにおけるGMWI2の頑健な再現性は、複数の疾患にわたる腸内細菌叢異常症の一般化された疾患関連シグネチャーが、データセットの統合およびインデックス策定中に効果的に捕捉されたことを示唆している。

縦断的研究における腸内健康の追跡

最近発表された4件の縦断的腸内細菌叢研究から得られた便メタゲノムにGMWI2を適用した。重要なことは、これらのサンプルは、GMWI2をトレーニングするために使用された8069メタゲノムの初期プールには含まれていなかったことである。ここで、我々の目的は、腸内細菌叢の健康追跡に向けてGMWI2を実証することにより、GMWI2の汎用性を説明することであり、それにより、当初意図されたケース対コントロールのシナリオを超えてその適用性を拡張することであった。腸の健康状態を定量的にモニタリングするための我々の指標は、心血管と代謝の健康状態を経時的に評価するためのコレステロールとグルコースの検査に例えることができる。

最初の研究23のデータを用いて、過敏性腸症候群（IBS）の22人の便メタゲノムを、2人の健康なドナーから糞便微生物叢移植（FMT）を受ける前と受けた6ヵ月後に解析した。参加者のうち、14人はFMT後に症状が軽減したと報告したが（「効果あり」群）、8人は症状が軽減しなかった（「効果なし」群）。両群とも、FMT後6カ月時点で種の濃度が有意に増加していたにもかかわらず（P< 0.05、片側Wilcoxon符号順位検定；補足図3）。しかし、「効果」グループの個体だけがGMWI2の有意な増加を示した（P< 0.05；図6aおよび補足表5）。同様に、種レベルのシャノン指数の増加は、「効果」グループでのみ観察された（P< 0.05；補足図4）。全体として、これらの知見は、リッチネスやシャノン多様性などのα多様性指標は相反する結論をもたらす可能性がある一方で、GMWI2の変化はIBSに対するFMT治療後の被験者の表現型のマーカーとして機能する可能性があることを示唆している。さらに、FMTのためのドナーのスクリーニングにおける臨床的意義と複雑さを考慮すると24,25、GMWI2のような計算ツールは（腸の健康状態のより微妙な定義を考慮すると）、適切な健康なドナーとその便サンプルの選択を導くのに役立つ可能性がある。

図6：GMWI2を用いた既存の縦断的腸内細菌叢研究の再解析。

a過敏性腸症候群患者におけるGMWI2の変化は、糞便微生物叢移植を受けてから6ヵ月後（6-mo）に観察された。症状緩和を経験した被験者（「効果」群）のみが、GMWI2の有意な増加を示した（P= 0.039、片側Wilcoxon符号順位検定）。nは、FMTドナーサンプル数（2人の健常ドナーからの合計17サンプル）またはFMTレシピエント数。EEN群はGMWI2に有意な変化を示し、値は2日目以降に有意に低下した（P< 0.05、両側Wilcoxon符号順位検定）。雑食動物群および菜食動物群では、ベースラインと比較してGMWI2に有意な変化は認められなかった。c抗生物質介入前後のGMWI2、Shannon Index、および種の豊富さ。42日目と180日目にそれぞれシャノン指数と種の豊かさが回復したにもかかわらず、GMWI2は0日目に比べて有意に低いままであり、約6ヵ月後でも腸内細菌叢の回復が不完全であることを示唆した（P< 0.05、両側ウィルコクソン符号順位検定）。実験は各試験群について3連で行った。バーの高さは平均GMWI2（実線バー内の数字）を示し、エラーバーは平均からの標準偏差を示す。点は個々の3連サンプルを示す。バーの上の異なる小さな文字は、TukeyのHSD検定（P< 0.05）によって決定されたGMWI2に有意差のある群を示す。対照群： NS0は0時間基質無添加、NS24は24時間基質無添加： FS24フラクトオリゴ糖、IN24イヌリン、GS24ガラクトオリゴ糖、XS24キシロオリゴ糖、FL24 2'-フコシラクトース。標準的な箱ひげ図（すなわち、中心線は中央値、箱の限界は上下四分位値、ひげは1.5×四分位範囲、点は個々のGMWI2スコアまたはα多様性値）は、(a-c)の数値データ群を描写するために用いられている。

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2番目の研究26では、食事の影響を調べた。食事介入前と介入中に30人の健康なボランティアから得られた便メタゲノムについてGMWI2を計算した。参加者は3つのグループに分けられた： 菜食主義者（菜食主義者であることを自己申告し、通常の食事を再開した）、雑食主義者（動物性と植物性の両方を含む標準的な食事を摂取した参加者）、排他的経腸栄養（EEN）（雑食主義者の参加者で、試験期間中、合成食物繊維を含まない食事を摂取した）である。便サンプルはベースライン時と食事介入期間中の毎日に採取された。菜食者と雑食者のGMWI2スコアは、介入期間中の5～6日間を通じて比較的安定していた（図6b）。しかし、EEN群のGMWI2は2日目以降、ベースラインに対して有意に低下した（P＜0.05、両側ウィルコクソンの符号順位検定；図6bおよび補足表6）。一方、α多様性は群間で有意な変化はなかった（補足図5）。これらの結果から、食物繊維の除去は腸内全体の健康状態の急速な低下につながる可能性が示唆されるが、この変化はα多様性の指標ではなく、GMWI2のみによって早期に検出された。全体として、今回の知見は、食物繊維が健康にもたらす効果27,28,29について確立された証拠を補強するものである。

3つ目の研究30では、広域スペクトル抗生物質（メロペネム、ゲンタマイシン、バンコマイシン）を4日間投与した12人の健康な若年成人の便メタゲノムについてGMWI2を算出した。便サンプルは曝露前に採取され、曝露後4日、8日、42日、180日目に再度採取された。種レベルのα多様性測定値（シャノン指数とリッチネス）は、42日目または180日目までに腸内マイクロバイオームがいくらか回復している可能性を示したが、GMWI2は180日目でも回復傾向を示さなかった（図6cおよび補足表7）。これらの所見は、以前は検出されなかったクロストリジウム属の増加や、ビフィドバクテリウム属のプロバイオティックメンバーや酪酸産生菌であるコプロコッカス・ユウタクタス（Coprococcus eutactus）およびユウバクテリウム・ヴェントリオサム（Eubacterium ventriosum）の消失など、Pallejaらによって当初指摘された介入後の有害な分類学的シフトを反映している。したがって、我々の結果は、短期間の広域抗生物質介入が腸内細菌叢に及ぼす長期的影響について新たな視点を提供し、GMWI2が急性疾患後の腸内細菌叢の回復を評価するための貴重なツールになり得ることを示唆している。

最後の研究31では、様々なオリゴ糖が腸内微生物群集に及ぼす影響を検討した。この研究では、LeeらはGMWIを用いてオリゴ糖のプレバイオティクス効果を評価し、腸内細菌叢のウェルネスへの影響に基づいて個別化された食事を設計するためのより広い示唆を与えた。ここでは、19人の健康な成人ボランティア（男性14人、女性5人）が糞便サンプルを提供し、それらを合わせてよく混合した。次に、フラクトオリゴ糖（FOS）、ガラクトオリゴ糖（GOS）、キシロオリゴ糖（XOS）、イヌリン（IN）、2′-フコシラクトース（2FL）を、24時間in vitro嫌気性バッチ式糞便発酵システムで、ホモジナイズした糞便サンプルの一部と別々に混合した。対照群として、0時間で基質を添加しない群（NS0）と24時間基質を添加しない群（NS24）の2群も用意した。実験は7つの試験群それぞれについて3連で行った。

すべての糞便サンプルについてGMWI2を算出し（図6dおよび補足表8）、これにより我々の新たな指標を用いて元の研究を再現した。これまでの知見と一致し、NS24群はNS0群よりも平均GMWI2が低く、これは健康度が低く、より疾病に関連した状態であることを示している。注目すべきは、3種類のプレバイオティクス（FOS、IN、GOS）の添加により、NS0群と比較してGMWI2が有意に高くなったことである（P＜0.05、Tukey's HSD検定）。また、これら3つのプレバイオティクスとXOSは、NS24と比較して有意に高いGMWI2をもたらした（P< 0.05）。しかし、GMWI2の結果とは異なり、伝統的なα多様性指標（シャノン指数、種の豊かさ、種の均等性、逆シンプソン指数）は、NS0群と比較してすべてのプレバイオティクス処理群で有意に低い値を示したと報告されている（P< 0.05）31。したがって、少なくともin vitro発酵の環境では、これら4つのプレバイオティクスの摂取は、健康な状態に関連する腸内微生物種の増殖を刺激する可能性があり、この効果はGMWI2を使用することによってのみ観察された。

考察

ヒトの腸内細菌叢に関する最近の研究は、予測的ヘルスケアのための革新的ツールの開発に役立つ可能性を強調している32,33,34,35,36,37。この点に関して、我々はGMWI2を紹介する。GMWI2は腸内細菌叢の分類学的プロファイルに基づく健康状態の頑健な予測因子であり、そのプロトタイプ（GMWI）と比較して著しい技術的進歩を示している。腸内細菌分類群とヒトの健康状態を結びつける生物学的シグナルを同定するために、54の発表済み研究から8069の便ショットガンメタゲノムがプールされ、6大陸にわたる26カ国の多様な人口統計を網羅する、我々の広範なマルチスタディ分析が行われた。GMWI2は、信頼度の高いサンプルについて約90％のクロスバリデーションによるバランス精度を実現し、健康な表現型とそうでない表現型を区別する分類器としての高い信頼性を確立した。さらに、過去に発表されたデータセットのデータを再検討し、再解釈することで、GMWI2は、食事の影響、抗生物質への曝露、およびFMTが腸内細菌叢に及ぼす影響に関する確立された理解に対しても、新たな視点を提供することができる。最後に、本研究は、頑健な機械学習アプリケーションを育成し、バッチ効果やバイアスに対する耐性を実証する上で、広範なデータ共有の重要性を強調している22,38,39,40。

GMWI2の大きさのカットオフ値を段階的に増加させた我々の分析では、分類精度とクラス予測の対象となるサンプルの量との間に逆相関があることを認識した。したがって、このマグニチュード・カットオフを単一の値に拘束することは、普遍的に適用できないかもしれない。その代わりに、このパラメータの選択は、個々のデータセットの特定のコンテキストと許容可能な精度の閾値に合わせて、ユーザーが柔軟に決定すべきである。言い換えれば、ユーザーは予測に対する信頼度の好みに基づいて、希望するGMWI2の大きさのカットオフ値を選択することができる。このユーザー主導のアプローチは、限られたデータセットにおける高い信頼性と、より低い信頼性でのより広い範囲の予測との間の柔軟性を提供し、従来の二値出力機械学習技術に対する我々の手法の明確な利点である。さらに、我々の知見は、GMWI2の大きさが低い場合の「拒否オプション」41,42の潜在的な有用性を促進するものであり、比較的不確実な予測を他のスクリーニング手法に振り向ける基準として機能することができる。

われわれの研究は、腸内細菌叢の予測能力に関する洞察を提供する一方で、認識すべきいくつかの限界がある。何よりもまず、我々はGMWI2スコアが健康状態との関連を反映していることを強調したい。これらのスコアは、消化管内の病原性細菌の検出、腸管運動特性、代謝プロファイル、血清マーカー、血中炎症マーカー、便中カルプロテクチン値などの直接的な臨床的健康指標との因果関係を示唆するものではない（また、それに取って代わることを意図したものでもない）ことを理解することが重要である。第二に、このモデルには、種の増殖速度、菌株の詳細、機能的可能性など、より複雑なマイクロバイオームの特徴が含まれることが有益である。これらの重要な因子を組み込むことで、予測精度が向上し、腸内細菌叢とヒトの健康全般を結びつける複雑なメカニズムについて、より豊かな視点が得られる可能性がある。第三に、我々は、プールされた便メタゲノミックデータセットが、地理的、人種的、文化的に多様な代表性を示すように、協調的な努力を払った。とはいえ、腸内マイクロバイオーム研究を真にグローバル化するために、今後の研究では、特に代表的でない地域や民族からの参加者をより広く受け入れることを重視すべきである。さらに、選択基準を緩めることで、より幅広い疾患表現型（神経変性疾患や精神疾患など）のメタゲノムが組み込まれ、さらに多様な層にアプローチできるようになる。このような拡大により、異なる集団間でのモデルの一般化可能性が高まる可能性がある。第四に、我々は種レベルまでの分類学的情報を利用したが、しばしば臨床的意義の高い微生物株に焦点を当てないことには、機会を逃す可能性がある。我々の方法は16S rRNA遺伝子アンプリコンシークエンシングの属レベルの限界を超えるが、同じ種の菌株間のばらつきは考慮されていない。第5に、Enterococcus faecium/faecalisを含むよく知られた病原体は、我々のGMWI2の枠組みでは負の係数を示さないことが我々の解析で明らかになった。それにもかかわらず、特定の日和見病原性分類群、特にClostridium属の間で負の係数が観察された（補足データ4に詳述）。病原性形質の決定は菌株レベルでより正確に行われ、我々のモデルの範囲外であることを強調することが重要である。さらに、慢性的な非感染性疾患に関連するすべての腸内細菌叢が、必ずしも侵襲性病原体を保有しているわけではないことは広く認められている。第6に、我々のモデルによって特定された健常者と非健常者の間の組成シフトは、通過時間、便の一貫性、および我々のメタデータでは把握されていないその他の要因などの変数によって影響を受ける可能性があることを認識している。これは、個々のサンプルについては有効な考慮事項である。しかし、8000を超えるメタゲノムサンプルの解析では、このような変数が均等に（ランダムに）分布している可能性が高いか、またはGMWI2ツールの全体的な性能に最小限の影響しか及ぼさないというのが我々の仮定です。最後に、健康（すなわち、自己報告による疾患または疾患に関連する症状がない）および非健康（すなわち、疾患の臨床診断を受けた患者）の定義は、我々の以前の研究10,11で使用されたものと一致している。しかし、これらの定義の微妙な違いがGMWI2の分類精度にどのような影響を与えるかについては調査していない。この点を分析することは、今後の研究の可能性のある分野である。

トランスレーショナルな可能性に関して、GMWI2は、腸内細菌叢の分類学的プロファイルの分析を通じて、半リアルタイムで個人の健康を動的にモニタリングするための新しい方法を提供するように設計されています。私たちの指標は、健康な腸内細菌叢と病気の腸内細菌叢を区別するように明示的に訓練されていますが、病気の前の状態を近似する実用的なアプローチも提供しています。これは、健常状態と疾患状態の間を補間することによって達成され、GMWI2が腸内細菌叢の健康スペクトルの変動を明らかにすることを可能にする。具体的には、我々のモデルの予測品質が十分であると仮定すると、個人のGMWI2スコアは、健康状態から疾患前状態、疾患状態へと移行するにつれて減少し、逆方向に移行する場合は増加する。さらに、GMWI2は、健常者から疾患者への定常的な移行を正確に追跡するために必要な、リソースを大量に消費する縦断的な腸内細菌叢データセットの収集に代わる実用的な選択肢を提供する。この分野における現在の取り組みは、規模が非常に限られており、コストもかかる。

総じて、GMWI2は特定の疾病診断を確認するためのものではなく、むしろ「炭鉱のカナリア」のような早期警告システムとしての役割を果たすものである。具体的な診断可能な症状が出る前に、腸内全体の健康状態が悪化する可能性のある変化を検出するように設計されている。このような検知は、軽度の問題が深刻な健康状態へとエスカレートするのを防ぐために、食事や生活習慣の改善に役立てたり、さらなる診断検査を促したりすることができる。既存の疾患特異的な指標とは異なり、我々の指標は複数の疾患にまたがっているため、汎疾患的な（あるいは一般的に健康な）腸内細菌叢の特徴を強調している。このような広範な適用可能性は、腸の健康状態が全身の健康状態を反映すると考えられるFMTドナーの選択などの臨床場面で特に有用であろう。関節リウマチや他の自己免疫性炎症性疾患のような疾患では、GMWI2は治療の漸減や中止、あるいは疾患再燃の可能性を評価する際の判断の指針となり得る。この意味で、GMWI2は、腸内細菌を中心とした健康分析における変革の時代を切り開く可能性があり、個人の微生物シグネチャーに合わせた微妙な健康評価を可能にする。今後、GMWI2を他のバイオ計測（マルチオミクス、ウェアラブルなど）やAIモデルとともに、より大規模な意思決定ネットワークに統合することで、腸内細菌叢からの知見によって、健康的な加齢43や予防的な健康スクリーニングおよびウェルネス・プログラム44,45のためのエキサイティングな可能性が開かれる可能性がある。

研究方法

ヒト便メタゲノームの複数研究によるプール

PubMedおよびGoogle Scholarにおいて、「腸内細菌叢」、「便メタゲノム」、「全ゲノムショットガン」などのキーワードを用いて包括的な文献検索を行った。検索は2022年1月まで行い、ヒト便サンプルのショットガンメタゲノムデータが公開されている発表研究を、対応する被験者のメタデータとともに特定した。複数のサンプルが異なる時点にわたって個人から収集された場合は、その研究対象者の最初のサンプルまたはベースラインサンプルのみを対象とした。食事や投薬による介入を含む研究は、GMWI2トレーニングのプールデータセットには含めなかった。また、40サンプル未満の研究は、このようなパイロットスケールのマイクロバイオーム研究からのマイクロバイオームデータの頑健性と信頼性に限界がある可能性を考慮して、解析から除外した。生配列ファイル（.sraまたは.fastq形式）は、さらなる解析のためにNCBI Sequence Read ArchiveおよびEuropean Nucleotide Archiveデータベースから取得した。

便メタゲノムサンプル除外基準

潜在的なバイアスを最小限に抑え、データの完全性を維持するため、本研究に含める便ショットガンメタゲノムサンプルに厳格な基準を適用した。具体的には、シーケンス技術の一貫性を確保するため、454 GS FLX Titanium、Ion Torrent PGM、Ion Torrent Proton、BGISEQ-500など、イルミナ以外のプラットフォームでシーケンスしたサンプルは除外した。データの質に関しては、品質管理フィルターにかける前に、リードカウントが低い（100万リード以下）サンプルを除外した。さらに、この解析では、ビロームに主眼を置いた研究や、便サンプルがウイルス様粒子精製を受けた研究のサンプルは除外した。

さらに、厳格な検体管理基準として、臨床診断に関連しない疾患コントロール検体も除外した。臨床的に特定の疾患と診断されていないが、特定の異常な状態を示す個体も除外した。(i)低体重（BMI＜18.5）、過体重（BMI≧25かつ＜30）、または肥満（BMI≧30）を示唆する体格指数（BMI）は、非健康的表現型として分類されなかった、(ii)薬物の大量使用（アルコールおよび娯楽用薬物を含む）が宣言されている、(iii)年齢が100歳を超えている、(iv)ベースライン時には健康であったが、縦断的研究中に後に疾患状態を発症したと報告された。さらに、ヒト成人腸内細菌叢に主眼を置いているため、新生児、乳児、小児の腸内細菌叢研究からのサンプルは除外した。最後に、初期段階の疾患（耐糖能異常、高血圧、大腸腺腫など）、希少疾患または遺伝的関連疾患（ベーチェット病、統合失調症など）、大腸以外のがん（膵臓がん、非小細胞肺がん、乳がんなど）を有する非健常者は除外した。これらの除外は、GMWI2をトレーニングするための均一で代表的なデータセットを確保するために適用された。

シーケンスリードの品質管理

ヒトゲノム（参照ゲノムGRCh38/hg38）にアライメントされたリードをBowtie246 v2.4.4（デフォルトパラメータ）を用いて除去することで、ヒトによる汚染の可能性を除外した。イルミナのユニバーサルアダプターシーケンスとともに、FastQC47 v0.11.8を用いて各メタゲノムサンプルからオーバープレゼントシーケンスを抽出し、アダプターの可能性が高い配列を同定した。アダプター配列のクリッピングとクオリティフィルトレーションは、Trimomatic48v0.39を用いて行った。具体的には、Trimomaticの "ILLUMINACLIP "ステップを使用し、最大シードミスマッチカウント2、回文クリップしきい値30、単純クリップしきい値10、最小アダプター長2 bpとした。さらに、各リードの先頭および末尾の低品質塩基（Phred quality score < 3）が除去され、ヌクレオチド長60 bp未満のトリミングリードは破棄された。

分類学的プロファイリング

すべての生メタゲノムに対してクオリティフィルトレーションを行った後、デフォルトパラメーターを用いてMetaPhlAn316 v3.0.13系統クレード同定パイプラインを用いて分類学的プロファイリングを行った。簡単に説明すると、MetaPhlAn3は、クレード特異的マーカー遺伝子のデータベース（mpa_v30_CHOCOPhlAn_201901）に基づいて、メタゲノムリードを分類群に分類する。分類学的特徴（またはクレード）のうち、同一性が不明/未分類のものを除去した後、プールデータセット中の少なくとも1つのメタゲノムサンプルで検出できた残りのクレードをさらなる解析の対象とした。

分類学的プロファイリングの結果、以下のメタゲノムが解析から除外された：(i)90%以上のマッピングされていないリードで構成されるサンプル、(ii)未知の分類群の割合が比較的高い（25%以上）サンプル、(iii)分類学的多様性が十分でない（100分類群未満）サンプル。これらのサンプルは、トレーニングデータの品質と信頼性を維持するために除外された。最後に、すべての除外基準を適用した後、残りのサンプルが 20 未満の研究を除外した。

存在／非存在分類学的プロファイルの作成

マイクロバイオームデータの組成的性質49、バッチ効果に関連する懸念を軽減し、GMWI2分類モデルの解釈を簡素化するため、MetaPhlAn3からの分類群相対存在量を各メタゲノムサンプルのバイナリ存在／非存在プロファイルに変換した。具体的には、あるサンプル中の相対存在量が0.00001（または0.001%）以上の場合、その分類群はそのサンプルに「存在する」とみなされ、そうでない場合は「存在しない」とみなされた。その結果、各サンプルは2値ベクトルで表された。

分類学的プロファイルのPCAおよびPERMANOVA分析

主成分分析（PCA）は、Rの "prcomp "関数を用いて、存在／不在の分類学的プロファイルに対して実施した。さらに、便メタゲノム中の微生物分類群（門から種までの範囲）の相対的存在量に基づいて、ブレイ・カーティス距離行列を作成した。これは、Rの "vegan "パッケージv2.6.4を用いて行った。次に、"adonis2 "関数を用いて、距離行列の並べ替え多変量分散分析（PERMANOVA）を行った。腸内微生物群集組成の全分散に対する被験者の健康状態の影響を評価するため、999回の並べ替えに基づいて検定統計量（擬似F）のP値を算出した。

Lasso-penalizedロジスティック回帰を用いた疾患尤度の推定

疾患の存在を予測するために、8069メタゲノムからなるプールデータセット全体のバイナリ存在/非存在分類学的プロファイルに対して、Lasso-penalizedロジスティック回帰モデル（Pythonライブラリ「scikit-learn」v1.0.2）を学習させた。L1（Lasso）ペナルティは、LIBLINEARソルバー50を使用した。ランダムな状態は42に設定され、クラスの重みは、プールされたデータセットにおける不均衡なクラス比率を考慮するために "balanced "に設定された。ハイパーパラメータのチューニング、特に正則化パラメー タの選択は、inter-study validation (ISV)フレームワークを実装したネステッドクロスバ リデーションによって達成した。ここでは、様々な候補を評価し、ISVで最適な分類パフォーマンスをもたらす値を選択した（補足表9；入れ子交差検証プロトコルについては表の脚注を参照）。\C）＝0.03が各外部ループ学習フォールド内で一貫して最適なハイパーパラメータとして現れ、最終的なGMWI2モデルに選択された。

({{{boldsymbol{x}}}_{i}})をn個の分類群の有無を表す2値ベクトルとする：

$${{{\boldsymbol{x}}}}_{i}=\left[{x}_{i}^{1},\, {x}_{i}^{2},\cdots,\, {x}_{i}^{n}\right]$$

(1)

ここで、({x}_{i}^{j}***)は、分類群(j)が試料(i)に存在すれば1、そうでなければ0である。さらに、n= 3200は、i番目のサンプルの分類学的特徴（またはクレード）の数である（合計3200の分類学的特徴が、プールされたメタゲノムデータセットで少なくとも1回観察された）。

続くlog-loss最適化目的関数は、L1正則化とクラス割合重みを用いて以下のように解かれる：

θ}^{*}={{mrm{argmin}}}_{θ}{in{{mathbb{R}}^{n}}C{sum }_{i=1}^{m}alpha ￤left({y}_{i}￤right)￤left[￤left(-{y}_{i}￤right！ -{y}_{i}\log \left({h}_{\theta }\left({{{\boldsymbol{x}}}}_{i}\right)\right)-\left(1-{y}_{i}\right)\log \left(1- {h}_{θ}left({{boldsymbol{x}}}_{i}}_{right})╱右]+parallel╱θ╱parallel _{1}$$.

(2)

$${h}_{\theta }\left({{{\boldsymbol{x}}}}_{i}\right)=P\left({y}_{i}=1{{\rm{|}}}{{{\boldsymbol{x}}}}_{i}, \theta \right)=\sigma \left({\theta }^{T}{{{\boldsymbol{x}}}}_{i}\right)=\frac{1}{1+{e}^{-{\theta }^{T}{{{\boldsymbol{x}}}}_{i}}}$$

(3)

ここで、Ⓐはシグモイド関数である。また、クラス割合の項は、プールされたデータセットのクラス割合が比較的アンバランスであることを説明する：

$$\alpha \left({y}_{i}\right)=\frac{m}{2\mathop{\sum }_{j=1}^{m}\left[{y}_{i}={y}_{j}\right]}$$

(4)

便メタゲノムベースの健康状態分類器としてのGMWI2の使用

プールデータセットに含まれる8069個の便メタゲノムすべてと、4つの腸内マイクロバイオーム事例研究のサンプルについて、GMWI2スコアを算出した。メタゲノムの分類学的プロフィールは、微生物分類群の有無をエンコードするバイナリ値を持つベクトル〙({{boldsymbol{x}}}_{mbox{test}}}) として表された。この計算には、事前に学習した係数ベクトルⒶ({theta }^{*}})を用いた予測対数オッズ(logit)を採用した：

$${{\mbox{GMWI}}}2\left({{{\boldsymbol{x}}}}_{{\mbox{test}}}\right)={\left({\theta }^{*}\right)}^{T}{{{\boldsymbol{x}}}}_{{\mbox{test}}}$$

(5)

分類のために、あらかじめ決められた大きさのカットオフ・パラメーター(c)を利用した（カットオフ・オプションがない場合やdeferオプションがある場合は、(c=0)）。最後に、GMWI2 をメタゲノムに対して以下の基準で計算した：

$${{\mbox{classify}}}\left({{{\boldsymbol{x}}}}_{{\mbox{test}}}\right)=\left\{\begin{array}{cc}{{\mbox{non{\mbox{- 健康}} & {{{mbox{GMWI}}}2left({{boldsymbol{x}}}}_{{mbox{test}}}}}}}< -c {{hfill {{mbox{defer}}}} & -cle {{mbox{GMWI}}}2left({{boldsymbol{x}}}}}_{{mbox{test}}}}}}}right)}、 & {{mbox{GMWI}}}2left({{boldsymbol{x}}}_{{mbox{test}}}}}}right) > ￤, c ￤ end{array}}right. $$

(6)

注目すべきは、我々の現在の方法論では、腸内細菌叢サンプルを第3の選択肢に本質的に分類していないことである。GMWI2は連続的なスコアをもたらし、その符号（陰性または陽性）はそれぞれ疾患の有無を示しており、より高い大きさは予測におけるより高い信頼性を意味する。defer"（または "not determined"）カテゴリーはオプション機能であり、ユーザーがGMWI2マグニチュード・カットオフ(guagnitude cutoff) \(c)をゼロ以外とすることを決定した場合に適用される。このユーザー定義のカットオフ値以下（例えば、-1.0～+1.0）のスコアは、"defer "に分類される。

分類性能の評価

GMWI2分類モデルの性能を評価するために、正しく分類された健常検体と非健常検体の割合の平均として定義されるバランス精度が用いられた。これは、異なるカットオフ・パラメーター（c）にわたって、複数の検証技法を用いて行われた：データセット全体に対するトレーニングと、同じトレーニング・セットに対するテスト、10重クロスバリデーション（10-fold CV）、およびleave-one-outクロスバリデーション（LOOCV）。10倍クロスバリデーションにおけるばらつきを考慮するため、シャッフルされたフォールドパーティションでこのプロセスを10回繰り返し、結果はすべての実行で平均された。さらに、研究間検証（ISV）が実施され、毎回1つの研究が保留され、モデルは残りの研究で訓練され、テストは保留された研究のサンプルで実施された。ISVにより、異なる研究間の分類性能を評価することができる。

報告概要

研究デザインに関する詳しい情報は、この記事にリンクされているNature Portfolio Reporting Summaryを参照されたい。

データの利用可能性

GMWI2分類法の学習に使用した便メタゲノムサンプル（および対応する研究）に関する情報は、補足データ2に掲載されている。生メタゲノムリードはシーケンスデータのアクセッションIDで入手できる。

コードの利用可能性

.fastq配列ファイルから便メタゲノムGMWI2スコアを計算するコマンドラインツールはAnaconda(https://anaconda.org/bioconda/GMWI2)からインストールできる。このツールのソースコード、処理済みデータセット（本研究で解析した全メタゲノムサンプルの分類学的プロファイルを含む）、および本研究で提示した全結果を再現するために不可欠なコードノートブック、さらにインストールと使用に関する完全なインストラクションは、https://github.com/danielchang2002/GMWI2 からオンラインで自由に入手できる。

参考文献

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参考文献のダウンロード

謝辞

本研究に関して有益なフィードバックをいただいたDan Knights教授に感謝する。本研究の一部は、National Center for Advancing Translational Sciences of the National Institutes of Health Award Numbers UL1TR002494およびUL1TR002377の支援を受けた。また、Minnesota Partnership for Biotechnology and Medical GenomicsからTranslational Product Development Fund（J.S.へ）、Mark E. and Mary A. DavisからMayo Clinic Center for Individualized Medicine（J.S.へ）の支援を受けた。

著者情報

著者メモ

  1. これらの著者は同等に貢献した： Daniel Chang、Vinod K. Gupta。

著者および所属

  1. 米国ミネソタ州ミネアポリス、ミネソタ大学コンピュータ理工学部
    ダニエル・チャン

  2. 米国ミネソタ州ロチェスター、メイヨークリニック、個別化医療センター、マイクロバイオミクスプログラム
    ヴィノッド・K・グプタ、ベンジャミン・ハー、ジェユン・ソン

  3. ウイルス情報研究所、サンディエゴ州立大学、米国カリフォルニア州サンディエゴ
    セルジオ・コボ＝ロペス

  4. バイオインフォマティクス・計算生物学プログラム、ミネソタ大学、米国ミネソタ州ミネアポリス
    ケビン・Y・カニンガム

  5. 韓国、清州、忠北大学校、食品科学・生物工学科、バイオ健康産業ブレインコリア21センター
    ナム・スー・ハン

  6. 韓国、ソウル、延世大学校生物工学科
    李仁淑

  7. 米国ミネソタ州ロチェスター、メイヨークリニック、医学部、リウマチ科
    バネッサ・L・クロンザー、ジョン・M・デイビスIII世、ソン・ジェユン

  8. 米国ミネソタ州セントポール、ミネソタ大学食品科学栄養学科
    リーバイ・M・タイゲン

  9. 米国ミネソタ州ロチェスター、メイヨークリニック、呼吸器・クリティカルケア科
    リウドミラ・V・カルナトフスカイア

  10. 米国コネチカット州ニューヘイブン、イェール大学神経科
    エリン・E・ロングブレイク

  11. 米国ミネソタ州ロチェスター、メイヨークリニック外科名誉教授
    ハイディ・ネルソン

  12. 米国ミネソタ州ロチェスター、メイヨークリニック、定量的健康科学部門、計算生物学部門
    ジェユン・ソン

貢献

D.C.、V.K.G.およびJ.S.は、研究のアイデアを考案し、すべての分析方法を設計した。D.C.とV.K.G.は計算実験を行った。全著者（D.C.、V.K.G.、B.H.、S.C.-L.、K.Y.C.、N.H.、I.L.、V.L.K.、L.M.T.、L.V.K.、E.E.L.、J.M.D.、H.N.、J.S.）がデータを解析し、議論した。原稿はD.C.、V.K.G.、J.S.が執筆し、他の著者の協力も得た。すべての著者が最終原稿を批判的に検討し、承認した。

責任著者

Jaeyun Sungまで。

倫理申告

競合利益

著者らは競合する利益はないと宣言している。

査読

査読情報

Nature Communications誌は、本研究の査読に貢献いただいた匿名査読者に感謝する。査読ファイルはこちら。

追加情報

出版社からの注記Springer Natureは、出版された地図の管轄権の主張および所属機関に関して中立を保っています。

補足情報

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報告書サマリー

権利と許可

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転載と許可

この記事について

この記事の引用

Chang, D., Gupta, V.K., Hur, B.et al.Gut Microbiome Wellness Index 2 enhances health status prediction from gut microbiome taxonomic profiles. Nat Commun 15, 7447 (2024). https://doi.org/10.1038/s41467-024-51651-9

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  • 2023年9月25日受領

  • 受理2024年8月09日

  • 2024年8月28日発行

  • DOIhttps://doi.org/10.1038/s41467-024-51651-9

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ネイチャーコミュニケーションズ（Nat Commun）ISSN 2041-1723（オンライン）

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