宿主マイクロバイオームの空間シークエンシングにより、マウス腸内のニッチが明らかになった

2023年11月21日 09:26

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出版：2023年11月20日
宿主マイクロバイオームの空間シークエンシングにより、マウス腸内のニッチが明らかになった

https://www.nature.com/articles/s41587-023-01988-1

Britta Lötstedt, Martin Stražar, ...Sanja Vickovic 著者一覧を見る
Nature Biotechnology (2023)この記事を引用する

メトリクス詳細

要旨
腸、肺、皮膚などの粘膜組織やバリア組織は、細胞や微生物の複雑なネットワークで構成され、病原体のコロニー形成を防ぎ、宿主-マイクロバイオーム共生を支える緊密なニッチを形成している。ホメオスタシスと疾患を理解するためには、このようなネットワークを高い分子・細胞分解能で明らかにすることが極めて重要である。空間宿主マイクロバイオームシーケンス（SHM-seq）とは、空間的にバーコード化されたガラス表面を改変することで、宿主の転写産物と16SリボソームRNAの超可変領域を同時に捕捉できるようにし、組織組織学、ポリアデニル化RNA、細菌の16S配列を組織から直接捕捉する全シーケンスベースのアプローチである。モデル系としてマウスの腸に本アプローチを適用し、データマッピングにディープラーニングアプローチを用い、細胞組成と微生物地理によって定義される空間ニッチを検出した。我々は、腸内細胞の亜集団が、地域常在菌に特徴的な異なる微小環境において特異的な遺伝子プログラムを発現し、宿主と細菌の相互作用に影響を与えていることを示した。SHM-seqは、健康と疾患における本来の宿主と微生物の相互作用の研究を強化するはずである。

主な内容
粘膜組織やバリア組織は、複数の宿主細胞タイプと複雑なマイクロバイオームからなる生態系であり、それらは空間的にも時間的にも変化する。宿主における抗原認識と自然免疫応答1、そしてマイクロバイオーム由来の分子メカニズムが一体となって、病原体のコロニー形成を防ぎ、宿主-マイクロバイオーム空間ニッチと宿主-微生物共生の確立を支えている2。逆に、炎症性腸疾患（IBD）などの疾患では、空間的調節異常3,4が腸管バリアの機能不全につながる可能性がある5,6。

宿主とマイクロバイオームの空間的ニッチを特徴づけ、理解するためには、宿主細胞とマイクロバイオーム種の同一性と分子特性、そして空間的文脈におけるそれらの相互関係を詳細に測定する必要がある。マイクロバイオーム側では、イメージング8,9またはメタゲノム・プロット・サンプリング10によって細菌をマッピングする空間メタゲノム解析法7が登場している。しかし、このような研究は、腸の襞の間、粘膜や管腔といった小さな領域に焦点を当て、通常、せいぜい科レベル10,11の広範な分類を用い、特定の属や種のレベルでの報告はほとんどない9,12,13,14。さらに、メタゲノミック・プロット・サンプリングは、今のところin situで空間的に細菌配列を決定する唯一のアプローチ10であるが、現在のところ宿主の遺伝子発現をプロファイリングすることはできない。宿主側では、シングルセルRNAシーケンス（scRNA-seq）を含むシングルセルゲノミクスが、宿主15、常在微生物16,17、あるいは宿主とウイルスのアンプリコン配列の共同プロファイリング18など、組織の細胞組成を特徴付けるのに役立っているが、空間的な情報はない。空間トランスクリプトミクス法は、イメージングに基づくものであれ、シーケンスに基づくものであれ、in situでの細胞タイプマッピングを可能にする19,20,21,22,23,24が、空間的コンテクストで宿主とマイクロバイオームの両方を同時にプロファイリングすることにはまだ応用されていない。

本研究では、このギャップを埋めるため、空間宿主マイクロバイオームシーケンス（SHM-seq；図1）を開発した。SHM-seqは、空間トランスクリプトミクス25,26におけるこれまでの進歩を活用し、組織学、空間RNA-seq、空間16Sシーケンスを、微生物の生物地理に関連した宿主の発現応答をプロファイリングするために、容易に入手可能な装置を用いて提供する、ロバストなオールシーケンスベースの技術である。我々はこれをマウスの大腸のモデル系に適用し、細菌の存在と相関する空間的遺伝子発現プログラムを調べるためのロードマップをここに示す。

図1：SHM-seq。
図1
a,マウスの腸の断面を分析する研究で使用した3つの異なるマウス条件。 b,マウスの結腸からの組織切片を、ポリアデニル化宿主転写産物と16S細菌rRNAを同時に捕捉するために適応したバーコード付き表面を持つバーコード付きガラスアレイ上に置いた。組織切片は画像化され、細胞は透過処理され、ライブラリー調製と配列決定の前にアレイ表面でcDNAが合成された。c, データ解析により、局所的遺伝子プログラム、その細胞型構成要素、マウスの状態との関連、特定の常在菌との局所的関連が同定された。Hybはハイブリダイゼーション、Extは伸長。

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結果
SMH-seq法
我々は、スライドグラス上のプローブでmRNAを捕捉した後にプロファイリングを行う空間トランスクリプトミクス25を応用してSHM-seqを開発し、ポリアデニル化（宿主）転写産物と16SリボソームRNA（rRNA）の超可変（V4）領域を同時に捕捉できるようにした（方法と図1）。具体的には、まず、ユニークにバーコード化され、空間的にアドレス可能なポリ(d)Tキャプチャー・プローブ25,26,27で覆われた固相空間トランスクリプトミクス・スライドを作製し、約1,000個の異なるDNA特徴（すなわち空間スポット）をガラス基板に蒸着させ、共有結合させた（Methods）。我々は、ハイブリダイゼーションと伸長反応によって、ポリアデニル化転写産物（〜50％の表面捕捉プローブ）と16S rRNA28の超可変（V4）領域（〜50％の表面捕捉プローブ）を同時に捕捉できるように、ガラスアレイ上のこれらの空間的にバーコード化された特徴を酵素的に改変した（Methods、図1および補足図1）。次に、凍結した組織切片を最適化したガラス表面に置き、ヘマトキシリン・エオジン（H&E）で染色し、明視野顕微鏡で組織像を撮影した。最後に、イメージング後、細胞を透過処理し、宿主のポリアデニル化転写産物と細菌の16S配列をアレイ上に捕捉できるようにした。その結果、宿主転写産物と細菌種の直接的な空間DNAバーコーディングが行われ、イルミナシーケンスによって配列が決定された26。

SHM-seqをテストするために、典型的な条件下（特異的病原体フリー（SPF））、あるいは無菌（GF）マウス、あるいはASF（altered Schaedler flora）マウスとして生育させたC57BL/6マウスの大腸断面のプロファイルにSHM-seqを適用した（図1および方法）。GFマウスは陰性対照となり、ASFマウスは決まった花叢しか含まないため、予想される細菌種の捕獲を検証するための明確なターゲットとなる。また、通常のC57BL/6 SPFマウスは、腸内細菌叢が変化していない複雑なケーススタディとなる。合計で124の組織切片にSHM-seqを適用し、3つの条件にわたって15,321の空間スポット（組織で覆われている）からデータを収集した（補足表1および2、補足図2）。

分類分類のためのディープラーニングアプローチ
空間トランスクリプトミクス（宿主）データについては、確立された処理パイプライン29を使用したが（Methods）、空間マイクロバイオームデータを処理するために、新規の分類学割り当てパイプラインを考案した。まず、専用のショットガンメタゲノムシーケンスデータで検出された細菌種を基に、実験用のカスタムゴールドスタンダード細菌ゲノムリファレンスを作成した（Methods）。これは、バルクリファレンスサンプルに少なくとも0.1%の存在率で存在する39属のうち、最も豊富な65種で構成され、最も正確なマッピングメトリクスを提供するカットオフ値として選択した（図2a、補足図3aおよびMethods）。次に、このカスタムリファレンスを使用した場合と、National Center for Biotechnology Information（NCBI）のRefSeq31全ゲノムデータベースやNCBIの16S rRNAデータベースを含む他の細菌リファレンスデータベースを使用した場合の分類学的割り当て（Kraken2（参考文献30）による）のパフォーマンスを比較しました（Methodsおよび補足図3b-d）。私たちがカスタマイズしたゴールドスタンダード（制限）全ゲノムリファレンス（SPF：65種、ASF：8種）は、実データとシミュレーションSHM-seqデータの両方でより高いマッピング精度と低い偽陽性率を示しましたが、RefSeqリファレンスもそれなりの性能を示したため、カスタマイズしたリファレンスのために専用のメタゲノミクスデータを収集できない場合に実行可能な選択肢となりました。シミュレーションデータはさらに、データベースのタイプ（全ゲノム対16S rRNA）、サイズ、シーケンスリード長がすべて分類学的割り当てのパフォーマンスに影響を与えることを示しています（補足図3e）。

図2：SHM-seqはSPFおよびASFマウスの細菌表現と存在量を正確に捉えている。
図2
a, マウス腸内細菌叢の細菌リファレンス。SPF大腸内容物の系統樹で、分類学上の科と属を強調するために色付けされた65種を表す。 b, ディープラーニングモデルのアノテーション性能の向上。Kraken2（オレンジ）またはKraken2と深層学習モデル（青）を併用した場合（n = 3）の、5つの分類学的レベル（x軸）の空間スポット（Methods）からの真の分類学的ラベルと予測される分類学的ラベルの間の平均ピアソン相関係数（y軸）。エラーバー： 95%信頼区間。 c, 細菌リードの特異性の高いマッピング。空間16Sシーケンスを用いたGF（左、n = 3）、ASF（中央、n = 3）およびSPF（右、n = 3）の組織切片の参照ゲノムに対する全体的な細菌アラインメント率（y軸、％）。 SHM-seqによるSPFマウス大腸の細菌量の高い再現性。e,SHM-seqは16S rRNAシーケンスとよく比較される。SHM-seq（x軸、SPFマウス、n = 3）とバルク16S rRNAシーケンス62（y軸、SPFマウス、n = 3）から得られた細菌属の擬似バルク存在量（点）。左上： pearson r. f. 酵素（SHM-seq）による細菌量の抽出は、確立された機械的抽出と一致する。g-i、ASF502を標的としたFISHプローブとSHM-seqの一致。g、FISH（y軸）およびSHM-seq（x軸）によるASF502カウントの分布（箱プロット、領域ごとの正規化シグナル）および個々の測定値（散布図、領域ごとおよびサンプルごとの平均シグナル、n＝6）。網掛け部分： c,g、箱ひげ図：中央の黒線は中央値、色分けされた箱は四分位範囲、エラーバーは1.5×四分位範囲、黒い点は外れ値。 h、ASFマウス結腸の断面（スケールバー、180μm）、4つの領域（赤い長方形）とそのズームイン（i）（スケールバー、25μm）。色：組織（青）、線維（灰）、ASF502（赤）。 e,f, 線：線形回帰モデルのフィット。網掛け部分： normは正規化、DLはディープラーニング。

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次に、Kraken2（参考文献30）を用いて、空間的に捕捉された配列をまず分類し（Methods）、分類学的分類のない配列は、新しいディープラーニングアプローチで処理した（Methods）。私たちのディープラーニングモデル（補足図4a）は、畳み込みニューラルネットワークとリカレントニューラルネットワークに基づいており、両方向からリードを処理し、局所的な配列パターンとそれらの遠隔相互作用を求め、最も可能性の高い分類学的割り当てを予測するように訓練されている（Methods）。SHM-seqで得られたデータを模倣し、分類群ラベルを付加した細菌リードをシミュレートして、その性能を評価した（Methods）。

深層学習モデルは、一般的に使用されている16S rRNA解析ツールであるKraken2（図2bおよび補足図4b,c）またはQIIME 2（参考文献32）を使用した場合と比較して、性能が向上した（平均ピアソンr：0.97（Kraken2 + 深層学習モデル）および0.21（QIIME 2）、P≤10-4、平均ブレイカーティス非類似度：それぞれ0.06および0.46、属レベル、補足図4d）。まず、ディープラーニングモデル（単独で使用）は、データの20％のテストデータセットで97％の精度で配列を属に割り当てた。次に、模擬データを用いて、学習中にモデルが未見のデータについて、予測された分類学的ラベルと真の分類学的ラベルを比較することで、分類学的割り当て指標を評価した。Kraken2後のディープラーニングモデルは、属レベルの分類において、Kraken2単独よりも有意に優れていました。2b）、（2）ランダムに割り当てられた1,000の空間スポットの解像度で評価した細菌組成の高い類似性（平均ブレイカーティス非類似度0.06対0.15；補足図4b）、および（3）バルクライクサンプルとして評価した場合、高い総合精度（92％対84％、P≦10-4）、高いF1スコア（89％対85％、P≦10-4）、および低い偽陽性率（8％対16％、P≦10-4；補足図4c）。このように、深層学習モデルはSHM-seqデータの分類学的割り当てを改善することができる。

高感度で特異的な細菌rRNAおよび宿主mRNAの捕捉
SHM-seqを、（1）バルク16S rRNAシーケンスおよび蛍光in situハイブリダイゼーション（FISH）と比較したSHM-seqにおける細菌捕捉率の特異性および感度、および（2）空間トランスクリプトミクス単独と比較したSHM-seqによって得られた宿主RNA-seq品質メトリクスによって評価した。

特異性（ゴールドスタンダードリファレンスのゲノム領域にマッピングされたシーケンスリードの割合）と感度（SHM-seqで検出された予想種の割合）を評価するため、ポジティブコントロールとしてASF33マウス、ネガティブコントロールとしてGFマウスの定義されたコミュニティからのプロファイルを解析した（図1および方法）。平均して、ASFマウスサンプル（n = 3）の全リードの22%が細菌リファレンスにアライメントしたのに対し、GFマウスサンプル（n = 3）のリードの0.008036%のみがリファレンスの65種のいずれかに割り当てられた（図2c）。ASFサンプルでは、細菌リードはそれぞれのASFリファレンスゲノムの予想される位置にマップされ、ターゲットキャプチャーの特異性が強調された（予想されるゲノムビン内の平均リード： 97.0±1.5％のs.e.m.、n = 18組織切片、補足図5）。ほとんどのリード（85.7±4.5％の平均±s.e.m.、n = 18組織切片）は、16S rRNA遺伝子の予想される捕捉領域に平均的にマッピングされた（補足図6）。SHM-seqの感度の高さを際立たせるように、ASFサンプルでは、ASF519とASF502を中心に、予想される細菌種がすべて捕捉され（補足図7a）、以前のバルクRT-qPCRの結果34（ピアソンr = 0.85；補足図7b）と一致し、複製間で高い再現性を示した（補足図7a）。SHM-seqでは、RT-qPCR35を用いた低存在量での検出が難しいと以前報告されたASF360も検出された。

より複雑なケーススタディとして、SPFマウスの細菌捕捉におけるSHM-seqの性能をさらに検証した（Methods; n = 3）。平均して、全リードの28％が細菌ゲノムリファレンスにアライメントし（図2c）、メタゲノムリファレンスの39属（そのうち22属が1％を超える存在率で存在）に割り当てられ、Duncaniella、Turicibacter、Muribaculumが最も多かった（図2d）。検出された属とその相対的存在量は、16S rRNAシーケンスとよく相関し（ピアソンr = 0.69、P≤10-4；図2e）、平均して、SHM-seqリード（n = 9組織切片）の90.7 ± 1.7％（平均±s.e.m.）は、予想された16S rRNA捕捉領域にマップされた。注目すべきことに、私たちの酵素的細胞透過化プロトコルは、従来の機械的核酸抽出と同様に、（バルク）細菌サンプルの調製に効率的であった（Pearson r = 0.95, P ≤ 10-4; 図2f）。

異なる関心領域における細菌ゲノムの空間的捕捉の特異性をさらに検証するために、ASFマウスのSHM-seqで得られた細菌の存在量プロファイルを、5種類の蛍光細菌検出プローブ（すべての細菌種を検出する陽性対照、3つの異なるASF種を標的とするプローブ、および陰性対照）を用いたFISH（Methods）で測定したものと比較した。3つの主要な組織領域にわたって蛍光シグナルを検出し、定量した（Methodsおよび補足図8a-d）。FISHにおける全体的な陽性対照および3つのASF特異的細菌種それぞれの存在量は、SHM-seq測定値と有意に相関していた（平均スピアマンρ；ASF502：0.72、ASF360：0.72、ASF519：0.55、陽性対照：0.75、P≦10-4；図2g-iおよび補足図8e-g）。

宿主RNA-seqの品質指標は、SHM-seqと空間トランスクリプトミクスの間で類似していた。SPFまたはASFマウス（n = 3; 補足図9a-d）のいずれにおいても、空間トランスクリプトミクスとSHM-seqの間で、RNA-seqリードマッピング率またはユニーク分子識別子（UMI）数に有意差はなかった：空間的に捕捉されたリードの66%および63%が一意にマップされ、擬似バルクUMIカウントは高い相関を示した（それぞれピアソンr = 0.95および0.92）。さらに、通常の空間トランスクリプトミクスアレイ（poly(d)T捕捉のみ）を、宿主細胞を破壊するためだけに開発された透過処理法と、宿主細胞と細菌細胞の両方を破壊するために使用された方法とで使用した場合、宿主発現プロファイルに高い一致が見られた（Pearson r = 0.94；補足図9e,f）。このように、SHM-seqで使用される表面処理、透過法、ライブラリー調製は、細菌サンプルの組成にアクセスし、空間的宿主発現プロファイリングを行うために一般的に使用される方法と特異性と感度で比較している。

細菌および宿主発現の空間パターンの定義
データから微生物と宿主の空間的組織を復元するために、各スポットにおける宿主遺伝子の発現と細菌属の存在量を定義し、それらを16の定義された形態学的関心領域（MROI）にマッピングして（図3a）、特徴的なパターンを同定し、最後に、よりグロス（メジャーMROIによる）またはファイン（マイナーMROI）レベルでの組織構造の変化の概要としてデータを可視化した。簡単に言えば、プロファイリングされた各組織切片の各スポットを、組織学に基づき、16のMROIカテゴリー（Methods）のいずれかに手動で割り当て、それらを各マウス条件（Methods）の組織のラスタライズされたベクトル表現上に自動的に可視化した。このようにして、SPFおよびGFマウスの大腸100切片から、空間的にバーコード化された10,924スポット（腸組織で覆われている）にまたがる空間的存在量を定量した。平均して、各マウスの結腸から、20の組織切片、2,208のスポット、および〜32,000の核細胞セグメントをサンプリングした（補足図10）。Splotch36,37（Methods）を用いて、サンプリングした切片における有意な発現の空間的差異を検定した。Splotchは、各スポットの相対的な位置（4つの最近傍）、MROI間のサンプリング（スポット数）の差異、マウス（つまり条件）と個体（つまり動物）における細菌の存在という生物学的バッチ変数を考慮した階層的確率的アプローチである。

図3：SHM-seqによる細菌と宿主遺伝子発現の空間検出。
図3
a, マウス結腸におけるMROI。GFマウス（左）とSFPマウス（右）のH&E染色組織切片（左パネル）に注釈を付け、ベクター表現（右パネル）で可視化し、各解剖学的組織層に関連する主要およびマイナーMROIにおける細菌および宿主の発現を示す（右パネル）。b、3つの主要MROIにおける宿主遺伝子の空間的発現。主要MROIにおけるGF（左）とSPF（右）の組織切片における、選択した空間的に変動する遺伝子の発現（カラーバー、正規化遺伝子発現）。遺伝子発現の差の有意性（ドットの大きさ、log10BF；Methods）と、マウスのGFとSPFの組織切片（列）間で発現が異なる上位10遺伝子（行）の発現レベル（正規化遺伝子発現）（Methods）。SPFマウス（青）とGFマウス（オレンジ）の大腸陰窩を記述する4つのMROIにおけるSatb2（左）とMuc2（右）の領域特異的係数パラメータ（β）の事後分布。e,SPFマウスの組織で6つのMROIにわたって検出された細菌。マイナーMROIで検出された細菌属の数（左）と最も多い上位3属（右）（カラーコード）。線の太さ：MROI間の平均ユークリッド距離。検出された各細菌（行）のMROI（カラーコード、列）におけるスケールされた正規化細菌数（各属内でスケールされた正規化数、カラーバー）。各空間スポット（カラースケール、ドット、n = 4,655、左パネル）のスケール化細菌数プロファイルのt-分布確率的隣接埋め込み（t-SNE）と、SPFマウスにおける6つのマイナーMROI（カラーコード）における全空間スポットの正規化細菌数の分布（右パネル）。ボックスプロット：中央の黒線は中央値、色分けされた枠は四分位範囲、エラーバーは四分位範囲の1.5倍、黒点は外れ値。3つの組織切片におけるH&E（左）、MROI注釈（カラーコード、中央）、およびPseudobutyrivibrioの正規化細菌数（カラースケール、右）。円：空間スポット。スケールバー、500μm。略号はMethods (c-h)と同じ。MROIカラーコード共有（f,g）。Normは正規化；NSは有意ではない；infは無限大。

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宿主と微生物組成の空間的共同化
16のMROIそれぞれにおける遺伝子発現が、全体的な細菌の存在によってどのような影響を受けるかを、SPFマウスとGFマウス（細菌なし）を比較して調べた。SPFマウスもGFマウスも、いくつかのマーカー遺伝子（例えば、上皮ではEpcam、筋層領域ではMyh11、パイエル板ではCd52；図3b）では同様の領域発現を示したが、他の遺伝子は領域特異的に有意に発現が異なっていた（図3c）。例えば、Satb2とMuc2は、粘膜と管腔に最も近接した組織層である、SPFマウスとGFマウスの陰窩頂部において、それぞれ発現低下と発現上昇が見られた（図3d）。Satb2は腸の恒常性維持に役立っており、その発現は陰窩の過剰な損傷や炎症を防いでいる38。同様に、Muc2は健康な粘膜層の維持に重要であり、その枯渇は大腸の上皮細胞と細菌が直接接触し、炎症や癌を引き起こす39。他の例では、上皮の再生に関連する遺伝子40であるHnf4aは、GFマウスとSPFマウスでは陰窩の基部でより高発現しており、その欠損がIBD症状の伝播に関連する41であるGpx2は、GFマウスとSPFマウスでは上皮と粘膜組織の境界領域で誘導されている（補足図11）。

SPFマウスにおける宿主の空間的発現パターンは、Splotch（Methods）によってSPFマウスの6つの異なるMROIで異なる量と組成で検出された細菌属によって反映された。検出された細菌は、大腸のフォールド間領域（crypt base、crypt mid、crypt apex/mid）、粘膜層（crypt apex/mucosa、mucosa/pellet）、または内腔（つまり、予想通り最も多く検出されたpellet）に存在した。フォールド間領域は最も多様性が低く、ペレットは最も多様性が高かった（図3e）。互いに近接する形態学的領域には、高い頻度で存在する属がいくつかあった： Pseudobutyrivibrioは2つの粘膜領域で共有され、Mediterraneibacterは偏性嫌気性菌で、以前はRuminococcus属の一部であった42。粘膜領域では、オシリバクター（図3f,g、中）；シュードブチリビブリオ（図3f,g、下）；オシリバクターが優勢であった（図3f,g、中）。一方、ペレットには、ラクトバチルス属、ムリバクラム属、アナエロクラムナ属などの常在細菌14,46が多く、また、ヒトの腸でのみ報告されているEubacteriales属のMassilistercoraも含まれていた47（図3g、上）。これらのパターンは、サンプル全体でも、個々の切片でも、再現性よく明らかであった（図3f-hおよび補足図12）。

粘膜バリアは、そうでなければ陰窩尖部の内腔と宿主細胞との不要な直接接触を防ぐが、上皮細胞を介するプロセスで免疫系にシグナルを送る48。我々は、検出された細菌属の中には、タイトジャンクション粘膜バリアでのみ観察されるもの（例えば、シュードブチリビブリオ、ルミノコッカス、オシリバクター；図3f,gおよび4a）と、組織特異的なフォールド間領域に拡散するもの（例えば、インテスティモナス、コプロコッカス、フラボニフラクター；図3fおよび4a）があり、近接した宿主の発現に影響を与え、また影響を受ける可能性があるという仮説を立てた。有意な地域差と細胞型組成の違いを系統的に調査し、それらを異なる属の細菌の存在と関連付けるために、スポット間で共発現する遺伝子の28の空間モジュールを同定した（補足図13aおよび方法）。次に、このような各モジュールを、一核RNAシーケンス（snRNA-seq）プロファイルにわたる遺伝子の共変化によって遺伝子サブモジュールに分割し（図4b、補足図13bおよび方法）、203のサブモジュールを回収した（補足表3および方法）。各サブモジュールを、snRNA-seqによって同定された30種類の細胞タイプの1つまたは複数における発現によってラベル付けし、濃縮されたKEGGパスウェイについてテストした（図4cおよび方法）。

図4：細菌の存在は、4つの主要な組織領域における宿主の発現に影響を与える。
図4
a, 細菌分類群と宿主遺伝子発現の地域的関連。4つの主要組織MROIにわたる各空間領域（行）において、選択された上位の発現差のある遺伝子（列、黒文字）および上位の発現差のある分類群（列、青文字）の平均数（カラースケール）（カラーコード、右、および上部のラベル）。左パネル：各空間スポット（点）におけるスケール化細菌数ベクトルのt-分布確率的近傍埋め込み（t-SNE）を、4つのMROIのそれぞれで差次的に豊富な分類群（青色カラースケール、スケール化正規化細菌数、上部の分類群）の豊富さで色分けした（カラーコード、左上隅のラベル）。右パネル：細胞タイプラベルで色分けされた個々のMROIでマッピングされた宿主snRNA-seq細胞プロファイル（ドット）のt-SNE。各空間領域およびマウス条件に関連する各サブモジュール（列）のKEGGパスウェイ（行）の濃縮度（カラーコード、中央）および同じ空間領域および条件に関連する細菌分類群（下）の有意性（カラースケール、-log10（FDR）、片側フィッシャー厳密検定）。空間モジュールの色分けはa.と同じ。d, 細菌分類群に関連する地域的遺伝子発現の差。SPFとGFの各MROIにおける細菌属の空間的存在量（青色カラースケール、正規化細菌数）と細胞タイプマーカー遺伝子の正規化空間発現（赤色カラースケール）で色分けした領域マップ。

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微生物叢、特にPseudobutyrivibrio、Sodaliphilus、Oscillibacterが存在する場合、陰窩の頂点にある結腸細胞は、グラム陰性細菌49の受容体であり大腸炎抑制因子50として知られるCeacam20を発現し、一方杯細胞は、IBD51で発現低下する粘膜バリア機能のマーカーであるHif1aを高レベルで発現した（図4dおよび補足表4）。近隣の領域（すなわち陰窩の上部中央領域）の神経細胞は、インテスティモナスの存在下で、Tacr1やその他の神経活性リガンド、腸の運動制御に関与する受容体を発現した52。一方、同じ領域で同じ細菌属の存在下にあるマクロファージは、受容体と微生物の結合により神経免疫シグナル伝達を調節することが示されている遺伝子であるFcrl2とSlamf6を発現した53,54（図4dおよび補足表4）。また、陰窩の下部領域にある特殊な空間ニッチには、筋収縮力（コプロコッカス存在下でCamk2a）、軸索誘導（フラボニフラクター存在下でSema4f）、コリン作動性シグナル伝達（コプロコッカス存在下でChat）に関与するニューロンや筋細胞のネットワークも含まれていた（図4dおよび補足表4）。

考察
SHM-seqは、ポリアデニル化された宿主転写産物および可変（V4）16S細菌領域を、空間的にバーコード化されたマイクロアレイ上に固体表面で捕捉することにより、細菌組成、宿主遺伝子発現、および組織組織学を共同で空間的にプロファイリングする方法である。SHM-seqデータからメタゲノム分類群の分類を強化するためのディープラーニングベースのアプローチを提供し、検出率と分類精度を向上させ、協調的な空間発現プログラムを調査するためのロードマップを提供した。同じシステムの専用メタゲノミクスデータから生成されたゴールドスタンダードのカスタムリファレンスに対するベンチマークを行い、SHM-seqデータが16S rRNAまたは全ゲノム細菌配列のいずれかを含む異なるデータベースへのマッピングに適合すること、マッピングの精度はそれぞれのデータベースの質とサイズに基づくことを示した。

SHM-seqの感度と特異性を、従来の16Sシーケンシング、公表されているRT-qPCRデータ、FISH、空間トランスクリプトミクスと比較して、3つのマウス条件でベンチマークを行った： SPF、GF、ASFである。SHM-seqは124切片からなる組織データセットを用いて再現性と頑健性を示し、SPFマウスでは16Sシーケンシング後に存在しなかったすべての細菌属を、ASFマウスでは参照された8種すべてを検出した。これまでの研究では、マウス間で細菌量にばらつきがあることが報告されている34,35,55。我々の研究でも、SHM-seqと外部ASFデータで得られた存在量に差が見られたが、データセット間の全体的な相関は高く（ピアソンr = 0.85）、SHM-seqはマウス間で再現性が高かった。今後の研究では、空間アレイ表面上のキャプチャーオリゴヌクレオチドの量と配列を変えて、細菌対宿主転写産物の回収率をさらに調整したり、関心のある他のユーザー定義のキャプチャー部位を導入したりすることができる。さらに、16S rRNA遺伝子の一部のみを配列決定することは、細菌の属を同定するには十分であることが示されているが56、特定の細菌種や菌株など、より細かい分類学的レベルでは分解能に限界がある。SHM-seqは、キャプチャ配列とライブラリー調製手順を変更することで、できればシーケンスリード長を長くすることで、将来的にはこれらの懸念に対処することができる。

これらのデータと方法を用いて、我々は、微生物叢の存在下で、杯細胞と結腸細胞の亜集団が、宿主と微生物のコミュニケーションのために、Muc2とCeacam20で満たされた細胞接着層を形成することを示した。さらに、SPFマウスでは、特定の微小環境で発現する遺伝子のサブモジュールが明瞭に観察された。これらの遺伝子は、GFマウスでは破壊される腸の生理機能や大腸運動を制御するタンパク質をコードしている57。このように、我々の空間解析により、マウスの状態に関連した明確な動態を示し、常在細菌の存在に依存する、および／または宿主-細菌相互作用に影響を及ぼす可能性のある領域集団に特徴的な、組織断面全体にわたる空間的発現プログラムが同定された。

SHM-seqは、多数の組織から頑健な空間的宿主マイクロバイオーム・プロファイリングを可能にするが、現在のところ固相キャプチャー・アレイの解像度に制限されている。これに対処するため、我々の定量的データモデルであるSplotch（方法）は、空間パラメーターと実験パラメーターを同時に組み合わせ、低解像度アレイから空間的に分解された遺伝子発現の確率的推論を改善する36,37。さらに、MROIを通じて組織コンテクストを調べることで、このモデルは組織切片間で情報を共有し、異なるマウス条件における再現可能な空間的変化を検出し、生物学的疑問と空間分解能58に導かれた共通の座標フレームワーク（CCF）を作成し、大規模な組織コホートの視覚化を容易にする。今後の研究では、より高密度なフォーマット23,24,59を用いたり、細胞-細胞間の種間コミュニケーションネットワークをデコンボリューションするための計算マッピングアプローチを強化することで、解像度の限界にさらに取り組むことができる。さらに、腸内細菌種に限定した16S rRNAデータベースを使用することで、SHM-seqデータのマッピングの計算負担をさらに軽減することができる。一方、大規模な16S rRNAデータベースにマッピングすると、偽陽性マッピング率のリスクや、これらのデータベースにおける生物種の表現が低くなるリスクが高まる。そのため、RefSeqのような全ゲノムデータベースを推奨し、可能であれば、隣接するメタゲノムデータに存在する生物種に限定する。

SHM-seqは、例えば大腸炎による変化時60や感染時61などの動物モデルと、宿主遺伝学と同様にマイクロバイオームと宿主細胞の両方が変化する縦断的または横断的にサンプリングされたヒト患者とを比較するようにデザインされた、より大規模な研究における将来の研究や詳細な調査への道を開くものである。このような解析は、宿主とマイクロバイオームの関係の理解を広げ、健康状態における恒常性を維持するメカニズム、あるいは慢性炎症の発症と持続のメカニズムの理解を深めることにつながる。したがって、我々の方法は、バリア組織や粘膜組織における、環境とマイクロバイオームが駆動する空間的近隣不均一性の理解を深めるのに役立つはずである。

方法
SHM-seqデータ作成
マウス
成体C57BL/6 SPFマウスはジャクソン研究所から購入し、MITおよびハーバード大学ブロード研究所の比較医学部門によって設立された機関動物飼育使用委員会（IACUC）によって監視された倫理的ガイドラインに従い、プロトコル0122-10-16で、1996年のNational Research Council（機関動物福祉保証番号A4711-01）のGuide for Care and Use of Laboratory Animals（実験動物の飼育と使用のためのガイド）に準拠して維持した。成体のC57BL/6 GFマウスはTaconic Biosciences社から入手し、gnotobiotic環境で飼育した。これらのマウスの一部を無作為に選択し、数世代にわたってASF33を接種し、6週齢を超えた時点で使用した。コロニー形成後、ASFマウスは無菌状態で飼育され、ポリメラーゼ連鎖反応（PCR）で検査し、無菌状態が維持されていることを確認した63。動物飼育室の温度はモニターされ、常に動物種特有の必要性に応じて維持された。湿度は30～70%に維持した。光強度と光周期のタイミングは、Broad Instituteの動物施設によって注意深く調節された。大腸管1本につき複数の切片から材料を採取し、1つの空間アレイ（～42 µm2に広がる1,007個の空間スポット）を最大限に利用するため、1つの空間捕捉領域に2～3個の組織切片を配置した。6つのアクティブキャプチャ領域を含む1枚の空間キャプチャースライドを前述の方法で切片化し、各マウスから～20切片をサンプリングした。

組織採取
大腸中央部の結腸管をマウスを殺してから数分以内に剥離し、組織を余分な体液から乾燥させ、Optimal Cutting Temperature（O.C.T.、フィッシャーヘルスケア社製）に包埋した。サンプルは切片化するまで-80℃に移した。

カスタマイズされた表面を持つスライドの作製
カスタマイズした表面プライマーを、メーカー（Surmodics社）の推奨に従い、共有結合バイオコンジュゲーション25,27を用いて、アミン活性化表面領域（～40 mm2ずつ）に固定化した。検証のために3つの異なる表面を作製した： 16S、poly(d)T、およびpoly(d)T/16S混合表面である。それぞれの場合のオリゴヌクレオチドの固定化は以下の通りであった：

5′-[AmC6]UUUUGACTCGTAATACGACTCACTATAGGGACGACGCTTCCGATCTNNNNATCTCGACGACTACHVGGGTATCTAATCC-3′．

5′-［AmC6］UUUUGACTCGTAATACGACTCACTATAGGGACGACGCTTCCGATCTNNNNNNTTTTTTTTTTTTTTTVN-3′（Integrated DNA Technologies（IDT）の両方）。

すべてのスライドのインキュベーションは、スライドをハイブリダイゼーションチャンバー（ArrayIt）にマウントしたサーマルインキュベーター（Eppendorf Thermomixer Option C）上で行われた。空間アレイ上で行われたすべてのin situ反応は、クラスIIバイオセーフティキャビネット内で行われた。

カスタマイズされた表面を持つ空間アレイの作製
すべての空間アレイは、オリジナルの空間トランスクリプトミクス法25,27について以前に記述したように作製した。簡単に言えば、アミン活性化CodeLinkスライド（Surmodics社製）を用いて、スライド1枚あたり6枚の空間マイクロアレイを作成した。アミン活性化表面への共有結合化学を確実にするために、DNAオリゴヌクレオチド（IDT）を以下のように構築した：

5′-[AmC6]UUUUGACTCGTAATACGACTCACTATAGGGACGACGCTTCCGA TCT-[18mer空間バーコード]-[7merランダムUMI]-[20T]-VN。

印刷は、ArrayJet LTDにより、100 pLの空間バーコード付きDNAオリゴヌクレオチド（2×CodeLink印刷バッファーで希釈した33 µM）をインクジェット技術でスポットし、スポット間ピッチ200μmで100μmのスポットを形成することにより行われ、その結果、6.2mm×6.6mmのキャプチャーエリアに合計1,007の異なる空間アドレス可能なスポットが印刷された。本研究で使用した空間バーコード化DNAオリゴヌクレオチドの全リストは、https://github.com/nygctech/shmseq。空間アレイを印刷した後、あらかじめ50℃に温めたブロッキング溶液（50mMエタノールアミン、0.1Mトリス、pH9）を用いてスライドを30分間ブロッキングし、4×クエン酸生理食塩水ナトリウム（SSC）と0.1％SDS（あらかじめ50℃に温めた）で30分間洗浄した後、脱イオン水でスライドをすすぎ、乾燥させた。

次に、ポリ(d)Tと16Sキャプチャー配列の混合物を含むカスタマイズされた表面を作るために、キャプチャー領域を変更した。空間的にバーコード化されたポリ（d）T表面プローブに16Sプローブをハイブリダイズさせるために、5′-GGATTAGATACCCBDGTAGTCGAGATNBAAAAAAAAAAAAAAAAAAA-3′（空間アレイに付着できるように配列28を改変）の配列を持つ16S（V4）プローブ（IDT）75μlを0. 8 nMの濃度で、2×SSC（Sigma-Aldrich）、20％フレッシュホルムアミド（Thermo Fisher Scientific）および0.1％Tween（Sigma-Aldrich）中で各空間捕捉領域に添加し、室温で30分間インキュベートした。その後、プローブミックスを除去し、捕捉領域を100μlの0.1×SSC（Sigma-Aldrich）で洗浄した。ハイブリダイズした16Sプローブを空間的にバーコード化したポリ(d)T表面プローブに共有結合させるために、75μlの1×M-MuLVバッファー、2Uμl-1 RNaseOUT、20Uμl-1 M-MuLV、0.5mM dNTPs（すべてThermo Fisher Scientific製）、0.20μgμl-1 BSA（New England Biolabs (NEB)製）をウェルに加え、42℃で30分間インキュベートして伸長反応を行った。その後、M-Mulv溶液を除去し、100μlの0.1×SSCで洗浄した。ハイブリダイゼーションと伸長反応に使用した16Sプローブを除去し、共有結合した16S表面プローブを一本鎖にするため、表面キャプチャー領域を75μlの100％ホルムアミドで3回、室温で3分間インキュベートした。その後、2×SSC/0.1%SDS（Sigma-Aldrich）でスライド全体を50℃で10分間洗浄し、0.2×SSCで1分間洗浄し、最後に0.1×SSCで37℃で1分間洗浄した。この結果、ポリ(d)Tと16Sキャプチャー配列が1:1の割合で含まれる空間的にバーコード化されたキャプチャーエリアが得られた。

クライオセクション
クライオチャンバー全体（クライオセクショニング中に使用したすべての表面と道具を含む）は、細菌汚染を避けるため、セクショニング開始前に70%エタノールで拭き取った。空間アレイとO.C.T.包埋腸組織ブロックの両方をクライオチャンバーの温度に到達させてから、腸組織の10µm厚断面をカスタマイズした空間アレイに配置した。組織固定は後述のように直ちに行った。

組織固定、H&E染色およびイメージング
空間アレイを37℃で2.5分間温めた。その後、蒸発を避けるため、スライドグラスの全領域をメタカルン溶液（60％絶対メタノール、30％クロロホルムをエタノールで安定化したもの、10％氷酢酸（すべてSigma-Aldrich製））で室温で10分間覆った。その後、メタカルンを除去し、スライドを乾燥させた後、イソプロパノール（Sigma-Aldrich製）300μlをスライドに加え、室温で1分間インキュベートした。スライドが再び完全に乾いたら、EasyDip Slide Jar Staining system（Weber Scientific社製）でH&E染色した。このシステムには、約80mlのDako Mayer's hematoxylinとDako Blueing Buffer（Agilent Technologies製）、pH6の0.45M Tris acetate（Sigma-Aldrich製）緩衝液中の5% Eosin Y、およびヌクレアーゼを含まない水（Thermo Fisher Scientific製）が別々に入った容器が含まれていた。スライドをスライドホルダーにセットし、ヘマトキシリンに6分間完全に浸漬した後、無核酸水に5回浸漬し、次に～800mlの無核酸水を満たしたビーカーに10回浸漬した。その後、スライドホルダーをDako Blueing Bufferに5秒間浸し、さらに無核水に5回浸した。最後に、スライドホルダーをエオシン溶液に1分間浸し、無核水に5回浸して洗浄した。スライドをホルダーから外し、風乾した後、85％グリセロールでマウントし、カバースリップ（VWR）で覆ってからイメージングを行った。ガラスアレイ上の染色H&E組織切片の画像化は、LED透過光源とCCDカメラを備えたAxio Imager Z2顕微鏡（Carl Zeiss）にMetaSystems社製Metafer VSlide Scanning Systemを装着して行った。A-P ×10/0.25 Ph1対物レンズ（Carl Zeiss）と設定プログラム26を用いて、ガラスアレイ上の各組織切片の焦点合わせとスキャンを自動的に行った。画像のつなぎ合わせは、VSlide（バージョン1.0.0）を用い、60μmのオーバーラップと視野間のリニアブレンディングで行った。画像はjpg圧縮で取り出した。

in situ反応：透過化と逆転写
開始前に、ハイブリダイゼーションチャンバーをRNaseZap（Thermo Fisher Scientific）と70%エタノールで洗浄し、その後UVライトチャンバーで少なくとも30分間照射した。切片のイメージング後、スライドを再びハイブリダイゼーションチャンバーに取り付け、以下の透過化反応（以下「細菌処理」と呼ぶ）を行った。まず、0.05 M EDTA（pH 8.0、Thermo Fisher Scientific）、0.1 M Tris HCl、pH 8（Thermo Fisher Scientific）、10 µg µl-1リゾチーム（鶏卵白由来、凍結乾燥粉末、Sigma-Aldrich）を含むリゾチーム溶液100 µlを各ウェルに加え、37℃で30分間インキュベートした後、0.1×SSC 100 µlで洗浄した。次に、75μlの10% Triton X-100（Sigma-Aldrich）を加え、37℃で5分間インキュベートした後、100μlの0.1×SSCで洗浄した。第3に、0.05% SDSと5 mM DTT（Thermo Fisher Scientific）を加えた溶液を37℃で5分間インキュベートし、0.1×SSCで100μl洗浄した。第4に、1×HBSS（いずれもThermo Fisher Scientific製）中100μlのコラゲナーゼI（200U）を各ウェルに加え、37℃で20分間インキュベートし、再び0.1×SSCで100μl洗浄した。最後に、0.1％ペプシン（pH1、Sigma-Aldrich）を各ウェルあたり75μl加え、37℃で10分間インキュベートした後、0.1×SSCで100μl洗浄した。in situ cDNA合成は、既述の26. 簡単に説明すると、75μlの50ng μl-1 アクチノマイシンD（シグマアルドリッチ）と0.5mM dNTPs（Thermo Fisher Scientific、0. 20 µg µl-1 BSAおよび1 U µl-1 USER酵素（ともにNEB社製）、6% v/v Lymphoprep（STEMCELL Technologies社製）、1 Mベタイン（B0300-1VL、Sigma-Aldrich社製）、1×ファーストストランドバッファー、5 mM DTT、2 U µl-1 RNaseOUTおよび20 U µl-1 Superscript III（すべてThermo Fisher Scientific社製））を各ウェルに加えた。反応液をMicroseal 'B' PCR Plate Seals（Bio-Rad社製）で密封し、少なくとも6時間インキュベートした。インキュベート後、各ハイブリダイゼーションチャンバーウェルから放出されたcDNA物質70μlを回収し、96ウェルPCRプレート（Eppendorf社製）に保存した。

ライブラリー調製
ライブラリー調製は、SM-Omicsの自動ライブラリー調製プロトコルを用いて行った26。過消化を避けるため、反応をEDTAで終止させ、T4 DNAポリメラーゼで末端を鈍らせた後、in vitro転写で直線状に増幅した。増幅された材料は再びcDNAに転写され、次のサブセクションで述べるようにPCRの指標付けが可能な材料となった。

定量、インデキシング、配列決定
qPCRの定量とインデキシングは、TruSeq LT IlluminaインデキシングとKAPA HotStart HiFi ReadyMix（Roche）を用いて、以前に記載された64通りに行った。インデックス化したcDNAライブラリーは、製造元のプロトコールに従って、PCR産物に対してAMPure XPビーズ（Beckman Coulter）を0.7:1の割合で用いて洗浄し、12μlの溶出バッファー（Qiagen）で溶出した。各サンプルの濃度はDNA HS Qubit assay（Thermo Fisher Scientific）を用いて測定し、平均断片長はBioanalyzer HSまたはDNA1000 TapeStation（Agilent Technologies製）を用いて決定した。その後、各サンプルをシーケンスに必要な濃度に希釈しました（NextSeqでは1.08 pM、MiSeqでは10 pM、いずれも～10% PhiX）。プールされたライブラリーは、NextSeqおよびMiSeq（Illumina）でそれぞれ、フォワードリードで25 nt、リバースリードで55 ntおよび150 ntでシーケンスされた。

細菌検証データの作成
細菌RNAの機械的抽出
O.C.T.のSPF結腸からペレットを含む約1 mm厚の組織切片を切り出し、乾燥氷冷したLysis Matrix D tube（MP Biomedicals）に入れた。上清を新しいチューブに移し、RNeasy Mini Kit（Qiagen）を用いてRNA抽出を行った。抽出されたRNAは、NEBNext Magnesium RNA Fragmentation Module Kit（NEB）を用いて、2分間加熱しながら断片化した。断片化したRNAは、MinElute Cleanup Kit（Qiagen）を用いて、製造元の指示に従って洗浄した。断片化したRNAの品質はBioanalyzer Pico Kit（Agilent Technologies）で評価した。次に、機械的に抽出したRNAを20 ng µl-1程度、16S表面プローブでコートしたQCアレイに添加し、「in situ反応：透過化と逆転写」のサブセクションで説明したように、in situ cDNA反応を行った。42℃で少なくとも6時間インキュベートした後、各ウェルから70μlの放出物質を回収し、新しい96ウェルPCRプレート（Eppendorf）に保存した。MiSeqでのライブラリー調製、定量、インデキシングおよびシーケンシングは、「ライブラリー調製」および「定量、インデキシングおよびシーケンシング」のサブセクションで説明したように行った。

糞便DNAの抽出およびメタゲノム配列決定
SPFマウスの大腸壁を穿孔し、ペレットと粘液を1.5mlの回収チューブ（Eppendorf）に掻き出すことにより、大腸からペレットを回収した。採取したペレットは、さらに処理するまで-80℃で保存した。Lysing Matrix Y tube (MP Biomedicals)を用いて、製造者の指示に従ってペレットからDNAを抽出した。抽出されたDNA濃度は、DNA HS Qubitアッセイを用いて測定した。Nextera XT（15031942 v05）を用いてDNAをライブラリーにした。DNA HS Qubit assay（Thermo Fisher Scientific）およびBioanalyzer HS（Agilent Technologies）を用いて、各サンプルの濃度と平均断片長をそれぞれ評価した。各サンプルをシーケンスに必要な濃度（9 pM、～10% PhiX）に希釈し、プールしたサンプルをMiSeq（2 × 150 bp、llumina）でシーケンスした。各サンプルは500万～1,000万リードまで配列決定された。

FISH
ASFマウスの新鮮凍結腸組織サンプルを用いてFISHを行った。すべての切片は10µm厚の断面で、連続して採取した。最初の切片を空間アレイ上に置き、続いて連続した切片をCodeLinkアミン活性化スライド（Surmodics）上に置き、次の2つの切片を再び空間アレイ上に置いた。空間アレイ上の切片はSHM-seqに使用し、アミン活性化CodeLinkスライド（Surmodics）上の切片はFISHに使用した。スライドを37℃で2.5分間、サーマルインキュベーターで加温した後、「組織固定、H&E染色、イメージング」のサブセクションで説明したように、新鮮に調製したメタカルンを用いて組織切片を固定した。次にスライドをハイブリダイゼーションチャンバーに入れ、75μlの予熱したFISH溶液（0.9M NaClおよび20mM Tris、pH7（ともにThermo Fisher Scientific）、0.1% SDS（Sigma-Aldrich）、FISHオリゴヌクレオチド検出プローブ（0.06μg ul-1））を各ウェルに加え、25℃で2時間インキュベートした。オリゴヌクレオチド検出FISHプローブ（IDT社製）は、目的のターゲットに応じて使用した：プローブEUB338（5′-／Cy5／GCTGCCTCCCGTAGGAGT-3′）は、すべての細菌について；プローブnon-338（5′-／Cy5／ACTCCTACGGAGGCAGC-3′）は、陰性対照として； ASF360を標的とするプローブLab158（5′-／Cy5／GGTATTAGCAYCTGTTTCCA-3′）65，66，67； ASF502を標的とするプローブLac435（5′-／Cy5／TCTTCCCTGCTGATAGA-3′）68，69；およびASF519を標的とするプローブBac303（5′-／Cy5／CCAATGTGGGGACCTT-3′）8，67。2時間のインキュベーション後、FISH溶液を除去し、ウェルを100μlの1×PBSで洗浄した後、ハイブリダイゼーションチャンバーを取り出し、スライドを50mlの1×PBSに12回浸漬し、風乾した。スライドは85％グリセロール（Sigma-Aldrich）とカバースリップ（VWR）でマウントした。Axio Imager Z2顕微鏡で、PhotoFluor LM-75光源（89North）とPlan-APOCHROMAT ×63/1.4オイルDIC対物レンズ（Carl Zeiss）を組み合わせて、蛍光画像を取得した。画像はVSlide（バージョン1.0.0、MetaSystems）を用いて処理した。

H&E画像データの処理
画像登録とアノテーション
SpoTteR26を用いて、画像処理とバーコード付きスポットのレジストレーションを行った。H&E画像（RGBチャンネルで収集）を約500×500ピクセルにダウンスケールした。効率的なグリッドスポット検出のため、赤色チャンネルで分位閾値を使用して画像から組織をマスキングした。画像のヘシアンを計算することにより、空間配列スポットの中心点を検出した。セントロイド座標を推定格子点として使用し、局所最適化器（nlminb, R package stats (R version 3.6.3)）を使用してこれらの推定格子点に矩形格子を当てはめた。完璧なグリッド構造に当てはまらない確率の高い点の10%を削除しながら繰り返し、行（ここでは35）および列（ここでは33）あたりのグリッド点の目標数に達するまで、新しいグリッドが当てはめられた。最終的なグリッド点は、検出された組織切片領域の下だけに存在する空間点を選択するために、以前にマスクされた組織切片とオーバーラップされた。これらの点をさらなる解析に用いた。

H&E画像は、グラフィカルなクラウドベースのインターフェース24を使用して、グリッドフィッティングプロセスの結果得られた各空間座標（x,y）に1つ以上の形態学的領域タグを手動で割り当てることにより注釈付けした。使用したタグは、上皮（E）、上皮・筋・粘膜下層（ALL）、上皮・粘膜・粘膜下層（EMMSUB）、上皮・粘膜（EMM）、筋・粘膜下層（MSUB）、陰窩基部（BASE）、外膜・内膜（MEI）である、 extterna (ME)、interna (MI)、mucosae and interna (MMI)、mucosa and pellet (MUPE)、crypt mid (MID)、crypt apex and mucosa (APEXMU)、crypt apex and crypt mid (UPPERMID)、Peyer's patch (PP)、pellet (PE)。E、EMMSUB、EMM、BASE、MEI、ME、MI、MUPE、MID、MMI、APEXMU、UPPERMID、PP、PEは組織ベクター表現で可視化した。

宿主リードの処理
生リードの処理と宿主リードのマッピング
bcl2fastq2 (version 2.20.0)を用いてリードを作成し、BBDuk70 (version 38.33)を用いてアダプター配列と16S表面プローブ配列を除去するためにトリミングした。ST Pipeline (version 1.7.6)29を用いて遺伝子ごとのバーコードマトリックスを作成した。逆品質フィルターしたリードをSTAR（バージョン2.6.0）71でマウスゲノムリファレンス（GRCm38 primary assembly）にマッピングし、ミトコンドリア配列を除去した。マッピングされたリードは、HTseq-count（バージョン0.11.4）72とmm11 mouse annotation reference（https://www.gencodegenes.org/mouse/release_M11.html）を用いてアノテーションされた。注釈付きリードは、TagGD29,73（バージョン0.3.6）を用いてハミング距離クラスタリングアプローチ（k-mer 6、ミスマッチ2）で多重化解除した。これにより、転写産物情報が空間バーコードに連結された。最後に、UMI-tools74に記載されているものと同様のナイーブクラスタリングアプローチ（ミスマッチ1）を用いて、転写産物および空間バーコードごとのUMIコラプシングを行った。

細菌リードの処理
ゴールドスタンダードマウス腸内細菌リファレンスの作成
FASTQリードをbcl2fastq2で生成し、KneadData (version 0.7.4) (https://huttenhower.sph.harvard.edu/kneaddata/) (mouse database mouse_C57BL)を用いてquality filteredを行った。MEGAHIT75(バージョン1.2.9)をアセンブルに用い、bowtie2(ref.76)(バージョン2.3.4.3)をアセンブルへのリードのマッピングに用いた。MetaBAT2(ref.77)(バージョン2.15)はアセンブリのビニングに、NCBI BLAST78のコマンドライン版(バージョン2.9.0+)はblastnとデータベース'nt'を用いてコンティグに分類子を割り当てるのに用いた。MEGAHIT、bowtie2、MetaBAT2はすべてデフォルト設定で実行した。E-value≦10E-6でフィルタリングされ、E-valueとpercent identityでソートされた。様々なカットオフ値（>0.1%、>0.05%、>0.01%でそれぞれ65種、121種、419種に相当）で種レベルで分類されたコンティグが保持された。各カットオフについて、NCBI RefSeqデータベース31（リリース205）から参照ゲノム配列（完全ゲノム、染色体またはスキャフォールド、これらの種の利用可能性に依存）をダウンロードし、SPFマウス（n = 6）で見つかった分類群のFASTA配列データベース（各カットオフについて1つ）を作成し、Kraken2（バージョン2.0.9）30でKraken2のデフォルトの指示に従ってカスタムデータベースを構築するための入力として使用した（低複雑度領域のマスキングを含む）。6種のリファレンスゲノムはRefSeqデータベースに見つからず（Supplementary Table 5）、FASTA配列データベースには含まれなかった。マウス腸内細菌のリファレンスは、マウスおよび／または腸で過去に発見されたことのある属についてもフィルターをかけた79,80,81。NCBIのCommon Treeを用いて参照分類群の系統樹を作成し、iTOL（バージョン6.4.3）を用いて可視化した82。マウスの腸内細菌叢を定義した組織（ASF）を解析する場合は、文献83に従ったゲノム配列をNCBIからダウンロードした。83に従ったゲノム配列をNCBIからダウンロードし、Kraken2でカスタムASFデータベースを構築するための入力として使用した。

シミュレーションデータの作成
カットオフ値0.1%と0.01%（「ゴールドスタンダードマウス腸内細菌リファレンスの作成」サブセクションで説明）を用いて、分類群の存在量に基づいて2つのシミュレートデータセットを作成した： SPFマウスで見つかった分類群の16S rRNA FASTA配列は、16S rRNA FASTA配列が欠落している2つの分類群（Sodaliphilus pleomorphusおよびAnaerocolumna sedimenticola）を除き、NCBIからダウンロードした（2021年7月24日ダウンロード）。コマンドラインNCBI BLAST78（バージョン2.9.0+）を使用して、16S表面プローブのあらゆる配列バージョンと16S rRNA FASTA配列をアライメントし、分類群ごとの16S表面プローブの最良のアライメントを求めた。実際のSHM-seqから空間的に捕捉されたリードを模倣するため、実際のSHM-seq実験から得られた200万個のペアリードを、フォワードリードのFASTQヘッダー、配列、品質スコア、およびリバースリードのFASTQヘッダー、品質スコアのテンプレートとして使用した。リード2の配列は、ランダムに選択した分類群由来の16S rRNA配列の150bp長フラグメントで置換した。断片は、無作為に選択した分類群ごとに16S表面プローブの最良のアラインメントから上流の領域を選択して作成した。各領域は、空間配列に特徴的なパラメータ（400 ± 44 bp）を持つ正規の長さ分布に基づく長さをランダムに選択し、150 bpにトリミングした。この結果、16S表面プローブが捕捉すると予想される場所から生成された、200万個のランダムに選択された16S rRNA遺伝子配列を持つシミュレーションデータセットが得られた。

ディープラーニングモデル：データの前処理
0.1%のアバンダンスカットオフ（「シミュレートデータの生成」サブセクションで説明）に基づいて、シミュレートされたデータセットから合計50万個のDNA配列をランダムに選択し、一様にサンプリングし、0.1%の割合でシングルポイント変異を導入した。続いて、真のSHM-seq実験から得られたフラグメント長（143±13 bp、150 bpで切断）の正規分布に基づいたランダムな短縮を行った。マウス腸内細菌リファレンスの各分類群からのリードは、1属あたり少なくとも100回表現した。配列はワンホットエンコードし、各ヌクレオチド（A、C、T、G、N）を5次元バイナリーベクターで表し、最大長（150 bp）までの配列パディングを続けた。分類群ラベルはN個の属のいずれかにワンショットでエンコードした。エンコードされた配列と分類群ラベルは、モデルを学習するための入力として提供された。

ディープラーニングモデル：アーキテクチャ
ショートリードの分類モデルは、Keras84とTensorFlow85バックエンド（バージョン2.2.0）を用いて、Python（バージョン3.8.10）で実装した（補足図4a）。このモデルは、様々な長さのワンショット符号化DNA配列を入力とし、出力として属ラベルを提供する。まず、パディングされたエントリーを無視するためにマスキング層が使われ、次に短いモチーフを抽出するために、カーネルサイズが15、17、19、23の1次元畳み込み層が4層続き、連結とドロップアウト（50％の割合）モジュールと2つの双方向長短期記憶ネットワーク層が続き、双方向で配列を処理した。この後、別のドロップアウト層（20％）、密な層（reLU活性化）、ドロップアウト層（10％）、別の密な層（reLU活性化）、最後に完全連結層（ソフトマックス活性化）が続き、最終的な出力サイズを入力データに含まれる別個の属の数まで縮小した。合計で、モデルは298,760の学習可能なパラメータから構成された。クロス・エントロピー損失は，最適化アルゴリズムとして Adam を用いたマルチクラス分類器を学習するために用いられた86．モデル・アーキテクチャはNetron87を用いて可視化された。

ディープラーニングモデル：トレーニングの詳細
モデルのパラメータは、80%のシーケンスをトレーニングに使用し、20%をテストに使用することで最適化した。各エポックは、訓練データをシャッフルし、各訓練データ・ポイントについて勾配更新を1回計算し、バイアスのかかっていない勾配推定値を得ることから始まった88。トレーニング中は、カテゴリ精度とクロスエントロピー損失を用いて進捗をモニターした。訓練は、最大15エポック後、または5つの連続したエポックで訓練損失が減少しない場合に終了した。Scikit-learn（バージョン0.24.2）89を使用して、受信者動作特性（ROC）曲線下面積とF1スコアを計算し、テストデータに対する最終的なパフォーマンスを報告するために使用した。

ディープラーニングモデル：評価
対応する分類群（「シミュレートデータの生成」のサブセクションで説明）を持つ100万個のシミュレート配列は、配列決定エラー率1%90で修正され、上記のようにランダムに短縮された。配列はKraken2単独、またはKraken2とディープラーニングモデルで分類された。Scipy（バージョン1.1.0）91 spatial.distance.braycurtisとScikit-learn（バージョン0.24.2）89 stats.pearsonrをそれぞれ用いて、スポットごとの細菌の相対存在量のBray-Curtis非類似度とピアソン相関係数を計算し、グランドトゥルースの分類ラベルと比較して性能を評価した。分類とグランドトゥルース間の相対的存在量の類似度が高いほど、ブレイ・カーティス非類似度は低く、ピアソン相関は高くなった。精度とF1スコアは、Scikit-learn（バージョン0.24.2）89 metrics.classification_reportを用いてデータセット全体で計算した。

分類法の割り当ての比較
異なるサイズのRefSeqデータベース（全ゲノム対16S rRNA）（制限あり対制限なし）を使用した場合のKraken2の性能を比較するために、分類学割り当てパイプラインによって分類学割り当てを行ったが、深層学習モデルは使用しなかった（「細菌データの生リード処理とマッピング」サブセクションで説明）。比較に使用したデータベースは以下の4つである： RefSeq Bacteria全ゲノムデータベース（Kraken2 GitHubバージョン2.1.2からダウンロード）と、それにKraken2のASF全8種の全ゲノム（ref.83 RefSeq全ゲノム'）、カスタムゴールドスタンダード制限付き全ゲノムデータベース（'65種全ゲノム'、'ゴールドスタンダードマウス腸内細菌リファレンスの生成'サブセクションで説明）、およびRefSeq Bacteria 16S rRNAデータベース（NCBIで16S rRNA配列が利用可能なRefSeq細菌分類群から得られた）（'RefSeq 16S rRNA'、～3,000分類群、2021年7月24日にダウンロード）；最後に、RefSeq 16S rRNAデータベースを、ゴールドスタンダードの制限付き全ゲノムデータベースで検出された65種に制限した（'65 species 16S rRNA'）。リード長による影響を比較するため、カットオフ0.1%を用い、長さ分布がより長い（650±44bp）、150bp、300bp、450bp、600bpにトリミングしたシミュレートデータセットを「シミュレートデータの作成」サブセクションで説明したように作成した。

生リードの処理とバクテリアデータのマッピング
bcl2fastq2を用いてFASTQリードを作成し、BBDuk70を用いてアダプター配列を除去するためにトリミングした。トリミングされたリードは、ST Pipeline (version 1.7.6)29と同じquality-filteringステップを使用してquality filteredされたが、100 nt以上のリードのみが保持された。TagGD73を使用して空間バーコードを各フォワードリードに接続し（k-mer 6、ミスマッチ2、ハミング距離クラスタリングアルゴリズム）、BWA-MEM（バージョン0.7.17）92と参照マウスゲノム（GRCm39）を使用して宿主マッピング配列を除去した。残りのリバースリードは、Kraken2（バージョン2.0.9）30（信頼度0.01）を用いて、マウス腸内細菌リファレンス（「ゴールドスタンダードマウス腸内細菌リファレンスの作成」サブセクションで説明したように作成）にマッピングした。GFおよびSPFマウス由来のリードはマウス腸内細菌リファレンスにマップされ、ASFマウス由来のリードはASFリファレンスにマップされた。Kraken2による分類の割り当ては、ディープラーニングモデルを用いて改善された。同一の空間バーコードと分類学的割り当てを持つUMIは、UMI-tools（バージョン1.0.0）74（UMIClusterer、閾値1）を使用して折り畳まれ、細菌ごとのバーコードマトリックスが得られた。

細菌検証データの解析
細菌蛍光の空間分析
スキャンした蛍光画像中の細菌の存在は、ilastik（バージョン1.3.3）93を用いて検出した。ilastikで各細菌の蛍光プリントを別々にトレーニングおよびテストした後、得られた細菌検出マスクを蛍光画像と位置合わせして、空間座標ごとの平均蛍光強度を検出し、行列として保存した。この行列をSplotchで実行した（「Splotchを用いた階層的確率モデリング」サブセクションで説明）。その結果得られた正規化蛍光強度を、サンプルごとに各注釈領域から最大3つの空間座標をランダムに選択し（正規化蛍光強度と正規化細菌存在量の間で共有される注釈領域のみが考慮された）、各サンプル内でスケーリングしてから、同じ領域内の空間座標にマッチングさせ、互いに比較することにより、正規化細菌存在量と比較した（空間座標ごとの正規化蛍光強度対正規化細菌存在量）。ペレットと注釈された領域を限定するために、ペレットと注釈された空間座標は、マウス組織と注釈された座標に空間的に隣接している場合に選択された。この手順を1,000回繰り返し、正規化細菌FISH強度と正規化配列決定細菌存在との間の平均空間相関測定値を作成し、スピアマン相関として表した。

16S表面プローブ感度
16S表面プローブ感度を評価するために、データベース（バージョン104.1）で利用可能なASF細菌（ASF356、ASF360、ASF457、ASF492、ASF500およびASF519（分類ID 1235789））について、参照DNA配列および遺伝子アノテーションファイルをEnsembl Bacteria94からダウンロードした。アレイ表面に16S表面プローブのみを持つ空間トランスクリプトミクスQCアレイ上のASF組織切片から取得したリードを、BWA-MEM（バージョン0.7.17）92を用いて各ASF細菌ゲノムに対して個別にマッピングした。RSeQC (version 4.0.0)95を用いて、それぞれの参照ゲノム中の16S rRNA遺伝子に対する遺伝子体カバレッジを作成した。ゲノムのビニングは、アラインメントされたリードを別々のビンにまとめ、各ビンはそれぞれのASFゲノムの100分の1を表す。

16S表面プローブの特異性
特異性はまず、バクテリアとマウスのリードアラインメントの割合で評価した。SPFマウス、ASFマウス、GFマウスの組織切片を16S表面プローブ付きQCアレイに置き、細菌処理またはコロン処理のいずれかを用いて完成ライブラリーを調製した。各完成ライブラリーは約660,000リードまで配列決定された。リードは、ディープラーニングモデルを使用せずに分類学割り当てパイプラインを使用して分類学的にアノテーションされた。それぞれの細菌リファレンス（SPFおよびGF組織サンプルではマウス腸内細菌リファレンス、ASF組織サンプルではASFリファレンス）にマッピングされたリードの割合は、トリミングリード数を用いて計算した。

プロトコルの特異性は、細菌処理と機械的処理（「細菌RNAの機械的抽出」サブセクションを参照）を比較することによっても評価した。スピアマン順位相関係数とピアソン相関係数は、Scipyのstats.spearmanr（バージョン1.1.0）91とstats.pearsonrを用いて計算した。

細菌処理は、C57BL/6Jマウスの糞便由来の16Sライブラリを用いたバルク16S rRNAシーケンスデータセット62と比較した（Sequence Read Archive (SRA) sample references： SRR9212951、SRR9213178、SRR9213335）。相関はScipy（バージョン1.1.0）のピアソン相関係数91を用いて計算した。

分類学割り当てパイプラインと QIIME 2 との比較
タクソノミー割り当てパイプライン（「細菌データの生リード処理とマッピング」サブセクションに記載）とQIIME 2（ref.32）（バージョン2022.2）を、シミュレートデータセット（「シミュレートデータの生成」サブセクションに記載）を用いて比較した。QIIME 2はシングルエンド配列のデフォルト設定で実行し、分類学的プロファイリングにはSilva 138 99% OTUs full-length sequences classifierを使用した。

マウス遺伝子発現に対する細菌処理の効果
宿主（マウス）の遺伝子発現測定に対する細菌処理の影響を評価するために、細菌処理あり／なしのサンプル（同じ飽和レベルまでリードをダウンサンプリング）、および表面をカスタマイズした空間アレイまたは標準的な空間アレイ（同じ飽和レベルまでリードをダウンサンプリング）で調製したサンプルの96遺伝子数を正規化した。ピアソン相関係数は、Scipyの（バージョン1.1.0）91 stats.pearsonrを用いて計算した。

宿主マイクロバイオームデータの空間モデリングと可視化
Splotchを用いた階層的確率モデリング
空間データの統計解析にはSplotch36,37を用いた。Splotchは、個体の年齢やマウスの状態など、様々な研究デザインの共変量をモデリングすることで、空間的なトランスクリプトームデータのばらつきを捉える階層的確率論的モデルである( ({rm{B}}↩))；条件付き自己回帰（CAR）事前分布を持つ、アレイデータの空間的変動を捕捉する線形モデルコンポーネント（ ({{psi }}）；および技術的アーチファクトを考慮するために、各独立空間測定で捕捉された遺伝子発現変動（ ({{epsilon }}）。シーケンス深度は、空間スポットあたりの捕捉されたUMIカウントの総数を、すべての解析スポットにわたるUMIカウントの中央値で除したサイズ係数sを使用することによって説明される。パラメータの事後分布をモデルから調べます。例えば、モデルで組織内の細菌の存在を条件とした場合、マウス条件と異なる組織コンテキストの両方にわたる発現変化を定量化します。

遺伝子(i)、組織切片(j)、独立した空間スポット(k)は以下のようにインデックス化した： (i\in \left[\mathrm{1,2},\ldots ,{N}{\text{genes}}\right],j\in \left[\mathrm{1,2},\ldots ,{N}{\text{tissues}}\right],)(k\in \left[\mathrm{1,2},\ldots ,{N}{\text{spots}}^{\left(; jright)}}right]。 ) 各スポットにおける遺伝子発現は、観測されたカウントの近似値であると考えられ、ここで⦿({y}{i,⦿,j,k}) は⦿({s}{j,k}{{{{lambda }}}{i,⦿,j,k}}) と等しいと予想される。({s}{j,k}}はサイズファクター（スポットkと組織切片で観察されたUMIの総数）であり、({{lambda }}{i,},j,k}}は遺伝子発現率（全体を通して正規化カウントと呼ばれる）である。Splotchはゼロ膨張ポアソン(ZIP)分布を用いて観測カウントをモデル化する：

y}{i,},j,k}をモデル化する。\sim {\mathrm{ZIP}}\left({s}{j,k}{\lambda }{i,,j,k},{\theta }{i}^{,p}\right),{\mathrm{nb}}=0,{\mathrm{zi}}=1,$$
(1)
ここで、｛｛θ｝｝｝＿｛i｝｝＾｛p｝｝｝｝は脱落の遺伝子特異的確率を表す。ゼロ膨張モデルは、ベルヌーイ確率変数によってゲートされる第2のゼロ生成過程を導入することで、ゼロの過剰を説明する：

$$\begin{array}{l}{y}{i,,j,k}\sim\left{\begin{array}{l}\begin{array}{ll}\qquad0,\quad\qquad\qquad{if},{\theta }{i}=1, \end{array}\ \begin{array}{l}{\mathrm{Pois}}\left({s}{j,k}{\lambda }{i,,j,k}\right),\quad{if},{\theta }{i}=0\end{array}\end{array}\right. \ \qquad\qquad\quad{\theta }{i}^{,P}\sim{\mathrm{Beta}}\left(1,2\right),\ \qquad\qquad\quad{\theta }{i}\sim{\mathrm{Bernoulli}}\left({\theta }{i}^{,P}\right),\end{array}$$
(2)
ここで、ポアソン過程は一般性を失うことなく負の二項(NB)に置き換えることができる。遺伝子発現率パラメータλi,j,kは3つの成分からなる一般化線形モデル(GLM)で記述される：

log \left({{{lambda }}{i,Γ,j,k}}right)={B}{i,Γ,j,k}+{{{psi }}{i,Γ,j,k}+{{{epsilon }}{i,Γ,j,k})$$.
(3)
ここで、｛B｝＿｛i，｛j，k｝｝｝｝｝はスポットkのコンテキストにおける遺伝子kの特徴的な発現であり、そこからどのMROIスポットkに由来するかを記述した特徴的な発現ベクトル｛｛｛｛β｝｝｝＿｛i｝｝in｛R｝＾｛N｝＿｛text｛MROI｝｝｝｝｝｝｝が導出される。一番上のレベルでは、データセットを重要な共変量（例えば、バクテリアの存在）に沿って分割し、各ユニークなグループに対して、別々の⦿({{{beta }}{i,{l}{1}}↩)をモデル化する（⦿({l}{1}}↩in⦿{1,⦿ldots {L}{1}}↩⦿）。次のレベルでは、各集合はさらに別の共変量（例えば、動物の個体）に沿って分割される。このように2階層モデルは以下のように定義できる：

$$\begin{array}{l}{{{\beta }}}{i,{l}{1}} \Γ, Γsim Γ, {{mathscr{N}}} }left({{beta }}{i,{l}{1}},{left({{sigma }}{i}^{left({l}{2}})} }right)}^{2}Iright)、 \ ΓΓΓΓΓΓΓΓΓΓΓΓΓΓΓΓΓΓΓΓΓΓΓΓΓΓΓΓΓΓΓΓΓΓΓΓΓΓΓΓΓΓΓΓΓΓΓΓΓΓΓΓΓΓΓΓΓΓΓΓΓΓ
(4)
ここで、実際には、全ての組織(i,{l}{1})に対して、({{sigma }}{i}^{left({l}{1}}right)}=2)であり、後因子は全ての組織({{sigma }}{i}^{left({l}{2}}right)})に対して推論される。また、便宜上、各組織の共変量グループは各レベルで1つであるため、βiに対応するl1,l2,l3個のインデックスに対応する逆写像関数({{rho }}^{-1}left({l}{2}}})を導入する。これによって、Bi,j,kは非構成モデルで正式に定義される：

$${B}{i,j,k}={x}{j,k}^{T}{{\rm{\beta }}}{i,{{\rm{\rho }}}^{-}1\left(j\right)},$$
(5)
ここで、ψ({x}{j,k})はスポットMROIアノテーション({D}{k}^{left(˶;j,˶right)})のワンホットエンコーディングであり、特性表現ベクトル(ψ({{β }}{i,{{rho}}^{-}1left(˶;j,˶right)})の関連エントリのインデックスに使用される。

ψi,j,kは、スポットkの局所および近傍がどのように遺伝子iに影響するかを記述し、CAR事前分布を使用してモデル化される。各空間スポットでのオブザベーションは、4つの最近傍として定義されるスポットの直接の空間近傍に依存すると仮定される。ψi,j,kは、各アレイのスポット上のマルコフ確率場として定義される：

$$\begin{array}{ccc}{{{\psi }}}{{\rm{i}},{\rm{j}}}{\rm{|}}{{{\alpha }}}{{\rm{i}},{\rm{j}}},{{{\tau }}}{{\rm{i}},{\rm{j}}},{{\rm{W}}}{{\rm{j}}}\sim{\mathscr{N}}\left(0, {\left({\tau }{i}{K}{j}\left(I-{\alpha }{i}{K}{j}^{-1}{W}{j}\right)\right)}^{-1}\right), \ left(0,1right),∕{{alpha }}{i}sim {{Gamma }^{-1}} }left(1,1right),∕end{array}$$。
(6)
ここで、◆({{sigma }}{i}}は空間自己相関パラメータ、◆({{tau }}{i}}は条件付き精度パラメータ、◆({K}{j}}は組織◆(j)の各スポットの近傍数を含む対角行列、◆({W}{j}}は隣接行列（対角ゼロ）である。

\epsilon}}_{i,j,k}}は、各スポットが独立同分配（i.i.d）であると仮定して、個々のスポットのレベルでばらつきを捉え、その標準偏差を推論する：

$$\begin{array}{l}{{{\epsilon }}}{i,,j,k} (7)で求めた標準偏差を$$begin{array}{l}{{mathscr{N}}}left(0,{{sigma }}{i}^{2}}right),{{sigma }}{rm{}}i }, {N}{ge 0}(0,0.{3}^{2}),$$end{array}$.
(7)
ここで、σiは推定された遺伝子Ⓐの変動レベルである。

データは、マウスモデル／条件および形態学的領域の違いを記述する場合は2レベルモデルとして（SPFマウスとGFマウスを比較する場合）、ASFマウス解析の場合は1レベルモデルとして処理した。入力データは生のUMIカウント（前述の通り）。事後結果からのサンプリングは、4つの独立した連鎖を実行し、1連鎖あたり200回の反復（ウォームアップ100回、サンプリング100回）を行いました。モデルは、10,924スポット、16形態学的領域タグ、および2つのマウス条件（SPF対GF）（2レベルモデル）、または4,397スポット、5形態学的領域タグ、および1つのマウス条件（ASF）（1レベルモデル）を条件とした。

β1およびβ2は、モデル中の任意の2つの組み合わせ（例えば、任意の2つの遺伝子、サンプル共変量（例えば、マウスの条件；SPF対GF）またはMROI領域（例えば、陰窩頂部および粘膜対陰窩底部）から生じる任意の2つの条件を表す。帰無仮説は、モデルによって推定された特徴的な発現係数β1とβ2に関する2つの事後分布が同一であり、Δβがゼロを中心に厳密に分布することを仮定する。この類似性を定量化するために、Δβ|({mathcal{D}})（ここで、˶({mathcal{D}}˶)は学習データである）を、条件間のベイズ因子（BF）を推定するSavage-Dickey密度比97を用いて事前分布Δβと比較する：

pleft({Delta }{beta }=0right)}{pleft({Delta }{beta }=0|{mathmcal{D}} {right)},$$。
(8)
ここで確率密度関数はゼロで評価される。もし、2つの条件間で発現が異なれば、事後Δβ|P（｛mathcal｛D｝｝｝｝｝｝｝｝｝｝｝｝｝｝｝｝｝｝｝｝｝｝｝｝｝｝｝｝｝｝｝｝｝｝｝｝｝｝｝はゼロで評価される。以下、Savage-Dickey密度比をBFと呼ぶ。少なくともlog(BF)>0.5の発現上昇遺伝子(Δβ > 0)は、2つの条件間で差次的に発現しているとみなし、すべてのダウンストリーム解析に使用した。形態学的領域ごとの細菌の加重平均数が、GFの対応する形態学的マウス領域における最大加重平均数よりも大きい場合、細菌属はSPF組織で検出されたと呼ばれた。総細菌数の2％以上を占める領域が検出されたことになる。

ラスターによる発現と量の可視化
切片および条件にわたる空間的データの可視化を可能にするため、結腸管中央部の標準的な組織構造をラスタ化した組織表現を、スケーラブルベクターグラフィックス（svg）として作成し、MROI情報で注釈を付けた。組織ベクトルは、本研究で観察された2つの最も一般的な組織構造（主要なMROI（E、EMM、ME、MEI、MI、MMI、PP、MUPEおよびP）の拡大図と、マイナーなMROI（APEXMU、BASE、MID、UPPERMID、EMM、EMMSUB、ME、MEI、MI、MMI、PP、MUPEおよびP）の拡大図）をキャプチャし、視覚化のみに使用した。matplotlib98 を使用して、svg ファイルに注釈された各 MROI および条件に対応するすべての空間スポットから、宿主遺伝子または細菌の平均発現を自動的にプロットした。

細胞タイプシグネチャーを用いた宿主遺伝子発現マッピング
snRNA-seqデータ処理
マウス結腸snRNA-seqデータは文献99から入手した。99から入手し、22,986個の発現遺伝子にわたる340,461個の細胞プロファイルを含む。簡単に言うと、最低10個の細胞で発現した800以上の遺伝子と、ミトコンドリアまたはrRNAシグネチャーが30％未満の核プロファイルが解析のために保持された。生カウントデータは転写産物-10,000（TP10K）に正規化された。差次的に発現している遺伝子を除外するために、各遺伝子の発現の平均と変動係数（CV）を計算し、20の等頻度ビンに分割した。LOESS回帰を用いてlog(CV)とlog(mean)の関係を推定し、1,500個の最も高い残差を持つ遺伝子を、これらのビン間で均等にサンプリングした。バッチの違いを考慮するために、これは各サンプルについて別々に実行され、最も回収率の高い1,500遺伝子のコンセンサスリストが選択された。次に、Scanpy100を使用し、Harmony101を用いて、主成分分析から20近傍成分と40主成分を用いて、さらにバッチ補正を行った。10回繰り返した後、収束に達し、得られたデータをPhenoGraph102でクラスタリングした。細胞タイプラベルはref. 99で提供されている細胞タイプラベルが、PhenoGraphクラスタリング後に手動でクラスタをラベル付けするために用いられた。

空間共発現解析とモジュールの定義
λi,j,kとして、形態学的差異とマウス条件の差異の両方を考慮した全ての事後推定値をスパースマトリックス形式で用いた(λi,j,k in {R}^{{N}{{mathrm{spots}}}{{xN}}{mathrm{genes}}}})。snRNA-seq正規化カウント表とSHM-seq事後平均カウント表は、両方のデータセットにおける共通遺伝子（Ncommon genes = 16,525）を考慮して、それぞれ細胞間と遺伝子内のスポット間で別々に標準化され、その結果、マトリックス︓（{X}{{mathrm{standardized}}}in {R}^{{N}{mathrm{cells}}}{xN}{}{mathrm{common}}}； {varLambda}{{mathrm{standardized}}}in{R}^{N}{{mathrm{spot}}{xN}}{mathrm{common}};{{mathrm{genes}}}}）となる。最後に、各スポットに対する各細胞の類似度(P)を、その標準化されインプットされた発現ベクトル({X}{mathrm{標準化}}}の列)とスポットの発現ベクトル({varLambda }{mathrm{標準化}}}}}の列)との間のピアソン相関係数rとして計算し、細胞特異的類似度ベクトルを得た。形態学的スポットは、PE と MUPE で見つかったものを除く全ての領域カテゴリーから使用した。共発現遺伝子のセット、つまりスポット間で類似した空間パターンを持つものを見つけるために、データPをL1ノルム（マンハッタン距離）を用いた平均連結法で階層的にクラスタリングし、scipy.cluster.hierarchy.fclusterを用いて28の異なるブロック（スポットのサブセット間で共発現している遺伝子のサブセット、以下空間モジュール）を検出するために距離閾値を設定した。

snRNA-seqプロファイルを用いてモジュールをサブモジュールに分割する
各空間共発現モジュールに属する遺伝子の発現サブマトリックスを作成した。各空間モジュールまたはサブモジュールにおいて、どの特定の細胞型が発現の根底にあるのかを同定するために、30個のsnRNA-seqクラスター（「snRNA-seqデータ処理」サブセクションに記載）それぞれにおける単一細胞プロファイル全体にわたって各遺伝子について平均発現値を計算し、クラスターごとの各遺伝子の平均発現を細胞型クラスター全体にわたるその最大平均発現で割ることによってスケーリングした。平均スケール発現が1より低い遺伝子は除去した（スケール発現を0に設定）。次に、各空間モジュール（またはサブモジュール）内の細胞型構成を推定するために、フィルタリングされ平均化された30個のsnRNA-seq細胞型（クラスター）シグネチャーからの遺伝子のサブセットに対する各空間モジュール内の発現プロファイルを、コサイン距離と平均連鎖を用いて各空間モジュール内で階層的にサブクラスタ化した。次に、各モジュールのこれらの遺伝子を、連鎖マトリックスの最大値の0.4×をカットオフ値として用いてサブモジュールにグループ化した。次に、両側Wilcoxon符号順位検定（Benjamini-Hochberg偽発見率(FDR)が続く）を用いて、共発現サブモジュールにおける細胞型（クラスター）シグネチャーの濃縮度を1対休息で比較した。濃縮解析に使用した細胞タイプは、ニューロン、トランジット増幅細胞（TA）、サイクリングTA、筋細胞、杯細胞、結腸細胞、線維芽細胞、グリア、リンパ系細胞、マクロファージ、腸内分泌細胞、中皮細胞、幹細胞、T細胞、房細胞、B細胞、血管細胞である。

KEGGパスウェイの濃縮
KEGGデータベース103遺伝子セットを、各細胞型特異的サブモジュールにおける濃縮について、片側Fisher exact検定に続いてBenjamini-Hochberg FDRを用いて検定した。FDR<0.05のKEGGパスウェイは可視化された。

報告概要
研究デザインに関する詳細は、本論文にリンクされているNature Portfolio Reporting Summaryを参照されたい。

データの利用可能性
全ての生データはNCBIのSRAにアクセッションPRJNA999495(ref.104)として寄託されている。全ての処理済みデータは、Single Cell PortalにアクセッションSCP2375 (https://singlecell.broadinstitute.org/single_cell/study/SCP2375)で寄託されている。

コードの利用可能性
全てのコードはGitHubのhttps://github.com/nygctech/shmseq (ref.105)に公開されている。

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参考文献のダウンロード

謝辞
図作成にご協力いただいたA. Hupalowska氏に感謝する。マウスの飼育を手伝ってくれたE. Brown、有意義な議論をしてくれたH. Vlamakisに感謝する。本研究は、Knut and Alice Wallenberg Foundation、Beijer Laboratory for Gene and Neuro Research、Royal Swedish Academy of Sciences、Swedish Society for Medical Research、Science for Life Laboratory、1RM1 HG011014-01（S.V.）、Hans Werthén Foundation、Foundation Blanceflor Boncompagni Ludovisi née Bildt（B.L.）、Klarman Cell Observatory、Manton Foundation、Howard Hughes Medical Institute（A.R.）より助成を受けた。S.V.は、マサチューセッツ工科大学（MIT）およびハーバード大学のブロード研究所でワレンバーグ・フェローとして、またウプサラ大学でワレンバーグ・アカデミー・フェローおよびサイライフラボ・フェローとして支援を受けていた。A.R.はハワード・ヒューズ医学研究所の研究員であった。

資金提供
ウプサラ大学よりオープンアクセス資金提供。

著者情報
著者メモ
Aviv Regev

現職：米国カリフォルニア州サウスサンフランシスコ、ジェネンテック社

著者および所属
クラーマン細胞観測所、ブロード研究所、マサチューセッツ工科大学およびハーバード大学、米国マサチューセッツ州ケンブリッジ

Britta Lötstedt、Aviv Regev、Sanja Vickovic

スウェーデン、ストックホルム、KTH王立工科大学、遺伝子工学科、生命科学研究所

ブリッタ・レトシュテット

ニューヨーク・ゲノム・センター（米国ニューヨーク州ニューヨーク市

ブリッタ・レトシュテット＆サニャ・ヴィコヴィッチ

ブロード研究所（マサチューセッツ工科大学・ハーバード大学、米国マサチューセッツ州ケンブリッジ

マーティン・ストラジャール & ラムニク・ザビエル

マサチューセッツ工科大学マイクロバイオーム情報学・治療学センター（米国マサチューセッツ州ケンブリッジ

ラムニク・ザビエル

分子生物学部門、計算統合生物学センター、マサチューセッツ総合病院、ハーバード大学医学部、米国マサチューセッツ州ボストン

ラムニク・ザビエル

米国マサチューセッツ州ケンブリッジ、マサチューセッツ工科大学生物学部

アビブ・レジェフ

米国ニューヨーク州ニューヨーク、コロンビア大学、生体医工学科、ハーバート・アーヴィングがんダイナミクス研究所

サニャ・ヴィコヴィッチ

ウプサラ大学免疫学・遺伝学・病理学部門生命科学研究所遺伝子・神経研究ベイジャー研究室スウェーデン・ウプサラ

サニャ・ヴィコヴィッチ

貢献
S.V.はA.R.の指導のもと、研究および実験の構想・設計を行った。S.V.とB.L.は、A.R.の指導のもと、データの解析を行った。B.L.は、M.S.の協力を得て、ディープラーニングモデルを構築した。S.V.、B.L.、A.R.は、全著者の意見を取り入れながら論文を執筆した。著者全員が結果について議論した。

対応する著者
Aviv RegevまたはSanja Vickovicまで。

倫理申告
競合利益
A.R.は、セルシウス・セラピューティクスの創設者であり株式保有者であり、イムニタス・セラピューティクスの株式保有者であり、2020年8月31日までは、シロス・ファーマシューティカルズ、ネオジーン・セラピューティクス、アシモフ、サーモフィッシャーサイエンティフィックの科学諮問委員会メンバーであった。2020年8月1日以降、A.R.はジェネンテックの社員であり、ロシュの株式保有者でもある。S.V.はSpatial Transcriptomics AB（10x Genomics）が出願した特許の著者。S.V.とA.R.は、本研究に関連するPCT/US2020/015481の共同発明者である。残りの著者は、競合する利益はないと宣言している。

査読
査読情報
Nature Biotechnology誌は、Iwijn De Vlaminck氏と他の匿名査読者に感謝する。

その他の情報
出版社注：Springer Natureは、出版された地図の管轄権の主張および所属機関に関して中立を保っています。

補足情報
補足情報
補足図1-13および補足情報参考文献。

報告概要
補足表1
空間メタデータ。

補足表2
空間スポットごとの宿主と細菌の生カウントの指標。

補足表3
細胞型特異的サブモジュール発現。

補足表4
すべてのモジュールとサブモジュールのKEGGパスウェイ解析。片側フィッシャー正確検定値を報告。

補足表5
ゴールドスタンダードリファレンスから除外した生物種。

権利と許可
オープンアクセスこの論文は、クリエイティブ・コモンズ表示4.0国際ライセンスの下でライセンスされている。このライセンスは、原著者および出典に適切なクレジットを与え、クリエイティブ・コモンズ・ライセンスへのリンクを提供し、変更が加えられたかどうかを示す限り、いかなる媒体または形式においても使用、共有、翻案、配布、複製を許可するものである。この記事に掲載されている画像やその他の第三者の素材は、その素材へのクレジット表示で別段の指示がない限り、記事のクリエイティブ・コモンズ・ライセンスに含まれています。素材が記事のクリエイティブ・コモンズ・ライセンスに含まれておらず、あなたの意図する利用が法的規制によって許可されていない場合、あるいは許可された利用を超える場合は、著作権者から直接許可を得る必要があります。このライセンスのコピーを見るには、http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/。

転載と許可

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この記事の引用
Lötstedt, B., Stražar, M., Xavier, R. et al. 空間的宿主マイクロバイオーム配列決定により、マウス腸内のニッチが明らかになった。Nat Biotechnol (2023). https://doi.org/10.1038/s41587-023-01988-1

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受領
2022年6月21日

受理
2023年9月12日

出版
2023年11月20日

DOI
https://doi.org/10.1038/s41587-023-01988-1

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