ビタミンB12の過剰摂取は腸内細菌-宿主相互作用を変化させ、マウスにおけるCitrobacter rodentiumのコロニー形成と病原体の発生を加速させる

2023年2月5日 14:57

公開日：2023年2月3日
ビタミンB12の過剰摂取は腸内細菌-宿主相互作用を変化させ、マウスにおけるCitrobacter rodentiumのコロニー形成と病原体の発生を加速させる
Andrew J. Forgie, Deanna M. Pepin, ...Benjamin P. Willing 著者を表示する
マイクロバイオーム11巻記事番号：21（2023）この記事を引用する

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指標詳細

概要
背景
ビタミンB12のサプリメントは通常、1日の推奨量をはるかに超える量を含んでおり、高い曝露量は一般に安全であると考えられている。B12は、腸内細菌間で競合的および合成的な相互作用が存在する。しかし、過剰なレベルがどの程度腸内細菌叢の活動に寄与しているかは、まだ不明である。本研究の目的は、マウス特異的病原体であるCitrobacter rodentiumを用いたB12補充マウスモデルを用いて、B12が微生物の生態に及ぼす影響を評価することであった。マウスには標準的なチャウ食を与え、水またはヒトの約25mgに相当するB12（シアノコバラミン：〜120μg/日）を添加した水のいずれかを投与した。感染の重症度は、体重、病原体負荷、病理組織学的スコアリングによって決定された。宿主の炎症バイオマーカーは、病原体曝露の前後に大腸で評価された。

結果
シアノコバラミンの補給は、感染後1日目（P < 0.05）および3日目（P < 0.01）において、病原体のコロニー形成を促進した。腸内細菌群集に対するB12の影響は軽微であったが、Lachnospiraceae集団の変化とα多様性の減少に起因する明瞭なものであった。シアノコバラミン処理により、腸内細菌叢の低存在量のコミュニティーメンバーの活性が乱された。その結果、ナイーブマウスの結腸において、インターロイキン12 p40サブユニットタンパク質（IL12/23p40；P < 0.001）とインターロイキン17a（IL-17A；P < 0.05）の量を増加させることができた。この免疫表現型は微生物に依存しており、その反応はベースラインの微生物叢によって変化した。また、腸管メタトランススクリプトームから、過剰なシアノコバラミンがC. rodentiumのグルコース利用遺伝子の発現を低下させることが明らかとなった。

結論
ビタミンB12の経口投与は、腸内Lachnospiraceae集団の活性を変化させることにより、C. rodentiumのコロニー形成を促進した。Lachnospiraceaeの種の減少がp40サブユニットレベルの上昇と相関し、Parasutterellaの検出がナイーブマウスの結腸における炎症マーカーを悪化させた。B12による腸内環境の変化は、病原体の排除に役立つ主要な微生物-宿主相互作用に影響を与えることで、C. rodentiumのコロニー形成能力を向上させることが明らかになった。本研究は、B12が腸内細菌叢にどのような影響を与えるかについての洞察を与えるとともに、過剰なB12補給によって微生物の競争／共有が阻害された場合に起こりうる結果を明らかにするものである。

グラフの概要

動画

背景
ビタミンB12（コバラミン）は、コバルトを含有するコリノイド分子で、ヒトと細菌の両方において基本的な生物学的プロセスに必要である。ビタミンB12は、微生物によってのみ作られ、コバミドの一種である有機金属補酵素に属します[1]。反芻動物が常在微生物によるコバラミンの生合成に依存しているなど、いくつかの例外を除き、ほとんどの動物は食物連鎖におけるコバミンの生物蓄積に依存しています[2]。ヒトは、コバラミンを生産することができる唯一の重要な微生物集団が、小腸の吸収部位を過ぎて結腸に存在するため、食事からコバラミンを摂取しなければなりません[3]。ヒトの食事からのコバラミン摂取源は主に動物由来ですが、サプリメント、強化食品、発酵食品、一部の植物や藻類も代替品として利用可能です [4]。経口サプリメントは、筋肉注射よりも効果的で魅力的なB12貯蔵量の補充方法です[5, 6]。過剰なB12は主に胆汁を通して排泄され、腸肝循環によって再吸収される可能性があることに注意することが重要です。しかし、吸収されなかったB12は腸の微生物群に到達します [7]。高濃度のB12がどの程度、消化管（GI）微生物叢および宿主の健康に影響を及ぼすかは、まだ十分に理解されていません。

コバミドは細菌にとって必須であり、細胞質での酵素活性のサポートや、核での遺伝子発現を制御する補酵素リボスイッチとして重要な役割を担っています[8]。ゲノム研究により、微生物間で広くコバラミンが共有され、多数のコバミド／コリノイド依存性酵素やトランスポータータンパク質を通じて、微生物の増殖や代謝に影響を与えることが明らかにされました[9,10,11]。このことから、B12とコバミドの誘導体は、微生物の生態系を調節する微生物間相互作用において、これまで理解されていたよりも重要な役割を担っている可能性が高い[3]。例えば、腸内常在菌であるBacteroides thetaiotaomicronによるB12の取り込みは、腸管出血性大腸菌O157:H7（EHEC）が産生する志賀毒素-2の生成を制限することがin vitroで示されている[12]。これは、アデノシルコバラミン依存性のエタノールアミンアンモニアリアーゼの活性化に必要なコバラミンが利用できなくなることで、EHECがエタノールアミン（脂質膜の分解産物で腸内の主要代謝物）を利用する能力が低下することに起因すると考えられている。エタノールアミン代謝の制御は、いくつかのEnterobacteriaceaeとFirmicutesの種の増殖や病原性に影響を与える[13]。したがって、コバラミンをめぐる微生物間の競争は、エタノールアミン利用菌の活性に影響を与える可能性があることがわかる。さらに、B. thetaiotaomicronは、表面に露出したリポタンパク質を用いて、コバラミンと親和的に結合し、ヒトや動物での吸収に必要なコバラミン輸送タンパク質である内在性因子からコバラミンを除去することで競争を生み出します[14]。しかし、GI管内のコバラミンに対する微生物間の競争的および合成的相互作用がさらに存在する可能性があり、これが腸内細菌の病原性にどの程度影響するかはまだ十分に解明されていない。

毎日の経口コバラミンサプリメントには、ヒトの1日推奨量2.4μg/日をはるかに超える量（10,000μg/錠にもなる）が含まれていることがある。正常な吸収が阻害される場合には高用量が必要となり、一般に安全と考えられている。十分な吸収を確保するためにコバラミンを過剰に補給する習慣は、B12補給の上限が設定されていないことからも裏付けられている。ヒト用の5000μg錠（30.46μg/日）に相当する用量を用いたC57BL/6Jマウスでの研究では、B12を投与しても、Bacteroidesの枯渇は見られたが、Cecal short-chain fatty acids（SCFA）やデキストラン硫酸ナトリウム（DSS）誘発大腸炎のマーカー、すなわち結腸長やフルオロセインイソチオシアナート・デキストラン透過試験には変化がなかった [15]．腸内病原体と常在微生物との間にはB12の封じ込めと共有のための競争が存在するため、コバラミン過剰補給は腸内細菌叢の機能活性を変化させ、病原体のコロニー形成と発病に好ましい環境を作り出すと仮定した。B12の上限値が決定されていないことから、マウスにメガドースのB12を飲料水として補充し、ヒトEHEC感染で見られる付着・排出の病態を反映する天然のマウス特異的病原体Citrobacter rodentiumでチャレンジした[16]。我々は、経口B12補給が腸内細菌叢および腸内病原体のコロニー形成と病原体形成に抵抗する宿主の能力に及ぼす直接的および間接的な影響を評価した。

方法
マウスとビタミンB12補充
動物実験は、Canadian Council on Animal Careのガイドラインに従って実施し、アルバータ大学（カナダ、アルバータ州エドモントン）のAnimal Care and Use Committeeの承認を受けた。すべてのマウスは、特定病原体非含有（SPF）または無菌（GF）条件下で飼育・維持された。6〜7週齢の雌のC3H/HeOuJマウス（Jackson Laboratories, Maine, USA）を、1ケージあたり4匹または5匹でランダムに収容した。8週齢の雌のC57BL/6Jマウス（アルバータ大学、AB、カナダ）を、Tecniplast Isocage-Pバイオエクスクルージョンシステム（Buguggiate、VA、イタリア）を使用してケージあたり3匹収容した。8週齢の無菌雌C57BL／6Jマウスを、アルバータ大学軸索マウス研究ユニットのオープンケージを備えたアイソレーター（CEP Standard Safety、McHenry、IL、USA）に収容した。すべてのマウスは、水と、オートクレーブ処理後の食餌1kgあたり約0.08mgのシアノコバラミン（2020SX; Envigo-teklad, Indiana, USA）を含む標準食餌に自由にアクセスできる状態で1週間馴化させた。マウス1匹あたりの1日平均食餌量5gから計算すると、標準飼料だけで約0.4μgのシアノコバラミンが摂取できることになる。マウスは、以下の実験において、2020SX食中の量の約100倍である40μg/mlのシアノコバラミン（V2876、Sigma-Aldrich, St.Louis, MO, USA）の形態でB12を補充した、または補充しないフィルター滅菌飲料水を2週間にわたって摂取した。

水処理2週間後、C3H/HeOuJマウス（n＝12）を用いて、後述のC. rodentium-challengeモデルによる生存（SURV）実験を実施した。SURV実験におけるマウスの人道的エンドポイントとして、初期体重の20％減を既述のように選択した[17]。

EPC（Early-stage pathogen colonization）実験は、C3H/HeOuJマウス（n = 16）を用いて、感染初期段階における病原体のコロニー形成の開始を調査するために行った。各群から1ケージあたり2匹のマウスを安楽死させ（naïve_CON & naïve_CNCbl40）、残りのマウスに水処理を継続しながらC. rodentiumにチャレンジさせた（inf_CON & inf_CNCbl40）、各群合計8匹のマウスを使用した。

1ケージ3匹で飼育した従来のC57BL/6Jマウス（n = 6）に、シアノコバラミンとメチルコバラミン（Thermo Fisher Scientific, MA, USA）を飲料水中に10μg/mlと40μg/mlを補給し、異なる形態のB12を調査した。

無菌C57BL/6Jマウス（n = 4）を用い、従来のマウスで見られた大腸炎症マーカーの変化を裏付けるため、40μg/mlの用量でシアノコバラミンの直接的な役割を検証した。

すべての実験において、ケージは治療群にランダムに割り当てられた：対照（CON）とB12補充（シアノコバラミン10μg/ml、CNCbl10、40μg/ml、CNCbl40；メチルコバラミン10μg/ml、MeCbl10、40μg/ml、MeCbl40）グループに適宜に割り当てられた。

水分摂取量とB12投与量の推定
B12（シアノコバラミン）を飲料水に添加したマウスの1日の飲水量を測定するためのパイロット試験（データ未提示）を実施した。40μg/mlのシアノコバラミンまたは対照飲料水をマウス（n=15；1ケージ5匹）に自由摂取させ、水の消費量を1週間モニターした。2日おきに飲料水を交換し、飲水量を測定した。各時点でケージごとに消費された水を複製とみなし、その平均値を用いて処理間の水分摂取量を比較した。飲料水にB12を添加しても、水摂取量に影響はなかった。1日の水摂取量は、マウス1匹あたり約3mlであった。

水摂取量から、飲料水に10μg/mlおよび40μg/ml添加したB12は、それぞれマウス1日あたり30μgおよび120μgの総線量に達すると推定された。これらの研究で使用されたシアノおよびメチルコバラミン飲料水のヒト等価用量は、標準的なヒト等価用量パラメータを使用して計算した、～5000μg/日（CNCbl10 & MeCbl10）および～25000μg/日（CNCbl40 & MeCbl40）である[18]。本研究では、表現型を押し進め、腸内における高い B12 レベルを確実に維持し、腸内細菌叢による B12 利用に関連する競争、交差摂食、微生物-宿主間の相互作用を混乱させるために、メガドーズを使用した。これらのレベルは、10,000μgのB12カプセルが入手可能であり、1回のボーラスとして摂取されるであろうヒト集団内で実現可能であると考えられた。ヒトとマウスのB12補給量をそれぞれの推奨食事摂取量（RDA）の倍率で比較すると、成人ヒトの1日5000～10000μg錠の投与は、2083～4167×2.4μg/日のRDAに相当するが、本研究で120μg/日を投与したマウスは2400×RDAに相当することが分かった。マウスのB12のRDAは約0.05μg/日であり、これはマウスにとって適切とされる1kgあたり10μgのB12を含む食事に基づく[19]。

C. rodentium-チャレンジモデル
グリセロールストックから、C. rodentium（DBS100）をMacConkey寒天（BD Difco, NJ, USA）上にプレーティングし、シングルコロニーを摘んでLuria-Bertani broth（Sigma-Aldrich ）中で37℃、200rpmで振盪しながら一晩インキュベートした。マウスに一晩培養したもの100μl（1×109CFU/ml）を経口投与して感染させた。すべてのマウスは、感染前にMacConkey寒天培地に糞便サンプルをプレーティングすることによって、大腸菌群が存在しないことを確認した。病原体負荷は、1×PBSで連続希釈したサンプルホモジネートをMacConkey寒天培地にプレーティングすることによって、感染後5日目の糞便サンプルおよびGI内容物において毎日測定された。プレートは37℃で一晩培養し、コロニーを数え、サンプル重量で標準化した。

サンプル採取
感染後、毎日または2日ごとに新鮮な糞便を1mlの滅菌1×PBSで直接採取し、プレーティングに使用した。すべてのマウスは二酸化炭素を使用して安楽死させ、サンプリングは無菌的に行った。感染前に、ベースライン微生物叢分析のためにマウスから糞便サンプルを採取した。マウス組織および腸内容物（回腸、盲腸、結腸）を液体窒素でスナップ冷凍し、使用時まで-80℃で保存した。

腸内ビタミンB12濃度測定
スナップ凍結した盲腸および結腸消化物試料を秤量し、Calgary Laboratory Servicesが提供する独自の緩衝液で2回の叩解（4m/sで30秒、氷上で冷却ステップ）を行い、ホモジナイズした。Diagnostic and Scientific Research Centre (Calgary, AB, Canada)が提供する独自のバッファーで2回叩打（4m/sで30秒、氷上で冷却ステップ）した。その後、サンプルを 10,000 rpm で遠心分離し、上清を回収して-20 ℃で保存した。ビタミンB12は、Roche Diagnostics e602 (Calgary Laboratory Services)で実施されたRoche Diagnostics vitamin B12 II assayを用いて電気化学発光により定量化された。この技術は、ルテニウム標識した組換えブタ内在性因子をレポータープローブとして用いて、総ビタミンB12を測定するものである。

短鎖脂肪酸（SCFA）分析
スナップ凍結した糞便を氷上で解凍し、重量を測定（30 mg/サンプル）、600 μlの25%リン酸でホモジナイズした。サンプルを15,000 rpm、4℃で10分間遠心分離し、上清を0.45 μmのシリンジフィルター（Fisher社製）に通過させた。ろ過したサンプルの200μlアリコートを50μlの内部標準（23μmol/ml、イソカプロン酸）と合わせ、SCION 456-GC装置で分析した。

ネコ科微生物メタトランススクリプトーム解析
総RNAは、既報の通り、凍結したセカルサンプルから抽出した[20]。約50 mgの凍結ネコ科内容物を、β-メルカプトエタノール（10 μl/ml、Sigma-Aldrich）および1 ml TRIzol（Invitrogen）を補充した300 μl RLTバッファ（RNeasy mini kit、Qiagen）を予め入れた0.1 mmガラスビーズ含有チューブ（PowerBead Tubes、Qiagen）に加えた。細胞破砕は，FastPrep®-24 ビーズビートマシーン（MP biomedicals）を用いて，2 回のビート（6.5 m/s で 30 秒）で行った．室温で5分間インキュベートした後、サンプルを遠心分離し（1分間、12,000×g、4℃）、上清を300 μlのクロロホルムを含むチューブに移し、ボルテックスして3分間インキュベートした。遠心分離（15分、12,000×g、4℃）後、上層水相を注意深く集め、新しく調製した70％エタノール溶液1 mlを含む新しいチューブに移し、ピペッティングにより混合し、RNeasyスピンカラム（RNeasy mini kit、Qiagen）にロードした。RNA抽出およびオンカラムDNA消化（Qiagen）は、製造業者のプロトコルに記載されたとおりに完了した。RNA の品質と量は Agilent Bioanalyzer を用いて測定した。RNA インテグリティナンバー（RIN）が 7.0 以上のサンプルは、Génome Québec Innovation Centre (Montréal, QC) でメタトランスクリプトームライブラリーを作成するために使用された。サンプルは100 ng/μlに希釈し、宿主のrRNA欠失（NEBNext® Human/Mouse/Rat）を実施しました。ライブラリーは、NovaSeq 6000システム（Illumina）で100 bpペアエンドリードとして配列決定された。

フィルタリングされていない生データ（サンプルあたり平均35Mリード）の解析は、Simple Annotation of Metatranscriptomes by Sequence Analysis 2.0 (SAMSA2) pipeline [21] を用いて以下のように完了した。PEAR (version 0.9.10) によるリードのマージ、Trimomatic (version 0.36) による低品質リードのトリミング、ShortMeRNA (version 2.1) によるrRNAの除去、DIAMOND (version 2.0.2) による RefSeqデータベースへのmRNAのアノテーション [22]です。マージステップでは、サンプルあたり約25Mのリードがマージされました。バクテリアrRNAはサンプルあたり約9百万リード、リボデプレートリード（mRNA転写物）はサンプルあたり約13百万リードの未知リードと約2百万リードの注釈付きリードとなりました。さらに、SEED subsystems hierarchical database [23]を用いて、マイクロバイオームの機能的活性を分類・比較した。注釈付きリードの解析はDESeq2パッケージを使用して完了し、Rでggplot2パッケージを使用して可視化しました。

サイトカイン・ケモカインアッセイ
遠位結腸の2cm片を用いてタンパク質を抽出し、アッセイプロトコルに記載されているように、プロテアーゼおよびホスファターゼ阻害剤を含む300μlのMeso Scale Discovery溶解バッファー中でホモジナイズした。ホモジネートを 15,000 rpm で 10 分間遠心分離し、上清中のタンパク質濃度を Pierce Bicinchoninic Acid assay Kit (Thermo Scientific) を用いて決定した。ナイーブマウスおよび感染マウスのサンプルホモジネートは、それぞれ総タンパク質量150μgおよび100μgでウェルにロードした。U-PLEX Biomarker Group 1（マウス）アッセイ・プラットフォーム（Meso Scale Discovery, Gaithersburg, MD, USA）を使用して、インターフェロンγ（INFγ）、インターロイキン（IL-1β、IL-4、IL-6、IL-10、IL-12／23p40、IL-17AおよびIL-22）、ケラチノサイト由来ケモカイン（KC）、腫瘍壊死因子α（TNFα）, 顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（GM-CSF）、マトリックスメタロプロテアーゼ-9（MMP9）、regulated on activation normal T cell expressed and secreted（RANTES）として知られるケモカイン蛋白、インターフェロンγ誘導蛋白10（IP10）、単球走化性蛋白1（MCP1）およびマクロファージ炎症蛋白（MIP1α、MIP2およびMIP3α）．最終濃度は、100μgの結腸タンパク質中のpg/mlとして示した。

微生物群集の分析
QIAamp Fast DNA Stool Mini Kit (Qiagen, Valencia, CA, USA) を用い、FastPrep-24 5G instrument (MP Biomedicals) で 200 mg のガーネットロックを用いて 6.0 m/s で 60 秒間のビーズビートステップを付加して回腸、盲腸および結腸内容から全 DNA を抽出した。細菌16S rRNA遺伝子のV3-V4領域を増幅するイルミナ（16S Metagenomic Sequencing Library Preparation）からのプロトコルに従って、アンプリコンライブラリを構築した。341F (5′-TCGTCGGCAGCGTCAGATGTGTATAAGACAGCCTACGGNGGCWGCAG- 3′) および805R (5′-GTCTCGTGGCTCGAGATGTGTATAAGACAGGACTACHVGGGTATCTAATCC-3′) を使用した。ペアエンドシーケンスは、Illumina MiSeq Platform（2×300 cycles；イルミナ社、カリフォルニア州サンディエゴ、米国）を用いて達成された。生配列はQuantitative Insight into Microbial Ecology 2 (QIIME) [24] パイプラインで処理し、divisive amplicon denoising algorithm 2 (DADA2) を用いてペアエンドリードをフィルター、トリム、マージしてアンプリコンシーケンスバリアント (ASV) にした。リボソームRNAデータは、QIIME2にてdeblur denoise-16S機能を用いて事前にマージしたシングルエンドリードとして処理し、160 bpでトリミングした。qiime alignment (mafft; mask) および qiime phylogeny (fasttree; midpoint-root) 関数を用いて系統樹を作成した。分類は、特定のアンプリコン領域について学習させたSILVA v138データベースを用いて、qiime feature-classifier classify-sklearn関数を用いて割り当てた[25]。QIIME2 ファイル (.qza) は qiime2R (version 0.99.4) パッケージを用いて R にインポートし、phyloseq (version 1.34.0) パッケージで解析した [26]．

C3H/HeOuJマウスの希少サンプル（回腸21,497リード、盲腸34,012リード、結腸7435リード）を用いてα多様性（Observed、Shannon、phylogenetic diversity（PD））およびβ多様性（weighted and unweighted UniFrac）指標を解析した。また、メタトランススクリプトームシーケンスデータからrRNA（raefied at 1,247,061 reads）を解析し、盲腸の微生物群集を解析した。アルファ多様性指標の統計的有意性は、ANOVAとTukey補正で判定した。主座標分析（PCoA）はphyloseqパッケージを用いてプロットし、クラスタリングの有意性は分散については "betadisper "関数 [27]、方向については "pairwiseAdonis.dm "関数 [28] を用いて決定された。存在量差解析は、non-rarefied readsと "tree_glom"（盲腸rRNAはtax_glom）関数を用いたDESeq2により行った。P値が0.05未満のASVのみの「log2foldchange」をプロットし、太字のASVは有意な修正P値<0.10, <0.05 (), <0.01 (), <0.001 ()を意味するものとしました。プロットされたASVは、分類学上最も低いランクに従って割り当てられ、最も多いものから最も少ないものまで、対応するASV番号で区別される。ナイーブ（SURVおよびEPC）および感染（EPC）マウス実験からの結腸組織における結腸微生物叢（DESeq2正規化ASV数）と免疫プロファイルのスピアマンの相関は、Rの「psych」パッケージおよび「pheatmap」パッケージを使用して分析および可視化された。

In vitro 培養実験
すべてのin vitro培養実験は、嫌気性チャンバー（5% CO2、5% H2、90% N2）で行われ、培養は37℃で振盪せずに行われた。B. thetaiotaomicronは、0.1％L-システインを含む1×PBSで連続希釈し、200μg/mlのゲンタマイシンを補充した還元前脳心筋梗塞（BHI；Difco）寒天＋10％子牛血（Cedarlane、ON、カナダ）上にプレーティングしてC3H/HeOuJマウス糞便試料から分離した [29]．分離菌は16S rRNA遺伝子の増幅とサンガーシークエンスにより同定し、BLASTウェブベースツール[30]を用いて配列を照合した。C. rodentium（10μlの一晩培養物）を、シアノコバラミンが0ppm、0.01ppm、15ppmで添加された10mlの予備還元低グルコースダルベッコ変法イーグル培地（Gibco Life Technologies, Grand Island, NY, USA）中で単独またはB. thetaiotaomicron（100μl一晩培養物）と競合して植菌した。 Luria-Bertani brothで1.4 × 107 CFU/mlで増殖したC. rodentiumのシングルコロニーとBHI broth（Difco）で5.5 × 107 CFU/mlで増殖したB. thetaiotaomicronから培養したオーバーナイト培養物を接種物として使用した．C. rodentiumはMacConkey寒天培地、B. thetaiotaomicronはBHI with calf blood寒天培地で培養し、菌数を測定した。ペレット化した細胞1mlからTRIzol試薬1mlを用いて直ちに全RNAを抽出し、上記のようにスピンカラムを用いて精製した。

逆転写定量PCR
大腸組織を600μlの溶解バッファー中でビーズビーティングによりホモジナイズし、GeneJET RNA Purification Kit (Thermo Scientific)を用いてRNAを抽出した。サンプルは製造元のプロトコールに従ってDNaseで処理した。大腸組織とin vitro培養実験の両方から抽出したRNAサンプルは、qFlex cDNA Synthesis Kit (Quanta Bioscience) を用いて逆転写させた。定量的PCRに使用したプライマー（Additional file 1 Table S1）は、以前に検証したものである[29, 31, 32]。qPCRは、PerfeCTa SYBR Green SuperMix（Quantabio）を用いて、ABI StepOne Real-Time Systemで、以下のサイクルで実施された。遺伝子発現は、ハウスキーピング遺伝子との相対的な変化量を示すデルタデルタCt（-ΔΔCt）法を用いて算出した。

統計解析
GraphPad Prism 6 (GraphPad software, La Jolla, CA, USA)を用いて有意性検定を実施した。パラメトリックなデータにはStudent's t-testまたはANOVAを、ノンパラメトリックなデータにはKruskal-Wallis testを使用した。データは平均値±標準偏差で示した。生存曲線分析は、感染後10日目までのデータを用いて、Mantel-Cox検定を用いて行った。複数の処理間の差は、Bonferroniの、Tukeyの、またはDunnのポストホック比較検定のいずれかを行うことによって補正された。

結果
C3H/HeOuJ マウスにおけるシアノコバラミン補充は、C. rodentium の初期コロニー形成および病原性を促進した。
マウスの盲腸および結腸内容物中の総コバラミン量を測定したところ、シアノコバラミン40μg/mlを飲料水に添加したマウスでは、対照水と比較して1000倍（P < 0.01）増加した（図1 a）。コバラミン濃度が高いほど、C. rodentiumのコロニー形成はより迅速かつ一貫しており、毎日の糞便中の菌数を測定した（Fig. 1 b）。感染後5日目の回腸と盲腸の内容物には、C. rodentium負荷の差は認められなかった（Fig. 1 c）。病原体量の差は感染後3日目に最も大きくなった（P < 0.05）。初期病原体コロニー形成（EPC）実験で見られたC. rodentiumのより迅速で安定したコロニー形成は、SURV実験でも確認された。シアノコバラミン過剰投与マウスは、コントロールの9日目と比較して、3日目から始まる死亡率の発症が早かった（図1 d）。CONとCNCbl40の生存曲線は、感染後14日目には有意差を失ったが（P = 0.14）、10日目には有意差を示した。病原体負荷の増加と一致して、感染後5日で終了したinf_CNCbl40群のマウスは、inf_CONと比較して高い結腸病理スコアを有した（P < 0.05）（図1 e）。シアノコバラミン水補給のみでは、感染前の目に見える組織障害は誘導されなかった（図1 e）。C3H/HeOuJマウスにおけるC. rodentiumのコロニー形成と病原性は、シアノコバラミンを飲料水に添加することで増強されることが明らかになった。

図1
図1
シアノコバラミン補給がC3H/HeOuJマウスの生存とC. rodentium感染症の早期発症に与える影響 a 飲料水中のシアノコバラミン補給により、セカールおよびコロンのコバラミンレベルが〜1000倍増加した（n = 15; P < 0. EPC実験におけるC. rodentiumの毎日の糞便中の菌数は、シアノコバラミン補給による感染後2日目（D2PI）およびD3PIでのコロニー形成負荷の増加を示した（n = 8; #P < 0.10, * P < 0.05）. d より急速なコロニー形成と一致して、SURV実験では死亡率の早期発現が見られ、感染後最初の10日間のマウスの生存率が低下した（n = 9; P < 0. e ナイーブマウスと感染マウスのD5PIにおける大腸病理学的スコアは、シアノコバラミンが感染対照マウスと比較して粘膜および上皮の損傷を有意に増加させた（）ことを示している（n = 8; P < 0.05; 検出限界（LOD））。

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C3H/HeOuJマウスのGI管内のファーミキューテス属とプロテオバクテリア属の集団は、コバラミン補給によって変化する
シアノコバラミンを40μg/mlで飲料水に添加すると、回腸ではなく盲腸と結腸の微生物組成に変化が生じ、プロテオバクテリアの種が好まれ、低存在のファーミキューテスの動態が変化した（図2および図3）。観察数で示される種の豊富さ、および系統的距離解析から、B12処理によって病原体曝露前の大腸の多様性が低下していることが示された。加重および非加重UniFrac距離指標を用いた主座標分析（PCoA）プロットでは、ナイーブマウスと感染マウスで微生物相が明確にクラスタリングされていた（pairwise Adonis; Additional file 1 Table S2）。重み付けされたUniFracではなく、重み付けされていないUniFracの差は、ナイーブ_CNCbl40マウスでは、ナイーブ_CONマウスと比較して盲腸（P < 0.05）および結腸（P < 0.01）において低存在コミュニティメンバーが影響を受けたことを明らかにした。感染によって誘発された微生物破壊の重症度は、inf_CONグループと比較してinf_CNCbl40でより顕著であった。大腸では，weighted (P < 0.01) および unweighted (P < 0.05) の両 UniFrac メトリクスにより，naïve_CNCbl40 と inf_CNCb140 の間に差が認められたが，感染群と非感染群の間には差がなかった (weighted P = 1.0, unweighted P = 0.81)．盲腸では、naïve_CONとinf_CON間の腸内細菌群集は、非重み付けUniFrac metricに基づくと差があり（P < 0.01）、naïve_CNCbl40とinf_CNCbl40グループは、重み付けUniFrac metricで差があった（P < 0.01）．

図2
図2
EPC実験のナイーブマウスと感染（inf_）マウスの微生物叢解析。回腸、盲腸、大腸の微生物叢の主座標プロットは、加重および非加重UniFrac非類似度メトリックに基づくものである。盲腸と結腸では、非重み付けUniFracにより区別されたクラスタリングが決定された（追加ファイル1 表S2）。シアノコバラミン補給は、大腸のα多様性（観察値とPD）を有意に減少させた（n = 7-12; P < 0.05)

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図3
図3
EPC実験のマウスの微生物群集のDESeq2差分解析。シアノコバラミンの補給により、GI管全体のファーミキューテス集団が変化した。対照群では、盲腸と結腸のa感染前とb感染後に、Lachnospiraceae種とClostridia vadinBB60グループ細菌を含むFirmicutesがより多く存在した（n = 6-8；P値が0.05未満のASVのみをプロット；有意性には調整P値を使用；太字の分類群は傾向（P < 0.10）を表す； *P < 0.05，**P < 0.01，**P < 0.001）。

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大腸と盲腸で観察されたベータ多様性の違いは、DEseq2の差分発現解析によって決定されたナイーブマウスと感染マウスの両方におけるFirmicutesとProteobacteria集団の変化によってほぼ説明された（図3）。感染前のナイーブ_CNCbl40群では、盲腸でClostridia vadinBB60群に属する未培養細菌、結腸でLachnospiraceaeがそれぞれP < 0.001, P < 0.05, P < 0.001, P < 0.05), ParasutterellaがP < 0.10 (図3 a)でナイーブ_CON群に比べ有意に少量となり、結腸で多くなった(図3 b). 感染前のNaïve_CNCbl40群では、Paitha属細菌、Paysu属細菌、Paitha属細菌、Paitha属細菌、Paitha属細菌がそれぞれNe tyve _CON群と比べ少量となった. Blautia属細菌は盲腸で唯一増加し（P < 0.01）、naïve_CNCbl40グループの大腸では増加しなかった。また、糞便中のC. rodentiumの数が多いことと一致して、inf_CNCb140群のマウスは回腸と結腸でinf_CON群と比較してC. rodentiumに対応するリード数が数値的に多かった（図3 b）。盲腸では、シアノコバラミン添加感染マウスにおいて、AcetatifactorとLachnospiraceaeの1種が増加し（P < 0.05）、Blautiaと他のLachnospiraceaeが減少した（P < 0.05）。inf_CNCbl40マウスの大腸では，inf_CONと比較してBlautiaが減少し（P < 0.05），Clostridia vadinBB60グループ，Oscillospiraceae，Lachnospiraceae A2および（Eubacterium）グループに属する種が減少していた．これらの結果は、シアノコバラミン補給がProteobacteria（ParasutterellaとCitrobacter）種の増殖を促し、腸内の低存在Firmicutes種の動態に影響を与えることを示唆している。

B12補給に応じたベータ多様性の一貫したシフトは、病原体曝露前のSURVおよびEPC実験において観察された（図4）。しかし、後述の免疫表現型に関連するAkkermansia muciniphila、Bacteroides thetaiotaomicron、Parasutterella種がSURV実験に存在しないなど（追加ファイル1図S1）、実験間で群集組成に顕著な違いがあった。SURV実験の糞便内容物のSCFA分析では、B12補給はSCFA濃度に影響を及ぼさなかった（追加ファイル1図S2）。ベースラインの微生物叢の違いにもかかわらず、種の豊富さ（観察数）および系統的多様性指数は、両方の実験においてB12を補給したマウスで低かった（P < 0.05）（図4 c）。Tuzzerella種の数値的な低さに加えて、Clostridia vadinBB60グループは、B12補給によって一貫して減少した（P < 0.01）（図4 dおよびe）。SURV実験ではParasutterella属が存在しなかったため、この属の高い相対的存在度（P < 0.10）はEPC実験でのみ検出された。

図4
図4
SURV実験とEPC実験のナイーブC3H/HeOuJマウスの大腸微生物群集の比較。a重み付けなしのUniFrac PCoAプロットとb重み付けUniFrac比較は、微生物群集クラスタリングの類似パターンを示した（追加ファイル1 表S2）。DEseq2解析によって決定された発現の差は、d SURVおよびe EPC腸内細菌叢を保有する両方のマウスにおいて、堅果類集団（Clostridia vadinBB60グループ）がシアノコバラミンによって影響を受けることも示した（n = 10-12；太字の分類群は傾向を表す（P < 0.10；*P < 0.05，*P < 0.01，**P < 0.001））。

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メタトランススクリプトームデータで同定されたリボソームRNA配列を用いて、活動的な腸内細菌叢の変化を解析した（図5）。Unweighted UniFracでは、ナイーブ治療群とinf_CNCbl40群の微生物叢は明確に分離していたが、inf_CON群の一部のマウスはナイーブ治療群に類似したままだった（図5 a; Additional file 1 Table S2）。重み付けしたUniFrac解析でも差は見られなかった（図5 b）。アルファ多様性指標では、観測された個数やシャノン多様性指標に変化は見られなかった。しかし、PD指標はnaive_CNCbl40グループで数値的に低く、これは16S rRNA遺伝子アンプリコンデータセットが盲腸から結腸へ移動したことと一致した。興味深いことに、inf_CNCbl40グループは、PD指標によって判断すると、naïve_CNCbl40グループよりも多様性が高くなった（P < 0.05）（図5 c）。全体として、Clostridia vadinBB60およびAcetatifactorを含むB12補給および感染による群集組成の変化は、16S rRNA遺伝子アンプリコンデータと一致している（図5 dおよびe）。盲腸の活性微生物群集の差次的発現解析では、有意な変化は見られなかったが、B12補給に関連した集団動態の再構築が示唆された（追加ファイル1図S3）。

図5
図5
EPC実験のSAMSA2メタトランススクリプトーム解析で同定した16S rRNA遺伝子の盲腸内微生物相解析。a重み付けなしのUniFrac PCoAプロットではなく、b重み付けしたUniFrac PCoAプロットにおける微生物コミュニティの明確なクラスタリング（追加ファイル1 表S2）。c Observed、Shannon、PDメトリクスによって決定したアルファ多様性は、コントロールと比較してシアノコバラミン補給マウスの感染後の多様性（PDのみ）が増加することを示した（P < 0.05) 。DEseq2を用いた微生物分類群の発現差解析により、dのナイーブマウスおよびeの感染マウスでは、シアノコバラミン補給によりファーミキューテス集団が変化することが確認された（n = 6-8；太字の分類群は傾向（P < 0.10）； ***P < 0.001)

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シアノコバラミンの補給は盲腸のファーミキューテス類の集団動態を変化させた
シアノコバラミン処理により、病原体曝露前後で微生物全体の活性が変化することが、トランスクリプトーム解析により明らかになった（図6）。ナイーブ_CNCbl40群では、クエン酸：ナトリウムシンポーターの発現が有意に低下し（P < 0.01）、コバラミン特異的酵素であるメチルテトラチドローフォレート-コリノイドメチルトランスフェラーゼ（未調整P < 0.001, 調整P = 0.64）が著しく減少した（図6 a）。病原体曝露後、inf_CNCbl40群は、フラジェリン・ドメインタンパク質（P < 0.01）、3Nドメインタンパク質-グリコシルヒドロラーゼファミリー（P < 0.05）および逆転写酵素（P < 0.10）の発現が低下し、一方、グルコース1-リン酸チミジルトランスフェラーゼ（P < 0.01）およびD-アラニン-ポリ（リン酸リビトン）リガーゼ（P < 0.10）が豊富になった（図6の b）。SEEDサブシステム経路解析（レベル3）では、naïve_CON群でカロテノイド経路に関連する遺伝子の発現が増加する傾向が見られた（P < 0.10）（図7）。同時に、B12を補充したマウスでは、リポポリサッカライド集合体（P < 0.05）およびβ-ケトアジピン酸カテコール分岐（P < 0.10）経路に関連する遺伝子の発現がより多かった。グラム陽性能力およびプトレシンの利用経路に関連する遺伝子は、ナイーブ_CONグループで数値的に高かった。また、コエンザイムB12の生合成経路はナイーブ_CNCbl40グループで有利であった（図7 a）。inf_CON群では、トリアシルグリセロール代謝、酪酸へのアセチルCoA発酵、オートインデューサー2（A1-2）の輸送とプロセシング（lsrACDBFGE）経路が主に濃縮されていた。inf_CNCbl40グループは、フルクトース-6-リン酸からのUDP-N-アセチルムラミン酸生合成経路を好む微生物活性を示した（図7 b）。

図6
図6
シアノコバラミン添加C. rodentium-challengedマウス（inf_）は、代謝（クエン酸：ナトリウムシンポーター）および運動（フラジェリンドメインタンパク質）に関する機能活性の変化を示し、Lachnospiraceae科に属することが確認された（n = 8、太字の分類群は傾向（P < 0.10）； *P < 0.05，*P < 0.01）。

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図7
図7
EPC実験のC3H/HeOuJセカールメタトランススクリプトームのSEEDサブシステムレベル3 DESeq2解析。シアノコバラミン補給は、ナイーブマウスではグラム陰性リポ多糖の集合に関連する経路を増加させ、bC. rodentium-challengedマウスではグラム陽性菌の能力に関連する遺伝子を減少させない（n = 8; 太字の分類群は傾向（P < 0.10）; *P < 0.05）。

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これらの変化の大部分は、感染前のLachnospiraceae属と感染後のC. rodentium属に起因するものであった。そこで、LachnospiraceaeとCitrobacterにアノテーションされたメタトランススクリプトームデータを抽出し、比較した（図8）。Lachnospiraceae属はシアノコバラミンで飽和した腸内環境に対応し、その活性を劇的に変化させることがわかった。ナイーブマウスでは、シアノコバラミン処理により、フィブロネクチンタイプ3ドメイン含有タンパク質（P < 0.01）とセリン/スレオニントランスポーターSstT（P < 0.05）の発現が亢進していた。 05）、2型毒素抗毒素系HicBファミリー抗毒素、フラジェリンドメインタンパク質、無機ピロホスファターゼ、プロピオニルCoAカルボキシラーゼ、リボソーム関連阻害剤A/シグマ54調節タンパク質といった多数の注目遺伝子を有利にしていた（図8 a）。また、Lachnospiraceaeのコバラミン結合タンパク質と環状ラクトン自己誘導ペプチド遺伝子がnaïve_CONグループで有利であった（Fig. 8 a）。Lachnospiraceaeの種はinf_CNCbl40グループよりもinf_CONグループで活性が高く、ribosome-associated inhibitor A/sigma 54 modulation protein, flagellin domain protein, propinyl-CoA carboxylase, and sensor domain-containing phosphodiesteraseが顕著に増加した。特に興味深いのは、ATP-cob(I) alamin adenosyltransferaseとMULTISPECIES: type 2 toxin-antitoxin system antitoxin, RelB/DinJ family遺伝子がinf_CNCbl40グループに濃縮されていた（図8 b）。シアノコバラミン補充により、C. rodentiumの活性が変化し、多数の病原性遺伝子の発現が顕著に増加した。大腸菌分泌タンパク質A（EspA）およびD（EspD）、translocated intimin receptor（Tir）、imintin、E. coli attaching and effacing gene B（EaeB）である（図8c）。興味深いことに、グルコース利用に関連する遺伝子であるファミリー31グルコシダーゼは、転写調節因子HdfRやDUF4150ドメイン含有タンパク質とともに、inf_CONグループで好んで使われた（図8 c）。

図8
図8
EPC実験から得られたLachnospiraceaeとCitrobacter特異的機能活性のDESeq2差分発現解析。感染前、Lachnospiraceaeファミリーの機能活性（a）は、シアノコバラミン処理により、フィブロネクチンタイプ3ドメイン含有タンパク質やセリン/スレオニン輸送SstTなど多数の遺伝子の発現が増加した。 b C. rodentiumに曝露後、inf_CNCbl40グループのLachnospiraceaeファミリーはinf_CONグループと比較して異なる活動を示すようになった。c シトロバクター特異的な遺伝子発現（c）はinf_CNCbl40群ではinf_CON群よりも顕著で、病原性遺伝子発現の増加のシグナルが顕著であり、対照マウスではファミリー31グルコシダーゼ活性がより高かった（n = 8；太字の分類群は傾向（P < 0.10）；*P < 0.05，**P < 0.01）．

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過剰なシアノコバラミンはin vitroでのC. rodentiumの病原性発現に直接影響を与えない
これまでの研究で、B. thetaiotaomicronのコバラミンに対する競合に対応して、in vitroで志賀毒素産生EHECの病原性発現が変化することが示されている[12, 29]。そこで、C. rodentiumを生理的に適切な濃度のコバラミンで単独または競合培養した場合の病原性発現を調べた（図9）。内腔のコバラミン濃度は 0.01 ppm から約 15 ppm まで増加することから、0 ppm、0.01 ppm、15 ppm のシアノコバラミンが C. rodentium の増殖および病原性にどのような影響を与えるかを評価した。競合試験により、C. rodentiumはコバラミン曝露量に関係なく安定したレベルを維持することが明らかとなった。一方、B. thetaiotaomicronは0.01および15ppmのシアノコバラミン添加により数が増加し（P < 0.05）、B12に対する競争があることが示された（図9 a）。C. rodentiumを単独で培養した場合、シアノコバラミン処理によりC. rodentiumの存在量は8.0から7.5 log CFU/ml（P<0.05）へと用量依存的に減少した（Fig. 9 b）。腸球浸潤遺伝子座（LEE）の病原因子は、LEEがコードするレギュレーター（Ler）、Tir、EspAを含むが、競合アッセイ（図9 c、d）およびC. rodentiumを単独培養した場合（図9 d）には違いが見られなかった。

図9
図 9
C. rodentiumとB. thetaiotaomicronのin vitro競合試験（シアノコバラミン生理的有効濃度下）。シアノコバラミン単独では、C. rodentiumの増殖や病原性を直接変化させることはできなかった。 a 嫌気的に6時間競合培養したC. rodentiumとB. thetaiotaomicronの菌数、b 単独培養したC. rodentiumの菌数。C. rodentiumを異なる濃度のシアノコバラミンでcの競争培養またはdの単独培養した場合、病原性に関連する遺伝子（Ler、Tir、EspA）の発現は処理間で差がなかった（n = 6; P < 0.05)

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コバラミンの補給は、ナイーブおよび感染C3H/HeOuJマウスの大腸サイトカインプロファイルを変化させる
シアノコバラミン処理に対する宿主応答を調べるため、EPC実験のナイーブマウスと感染マウスの大腸組織でサイトカインおよびケモカインのバイオマーカーを測定した（図10；追加ファイル1図S4およびS5）。コバラミンが過剰に補充されたナイーブマウスは、結腸組織においてサイトカインIL-12/23p40（P < 0.001）、IL-4（P = 0.06）、およびIL-17A（P < 0.05）の濃度がより高かった（図10 a）。また，inf_CNCbl40群はinf_CON群に比べ，IFNγ（P < 0.05），IL-10（P < 0.05），IL-17A（P < 0.01）およびGM-CSF（P < 0.05）のレベルが増加した（図10 b）．これらの結果は、シアノコバラミンの補給が感染前の免疫活性化に影響を与えることを示唆している。

図10
図10
EPC実験のC3H/HeOuJマウスの結腸組織ホモジネートで測定された有意な宿主バイオマーカー濃度 aシアノコバラミン補給はナイーブマウスのIL-12/23p40およびIL-17Aサイトカインを増強し、IL-4のレベルが高い傾向（P = 0.06）となった。 06）。 bC. rodentiumチャレンジにより、シアノコバラミン添加マウスではIFNγ、IL-10、IL-17A、GM-CSFが有意に増加した（n = 8; *P < 0.05, **P < 0.01, ***P < 0.001)

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コバラミン投与により、微生物叢の状態に応じて大腸p40サブユニットが増加した
IL-12/23p40の測定は、IL-12またはIL-23サイトカインのいずれかを表す可能性がある。そこで、大腸におけるIL12A（p35）およびIL12B（p40）の遺伝子発現を測定した。IL12BはNaive_CNCbl40群ではNaive_CON群に比べ有意に濃縮されていたが（P < 0.01）、IL12Aでは差が認められなかった（図11のa）。一致して、p35とp40サブユニットのヘテロダイマーであるIL-12p70サイトカインレベルは、結腸ではアッセイの検出限界以下であった（データは示さず）。IL-12/23p40レベルの増加は、SURV実験マウスでは観察されず（図11 b）、この反応は、微生物叢の特定の構成要素に依存している可能性が高いことが示された。そこで、IL-12/23p40の誘導に微生物群集が必要であるかどうかを検証した。実際、シアノコバラミン処理によって、無菌C57BL/6JマウスではIL-12/23p40タンパク質レベルは増加しなかったが（図11のc）、従来のC57BL/6Jマウスでは増加した（図11のd）。SURVとEPCの相関解析により、ナイーブマウスではIL-12/23p40がLachnospiraceae, Oscillospiraceae, Eggerthellaceae, Ruminococcaceaeのメンバーを含む複数のFirmicutes種の減少に関連していることが分かった（追加ファイル1図S6）。Ruminococcaceaeの選択種は、感染マウスにおいてIL-12/23p40と負および正の相関を示した（Additional file 1 Fig.S6）。また、他の形態のB12と比較してシアンの可能性を除外することを望んだ。従来型のC57BL/6Jマウスは、シアノコバラミンまたはメチルコバラミンを投与した場合、IL-12/23p40タンパク質レベルの同様の上昇を示した。大腸のIL-12/23p40タンパク質レベルは、CNCbl10（P < 0.05）およびMeCbl10（P < 0.05）グループで最大であり、CNCbl40およびMeCbl40は数値的に高かった（図11のc）。

図11
図11
シアノコバラミンによるディスバイオーシスにより、病原体曝露前のマウスの結腸組織ではp40サブユニットの産生が増加した。大腸組織における感染前のIL-12/23p40のレベルは、微生物叢の構造に直接関係し、関連するマウスの遺伝子型に依存しなかった。 a EPC実験では、p40サブユニットコード遺伝子であるIL12Bの遺伝子発現が有意に高く、IL-12A（p35）遺伝子は認められなかった（n = 8）。b SURV実験ではIL-12/23p40の増加は見られず（n = 5-6）、c無菌C57BL/6Jマウス（n = 4; *P < 0.05, **P < 0.01, ***P < 0.001） dシアノコバラミンとメチルコバラミン10μg/mlと40μg/ml補充で従来のC57BL/6Jマウス（n = 6; P < 0.05 ）のコロンのIL/23p40タンパク質レベルはコントロールと比べ増加している。

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考察
我々は、腸内の過剰なコバラミンレベルが微生物叢の機能的動態と宿主免疫シグナル伝達を変化させ、病原体のコロニー形成を支援する環境を提供することを実証した。宿主の食事、環境因子、免疫状態を含む宿主代謝が、消化管の生態環境を駆動することはよく知られている[33,34,35]。腸内細菌叢の活性の乱れ（別称、腸内細菌叢異状）は、いくつかの疾患とともに典型的に報告されている [36, 37]。抗生物質を用いて酪酸産生微生物を枯渇させた研究では、この種の腸内細菌叢の異常は、ペルオキシソーム増殖剤活性化受容体γ（PPAR-γ）の恒常性シグナル伝達経路の抑制を介して腸内細菌の増殖および炎症をサポートすることが明らかにされた[38]。PPAR-γの活性化は、マクロファージおよびT細胞集団を調節することによって、腸の炎症を防ぐことが示されている[39, 40]。抗生物質や食事療法を用いて腸内細菌叢の異常を誘発した多くの研究では、αおよびβ多様性の減少が粘膜炎症の増加や病原体および/または病原体活性の変化と関連している[41,42,43,44]。環境因子と宿主の協調的代謝戦略は、宿主-微生物叢の相互作用を促進し、腸の強毒性病原体の無害な乗客への移行を促進することができる[45]。本研究では、病原体チャレンジ前の高コバラミンレベルの腸内細菌叢への影響が、シアノコバラミン処理した感染マウスにおけるC. rodentiumコロニー形成の促進、生存率の低下、粘膜損傷の増大を説明する一助となった。

シアノコバラミン投与は、微生物叢全体の構造には微妙な影響を与えるが、盲腸と結腸のFirmicutes集団には明確な影響を与えることがわかった。C57BL/6Jマウスを用いた研究では、B12補給は健康な状態では微生物群構造に最小限の影響を与えるが、DSS誘発大腸炎処理後には影響を与えると結論付けている[46]。これらの条件下で、研究者は、1kgあたり200mgのシアノコバラミンでB12を補給した非SPFマウスにおいて、LachnospiraceaeファミリーとParabacteroidesが減少し、Enterobacteriaceae種が増加することを確認した[46]。この結果は、シアノコバラミンを投与したナイーブマウスでは、Firmicutes属の種の減少とParasutterella属の種の増加により、常にα多様性の減少を示したという我々の知見を支持するものである。C. rodentiumの添加により、C. rodentiumの量が増加し、Lachnospiraceaeの種が多くなることがわかった。シアノコバラミン投与により、SURVおよびEPC実験のいずれにおいても、Clostridia vadinBB60群、Lachnospiraceae NK4A136群、およびその他のLachnospiraceae属の種が一貫して減少した。微生物相への同様の変化は、腸に定着するサルモネラ菌の能力を高めることがわかった[47]。研究者たちは、Clostridia vadinBB60 と Lachnospiraceae NK4A136 グループ、および Ruminococcaceae のメンバーをより多く保有する gnotobiotic マウスが、サルモネラ挑戦に対するコロニー形成抵抗を強化したことを発見しました[47]。ヒトでは、Clostridia vadinBB60の高レベルは、Escherichia-Shigellaの低レベルとも関連している[48]。これらのファーミキューテス類と他の常在微生物間の相互作用は、Salmonella、Clostridium difficile、EHEC、Citrobacter感染における病原体のコロニー形成と発病に対する宿主の抵抗力に寄与することが示されてきた[49,50,51,52,53]。そこで、C. rodentiumの腸内常在菌群への統合に対するシアノコバラミンの影響をより理解するために、ナイーブマウスと感染マウスにおける腸内細菌叢の活性を調べた。

シアノコバラミン処理により、腸内メタトランススクリプトームで決定される腸内細菌叢の活性が変化し、一部の微生物でコバラミンの輸送と利用が変化している可能性が示唆された。クエン酸：ナトリウムシンポーターは、naïve_CNCbl40群よりもnaïve_CON群で発現が多く、GI管内の少数の病原性および常在菌にのみ存在し、クエン酸発酵に必要である[54]。興味深いことに、腸内常在菌であり日和見病原体であるEnterococcus faecalisによるクエン酸利用が増加すると、Galleria mellonella幼虫の病原挙動が改善された[54]。シアノコバラミン補給後、クエン酸：ナトリウムシンポーターの発現が低下したことから、常在菌によるクエン酸代謝が全体的に低下していることが示唆された。このことは、C. rodentiumのために多くのクエン酸を残し、ナイーブなマウスでは通常クエン酸代謝微生物によって満たされているニッチを開くことになる。腸内の様々なニッチに常在する微生物は、おそらく競争的排除によって病原体のコロニー形成に抵抗する宿主の能力に寄与しており [55]、クエン酸代謝の増強は微生物-微生物相互作用の良い兆候である可能性がある。ナイーブマウスにおけるリポポリサッカライド構築遺伝子の発現の増加は、Parasutterellaのようなグラム陰性微生物がシアノコバラミン補給によってより活発に、より多く存在することを意味する。これは、β-ケトアジピン酸経路のカテコール分岐の遺伝子の増加と一致し、以前にPseudomonas種で示されたようにB12のプロテオバクテリア分解に関連している可能性がある[56]。コエンザイムB12生合成」の増加は、コバラミン輸送に関わる遺伝子と関連しており、微生物がコバラミンが過剰に存在する場合にリサイクルする結果であった。一方、対照群では、「グラム陽性能力」に関連する遺伝子が、プトレシンの利用経路やカロテノイド経路とともに上昇した。これらの経路は、GIホメオスタシスの維持に役立つ大腸免疫や微生物相互作用と関連している[57,58,59,60]。シアノコバラミンの補給は、様々な酵素、転写調節因子、トランスポーターの変化を含む便性マイクロバイオームの明確な変化をもたらし、C. rodentiumのコロニー形成の促進を間接的に説明する可能性がある。一方、培養実験では、生理的なコバラミンレベルでは、C. rodentiumの増殖や病原性に直接的な影響は見られなかった。興味深いことに、C. rodentiumは対照マウスにおいて「ファミリー31グルコシダーゼ」の発現を増強していた。この特徴は、シアノコバラミン補給によるこの病原体の代謝の性質と病原性遺伝子発現の増加を説明するものであろう。実際、細菌のグルコース代謝と腸内のグルコースレベルを上昇させる宿主ニッチ適応は、病原体の病原性を制御し[33]、C. rodentiumの病原性を減弱させることが示されている[45]。さらに、B12は1,2-プロパンジオールの分解を通じてC. rodentiumの代謝に直接寄与すると考えられ、その経路の最初の酵素はB12依存性のプロパンジオールデヒドラターゼでプロピオン酸を生成する [61]．しかし、過剰なB12は、大腸で1,2-プロパンジオールを生産するB. thetaiotaomicronと培養しても、in vitroでのC. rodentiumの増殖と病原性にはほとんど影響を与えなかった[62]。このことから、B12の感染結果への影響は、C. rodentiumによるB12の直接利用ではなく、感染挑戦前に発生した常在細菌叢への全体的な影響である可能性が高いことが示唆される。例えば、Lachnospiraceaeに関連するフラジェリン・ドメインタンパク質の顕著な変化は、これらの微生物が運動する必要性が高くなったことを表しているのかもしれない。これは、フィブロネクチンタイプ3ドメイン含有タンパク質とセリン・スレオニントランスポーターに関連している可能性があり、これらはそれぞれ、細胞結合[63, 64]と同化反応[65]に重要であることが示されている。これは、シアノコバラミン補給と病原体への挑戦に反応して、Lachnospiraceae種やおそらく他のFirmicutes種の間でニッチ変位が起こっている兆候であると推測される。

上記のようなコバラミンによる微生物組成や活性の変化は、大腸におけるIL12/23p40サブユニットレベルの上昇に寄与していると思われる。サイトカインIL-12およびIL-23は、T細胞を介した制御において中心的な役割を果たし、治療標的としての使用は、宿主防御および炎症性疾患に対するそれらの重要性を強調している[66,67,68]。IL-12p40の活性化は、以前、Th1/Th17反応を制御することにより粘膜炎症の重要な制御因子である低酸素誘導性因子-1に起因するとされていた[69]。私たちの結果とは反対に、研究者たちはIL12p40がC. rodentiumに対して保護的であるという証拠を示している。しかし、彼らはIL-17の減少に注目しており、我々のマウスでは、ナイーブと感染シアノコバラミン補給群の両方でIL-17が上昇していた。これまでの研究で、微生物叢が腸内のTh17反応に影響を与えること[70]、そしてこの腸内炎症が病原体のコロニー形成を促進することが示されている[71]。実際、クラス1制限T細胞関連分子遺伝子のノックアウトによる我々のコントロールマウスと同様の微生物変化を伴う研究は、Th17反応の低下とサルモネラ菌のコロニー形成の減少に関連していた[47]。IL-17はC. rodentium感染防御に重要な役割を果たすが[72]，感染前の大腸組織におけるIL-17およびIL-12/23p40レベルの上昇は免疫調節異常の兆候であり，これがコロニー形成を大きくしていることを見いだした．感染後、シアノコバラミンを補充したマウスの大腸では、IFNγとIL-17Aのレベルがより高いことを見出した。マウスの盲腸では、BacteroidetesとVerrucomicrobiaceaeに支配された微生物叢が存在し、他の細菌とともに、あるいは他の細菌と一緒に粘膜免疫をプライミングして、サルモネラのコロニー形成から守るのに役立つ免疫表現型が以前特徴づけられた[50]。腸管組織におけるIFNγおよびIL-17Aの産生の増強は、サルモネラのコロニー形成の抑制と関連していた。一方、我々の研究では、C. rodentiumのコロニー形成が増加すると、IL-17AおよびIL-12/23p40が増加するがIFNγには変化がなかった。興味深いことに、異なる常在大腸菌株は、IFNγ、IL-17A、およびGM-CSF産生の変化と関連している[73]。しかし、本研究のマウスは大腸菌を使用しておらず、これがIFNγ産生の増加を見なかった理由かもしれない。無菌マウスとSURV実験マウスでは、EPC実験マウスで観察されたようなB12補充によるIL-12/23p40タンパク質レベルの増強は観察されなかった。このことから、シアノコバラミンによる効果は腸内細菌叢を介したものであることがさらに示唆された。最後に、従来のC57BL/6Jマウスにシアノコバラミンとメチルコバラミンを30および120μg/dayで補充したところ、大腸のIL-12/23p40レベルが同様に増加した。これらの結果を総合すると、B12が誘発するディスバイオーシスは、B12の形態にかかわらず、またマウスの30μg/日という典型的なヒト等量（5000μg錠1個）で結腸のIL-12/23p40レベルを駆動することが示唆される。今後の研究では、より低い用量を用いて、微生物叢、特にLachnospiraceae集団の活動を変えるのに必要な腸内のB12の閾値濃度と、これらの変化が腸管に沿ったIL-12p40サイトカイン産生に特に焦点を当てた腸内の微生物-宿主相互作用に与える影響を明らかにする必要がある。

結論
本研究では、腸内の過剰なB12濃度がC. rodentiumのコロニー形成と病原性を促進するディスバイオーシスをマウスに誘発することを明らかにした。B12による腸内細菌叢の変化は、Clostridia vadinBB60およびLachnospiraceae NK4A136に属する細菌が減少し、Parasutterellaが盲腸および大腸で増加することによって特徴づけられる。B12補給による腸内細菌叢の変化は、大腸のIL-12/23p40サブユニットとIL-17Aサイトカインの産生を刺激し、病原体チャレンジ前の明らかな組織損傷なしにC. rodentiumコロニー化のための腸管ニッチを開放した。一般に、経口B12補給は、コバラミン型に関係なく、低悪性度炎症と病原性C. rodentium集団を促進するディスバイオーシスに寄与することができる。B12が飽和した腸内環境は、微生物叢の変化を通じて、グルコース酵素活性の低下と病原性遺伝子発現の増加によって決定されるように、C. rodentiumの代謝を無害から病原性へとシフトさせる。

データおよび資料の利用可能性
本研究で作成または解析されたすべてのデータは、この発表論文（および補足情報ファイル）に含まれているか、NCBI SRAリポジトリ、BioProject.で入手可能である。PRJNA791318に掲載されている。

略語
CON:
コントロール

CNCbl10:
10μg/mlのシアノコバラミン

CNCbl40:
40μg/mlのシアノコバラミン

MeCbl10:
10μg/mlのメチルコバラミン

MeCbl40:
40μg/mlのメチルコバラミン

EHEC:
腸管出血性大腸菌

SURV:
生存率実験

EPC
初期病原体コロニー形成実験

PBS:
リン酸緩衝生理食塩水

SAMSA2:
配列解析によるメタトランススクリプトームの簡易アノテーション2.0

SCFA:
短鎖脂肪酸

INFγ:
インターフェロンγ

IL:
インターロイキン

KC
ケラチノサイト由来ケモカイン

TNFα:
腫瘍壊死因子（Tumor necrosis factor）α

GM-CSF：顆粒球マクロファージコロニー刺激因子
顆粒球マクロファージコロニー刺激因子

MMP9：マトリックスメタロプロテアーゼ
マトリックスメタロプロテアーゼ-9

RANTES：ランテス
正常T細胞の活性化に伴い発現・分泌される制御因子

IP10
インターフェロンガンマ誘導タンパク質-10

MCP1:
単球走化性タンパク質-1

MIP
マクロファージ炎症性タンパク質

ASV:
アンプリコンシークエンスバリアント

BHI：Brain heart infusion:
Brain heart infusion（脳心筋梗塞）。

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参考文献のダウンロード

謝辞
動物およびサンプル収集に協力していただいたNicole Coursen、およびMeso Scale Discovery技術に関する専門知識と協力をいただいたアルバータ大学のKuni SuzukiとMacauley Labに追加で感謝します。

資金提供
このプロジェクトは、AFに授与されたビタミン研究費と、アルバータ大学から大学院生とポスドクの研究に対して提供された資金によって行われたものである。BWはCanada Research Chairs Programの支援を受けている。

著者情報
著者および所属
アルバータ大学農業・食品・栄養科学学部、アルバータ州エドモントン、T6G 2P5、カナダ

Andrew J. Forgie, Deanna M. Pepin, Tingting Ju, Stephanie Tollenaar & Benjamin P. Willing（アンドリュー・フォージー、ディアナ・マイ・ぺピン、ティンティン・ジュー、ステファニー・トレナー、ベンジャミン・P・ウィリング

イースタン・オンタリオ小児病院（CHEO）解剖病理学部門（カナダ、オンタリオ州オタワ市

コンソラート・M・セルジ

カナダ、ケベック州モントリオール、マギル大学医学部および健康科学部

Samantha Gruenheid

貢献度
AF、DP、SG、BWが本研究を構想した。AFとDPはそれぞれEPCとSURVの実験を行った。CSは腸管組織の病理学的スコアリングを管理した。TJとSTは動物実験に協力した。AFは原稿を執筆し、図表を作成した。著者らは最終原稿を読み、承認した。

共著者
Benjamin P. Willingに連絡する。

倫理に関する宣言
倫理的承認と参加への同意
すべての動物実験は、Canadian Council on Animal Care の定めるガイドラインに従って実施し、アルバータ大学（カナダ、AB州エドモントン）の動物管理・使用委員会の承認を得た。

論文発表の同意
該当なし

利害関係
著者らは、競合する利害関係を有しないことを宣言する。

追加情報
出版社からのコメント
Springer Natureは、出版された地図の管轄権の主張および所属機関に関して、中立的な立場をとっています。

補足情報
追加ファイル1: 補足図S1.
SURV実験とEPC実験のナイーブC3H/HeOuJマウス間の微生物群集のDESeq2差分発現解析。図S2. SURV実験のナイーブC3H/HeOuJマウスのCecal SCFAプロファイル。図S3. C3H/HeOuJマウスのセカルメタトランススクリプトミクスによって決定された活性微生物群集のDESeq2差次発現解析。図S4. EPC実験のナイーブC3H/HeOuJマウスにおける炎症バイオマーカー（n = 8）。図S5. EPC実験のC. rodentiumチャレンジドC3H/HeOuJにおける炎症バイオマーカー（n = 8）。図S6. C3H/HeOuJマウスの結腸組織と微生物叢の免疫プロファイルの有意な変化のスピアマンの相関。補足表:表S1. リアルタイムqRT-PCRプライマーリスト。表S2. 微生物群集のβダイバーシティ解析の概要。

追加ファイル2.
微生物群集のR解析。

追加ファイル3.
Microbiota Deseq2 結果。

追加ファイル4.
Cecal metatranscriptomics Deseq2 Results.

権利と許可
オープンアクセスこの記事は、クリエイティブ・コモンズ表示 4.0 国際ライセンスの下に提供されています。このライセンスは、原著者と出典に適切なクレジットを与え、クリエイティブ・コモンズ・ライセンスへのリンクを提供し、変更があった場合にそれを示す限り、いかなる媒体または形式においても使用、共有、適応、配布、複製を許可するものです。この記事に掲載されている画像やその他の第三者の素材は、素材へのクレジット表示で別段の指示がない限り、記事のクリエイティブ・コモンズ・ライセンスに含まれます。もし素材が記事のクリエイティブ・コモンズ・ライセンスに含まれておらず、あなたの意図する利用が法的規制によって許可されていない場合、あるいは許可された利用を超える場合には、著作権者から直接許諾を得る必要があります。このライセンスのコピーを見るには、http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/。クリエイティブ・コモンズ・パブリック・ドメインの献呈放棄（http://creativecommons.org/publicdomain/zero/1.0/）は、データへのクレジットラインに特に記載がない限り、この記事で利用可能になったデータに適用されます。

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この記事の引用
Forgie, A.J., Pepin, D.M., Ju, T. et al. ビタミンB12の過剰補給は腸内の微生物-宿主相互作用を変化させ、マウスのCitrobacter rodentiumコロニー形成および病原性の加速につながる。Microbiome 11, 21 (2023)。https://doi.org/10.1186/s40168-023-01461-w。

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受付終了
2022年5月20日

受理済
2023年1月04日

公開
2023年2月3日

DOI
https://doi.org/10.1186/s40168-023-01461-w

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キーワード
コバラミン
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微生物叢
健康
消化管
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ISSN: 2049-2618

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