早産はゼノバイオティクスと関連し、膣内メタボロームで予測される

哉百名


早産はゼノバイオティクスと関連し、膣内メタボロームで予測される

https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC9894755/


ウィリアム・F・キンシュウ、フェデリコ・バルディーニ、[...]、タル・コレム
追加記事情報
関連データ
補足資料
データの利用可能性に関する声明
アブストラクト
自然早産（sPTB）は、母体および新生児の罹患率と死亡率の主要な原因であるが、その予防や早期リスク層別化は限られている。これまでの調査で、膣内の微生物や代謝物がsPTBに関与している可能性が示唆されています。ここでは、早産で終了した妊娠の80例から採取した妊娠第2期の膣サンプル232個を対象に、アンターゲットメタボロミクスを実施しました。膣内代謝物とその後の早産との間に複数の関連性を見出し、ジエタノールアミンやエチルグルコシドなど、これらの代謝物のいくつかは外因性であることを提案する。また、16SリボソームRNAアンプリコンシークエンスで得られたマイクロバイオームプロファイルとメタボロームの間に関連性が認められ、Gardnerella vaginalisなどの最適でないと考えられる細菌と、チラミンなどの早産で豊富になる代謝物の間に相関があることがわかりました。私たちは、代謝モデルを用いてこれらの関連性を調査しています。機械学習モデルを用いて、出産の数週間から数ヶ月前の代謝物レベルからsPTBリスクを予測したところ、良好な精度（受信者動作特性曲線下面積0.78）を得た。2つの外部コホートを用いて検証したこれらのモデルは、微生物ベースおよび母親の共変量ベースのモデルよりも正確である（受信者動作特性曲線下面積0.55-0.59）。本結果は、sPTBの早期バイオマーカーとしての膣内代謝物の可能性を示すとともに、未熟児の潜在的なリスク因子としての外因性曝露を浮き彫りにするものである。
主題用語 マイクロバイオーム、メタボロミクス、機械学習、疾患、危険因子
メイン
妊娠37週未満の出産である早産（PTB）は、新生児死亡の主な原因であり、生涯にわたって様々な病気を引き起こす可能性があります1,2。また、PTBには顕著な人種間格差があり、黒人女性におけるPTB率がかなり高いことが明らかになっています3。この格差は、制度的・環境的な人種差別による持続的なストレスや、妊産婦ケアへのアクセス不足など、さまざまな要因によって引き起こされています4。医学的に誘発されないPTBである自然早産（sPTB）は、PTB全体の3分の2を占めている1。広範な努力にもかかわらず、PTBの早期予測、予防または治療のための方法は欠如しており1,5,6、その有病率は依然として高い1。
ヒトのマイクロバイオームは、多くの複雑な疾患の強力なバイオマーカーである7-11。特に膣内細菌叢は、sPTBやその他の有害な妊娠転帰と繰り返し関連しています12-17。しかし、膣マイクロバイオームと妊娠悪阻の関係については明確なコンセンサスが得られておらず18、妊娠悪阻における宿主とマイクロバイオームの潜在的な相互作用の基礎となる特定のメカニズムに関する知識も不足している。
マイクロバイオームが産生または修飾する代謝物は、宿主に局所的および全身的な影響を及ぼす可能性のある顕著な要因として浮上している19-22。その研究は、生態系に存在する何千もの低分子を測定できるメタボロームによって促進され、マイクロバイオームとメタボロームのペア研究によって、さまざまな病態における宿主とマイクロバイオームの相互作用に関するメカニズム的な洞察を得ることができるようになりました23,24。膣のメタボロームに関するいくつかの研究では、マイクロバイオーム、炎症、PTBとの関連性が報告されています25,26。しかし、未熟児やその他の妊娠転帰における膣の生態系の役割についての理解を深めるためには、sPTBのリスクが高い人口集団を対象とし、幅広い代謝物の測定を行い、sPTBの強固な予測モデルを作成する研究が依然として必要である。
ここでは、16SリボソームRNA遺伝子アンプリコンシーケンス14を用いて微生物叢の特性を以前に明らかにした232人の妊婦の第2期膣内メタボロームを測定した。我々は、膣メタボロームがコミュニティステートタイプ（CST）に部分的に対応することを示し、妊娠中期に測定した代謝物とその後のsPTBとの関連を明らかにし、これらの代謝物の一部は外因性であることを提案する。最後に、膣メタボロームを用いて、分娩の平均3ヶ月前にその後のsPTBを予測する機械学習アルゴリズムを考案し、2つの外部コホートで検証した。この結果は、未熟児の潜在的な原因を研究し、早期のリスク層別化を行うための有望なアプローチであり、sPTBの危険因子として環境暴露を研究する必要性を強調するものである。
研究成果
妊娠コホートからの膣内細菌叢とメタボローム
我々は、同じタイムポイントから微生物相が以前に特徴付けられた単胎妊娠の女性から妊娠20週から24週の間に収集された232の膣サンプルを質量分析を用いてプロファイル化した14（補足表1および方法）。その後のsPTBと利用可能なサンプル（N = 80）を持つすべての女性、および同様の期産対照（TB；N = 152）を対象とした（表（Table1）.1）。予想通り、PTB歴はsPTBと関連していた（フィッシャーの正確なP = 3 × 10-4）。
表（Table）1
コホート特性
635種類の同定代謝物と、110種類の無名スペクトル特徴を定量化した（Methods）。代謝物は、アミノ酸、脂質、ヌクレオチド、炭水化物、ゼノバイオティクスなど、多様な生化学的クラスに属していました。ほとんどの代謝物（549）はコホートの50%以上で測定され、108の代謝物はすべてのサンプルで存在した（Extended Data Fig. Fig.1;1；サンプルのバッチ処理については、Supplementary Note 1およびExtended Data Fig. Fig.2).2)を参照してください。同様の測定結果は、独立した認定医療機関27による測定結果と優れた一致を示すことを以前に示している。
エクステンデッドデータFig.1
測定した代謝物の有病率と超経路
拡張データ Fig.2
メタボロミクスバッチ効果に対する解析の頑健性。
膣メタボロームはCST構造を部分的に保存している
膣マイクロバイオームは、明確に定義されたCSTsにクラスタリングされる28。我々は、このコホート14について同様のことを証明し（順列多変量分散分析（PERMANOVA）P < 0.001; Fig. Fig.1a),1a）、膣のメタボロームがこの構造を再現しているかどうかを調査した。メタボロームはCSTによって分離され（P < 0.001; 図1b）,1b）、既述のように一般的にマイクロバイオームと関連していた（Mantel P < 0.001）29. しかし、特定のCSTはそれほど分離していなかった。CST-I（ラクトバチルス・クリスパタスが優勢）とCST-IV（多様な嫌気性菌が豊富）のマイクロバイオームを持つ女性のメタボロームは、他のコホートからよく分離されていたが（PERMANOVA P＜0. 001 for both）、CST IV-AとIV-B、CST-II（Lactobacillus gasseriが優勢）とCST-III（Lactobacillus inersが優勢）の女性のメタボロームは互いにあまり離れていなかった（それぞれP = 0.158 と P = 0.155）。全体として、これらの結果は、膣マイクロバイオームとメタボロームの間に強い対応関係があるが、不完全であることを示すものである。
図1
膣内メタボロームクラスターはPTBと関連している。
sPTBと関連するメタボロームクラスター
次に、メタボロームの de novo k-medoids クラスタリングを行ったところ、6つの「代謝物クラスター」（MC A-F; Methods, Fig. Fig.1c,1c, Extended Data Fig. Fig.33、補足表2）、これらは膣内細菌叢からCSTへの分離ほどには分離していない。各MC内で最も濃縮された代謝物サブパスウェイは、MC A-Fではそれぞれポリアミン代謝、ジペプチド、ジカルボキシル化脂肪酸、グルタミン酸代謝、トリカルボン酸サイクル、ジペプチドでした（いずれもフィッシャーの正確なP < 0.05）。アミノ酸関連代謝物はMC A,B,Dで同様に濃縮され（P < 0.01, q < 0.1 for all）、ゼノバイオティクスはMC-Cで濃縮された（Fisherの正確なP = 0.005, q < 0.1）．MC-A〜Dはほとんどが乳酸菌主体のCSTと対になっているが（54〜93％）、MC-FはすべてCST-IVで構成され、MC-Eは均等に分かれている（50％CST-IV：図1d1dおよび拡張データ図4a）。逆に、MCでは様々なCSTの濃縮が見られた（Extended Data Fig.4b4b）。
エクステンデッドデータFig.3
代謝物クラスターの特徴
拡張データFig.4
代謝物クラスターはCSTに対応している。
このコホートにおけるグローバルマイクロバイオームシグネチャーと自称人種との強い関連（PERMANOVA P < 0.001; 拡張データ図.4c）,4c）と同様に、黒人女性と白人女性の代謝物には有意差が見られた（P < 0.001; 拡張データ図.4d）.4d）。しかし、これらのサブグループ間では、MCへの割り当てに軽度の差異しか認められませんでした（図（Fig.1e）.1e）。興味深いことに、CSTはsPTBと弱い関連しかなく、白人女性においてのみであるが（フィッシャーの正確なP = 0.047, q = 0.21; Fig. Fig.1f1f および Extended Data Fig. Fig.4e;4e；以前の解析14と同様）、黒人女性では、いくつかのMCがsPTBと有意に関連していることがわかった（MC A、B、Dについて、それぞれP = 0.047, P = 0.025, P = 0.006; q < 0.1 for all; Fig. Fig.1g1gおよびExtended Data Fig. Fig.4f）.4f）。しかし、早期PTB（32週未満；qはすべて0.1、Extended Data Fig.4g）.4g）との有意な関連は観察されなかった。これらを総合すると、本コホートのメタボローム構造は、マイクロバイオーム構造よりも黒人女性の未熟児との関連をよく捉えていることが示された。
複数の代謝物がsPTBと関連する
次に、sPTBと特定の代謝物との関連について検討した。その結果、sPTBと有意に関連する4つの代謝物が見つかりました（Mann-Whitney P < 0.05, q < 0.1; Fig. Fig.2a2a およびExtended Data Fig. Fig.5a).5a)。このうち、β-グルコピラノシドエチル（ethyl glucoside; P = 1.9 × 10-4, q = 0.065）； 酒石酸塩（P = 4.8 × 10-4, q = 0.078）； エタノールアミン（DEA；P < 10-10, q = 5 × 10-8）の3つがsPTBで高く、外因性のものと考えられる30～36．代謝物の起源を予測する手法であるAMON37（Methods）を用いてこれを確認したところ、DEAと酒石酸塩は異種生物由来であると予測された（エチルグルコシドについては予測できなかった；Supplementary Table 3）。注目すべきは、DEAは、sPTBが濃縮されていることがわかったMC-A（P = 0.006, q = 0.014）およびMC-D（P = 0.04, q = 0.07）とも関連していることです（図（図1g）1g)。外因性の可能性が高いにもかかわらず、これらの代謝物はこのコホートの95%以上で検出されました（Extended Data Fig.図5b5b）。
図2
膣内代謝物はその後の早産と関連する。
エクステンデッドデータFig.5
sPTBで変化した代謝産物。
さらに、後続のsPTBを有する女性では、コリンレベルが低いことがわかった（P = 5.5 × 10-4, q = 0.078; Fig.2a, b）。コリンは必須栄養素であり38、未熟児の臍帯血でコリンの濃度が低いことが以前に判明している39。また、コリンはベタイン40の前駆体であり、sPTBとも負の相関を示した浸透圧調節物質である（P = 0.007, q = 0.29; Fig. Fig.2b）.2b). DEAはコリン代謝を阻害することが知られており41、マウスに経皮投与すると肝コリンが枯渇する42,43。したがって、sPTBにおけるDEAの高濃度は、コリンおよびベタイン濃度の低下とも関連している可能性があることを提案する（図2b、c）。DEAはさらに、マウスで発がん性44と催奇形性42があることが示された。しかし、今回のメタボローム解析は相対的なものであるため、過去の研究で測定されたレベルとの定量的な比較はできない。これらの結果は、未熟児におけるいくつかの代謝物の潜在的な役割を明らかにするものであり、そのうちのいくつかは環境暴露から外来的に生じる可能性があります。
代謝物の関連は、人種およびsPTBタイミングと相互作用する
黒人女性と白人女性ではメタボロームが異なるため、人種で層別化した上で同様の関連解析を実施した。興味深いことに、sPTBと負の相関を持つ代謝物が5つ追加で検出された（Mann-Whitney P < 0.05, q < 0.1; Fig. Fig.2a2a and Extended Data Fig. Fig.5a).5a)。黒人女性では、これらは、子癇前症45で変化することが以前に報告されたグリセロホスホセリン（P = 3 × 10-5, q = 0.014）、早産児の血液で増加することが以前に示されたスペルミン（P = 3.5 × 10-4, q = 0.07）46 、ヒドロキシブチルカルニチン（P = 2. 6 × 10-4, q = 0.065）、低出生体重の満期新生児47の血液中で減少していることが示されているケトカルニチン、およびグルタミン酸γ-メチルエステル（P = 4.9 × 10-4, q = 0.078）．生体アミンの一つであるチラミンは、早産した白人女性のサンプルで有意に低かった（P = 2.8 × 10-4, q = 0.065; Fig.Fig.2a）.2a）. チラミンは、マウスの子宮叢のシナプス小胞と共局在することが示され、子宮収縮における役割の可能性を強調している48。これらの結果から、膣内の代謝物、他の臓器の代謝物レベル、およびsPTBに関連する可能性があることが明らかになりました。
このコホートでは、数名の参加者（N = 13、黒人女性ではN = 11）がサンプル採取前または採取間近（妊娠18-23週）に膣内プロゲステロンの投与を受けていたため、膣内プロゲステロンの投与を受けていない女性でのみ同様の解析を実施した。1つの関連、黒人女性におけるグルタミン酸γ-メチルエステルと結核の間（図（2a）2a）は、もはや多重仮説検定の補正を通過しなかった（P = 0.002, q = 0.12; Extended Data図（5c）5c). しかし、黒人女性の結核と関連する代謝物をさらに7つ発見した（すべてP < 0.05; q < 0.1; Extended Data Fig.5c).5c)。これらには、コラーゲン49のアミノ酸残基の約4分の1を占め、細胞外マトリックスに不可欠なプロリン（P = 6 × 10-4, q = 0.08）、胎盤血管新生50に重要なポリアミンであるスペルミンは、その後のsPTBで黒人女性で低かった（P = 4 × 10-4, q = 0.08）およびベタイン（P = 9 × 10-4, q = 0.091）。プロリンから生成され、スペルミンなどのポリアミンの合成に必要なN-アセチルアルギニン（P = 0.0015, q = 0.102）も、sPTB後の黒人女性で低くなっていました。胎盤の血管新生の障害と細胞外マトリックスのリモデリングは、いずれもsPTBと関連している51。
早期の早産は、より悪い転帰と関連している1。そこで、次に、膣内代謝物とその後の超早産および極早産（出生時の妊娠年齢がそれぞれ32週未満および28週未満）との関連性を調査した。この解析は、超早産と極早産の割合が高い黒人女性に限定しました（それぞれ26人中21人、15人中14人）。これらの早期sPTBにのみ関連する13の代謝物を同定した（P < 0.05, q < 0.1; Fig. Fig.2d）.2d）．リン脂質であるパルミトイルスフィンゴミエリンとパルミトイルジヒドロスフィンゴミエリンは、いずれも極めてPTBと負の相関を示した（それぞれP = 8.7 × 10-4, q = 0.061 および P = 0.0011, q = 0.069 ）。シトラコン酸も同様にPTBと負の相関があり（P = 0.0014, q = 0.075）、以前に重症子癇前症の女性の胎盤ミトコンドリアにおける濃度が低いことが判明している52。また、大腸菌などの尿路病原体との関連が指摘されているマンノース（P = 4 × 10-4, q = 0.052）、細菌性膣炎（BV）との関連が指摘されているアラビノース（P = 9 × 10-4, q = 0.061）54 およびPTBとの関連が指摘されているマンニトール・ソルビトール（P = 1.7 × 10-4, q = 0.022 ）55などの糖・糖アルコール代謝産物が早期PTBで高いことが明らかになった。エチレンジアミン四酢酸（EDTA）は、外因性である可能性が高い56-58の追加異種生物であり、AMON（方法および補足表3）でも確認されたが、極めてPTBおよび非常にPTBで増加した（それぞれP = 8×10-4, q = 0.061 およびP = 1.6×10-4, q = 0.044）．EDTAは膣上皮細胞で細胞毒性があることが示されており59、ラットでは非水毒性用量で催奇形性がある57,60。EDTAはこのコホートの女性の100%から検出され（拡張データ図5b）、これはサンプル収集バッファに含まれていることから予想されることですが、このことがこれらの関連性を説明することはないでしょう。全体として、sPTBとの代謝物の関連は、人種とsPTBのタイミングの両方と相互作用することがわかり、さらにsPTBに関連する異種物質を検出した。
sPTBとの関連性が高い機能性代謝物セット
次に、特定の代謝物の変化が小さくても、代謝物の機能グループ（例えば、Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes（KEGG）パスウェイ61；補足表4）がsPTBとの関連で富んでいるかどうかを確認した（Methods）。我々は、プロリンとN-アセチルアルギニンに関する我々の知見（Extended Data Fig.5d),5c)と一致して、プロリンとアルギニン代謝に有意な濃縮を認めた（P = 0.0018, q = 0.058; Extended Data Fig.Fig.5d)5d）．さらに、白人女性におけるチラミンと結核の関連性（図（2a）,2a）と再び一致するが、白人女性において内分泌系に関連する代謝物の濃縮を認めた（P = 0.0045, q = 0.077; Extended Data Fig.5d）.5d）．さらに、黒人女性における初期のsPTBとの関連に富んでいる脂質代謝関連代謝物を同定した（非常にPTBと非常にPTBではそれぞれP = 0.0019, q = 0.032, P = 0.0047, q = 0.038；Extended Data Fig. Fig.5d),5d)、PTB62で報告された他の脂質代謝の変化と関連する可能性がある。注目すべきは、黒人女性におけるsPTBに関連するゼノバイオティクスのグローバルな濃縮（P = 0.006, q = 0.054; Extended Data Fig.5d）,5d）を確認し、特定の代謝物に関する我々の発見と一致した（図（図22））。
sPTBにおける微生物と代謝物の関連性ネットワーク
次に、推定された微生物種の絶対量とsPTB関連代謝物との相関を調べた（Methods）。その結果、代謝物とsPTBとの関連とは逆に、微生物と代謝物の関連と人種およびsPTB時期との間に弱い相互作用が見出された（補足注2）。この結果は、Dialister種やEnterococcus faecalisとチラミン63,64のような既知の複数の関連性を再現している（Spearman ρ > 0.54, P < 10-10, q < 0.1 for all; Fig. Fig.3a3aおよびExtended Data Fig. Fig.6a),6a）、G. vaginalis65とCorynebacterium aurimucosum66におけるコリン代謝の証拠（それぞれρ = 0.34, P < 10-6, q = 1.7 × 10-5 およびρ = 0.40, P = 4 × 10-4, q = 0.006, ）と同じである。さらに、より高いチラミン濃度は、以前にBV67で発見され、我々が発見したBV関連微生物との関連を支持している（図（Fig.3a3a））。
図.3
微生物-代謝物相関と代謝モデルから、sPTB関連代謝物の供給源が示唆された。
拡張データ Fig.6
PTB関連代謝物との微生物相関のネットワーク。
sPTBに正に関連するゼノバイオティクスは、膣内微生物との相関が、他の代謝物について観察された相関よりも有意に弱いことに注目する（Mann-Whitney P = 0.024）．例えばDEAは、すべての膣内微生物と弱い相関しか示さない（ρ < 0.23, q > 0.1 for all microbes）。この観察結果は、これらの代謝物の外因性供給源をさらに支持するものである。
我々は、白人女性の結核で高かったチラミン（35の関連、スピアマン0.27＜ρ＜0.73；図3a）、3a）について最も強く、最も多くの相関を発見した（図（図2a）、2a）。また、35種のチラミン関連微生物のうち8種は、全女性の結核で濃縮されていたコリンとも相関している（図(2a).2a）。興味深いことに、Atopobium vaginae、G. vaginalis、いくつかのPrevotella種、BV-associated bacteria（BVAB）など、TB関連代謝物と正の相関を持つ種の多くは、BV68、PTB13-15,17、その他の妊娠69および新生児70の有害転帰といった負の転帰と関連していると以前に報告されていた。我々は、BV71や早産新生児の晩期敗血症72と以前から関連するStaphylococcus epidermidisと酒石酸およびエチルグルコシドとの間に同様に逆説的な負の相関を見出した（ρ = -0.28, P = 6.9 × 10-4, q = 0.009 およびρ = -0.26, P = 0.0015, q = 0.016, それぞれ; Figure. Fig.3a),3a)のように、sPTBと正の相関があった。したがって、これらの関連性の多くが知られていたとしても、今回の結果は、最適でない膣内微生物、sPTB関連代謝物、健康アウトカム間の複雑な相互作用も示唆しています。
代謝モデルがマイクロバイオームによるチラミン産生を支持する
私たちが発見した相関関係に対するメカニズム的な洞察を得るために、遺伝的および生化学的知識を統合して各微生物試料（コミュニティ純最大生産能力73（NMPC）；方法）の代謝出力を予測するコミュニティレベル代謝モデル73を使用しました。我々のモデルは、プトレシンやヒスタミンなど、膣マイクロバイオームによって生産されることが知られているいくつかの代謝物について正確な予測を示した（NMPCとメタボローム測定値の間のスピアマンρ = 0.64、N = 214、P < 10-10 およびρ = 0.54 、N = 167、P < 10-10, それぞれ； Extended Data Fig.7a, b）。
拡張データ図7
代謝モデルによるプトレシン、ヒスタミン、チラミンの正確な予測。
sPTBに関連する2つの代謝物、チラミンとコリンは、我々のモデルで表現されました。コリンは膣内微生物の影響を受けない（すべての女性でNMPCが0）とモデルで予測されたため、先行研究で膣内微生物によって生成されることが示唆されているチラミンに注目しました63,74。ゲノムキュレーション（Methods）後、我々のモデルの予測は非常に正確だった（Spearman ρ = 0.62, N = 229, P < 10-10; Extended Data Fig.7c）.7c ）。興味深いことに、白人女性では、測定されたチラミンのレベルが結核で濃縮されているのに対し（Mann-Whitney P = 2.8 × 10-4; 図3b）、予測されたマイクロバイオームの出力はそうではなく、sPTBでやや高くなった（P = 0.26; 図3c）3c）ことさえ分かった。） これは、早産した白人女性におけるチラミン予測の精度が低いことに起因する（Spearman ρ = 0.19 対 ρ = 0.65, ρの差はP = 0.02; Fig. Fig.3d3d）。
この精度の差は、代謝モデルにおける微生物の表現では説明できず、黒人女性では実際に低く（Mann-Whitney P = 0.05, Extended Data Fig.7d),7d） 、おそらくこの集団では一般的に膣内の微生物の多様性が高いためと考えられる75。さらに、チラミン予測精度は、代謝物の取り込みに関する制約や、低存在量の分類群の表現に敏感ではなかった（方法、補足表5および拡張データ図7e）.7e）。これらの分析から、sPTB白人女性におけるチラミン予測精度の低さは、モデリングのアーティファクトの結果ではないことが示唆されるため、精度の違いは、菌株、機能的能力、または非微生物的効果の違いに起因している可能性があります。また、いずれかの現象は、前述のチラミンと微生物の逆説的な関連性を説明する可能性がある（図（Fig.3a）.3a）。微生物の違いまたは宿主の効果の可能性は、チラミンが微生物由来か宿主由来かを予測するAMON37によっても支持されています（補足表3）。全体として、今回の結果は、微生物とメタボロームの相互作用を研究する上での代謝モデルの有用性を示すとともに、さらなる研究のための興味深い仮説を提起するものである。
膣メタボロームによるsPTBリスクの早期予測
未熟児リスクの高い妊娠を早期に診断することは、予防・介入戦略の開発にとって極めて重要である。そこで、出産3ヶ月前（平均14.5±4.2週）に収集した臨床データ、マイクロバイオームデータ、メタボロームデータを用いて、その後のsPTBを予測できるかどうかを検討しました。我々はブースト決定木を使用したが、これは代替モデルよりも優れていた（Extended Data Fig.図8a）.8a）。微生物とメタボロームベースのモデルについては、白人女性と黒人女性に別々のモデルを使用するように、複合予測因子を訓練した。各モデルの有効サンプルサイズが小さくなるにもかかわらず、この方が性能が向上した（拡張データ図8b）.8b）。テストデータを漏らさず、ネステッドクロスバリデーションを用いて、保留したサンプルで全モデルを評価した（Methods）。
拡張データ Fig.8
sPTBに対する予測モデルの性能と特徴。
臨床データ（年齢、肥満度（BMI）、人種、PTB歴、不妊症）と微生物量データを用いた我々のモデルは、限られた精度しか得られなかった（臨床データの受信者動作特性曲線下面積（auROC）0.59、精度-再現曲線下面積（auPR）0.46、微生物群データのauROC＝0.55、auPR＝0.41、モデル間の差はP＝0.12）；メソッズと図4a、b。注目すべきは、メタボロームデータを使用することで、優れた精度のモデルを生成できたことです（auROC=0.78、auPR=0.61、臨床またはマイクロバイオームモデルとの比較でP < 10-10、方法および図4a、b). 最後に、臨床データ、マイクロバイオームデータ、メタボロームデータを組み合わせたモデルは、メタボロームベースモデルと同様の精度（auROC = 0.76, auPR = 0.62, P = 0.44 対 metabolome-based model; Extended Data Fig.8c,d） が得られ、代謝物がモデルへの貢献度が最も高かった（Extended Data Fig.8e）.8j）. このことから、代謝物測定は、sPTBに関してこれら3つのデータタイプに含まれる情報を十分に表現していることがわかります。
図4
メタボロームベースの後続sPTBの予測。
我々のメタボロームベースのモデルは、羊水メタボローム（auROC 0.65-0.70, N = 24）（文献76）、母親血清メタボロームと臨床データ（auROC 0.73, N = 164）（文献77）、母親尿と血漿メタボローム（auROC 0.69-0.79, N = 146）等の既発表モデルより精度で優れているか同様である。 69-0.79, N = 146）（文献78）、血中無細胞RNA測定（auROC 0.81, N = 38）（文献79）または膣タンパク質バイオマーカー（auROC 0.86, N = 150, sPTB N = 11）（文献80）、多くはサンプルサイズが小さい、人口動態の多様性がない、ハイリスクコホートに焦点を当てているものでした。全体として、今回の結果は、sPTBの早期かつ正確なバイオマーカーとしての膣内代謝物の有望な有用性を示しています。
次に、同じモデルを再トレーニングすることなく、同じ保持データ（つまり、結果の真実の分類のみが変更された）から、黒人女性の極めてPTBと非常にPTBを予測するために評価しました。興味深いことに、メタボロームベースのモデルは精度がわずかに低下した（黒人女性のsPTBのauROC 0.77に対し、極めてPTBはauROC 0.69と0.73、それぞれP = 4.3×10-4 とP = 0.001; Extended Data Fig. Fig.8f）,8f）、微生物ベースのモデルは、精度の向上を示した（auROC 0.55に対し、auROC 0.69、0.62、それぞれP = 0.031, P = 0.49；Extended Data Fig. Fig.8g).8g)。これらの結果は、早期のsPTBにおいて膣内細菌叢の関与が高まる可能性があることを反映していると考えられる1。
外部コホートにおけるメタボロームベースの予測因子の再現性
メタボロームベースのモデルの一般化可能性を検証するため、2つの独立したコホートでその精度を検証した（Methods）：妊娠24-28週にサンプルを収集した、PTBリスクの高い女性20人（PTB10人）、ほとんどが（75%）白人（Ghartey、2015）（文献）（文献）。81）、および早産の症状を呈し、PTB歴のない50人の女性（20人のPTB）、ほとんどが（88％）Blackで、妊娠22-34週にサンプルを採取したケースコントロール研究（'Ghartey, 2017' ）（文献55）です。
この検証は非常に困難であった：異なる包含基準と集団構造のため、異なる研究間でメタボローム測定における実質的なバッチ効果82、そして最後に、データが4-6年前に生成されたため、我々の予測因子が使用する代謝物のほんの一部しか測定されなかった（34％および39％）。これを強調するために、我々が膣内代謝物とsPTBとの間に検出した10の関連（図（Fig.2a）2a）のうち、これらのコホートでは1つと2つ（それぞれGhartey 2015と2017について）しか調べることができず（方法）、そのうちどれも有意ではなかった（マン・ホイットニーP＞0.05）。これらのsPTB関連代謝物は、おそらく予測に重要な特徴であり、これらのコホートでの一般化を困難にしています。この困難な設定にもかかわらず、再トレーニングや適応を行わず、ここでプロファイリングした232サンプルに対してのみトレーニングしたメタボロームベースの予測器は、両方の外部コホートで比較的正確な予測を行いました（Ghartey 2015と2017についてそれぞれauROC = 0.65, auPR = 0.67, auROC = 0.66, auPR = 0.58; Fig. Fig.4c4c and Extended Data Fig.8h,i）。これらの結果は、膣メタボロームと、研究特有のバイアスに対する我々の予測アプローチの頑健性を示しています。
モデルの解釈により、他の寄与する特徴が明らかに
モデルで使用される特徴量に関する洞察を得るために、SHapley Additive exPlanations（SHAP）83を用いて、各サンプルの予測に対する各特徴量の寄与度を評価した（補足表6）。予想通り、最も予測性の高い10種類の代謝物のうち、DEA、チラミン、アラビノース、グルタミン酸γ-メチルエステル、マンニトール/ソルビトール、マンノースの6種類が、関連解析でも同定され、同様の関連方向が見られた（Figs. Fig.22とand4d）.4d）。さらに、ピペコレートが高く、ラクトシル-N-パルミトイル-スフィンゴシンとオロチジンが低いと、sPTB予測に寄与することが分かった。これらのうち、ピペコレートはBV84の女性で上昇することが示されました。
微生物学に基づく予測因子の同様の分析では、Mobiluncus mulieris14とFinegoldia magna85、Lactobacillus14とDialister種15を含む膣内微生物とsPTBとの間の以前に検出された関連も捉えた（拡張データ図8j）.8j）。これらの結果は、我々のモデルの解釈のしやすさと、複雑な非線形相互作用をモデル化する能力を強調し、単変量解析では検出されなかった関連性を明らかにすることを可能にしました。
考察
本研究では、232名の妊婦の第2期膣内メタボロームを測定した。膣マイクロバイオームと関連すること、および代謝物シグネチャーが黒人女性のsPTBに濃縮されていることを示す。sPTBと関連する複数の代謝物を、コホート全体、および黒人女性と白人女性に分けて同定した。その結果、sPTBと強い関連を持つ外因性代謝物が明らかになり、重要なリスクファクターとなることが示唆された。さらに、結核に関連する代謝物と潜在的に最適でない微生物との間の興味深い相互作用を明らかにし、早産した白人女性におけるチラミンの膣内代謝の違いを提案しました。最後に、メタボロームベースのモデルにより、その後の結核を数週間から数ヶ月前に予測できることを示し、早期診断への道を開く可能性を示しました。
我々は、sPTBに関連するいくつかの異種物質を検出した： DEA、エチルグルコシド、酒石酸塩、EDTAは、先行文献と機能解析37により、外因性のものであることが示唆されました。DEAは、天然起源が不明な化学物質86であり、一般的に掘削や金属加工液35に使用され、生殖年齢の女性が高い曝露を受ける87、エチルグルコシドはアルコールを含む製品31に存在し、いずれも衛生的で化粧品の前駆体または成分である30，33．酒石酸塩とEDTAは食品添加物として使用されており32,58、また衛生的で化粧品によく含まれている32,57。これらの代謝物の発生源は特定されていないが、すべてが衛生用品や化粧品に記録されているという事実は、これらの製品の一部がsPTBのリスクを高める可能性があることを懸念させるものである。我々の結果は、妊娠中の環境暴露に関する懸念を提起する最近の研究88,89と一致し、これらの化学物質が生殖管に存在することが確認された。これらの代謝物の発生源を特定し、宿主、マイクロバイオーム、妊娠転帰に対する影響を明らかにするために、さらなる研究が必要であり、様々な製品および妊娠中の使用に関する政策提言を行うことができるようにする。
私たちが分析したコホートには黒人女性が多く含まれており、PTBやその他の有害な妊娠転帰によって不釣り合いに負担を強いられている一方で、多くの研究において少数で表現されている女性におけるPTBを研究する機会を提供しています。しかし、母親の自認する人種は、サンプリング時の既往の違い、格差、臨床的共変量が複雑に絡み合っているため、黒人女性と白人女性との関連性の違いから結論を導き出すことには注意を要する。黒人女性はパーソナルケア製品を通じて内分泌撹乱化学物質への曝露が多いという報告92,93や、PTBを引き起こす可能性のある要因として外因性化学物質を特定した研究94,95と一致している。メタボローム曝露パターンは、未熟児率の人種間格差と膣マイクロバイオームの人種間差との関連に寄与する可能性がある96。
我々は微生物によるチラミン代謝を調べるために、コミュニティスケールの代謝モデルを使用したが、これには重要な限界がある。モデルのキュレーションは継続的な取り組みであるため、モデルは各サンプルに合わせたものでなかったり、ニッチ特有の代謝能力を表現できていない可能性がある。また、16S rRNAアンプリコンシーケンスの解像度に起因する制限もあり、種または属レベルで分類子を特定するため、菌株固有のモデリングは不可能です。これらの限界にもかかわらず、我々のモデルはいくつかの代謝物を正確に予測し、チラミンの潜在的な供給源に関する洞察を提供しました。
(1)sPTBに富むケースコントロールコホートを使用したため、集団レベルの予測値を評価する能力に限界があり、前向き研究でさらなる検証が必要であった。(2) このコホートはsPTBに焦点を当てたものであるため、我々のモデルがsPTBに特化したものなのか、それとも妊娠の有害な結果に対する一般的なリスクを検出しているのかを評価することができない。(3) 私たちのモデルで人種を使用することは、医学界では一般的であるが97、論争があり、実施に際して問題が生じる98。これは、本コホートにおける黒人女性と白人女性のサンプルサイズと膣メタボローム自体の違いによってもたらされ、全体として精度が向上しました。(4) 最後に、さらに以前のサンプルを予測に使用することで、さらに未解明の可能性があります。サンプルサイズを大きくし、母体の尿や血清メタボローム、膣メタゲノミクス、無細胞RNA測定など、他のデータソースと組み合わせることで、予測精度をさらに向上させることができます。
この結果は、PTBの初期バイオマーカーとしての膣内代謝物の有用性を示し、修正可能なsPTBリスク因子としてxenobiotic代謝物を特定したもので、黒人女性に不釣り合いな影響を与える可能性もあります。このような強い関連性は、子癇前症、PTB、BVといった他の有害な妊娠アウトカムとの関連において、膣マイクロバイオームとメタボロームを調査する動機付けとなります。
研究方法
試験デザインおよびコホートの説明
我々は、以前に収集・記載されたMotherhood and Microbiome cohort（NCT02030106）からバンクされたサンプルを分析した（文献14）。このコホートは、ペンシルベニア大学（IRB 818914）およびメリーランド大学医学部（HP-00045398）の機関審査委員会の承認を受け、すべての参加者が書面によるインフォームドコンセントを提供した。Motherhood and Microbiomeコホートは、妊娠20週以前の単胎妊娠の女性2,000人を募集しました。女性は出産まで追跡され、sPTBは、子宮頸管拡張および/または膜早期破裂を呈した妊娠37週以前の出産と定義されました。このうち、503名の女性の膣内細菌叢は、妊娠20週から24週の間に採取した膣スワブの16S rRNA遺伝子アンプリコンシーケンス（V3-V4領域）によって以前に特徴づけられ、総菌量はTaqMan BactQuant assay14を用いて評価された。本研究では、入手可能なマイクロバイオームデータを持つ女性のうち、早産した女性（N = 80）から入手可能なすべてのサンプルを選択し、さらに、正期産の対照152人からのサンプルも選択しました。選択した頸膣サンプルは、16S rRNA遺伝子配列決定に使用したサンプルの複製で、ダブルシャフトダクロンスワブを用いて採取しました。子宮頸管スワブは、自分で採取するか、研究訪問時に研究コーディネーターが採取した14。
統計と再現性
本研究では、解析から除外されたデータはなかった。本研究は観察研究であるため、割り付けや無作為化は行わなかった。本研究では、早産した利用可能なすべてのサンプルを対象とし（N = 80）、サンプルサイズを事前に決定するための統計的手法は用いませんでした。本研究のサンプルサイズは、過去の論文で報告されたサンプルサイズと同様です25,26。サンプルはメタボロミクスバッチ間でランダムに分配され、メタボロミクス解析は各サンプルの結果評価について盲検化されたMetabolonによって実施されました。代謝物レベルとsPTBとの関連を特定するために、両側Mann-Whitney U検定（SciPy 1.5.2）およびロジスティック回帰（Statsmodels 0.12.1）が使用されました。MC、CST、人種、sPTB間の関連性を確認するために、両側フィッシャーの正確検定（R stats 3.6.1）を使用した。マイクロバイオーム、メタボローム、CST、人種、メタボロームバッチ間の関連を特定するために、PERMANOVA検定（scikit-bio 0.5.6）を使用しました。代謝物セット濃縮分析（Methods）を用いて、代謝物セットとsPTB間の関連性を同定した。代謝物レベルとNMPCの間の一致、および代謝物レベルと微生物量の間の一致を測定するために、スピアマン相関を使用しました。サブグループ内で測定された相関を比較するために、フィッシャーR-z変換を使用した。機械学習モデルの評価は scikit-learn 0.24.2 を用いて行い、データ処理には pandas 1.1.5 および NumPy 1.18.5 を使用した。予測モデルの汎化誤差のロバストな評価は、ネステッドクロスバリデーションによって達成された。
メタボロミクスプロファイリングとプリプロセッシング
メタボライトレベルは、Metabolon社により、アンターゲット液体クロマトグラフ-タンデム質量分析（LC-MS/MS）プラットフォーム99を用いて膣スワブから測定されました。サンプルのバッチ処理に関する議論は、Supplementary Note 1およびExtended Data Fig. Fig.2.2を参照してください。スワブのロット番号、ブランク処理用の無菌スワブ、サンプルコレクター（コーディネーターまたは自己採取）が入手できないことに留意されたい。このため、潜在的なバッチ効果の分析は制限されるが、サンプルは分娩と転帰決定の前に収集されているため、バッチ交絡（例えば、sPTBに関連するスワブロット）は考えにくいと考えられる。
メタノールベースの低分子抽出後、サンプルを5μlのアリコートに分け、それぞれを適切な抽出溶媒に再懸濁し、4つのクロマトグラフィー手法のうちの1つで分離しました。各クロマトグラフィー法は、疎水性、塩基性または極性化合物の抽出に最適化されていた。各代謝物の定量に使用したクロマトグラフィー法は、補足表4に記載した。同位体標識またはハロゲン化標準物質は、抽出前にすべてのアリコートに一定濃度で添加し、保持時間マーカーとした。抽出後、化合物をエレクトロスプレーイオン化し、Q-Exactive Hybrid Quadrupole-Orbitrap高分解能質量分析計によるタンデム質量分析で測定した。Metabolon社独自のソフトウェアと保持指標およびフラグメントイオンスペクトルのデータベースとの比較により、m/zピークの同定および注釈を行いました。注釈付きm/zピークの下の領域は、代謝物の測定値として扱われました。クロマトグラフィーおよび質量分析計の全パラメータの包括的な概要は、補足表7に記載されています。各メタボロームプレートでプロセスブランク（陰性対照）を実施し、これらの対照よりも少なくとも3倍高いレベルで代謝物が検出された場合にのみ、代謝物が存在するとみなした。膣サンプルおよび陰性コントロールにおける、本研究で注目されたゼノバイオティクスの検出レベルを、Extended Data Fig.に示します。Fig.5e,5eに示し、同じことを証明しています。これらの有害物質の質量誤差については、拡張データFig.5f,5fも参照してください。Fig.5f,5fを参照し、他の非ゼノバイオティクス代謝物と比較して、高い同定品質を示しています。
大半の代謝物（N = 556）は、実験的に測定されたライブラリ標準物質とフラグメントスペクトルが一致することにより、MetabolonによってTier1同定されましたが、Metabolonプラットフォームの独自の性質により、Tier2同定のみが利用可能です。代謝物の測定は、使用したバッファーの容量に正規化されましたが、これは必ずしも元の組織の違いを考慮していないかもしれません。続いて、log（base10）変換された値のロバスト標準化27（中央値を引き、上下5％の外れ値をクリップしながら計算した標準偏差で割る）が行われました。Shapiro-Wilk検定により、大半の代謝物（635代謝物中389代謝物）でlog（base10）変換値が正規性から逸脱していると判定された。このため、以降のメタボローム解析ではノンパラメトリックテストを使用しました。
マイクロバイオームデータ処理
すべてのマイクロバイオームベースの解析は、DADA2（文献100）およびSpeciateIT14で事前に処理したデータを用いて行い、文献のSupplementary Data 2から入手可能であった。14. ただし、予測モデルは例外で、USEARCHパイプライン101を用いて97%クラスター化された運用分類単位（OTU）で学習させた。Genotypes and Phenotypes (dbGaP)のデータベースから、研究アクセッション: phs001739.v1.p1 で生の配列を入手した。プライマーはリードにアライメントし、トリミングした後、エンドマージと品質フィルタリング（-fastq_maxee 1.0）を行った。フィルターされたリードはプールされ、重複除去され、97%の閾値でクラスタリングされ、UPARSEアルゴリズムでキメラフィルターされ、OTUカウントマトリックスを作成した。
グローバルマイクロバイオームとメタボローム構造
PERMANOVA解析は、マイクロバイオームデータにはBray-Curtis距離、代謝物データにはCanberra距離を用い、外れ値に強く、共通特徴の違いに敏感な手法で実施しました。代謝物ベクトルのデノボクラスタリングは、k-medoidsアルゴリズム（scikit-learn-extra 0.2.0）を用い、同じくCanberra距離で実施した。kを1～15に設定したクラスタリング解のクラスタ内二乗誤差とギャップ統計量を比較し、最適なクラスタ数を決定しました（拡張データ図3a、b）。これらのクラスターの頑健性と一貫性を確認するため、232サンプルのうち209サンプル（90%）を100回ランダムに選択し、それぞれのランダムサブセットに対して同じ手順でクラスターを新たに作り直した。その結果、多くのサブセット（36個）では、95%以上のサンプルが元の割り当てと同じ代謝物クラスターに割り当てられ（補足表2）、すべてのランダムサブセットで平均86%の割り当て精度（拡張データ図3g）、3g）、我々の代謝物クラスターが実際に一貫していることを実証しました。一様多様体近似と投影（UMAP）102は、Python umap-learnパッケージ102を使用して、マイクロバイオームデータではn_neighborsが15、min_distが0.05、メタボロームデータではn_neighborsが15、min_distが0.25で実行しました。各メタボロミクスクラスターをさらに詳しく説明するために、フィッシャーの正確検定を用いて、各クラスターに関連する代謝物の中で濃縮された代謝物スーパーとサブパスウェイを特定しました（P < 0.05）。
存在量の差の検定と代謝物セットの濃縮解析
代謝物レベル間の差分存在量検定は、少なくとも半数以上の症例に存在する代謝物について、両側Mann-Whitney U検定を用いて行われた。早期PTBとの関連は、これらの分娩における割合が高いため、黒人女性からのサンプルのみを用いてすべて算出した（妊娠32週未満の分娩では26例中21例、28週未満の分娩では15例中14例）。sPTBとTBの間で変化した代謝物の機能セットを特定するために、各セットについて、セット内の代謝物についてPTBとsPTBの間の存在量の差に関するMann-Whitney P値とセット外の代謝物に関する同じP値を、追加のMann-Whitney U検定を用いて比較しました。後者の検定のP値を、sPTBとTBのラベルのランダムな並べ替えで計算した10,000個の同様のP値と比較することで有意性を計算しました。機能セットについては、Metabolonが提供するスーパーパスとサブパス、およびKEGG61パスウェイの定義を使用した。誤検出率（FDR）補正は、代謝物セットの種類ごとに個別に行いました。
AMONを用いた代謝物起源の予測
AMON37は、KEGGデータベース61に従った機能的アノテーションを使用して、KEGGエントリーに一致することができたすべての代謝物（635の名前付き代謝物のうちN = 334）の代謝物起源を予測する方法です。PICRUSt2（文献103）を用いて各サンプルの機能プロファイルを作成し、AMON37を適用して、KEGGデータベースでエントリーが一致した代謝物がヒトと微生物の代謝産物であるかどうかを予測しました。両方が偽であった場合、その代謝物は異種生物であると解釈しました。
微生物と代謝物の相関関係
微生物と代謝物の関連を特定するために、TaqMan定量ポリメラーゼ連鎖反応（qPCR）ベースのパネル14,104,105を用いて得られたサンプルの総16S rRNAコピー数に各分類群の相対存在量を乗じることで微生物の絶対量を推定し、sPTBと関連があると考えられる代謝物のレベルとのスピアマン相関を算出しました。すべての相関ネットワーク分析（図（Fig.3a3aおよび拡張データ図6a,c-e））において、少なくとも22％のペア測定値との相関を含み、Fig.3a3aについては232サンプルのうち50サンプルに相当した。Fig.3a.3aの場合。すべての相関測定は、インピュテーションなしで利用可能なデータを使用し、多重検定の補正はBenjamini-Hochberg FDR法を用いて行った。ネットワーク内のエッジが人種（拡張データ図6b）6b）またはsPTBの重症度（拡張データ図6f）6f）に影響されるかどうかを判断するために、両側フィッシャーR-z変換を用いて、黒人女性のこれらの相関を白人女性の同じ相関と比較し、また32週以前に出産した黒人女性のこれらの相関と他のすべての黒人女性の同じ相関と比較しました。
膣内マイクロバイオームモデルの作成と解析
マイクロバイオーム代謝モデリングは、AGORA2（文献107）からのモデルを使用して、Microbiome Modeling Toolbox（COBRA toolbox commit: 71c117305231f77a0292856e292b95ab32040711）（refs.73,106） を使用しました。すべての計算は、MATLABバージョン2019a（Mathworks）で、IBM CPLEX（IBM）12.10.0 ソルバーを用いて行った。
各サンプルについて、コンパートメント化技術108により、テーラーメイドのマイクロバイオームモデルを作成した：サンプルに存在する種の代謝再構成を共有コンパートメントに統合し、入力および出力コンパートメントを追加する。共有区画では微生物が代謝物を共有し、入力区画と出力区画は化合物の摂取と分泌を可能にするために存在する。結合制約は、refs.109,110と同様に追加される。相対的な存在量と各生物種のネットワークフラックスとの間の依存関係を保証するために、文献109,110と同様に結合制約を追加した。最後に、各微生物バイオマスの合計に対応する相対存在量の値を乗じたサンプル固有のマイクロバイオームバイオマス目的関数が、各マイクロバイオームモデルに追加されています。
各サンプル固有のマイクロバイオームモデルの分泌能を調べるために、Microbiome Modeling Toolbox73のパイプラインmgPipe.mを用いてNMPCを計算しました（補足表8）。NMPCの計算は、マイクロバイオーム化合物の最大生産量と取り込み速度を考慮し、特定の化合物の代謝に対するマイクロバイオームの全体的な寄与を予測することを目的としています73。予測精度を評価するため、NMPC と対応する代謝物測定値との間のスピアマン相関を計算しました（インピュテーションなし）。
チラミン予測の精度を高め、サポートするために、チロシン脱炭酸酵素をコードする TDC 遺伝子の存在を確認しました。代謝モデル（N = 95）で表される各生物種について、Prodigal111を使用して、ランダムに選択した最大200個のRefseq112アセンブリのオープンリーディングフレームを予測し、Hmmer3.3.2のhmmsearch機能（文献113）とTDC114のプロファイルhmm（NCBI HMM accession TIGR03811.1）でTDCを示す証拠を検索しました。そして、少なくとも1つのアセンブリに対応する遺伝子が含まれているモデルにおいて、対応する反応が存在することを確認し、代謝モデルをキュレーションしました。
代謝モデルを作成するために、マイクロバイオームサンプルで検出された種とAGORA2（文献107）に存在する種の間でマッチングを行った（補足表9）。モデルの代表性を高めるため、対応するAGORA2モデルがない豊富な膣内生物種のうち、少なくとも20サンプルで相対存在度5%以上で存在する3つの代表を追加した（補足表9に記載）。この閾値を超えた唯一の種で、モデルに含まれなかったのはCandidatus Lachnocurva vaginae (BVAB1)で、適切なAGORAモデルが存在しなかったためである。種レベルのモデルを作成するために、Microbiome Modeling Toolbox73 の関数 createPanModels.m を使用して、利用可能な菌株の代謝モデルを組み合わせました。合計で、私たちのマイクロバイオーム代謝モデルには95の異なる種が含まれ、各サンプルには平均20種が含まれていました。膣マイクロバイオームは非常に歪んだ分布をしているため28、この結果、我々のモデルで表されるサンプル全体の存在量の中央値（四分位範囲（IQR））は96.7％（88.4-98.8％）となりました（拡張データ図7d7d）。
低存在量の微生物の表現不足に対するモデルの感度を調べるため、最も存在量の少ない10種をモデルで考慮しないように繰り返しシミュレーションを行い、よくモデリングされた代謝物であるチラミン、プトレシン、ヒスタミンの予測におけるモデルの精度を評価しました。予想通り、我々のモデルは各微生物の存在量を考慮しており、膣マイクロバイオームは歪んだ分布をしているため、95モデル中70モデルを削除しても、我々のモデルは存在量の少ない微生物の表現に敏感ではありませんでした（拡張データ図7e）,7e）。
代謝モデリングには、培地や炭素源の利用可能性などの環境条件が必要である115。そこで、AGORAで対応する代謝物が同定された少なくとも50サンプルに存在するすべての代謝物の連合体として、無制限（つまり非常に高い）濃度で存在すると仮定した「一般的な膣内媒体」（補足表10）を策定しました。この膣内メディアは、代謝物の取り込み反応に対する制約という形で各マイクロバイオームモデル入力区画に適用され、環境に存在しない化合物の取り込みはゼロに制約された。mgPipeで自動的に実行される特定の腸関連食物化合物の取り込みは、膣内の代謝環境が異なることを考慮して無効にし、マイクロバイオーム増殖に必要な必須代謝物をそれぞれのフラックス値とともに、COBRAツールボックス106のfastFVAおよびfindMIIS関数を使用して検出して膣培地に追加した。一般」培地と、黒人女性と白人女性のサンプルの75%に存在する代謝物と定義し、取り込みフラックスをサブグループ全体の平均値に拘束したサブグループ別培地、および取り込みフラックスを各サンプルごとに拘束した人別培地の比較では、チラミンの予測に関して同様の精度を示した（補足表5）。
sPTB分類器のトレーニング、テスト、およびバリデーション
臨床データ（年齢、人種、分娩の有無、sPTB歴、BMI）、マイクロバイオームデータ、メタボロミクスデータを個別に用いて予測モデルを構築し、さらにこれらすべてのデータを組み合わせた組み合わせモデルも構築した。人種はマイクロバイオームやメタボロミクスデータと非常に強い相互作用があるため、マイクロバイオーム、メタボロミクス、組み合わせモデルについては複合予測因子を訓練し、黒人女性については別のモデルを訓練した。各モデルのサンプルサイズが小さいにもかかわらず、これにより経験的に予測性能が向上しました（拡張データFig.8b）.8b）。微生物学ベースのモデルは、上述のようにUSCARCH処理されたOTUから計算された絶対量を使用した。qPCRベースの総量が利用できない場合（N = 14）、トレーニングサンプルのみを使用して平均総量にインプットした。
サンプルは、10倍クロスバリデーション（「外倍」）を用いてトレーニングセットとテストセットに分割し、出生時の妊娠年齢（GAB）の十分位でブロック層別化し、マイクロバイオーム、メタボロミクス、複合モデルについては人種で層別化しました。10倍への分割の確率を考慮するため、このプロセスを5回繰り返した。訓練と試験の無菌性は厳密に維持された。最適なハイパーパラメータ（特徴工学と選択のためのパラメータを含む）のセットを調整し、一般化誤差のロバストな推定値を得るために、入れ子式クロスバリデーションを使用した。この訓練-テスト-検証の枠組みの拡張では、訓練セットをさらに5つのフォールド（「内部フォールド」）に分割し、その上でハイパーパラメータのランダムなセットを1,000回反復使用した（補足表11）。確率を考慮し、もう一度このプロセスを5回繰り返した。我々は、最良のハイパーパラメータセットを、sPTB分類の平均R2に基づく最も正確なモデル上位5つのうち、内側の折り目の性能に基づく平均auROCスコアがトップのモデルとして選んだ。そして、これらのハイパーパラメーターを用いて、外側の折り目の全トレーニングデータでモデルを学習し、取り置いたテストデータで評価しました。なお、このフレームワークでは、ハイパーパラメータは外側の10倍クロスバリデーションの訓練データを厳密に使用して選択され、テストセットで一度だけ評価される。予測パイプラインには、標準化とインピュテーション（メタボロミクスデータ用）、主成分分析（PCA）変換（オプション）、スパース性、SHAP83特徴重要度、情報利得、スピアマン相関による特徴選択、LightGBM116による予測、があり、すべてのステップはトレーニングデータを厳密に使用して実行されています。次に、選択されたモデルは、再トレーニングなしで、外褶曲の極めて（GAB＜28週）または非常に（GAB＜32週）PTBを分類する際に評価されました。ベンチマーク分析（拡張データ図8a,b）は、10倍クロスバリデーションを用いて行い、5回繰り返した。2つのモデル間のauROCの差の有意性は、auROCs117の正規分布のzスコアを計算することで評価した。
解釈と検証のための最終モデルを得るために、外側のフォールドのそれぞれについて選択したハイパーパラメータを用いて、コホート全体（N = 232）について新しい複合モデルをトレーニングし（50モデル）、同じコホートで最高のauROCを持つモデル（トレーニングフィット）を選んだ。各モデルの最終的なパラメータセットは、補足表12に記載されています。外部の膣メタボロームデータセットでの検証では、被験者レベルでの母親の人種に関する情報が得られなかったことに留意する。そこで、非黒人女性に使用したメタボロミクスモデルを、再トレーニングや適応なしに、Ghartey 2015（文献81）コホートのメタボロミクスデータに適用し、同様に黒人女性に使用したメタボロミクスモデルをGhartey 2017（文献55）コホートからのメタボロミクスデータに適用しました。これらのコホートにおける代謝物とsPTBとの関連性（図（Fig.2a）2a）の検証については、図（Fig.2a）の10代謝物のうち、Fig. Fig.2a,2aにおいて、Ghartey 2015コホートで検証できるのは、全女性と白人女性に該当する6つのみであり、そのうち1つのみ測定され、Ghartey 2017コホートで検証できるのは、全女性と黒人女性に該当する9つのみで、そのうち2つのみ測定されています。
報告書の概要
研究デザインの詳細については、本記事にリンクされている「Nature Portfolio Reporting Summary」にてご確認いただけます。
補足情報
補足説明(297K, pdf)
補足資料1-2.
報告書の概要(72K, pdf)
補足表(3.2M, xlsx)
補足表1 生の代謝物測定値。サンプルIDはref.のSupplementary Data 2を参照。14. 数値は生の面積カウント。補足表2 代謝物クラスター（MC）へのサンプルの割り付け。サンプルIDは文献のSupplementary Data 2を参照。14. 補足表3 AMONによる代謝物起源予測。補足表4 メタボライトのアノテーションと抽出プラットフォーム。補足表5 異なるメディア定義を用いた代謝モデルによるチラミン予測精度。数値はNMPC値とチラミン測定値の間のスピアマンρ。補足表6 予測モデルのシャプレー値。補足表7 クロマトグラフィーおよび質量分析パラメータ。Metabolon社のLC-MS/MSプラットフォームそれぞれの技術パラメータを列挙しています。補足表8 チラミン、プトレシン、ヒスタミンのNMPC予測値。サンプルIDは文献のSupplementary Data 2を参照。14. 補足表 9 SpeciateIT 種の AGORA モデルへのアサインメント。SpeciateIT の種は、文献14のSupplementary Data 2の列である。14. 補足表10 代謝モデルで使用した膣培地に含まれる代謝産物。含まれる代謝物をAGORAの識別子とともに列挙した。補足表11 予測モデルの最適化に使用したハイパーパラメータセット。補足表12 最終的な予測モデルのパラメータ。補足表13 ハイライトされたゼノバイオティクスの測定特性。
謝辞
M. A. Elovitz、J. Ravel、K. D. Gerson、P. Gajer、L. Antonには、サンプルの開始、収集、共有、資金獲得への協力、有益な議論に感謝しています。Koremグループのメンバー、L. Shenhav、D. Zeevi、N. Bar、R. Wapnerには、有益な議論をしていただいたことに感謝しています。Motherhood and Microbiome cohortは、National Institute of Nursing Research (NINR; R01NR014784)から資金提供を受けました。使用したデータセットの1つは、dbGaPのアクセッション番号phs001739.v1.p1を通じてGenotypes and Phenotypes（dbGaP）のデータベースから入手した。本研究は、NINR（R01NR014784）、ペンシルベニア大学精密医療センター、コロンビア大学精密医療イニシアチブが提供するVagelos賞、コロンビア大学数理ゲノムプログラム、CIFAR Azrieli Global Scholarship in the Humans & the Microbiome Programから支援を受けました。W.F.K.は、NIH T32GM007367およびF30HD10886の支援を受けています。I.T.とA.H.は、I.T.に与えられた欧州連合のHorizon 2020研究・革新プログラム（助成金契約番号757922）の下、欧州研究会議（ERC）からの助成金により支援された。
拡張データ
著者による寄稿
W.F.K.、F.B.、M.C.L.は、すべての解析を設計・実施し、結果を解釈して原稿を書き、この仕事に平等に貢献した。H.H.L.、J.L.、Y.M.は、データ解析を支援した。A.H.とI.T.は、代謝モデル解析のためのリソースとサポートを提供しました。C.A.T.はメタボローム解析を監修した。M.L.とT.K.は、プロジェクトの構想、研究の設計、結果の解釈を行った。T.K.は解析を指揮し、原稿を執筆した。すべての著者が原稿を確認し、貢献した。
査読
ピアレビュー情報
Nature Microbiologyは、Rodman Turpinと他の匿名の査読者に感謝します。
データの入手方法
本研究で解析した16S rRNA遺伝子アンプリコンシーケンスデータと関連するサンプルおよび被験者のメタデータは、Genotypes and Phenotypesデータベース（dbGaP）のアクセッション番号 phs001739.v1.p1 および文献の補足データ 2 で公開されている。14. メタボロミクスの生データは、Supplementary Table 1に掲載されています。マススペクトルデータは、MetaboLightsからアクセッション番号MTBLS702 (https://www.ebi.ac.uk/metabolights/MTBLS702)で入手できます。ゼノバイオティクスに関する追加情報は、Supplementary Table 13に記載されています。KEGG Databaseはhttps://www.genome.jp/kegg/、AGORAモデルはhttps://www.vmh.life/ で利用可能です。
コードの入手方法
解析を再現するためのスクリプトはGitHubリポジトリで公開されています: https://github.com/korem-lab/PTB_Metabs_2021. mgPipeパイプラインは、COBRAツールボックス（https://github.com/opencobra/cobratoolbox）内で利用可能です。
競合する利益
M.L.とT.K.は、この研究に関連する仮特許出願の発明者である。他の著者は利益相反のないことを表明している。
脚注
出版社からのコメント Springer Natureは、出版された地図や機関所属の管轄権主張に関して中立を保っています。
これらの著者は同等に貢献した： William F. Kindschuh, Federico Baldini, Martin C. Liu.
変更履歴
1/26/2023
当初オンライン版で公開された補足情報では、文献118-120が省略されていましたが、現在は含まれています。
投稿者情報
Maayan Levy, Email: ude.nnepu.enicidemnnep@elnayaam.
Tal Korem, Email: ude.aibmuloc@merok.lat.
拡張データ
は、10.1038/s41564-022-01293-8で本論文のために利用可能です。
補足説明
オンライン版には、10.1038/s41564-022-01293-8で入手できる補足資料が含まれています。
記事情報
Nat Microbiol. 2023; 8(2): 246-259.
オンライン公開 2023 Jan 12. doi: 10.1038/s41564-022-01293-8
pmcid: pmc9894755
NIHMSID: NIHMS1864989
PMID:36635575
William F. Kindschuh, #1 Federico Baldini, #1 Martin C. Liu, #1,2 Jingqiu Liao, 1 Yoli Meydan, 1 Harry H. Lee, 1 Almut Heinken, 3 Ines Thiele, 3,4,5,6 Christoph A. Thaiss, 7,8,9 Maayan Levy, 7,9 and Tal Korem1,10,11
1コロンビア大学アービング医療センターシステム生物学部数理ゲノミクスプログラム（米国ニューヨーク州ニューヨーク市
2コロンビア大学アービングメディカルセンターバイオメディカルインフォマティクス科（米国ニューヨーク州ニューヨーク市
3アイルランド大学ゴールウェイ校医学部、アイルランド、ゴールウェイ
4アイルランド、ゴールウェイ大学、微生物学研究室
5ゴールウェイ大学ライアン研究所、ゴールウェイ、アイルランド
6APC Microbiome Ireland, University College Cork, Cork, アイルランド
7米国ペンシルバニア大学ペレルマン医学部微生物学教室、フィラデルフィア
8米国ペンシルバニア大学ペレルマン医学部糖尿病・肥満・メタボリズム研究所
9米国ペンシルバニア大学ペレルマン医学部免疫学研究所
10コロンビア大学アービングメディカルセンター産科婦人科（米国ニューヨーク州ニューヨーク市
11CIFAR Azrieli Global Scholars program, CIFAR, Toronto, Ontario Canada
Maayan Levy, Email: ude.nnepu.enicidemnnep@elnayaam.
寄稿者情報です。
コレスポンディングオーサー。
#Contributed equally.
Received 2022 Jul 21; Accepted 2022 Nov 23.
著作権 © The Author(s) 2023年、訂正出版 2023年
オープンアクセス この記事は、クリエイティブ・コモンズ表示4.0国際ライセンスの下でライセンスされており、原著者および出典への適切なクレジット表示、クリエイティブ・コモンズ・ライセンスへのリンクの提供、変更があった場合の表示を行う限り、あらゆる媒体や形式での使用、共有、適応、配布および複製が許可されています。この記事に掲載されている画像やその他の第三者の素材は、素材へのクレジット表示で別段の指示がない限り、記事のクリエイティブ・コモンズ・ライセンスに含まれています。素材が記事のクリエイティブ・コモンズ・ライセンスに含まれておらず、あなたの意図する使用が法的規制によって許可されていない場合、または許可された使用を超える場合、あなたは著作権者から直接許可を得る必要があります。このライセンスのコピーを見るには、http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/。
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