胎便中の細菌負荷

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胎便中の細菌負荷

https://onlinelibrary.wiley.com/doi/full/10.1002/imt2.173

金文宇, 彭静, 戴金平, 唐栄康, 郭嘉欣, 趙煥, 王潔琳, 張秀, 高毅周
初出：2024年2月13日
https://doi.org/10.1002/imt2.173
Wen-Yu JinとJing Pengは本研究に等しく貢献した。
研究概要
セクション

図表による要約
スパイクインプラスミド法を用いて、メコニウムと二次通過糞便の分析を行い、相対定量と絶対定量の両方の結果を得た。絶対定量データでは、メコニウム17検体中の細菌量は1.14×107コピー/g、セカンドパス糞便17検体中の細菌量は1.59×109コピー/gであった。分娩様式は、72時間以内の新生児の腸内細菌の変化と組成に大きく影響する可能性がある。

詳細不明
編集者へ
腸内細菌叢は非常に多くの細菌を宿主としており、成人の大腸では約1011 CFU/gと推定されている[1]。メタゲノミクス、メタボロミクス、その他のオミクス技術[2]の発展により、腸内細菌の組成と機能がさらに解析され、認識されるようになってきた[3]。既存の研究では、腸内細菌叢の代謝産物が様々な疾患の発症に関連している可能性が示されている[4]。さらに、乳幼児期の腸内細菌叢は、ヒトの成長と発達に極めて重要な役割を果たしている。研究者らは、乳幼児期の腸内細菌叢と、免疫関連疾患の発症を含む乳幼児期の免疫系の成熟との間に有意な関連が存在すると推測している［5］。

腸内微生物の組成は乳児期、特に生後1～3ヵ月の間に最も大きく変化し [6] 、生後1年以内に安定し、約5歳までに成熟することが広く認められている [7] 。以前の研究では、出生前の糞便は完全に無菌であることが示されている [8]。視線をメコニウムに移すと、メコニウムは新生児が最初に排出する便で、色は真っ黒である。最初の哺乳後、食物は乳児の胃に2～3時間、小腸に8～96時間とどまり [9]、糞便は徐々に緑色に変化する。哺乳から4日後には、糞便は黄色になる。赤ちゃんが生まれてからも、細菌は糞便中に存在することが示されている。しかし、最初の哺乳段階後、出生後12時間以内に採取された胎便のマイクロバイオームの変化は未知のままである。

16SリボソームDNA（rDNA）配列決定を用いた先行研究では、糞便中の微生物組成が研究されている[10]。しかし、従来の16S rDNAシーケンスやメタゲノミクスは、通常、細菌を多く含むサンプルに採用されている。メコニウム中の微生物数が極めて少ないことを考えると、従来のシーケンス手法に特有のバックグラウンドノイズが結果に大きく影響する可能性がある。さらに、サンプル採取時や機器分析時にコンタミネーションが発生する可能性があり、分析中にバックグラウンドシグナルと実際のシグナルを区別することが難しくなる。

近年、絶対定量的なオミックス解析法に対する関心が高まっている[11]。本研究では、出生後72時間以内の糞便中の微生物の存在とその動態を調査することを目的とした。出生前の期間に健康で、腸管関連疾患がなく、短期間の抗生物質投与を受けていない妊婦のスクリーニングを実施した。出生後12時間以内に排泄された胎便と72時間以内に排泄された胎便を採取し、各サンプルの16S rDNAの塩基配列を別々に決定し、内部標準プラスミドを用いて解析した。さらに、帝王切開で生まれた乳幼児と真正母乳で生まれた乳幼児の糞便微生物組成の違いについても検討した。本研究で得られた知見は、腸内細菌叢の初期コロニー形成についてのより包括的な理解に寄与するものである。

2023年5月から2023年6月にかけて、男性11人、女性6人の計17人の新生児が本研究に登録された（表S1）。このうち、10人は人工授精で生まれ、7人は帝王切開で生まれた。平均出生体重は3300.5±476.2g、平均妊娠週数は38.3±1.5週、平均母体年齢は32.2±3.5歳であった。出生後12時間以内にすべての乳児から糞便サンプルを採取した。

細菌の絶対定量はスパイクインプラスミドを用いて34検体で計算した（表S5）。その結果、17検体の糞便中の細菌の平均量はそれぞれ1.14×107および1.59×109コピー/g（CFU/g）であった（図1A）。胎便中に検出された上位15属は二次通過便中にも検出され、15属中14属が数の増加を示した（表S2）。しかし、糞便中に最も多く存在する15属のうち、相対存在量が0.05％を超えて検出されたのは5属だけであった。メコン中のコリンセラ（Collinsella）、セラチア（Serratia）、うどんこ病菌（Erysipelotrichaceae_UCG-003）、ジェメラ（Gemella）の絶対量は1000 CFU/g以下であった。Serratiaはどの糞便サンプルからも検出されなかった（Table S2）。

詳細は画像に続くキャプションを参照。
図1
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パワーポイント
キャプション
34検体を4群に分けた：真性糞便群、帝王切開真性糞便群、真性第2通過糞便群、帝王切開第2通過糞便群。絶対定量の結果、メコニウム、セカンドパス糞便ともに、真性群と帝王切開群で微生物量に有意差はなかった（図1B）。

β多様性によると、主座標分析によるBray-Curtis距離ベースの類似性分析では、メコニウムサンプルはセカンドパスフンとは別にクラスタ化されていた（図1C）。哺乳後、各第二通過糞便サンプルの距離は増加し（図1C）、乳児の腸内細菌叢の変化は出生後72時間以内に始まることが示された。

分娩様式に基づき、メコニウムとセカンドパス糞便の両方が、真珠腫群と帝王切開群に分類された。β多様性解析の結果、メコンでは、真正分娩群と帝王切開群の間に有意差は認められなかった（図1D）。しかし、セカンドパス糞便では、真性群と帝王切開群で有意差が認められた（p = 0.033）（図1D）。

分娩様式を考慮すると、バクテロイデーテス（Bacteroidetes）、プロテオバクテリア（Proteobacteria）、アクチノバクテリア（Actinobacteria）、ファーミキューテス（Firmicutes）がヒト腸内で最も一般的な4つの門として浮上する。門レベルでは、第2通過糞便の真正腔群は主にプロテオバクテリア（47.6％）、放線菌（22.6％）、ファーミキューテス（20.6％）、バクテロイデーテス（9.2％）で構成され、第2通過糞便の帝王切開群は主にファーミキューテス（58.2％）とプロテオバクテリア（40.6％）で構成されていた（図1E）。

C-セクションの菌叢数は、メコニウムからセカンドパス糞便にかけて減少し、バクテロイデーテスなど特定の菌叢で減少が観察された。また、放線菌は二次通過糞便のCセクションに大きな割合を占めることはなかったが、その平均絶対数は30,505.86 CFU/gから7,965,105.57 CFU/gへと増加した（図1E）。

今回の検討では、スパイクインプラスミド法を用いて、糞便と二次通過糞便の相対定量と絶対定量を行った。これまでの研究では、乳児期の腸内細菌叢の変化を調べるために、主に縦断的なサンプリングに焦点が当てられており[12]、特に重要なサンプルである糞便の定量分析は限られていた。そこで本研究では、糞便の定量分析を行うことで、このギャップを解決しようとした。

その結果、糞便と2次通過糞便のβ多様性には大きな違いがあることがわかった。メコニウムの各サンプルはベータ多様性において高い類似性を示したが、第2通過糞便では有意に減少した。さらに、分娩様式で層別化したところ、糞便の類似性は分娩様式に影響されなかったが、第2通過糞便では、人工授精で分娩された乳児と帝王切開で分娩された乳児の間で顕著な違いが認められた。

絶対定量を採用することで、我々は、メコニウムおよび第2通過糞便中の微生物叢組成、ならびに乳児の腸内微生物叢に対する真正分娩および帝王切開分娩の影響について、より直感的な理解を得ることができた。二次通過糞便中の微生物の絶対量は、メコン中のそれを100倍上回った。さらに、第二通過糞便サンプルの総微生物数には有意な個人差が観察されたが、メコニウムサンプル間の個人差はわずかであった。

分娩様式を考慮した場合、分娩様式は微生物種の総数には影響を及ぼさなかったが、マイクロバイオームの構成には影響を及ぼしたという結果である。72時間以内に、経膣分娩（eutocia）で生まれた乳児の腸内細菌叢は、帝王切開で生まれた乳児と比較して、より成人に近いものであった。セカンドパス糞便において、ユートシア群の放線菌とバクテロイデーテスの割合と数は、帝王切開児よりもはるかに多い。さらに、腸内細菌叢の変化は、すべての共通フィラの存在量が増加するにつれて、より安定的になることが観察された。対照的に、帝王切開児の腸内細菌叢の変化はより無秩序であり、成人の腸内に最も多く存在する門のひとつであるバクテロイデーテス門の数が減少していた。

出生前の赤ちゃんの腸内に微生物が存在するかどうかは、長年議論の対象となってきた。ケネディらは、帝王切開で出産した赤ちゃんの糞便サンプルを用いて検査を行い、出生前に細菌が存在しないことを報告した［8］。しかし、検出されないからといって必ずしも存在しないとは限らないという意見もあるだろう。なぜなら、胎児と成人（1010-1011 CFU/g）の中間的な状態（106-107 CFU/g）を発見したからである[1]。この発見は、ヒトの腸内細菌叢の確立に関する理解における重要なギャップを解決するものである。

著者貢献
Wen-Yu Jin、Jing Peng、Jinping Dai、Yi-Zhou Gao、Jielin Wangが研究の構想と設計を行った。Jing PengとJinping Daiは試料を提供した。Wen-Yu Jin、Jing Peng、Rongkang Tang、Jia-Xin Guoが実験を行った。Wen-Yu Jin、Jinping Dai、Yi-Zhou Gaoはデータを分析し、図を作成した。Wen-Yu Jin、Jing Peng、Yi-Zhou Gaoが原稿を執筆。Jinping Dai、Huan Zhao、Jielin Wang、Yi-Zhou Gao、Rongkang Tang、Wen-Yu Jinが原稿を修正した。Jing Peng、Jielin Wang、Yi-Zhou Gao、Shu Zhangが監修した。著者全員が最終原稿を読み、掲載を承認した。

謝辞
本研究は、CAS青年創新推進協会（2021264）、上海市自然科学基金（22ZR1469800）、上海市科学技術専攻プロジェクト（2019SHZDZX02）、上海セーリングプログラム（20YF1408100）の助成を受けた。

利益相反声明
著者らは利益相反がないことを宣言する。

倫理声明
倫理申請（第2023-124号）は復旦大学産科婦人科病院研究倫理委員会により承認された。

参考情報
参考文献
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