MHCII+CD80+胸腺好酸球はマウスの新生児期に増加し、その蓄積は微生物叢に依存する。

2023年9月20日 12:26

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MHCII+CD80+胸腺好酸球はマウスの新生児期に増加し、その蓄積は微生物叢に依存する。

https://academic.oup.com/jleukbio/article/114/3/223/7179558?login=false

Dominique M Gatti, Courtney M Gauthier, Brandon E Moeller, Rachael D FitzPatrick, Mia H E Kennedy, Victoria Pluzhnikova, Kate M E Conway, Julian Smazynski, Robert L Chow, Lisa A Reynolds
Journal of Leukocyte Biology, 第114巻, 第3号, 2023年9月, 223-236ページ, https://doi.org/10.1093/jleuko/qiad064
公開：2023年5月25日記事履歴
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要旨
好酸球は哺乳類の胸腺に存在するが、恒常性発生におけるこの部位での機能は不明である。我々はフローサイトメトリーを用いて、新生児期、生後後期、そして成体期に至るマウスの胸腺における好酸球（ここではSSchigh SiglecF+ CD11b+ CD45+細胞と定義する）の存在量と表現型を測定した。我々は、胸腺好酸球の総数と白血球中の頻度の両方が、生後2週にわたって増加すること、および胸腺における好酸球の蓄積は、無傷の細菌微生物叢の存在に依存していることを示した。胸腺好酸球はインターロイキン5受容体（CD125）、CD80、IDOを発現し、胸腺好酸球のサブセットはCD11cと主要組織適合複合体II（MHCII）を発現することを報告した。我々は、MHCIIを発現する胸腺好酸球の頻度は生後2週にわたって増加すること、そしてこの生後間もない時期にMHCIIを発現する胸腺好酸球の頻度が最も高いのは内側髄質領域であることを見いだした。これらのデータは、胸腺における好酸球の量と機能的能力の時間的かつ微生物叢依存的な制御を示唆している。

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好酸球、ホメオスタシス、マウス、生後発達、レパートリー発達、げっ歯類、Tリンパ球、胸腺
問題のセクション論文
1 はじめに
好酸球は骨髄由来の顆粒含有白血球の一種であり、多様な機能的役割を持つ。好酸球は、寄生虫感染やアレルギーの際の最終段階のエフェクター細胞として最もよく研究されてきたが、現在では、好酸球が恒常性の発生過程や免疫過程にも寄与していることが理解されている1-3。ホメオスタシス時には、好酸球は小腸の固有層に最も多く存在し、気道粘膜、子宮管、脂肪組織、乳腺にも常在している。例えば、好酸球はグルコース不耐性を促進し4、乳腺の管状形態形成を支持し5、腸管免疫恒常性の多くの側面を維持することが分かっている。

ヒトとマウスの胸腺に恒常性好酸球が存在することはよく知られているが9-12、恒常性発生におけるこの部位での好酸球の機能的役割は不明である。胸腺は、T細胞の発生に不可欠な間質特異的微小環境に分かれた小さなリンパ器官である。生後、胸腺は発達と拡大を続けるが、加齢とともに胸腺の細胞数と機能は低下する。ヒトでは、胸腺細胞の減少は生後2年目までに明らかになり、マウスでは、生後16週までに胸腺細胞の減少と、負の選択過程を経た発育中のT細胞（胸腺細胞）の減少が見られる13。これまでの研究で、CD11cを発現する好酸球の集団が、マウスの発育に伴って胸腺内の異なる場所に存在することが報告されており、好酸球の大部分は新生児期には皮質髄質領域に存在し、それ以降の時期には髄質で顕著になることが報告されている9。しかし、これらの発生時期に胸腺好酸球が果たす役割や、胸腺における好酸球の動員／拡大／生存を制御するシグナルは不明である。

腸内細菌叢による腸管のコロニー形成は出生時に始まり、これは免疫細胞の発達に大きな影響を及ぼす14。腸や肺の組織常在好酸球は、微生物叢と関係があることが示されている15,16。

本研究では、新生児期（本明細書では生後2週齢までと定義する）およびマウスが成体（6週齢）に達するまでの生後発育期間全体を通して、複数の時点における組織常在胸腺好酸球の表現型を包括的に特徴付けた。我々は、フローサイトメトリーを用いて、Siglec-FとCD11bの共発現と高い内部複雑性（side scatter [SSc]）の特徴から好酸球を同定し、これにより、これまで報告されていなかった胸腺好酸球のCD11c陰性亜集団を同定することができた。我々は、胸腺好酸球の生後2週間にわたる総数および白血球中の存在量の増加を報告し、胸腺好酸球の大部分がインターロイキン5受容体（IL-5R）、CD80、および酵素IDOを発現していることを見出した。さらに、このMHCIIを発現する集団は胸腺の髄質領域に濃縮され、生後2週にわたってその頻度が増加することも報告した。最後に、我々は細菌微生物叢が胸腺好酸球量の重要な調節因子であること、微生物叢のコロニー形成状態が胸腺好酸球の細胞形態に影響することを明らかにした。

2 方法
2.1 マウス
すべての動物実験はビクトリア大学の動物飼育委員会の承認を受け、Canadian Council on Animal Careの方針に従って行われた。C57BL/6JおよびBALB/cJマウスは、当初Jackson Laboratoryから入手し、その後ビクトリア大学の特定の病原体フリー条件下で飼育された。マウスは21～22日齢で離乳した（母親のいるケージから出した）。

2.2 性の決定
1～4週齢のマウスの性別は、以前に報告された方法17 に従って、ポリメラーゼ連鎖反応により確認した。簡単に言うと、50 mM NaOHと95 °Cで45分間インキュベートすることにより、耳クリップからDNAを抽出した。使用したプライマーは、F: 5′-GATGATTTGAGTGGAAATGTGAGGTA-3′ およびR: 5′-CTTATGTTTATAGGCATGCACCATGTA-3′ であり、雄マウスでは約300 bpの産物が得られ、雌マウスでは約500 bpと約700 bpの2つの産物が得られた。

2.3 抗生物質処理と腸内細菌減少の確認
妊娠ダムを抗生物質無添加の逆浸透膜飲料水（コントロール）、または0日目の膣栓の観察から出産予定日の3日前（妊娠16日目）に0.5mg/mLバンコマイシン、0.5mg/mLアンピシリン、0.5mg/mLストレプトマイシン、0.1mg/mLシプロフロキサシン（すべてGoldBio社製）を含む逆浸透膜飲料水に入れた。妊娠期間中および出生後を通じて、コントロールと抗生物質入りの飲料水を4日ごとに交換した。

子マウスの腸管内細菌量に対する抗生物質曝露の有効性を確認するため、14日齢のマウスの全大腸を採取し、QIAamp DNA Stool Mini Kit（Qiagen）を用いてDNAを抽出した。抽出したDNAをnanodropで定量し、16SリボソームRNA（rRNA）遺伝子を標的とするプライマー（F：5′-ACTCCTACGGAGGCAGCAGT-3′；R：5′-ATTACCGCGCTGCTGGC-3′）を用いて、SYBR Green Master Mix（Applied Biosystems）を用いた定量的リアルタイムポリメラーゼ連鎖反応に各サンプルのDNAを3連で用いた。16S rRNA遺伝子の相対存在量は、ハウスキーピング遺伝子β-アクチンを用いて各サンプルについて計算した（F：5′-CTCTGGCTCCTAGCACCATGAAGA-3′；R：5′-GTAAAACGCAGCTCAGTAACAGTCCG-3′）。

2.4 胸腺細胞および腸間膜リンパ節細胞のフローサイトメトリー
解剖後、胸腺と腸間膜リンパ節（mLN）をそれぞれ手作業で70μmのセルストレーナーを通して破砕し、5％ウシ血清アルブミンを含むリン酸緩衝生理食塩水（PBS）中の単一細胞懸濁液を得、血球計数器を用いて全生細胞数を測定した。胸腺細胞とmLN細胞をFixable Viability Dye（Thermo Fisher Scientific）で4℃で20分間染色した後、洗浄し、CD16/32ブロッキング抗体（Clone 93; BD Biosciences）と10分間インキュベートした。ブロッキング後、SiglecF-APC-R700（クローンE50-2440）、CD11b-FITC（クローン53-6.7）、MHCII-APC-eFluor 780（I-A/I-E；クローンM5/114.15. 2；サーモフィッシャーサイエンティフィック）、CD45-PerCP-Cy5.5（クローン30-F11）、CD11c-PV421（クローンN418）、CD125-PE（クローンT21）、CD63-APC（クローンNVG-2；サーモフィッシャーサイエンティフィック）、CD80-PE（クローン16-10A1）、CD249-FITC（Ly51；クローン6C3）、CD326-PE（EpCAM；クローンG8. 8）、UEA-1-ビオチン化（Vector Laboratories Inc；次いでストレプトアビジン-APC-Cy7）、CD19-BV420（クローン1D3）、CD172-BV785（Sirpα；クローンP84）、CD317-BV786（PDCA-1；クローン927）、CX3CR1-PE-Cy7（クローンZ8-50）、CD103-PE（クローンM290）、CD24-APCeFluor780（クローンM1/69）、TCR-β-APC（クローンH57-597；Thermo Fisher Scientific）、CD45-APC-R700（クローン30-F11）、NK1. 1-BV420（クローンPK136）、F4/80-BV420（クローンT45-2342）、Ly-6A/Ly6E-BV420（クローンD7）、CD8α-605（クローン53-6. 7）、CD4-BV785（クローンRM4-5）、CD25-FITC（クローン7D4）、CD3e-PE-Cy7（クローン145-2C11）、B220-PerCP-Cy5.5（クローンRA3-6B2）、Ly-6G/Ly-6C-PerCP-Cy5.5（クローンRB6-8C5）、SiglecF-PerCP-Cy5.5（クローンE50-2440）。使用したフローサイトメトリー抗体は、特に断りのない限りすべてBD Biosciencesのものである。細胞内染色が必要な実験では、細胞をeBioscience Foxp3/Transcription Factor Staining Buffer Set（Invitrogen社製）を用いて、製造元の指示に従って固定・透過処理した後、IDO-PE（Clone; Mido-48;Invitrogen社製）と共に暗所、4℃で30分間インキュベートし、CytoFLEXフローサイトメーター（Beckman Coulter社製）で測定した。関連する蛍光マイナス1コントロールおよび/またはアイソタイプコントロールを実験に含めた。データは、CytExpertソフトウェア・バージョン2.3（Beckman Coulter）で処理・解析した。

2.5 サイトカイン定量
胸腺サンプルは、ホモジナイズビーズとビーズミル24（Thermo Fisher Scientific）を用いて、プロテアーゼ阻害剤（complete Mini Protease Inhibitor Cocktail; Roche Diagnostics GmbH）を含む300μLのPBS中であらかじめ秤量した組織をホモジナイズすることにより調製した。ホモジネートを13,000rpmで3分間遠心し、上清を回収し、回収した上清で遠心ステップを繰り返した。得られた上清は、サイトカイン分析の前に-80℃で保存した。IL-5レベルは、マウスサイトメトリービーズアレイフレックスセットキット（BD Biosciences）を用いて、製造業者のプロトコールに従って測定した。サンプルはCytoFLEXフローサイトメーターとCytExpertソフトウェアを用いて解析した。

2.6 機械的および段階的酵素消化による胸腺分画
簡単に説明すると、無傷の胸腺をそれぞれ、0.01% w/v Liberase TL（Roche Diagnostics GmbH）およびウシ膵臓由来0.01% w/v DNAse I（DN25-1G）（Sigma-Aldrich）を含む1mLのRPMI-1640に入れ、37℃で10分間インキュベートした。インキュベーション後、胸腺をワイドボアチップを通して15～20回優しくピペッティングし、外側の細胞を解離させた。未消化の胸腺組織を沈降させ、上清を回収した。直ちに、上清を2％子牛胎児血清、2mM EDTA、0.01％NaN3を含む1mLの冷PBSと混合し、氷上に保存して分画1とした。残りの胸腺組織は、0.01% Liberase TL（Roche Diagnostics GmbH）およびウシ膵臓由来0.01% DNAse I（DN25-1G）（Sigma-Aldrich）を含む1mLのRPMI-1640を加え、37℃で10分間インキュベートすることによって繰り返し消化し、各消化後に上清を回収し、前回と同様に別々に保存した（画分2～6）。6回目の消化後、各消化細胞画分を25Gの針に5回静かに通し、70μmのセルストレーナーで手動で破砕し、すべての胸腺細胞が単独で浮遊していることを確認した。

2.7 胸腺常在好酸球と血中好酸球の区別
胸腺常在好酸球と循環好酸球を区別するために、先に述べたのと同様の血管白血球染色法を行った19。簡単に言うと、680μLの滅菌PBSに懸濁した20μgの抗CD45.2-PE（クローン104；BD Biosciences）をマウスの尾静脈（静脈内）に注射するか、あるいはマウスにPBSのみの対照注射を行った。3分後、マウスをイソフルランで麻酔し、血液凝固を防ぐためにEDTAを含むチューブに心臓穿刺で血液を採取した。マウスは頸椎脱臼により安楽死させ、mLNと胸腺を回収し、70μmのセルストレイナーを通して単細胞懸濁液とし、図の説明に従って染色し、フローサイトメトリーで解析した。ACK溶解バッファー（Gibco [Thermo Fisher Scientific]）を10:1の割合で血液に加え、室温で5分間インキュベートした。細胞は5％ウシ血清アルブミンを含むPBSで洗浄し、図の説明に従って染色し、CytoFLEXフローサイトメーターとCytExpertソフトウェアを用いてフローサイトメトリーで解析した。

2.8 糞便微生物叢移植
新鮮な糞便ペレットをC57BL/6JまたはBALBc/Jのドナーマウス（図中の凡例に示す）から採取し、ペレットを滅菌PBS中でホモジナイズし（PBS250μLあたりペレット約1個の割合）、1,500rpmで3分間遠心分離し、糞便上清を回収した。妊娠ダムはまず、糞便微生物叢移植（FMT）に備えて、胃酸を中和するために5％w/v炭酸水素ナトリウムを経口投与した。重炭酸ナトリウムの経口投与から30分後、妊娠ダムは出産予定日の5日前（C57BL/6Jマウスは妊娠16日目、BALBc/Jマウスは妊娠17日目）から3日間連続で糞便上清200μLを経口投与された。出生後14日目にそれぞれの仔マウスを安楽死させ、フローサイトメトリー解析のために胸腺を採取した。

2.9 好酸球細胞選別と染色
胸腺好酸球を濃縮するために、前述のように胸腺の単細胞懸濁液を得、CD4+ CD8+ 細胞を、CD4(L3T4)およびCD8(Ly-2)特異的磁性マイクロビーズとMACS枯渇カラムを用いて、製造者の指示に従って枯渇させた（すべてMiltenyi Biotec社製）。残りの細胞は、前述のように生細胞／死細胞および表面マーカーで染色し、好酸球はBD FACSMelodyセルソーター（BD Biosciences社製）を用いて、生細胞、一重項CD11b+ SiglecF+細胞にゲーティングして集めた。約3×104個の細胞をL-リジンコートした顕微鏡スライドに置き、1時間風乾させた後、Wright-Giemsa染色（CAMCO Quik Stain II; Cambridge Diagnostic Products, Inc）で染色し、Nikon TE-2000倒立顕微鏡を用いて明視野画像を得た。

2.10 統計分析
データセットはD'AgostinoおよびPearson検定を用いて正規性を検定した。使用した統計学的検定は図の凡例に示してあり、使用した検定は実験群の数と変数の数、データセットが正規分布しているかどうかに基づいている。統計解析はGraphPad Prism v.7（GraphPad Software）を用いて行った。外れ値／サンプルの除外は行わなかった。

3 結果
3.1 胸腺好酸球は生後数週間で増加し、サブセットはCD11cを発現しない。
好酸球がヒトとマウスの胸腺に存在することはよく知られているが、恒常性発生におけるこの部位での好酸球の機能はまだ不明である。生後発生期のマウスの胸腺における好酸球の存在量を特徴づけた以前の先駆的な研究により、胸腺好酸球はSSchigh CD11b+ CD11c+細胞であることが同定された9。この最初の発表以来、シアル酸結合Ig様レクチンSiglecFが同定され、恒常性好酸球と炎症性好酸球の両方の主要なシグネチャー表面マーカーとして採用されている1,20,21。そこで我々は、フローサイトメトリー解析により胸腺好酸球をSSchigh SiglecF+ CD11b+ CD45+生細胞として定義し（ゲーティング戦略を補足図1A, Bに示す）、セルソーティングによりこれらの細胞が好酸球と一致する形態学的特徴を持つことを確認した（補足図1C）。C57BL/6Jのブリーダーを、同じ実験日に1週齢、2週齢、3週齢、または6週齢（±1日）になるように設定し、雄と雌の子孫における胸腺好酸球の頻度と総数を定量した（図1A）。新生児期（出生から2週齢まで）、離乳期（3週齢）、そして一般的にマウスの成人期と定義される時期（6週齢）を包含するように、これらの時点における胸腺好酸球の量を特徴付けることにした。その結果、白血球の中の胸腺好酸球の頻度と胸腺好酸球の総数の両方が生後1〜2週の間に増加し、その後マウスが生後6週で成体になるにつれて胸腺好酸球の頻度は減少することがわかった（図1B、C）。生後発育を通しての胸腺好酸球のこれらのパターンは、雄マウスでも雌マウスでも一貫していた（補足図2）。

図1.
胸腺好酸球は生後数週間のうちに白血球の中で数も頻度も増加する。(A）実験タイムライン。生後1週（1W）、2W、3W、6W（±1d）のC57BL/6J雌雄マウスを安楽死させ、胸腺を採取した。(B）白血球中の胸腺好酸球（SSchighSiglecF+ CD11b+ CD45+一重生細胞）の頻度。(C）フローサイトメトリーを用いて定量した胸腺好酸球の総数。(D) サイトメトリービーズアレイで測定した胸腺組織のIL-5 pg/g。(E）CD125を発現している胸腺好酸球の割合（上）、およびCD125のアイソタイプコントロールと比較した各年齢群の好酸球におけるCD125発現レベルを示す代表的ヒストグラム（下）。(F)CD11cを発現している胸腺好酸球の割合(上)と、CD11cのアイソタイプコントロール(下)と比較した各年齢群における好酸球上のCD11c発現レベルを示す代表的なヒストグラム。データは2つの独立した実験からプールしたもので、各実験群につきn＝4〜5（B、C、E、F）またはn＝3〜5（D）。各記号は1匹のマウスのデータを表す。統計的比較は、一元配置分散分析にTukeyの多重比較検定を加えたもの（B、E、F）、Kruskal-Wallis検定にDunnの多重比較検定を加えたもの（C）、またはMann-Whitney検定（D）を用いて行った。* = p < 0.05, ** = p < 0.01, *** = p < 0.001, **** = p < 0.0001. (A)の図は、BioRender.comの画像を用いて作成した。
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胸腺好酸球は生後数週間のうちに白血球の中で数も頻度も増加する。(A）実験タイムライン。生後1週（1W）、2W、3W、6W（±1d）のC57BL/6J雌雄マウスを安楽死させ、胸腺を採取した。(B）白血球中の胸腺好酸球（SSchighSiglecF+ CD11b+ CD45+一重生細胞）の頻度。(C）フローサイトメトリーを用いて定量した胸腺好酸球の総数。(D) サイトメトリービーズアレイで測定した胸腺組織のIL-5 pg/g。(E）CD125を発現している胸腺好酸球の割合（上）、およびCD125のアイソタイプコントロールと比較した各年齢群の好酸球におけるCD125発現レベルを示す代表的ヒストグラム（下）。(F)CD11cを発現している胸腺好酸球の割合(上)と、CD11cのアイソタイプコントロール(下)と比較した各年齢群における好酸球上のCD11c発現レベルを示す代表的なヒストグラム。データは2つの独立した実験からプールしたもので、各実験群につきn＝4〜5（B、C、E、F）またはn＝3〜5（D）。各記号は1匹のマウスのデータを表す。統計的比較は、一元配置分散分析にTukeyの多重比較検定を加えたもの（B、E、F）、Kruskal-Wallis検定にDunnの多重比較検定を加えたもの（C）、またはMann-Whitney検定（D）を用いて行った。* = p < 0.05, ** = p < 0.01, *** = p < 0.001, **** = p < 0.0001. (A)の図はBioRender.comの画像を用いて作成した。

IL-5は好酸球の生物学の多くの側面を制御している。このサイトカインは骨髄前駆細胞からの好酸球生成を支持し、組織への好酸球の動員を制御し、好酸球の生存を延長する。細胞測定ビーズアレイを用いて、我々はマウスの生後2週間の胸腺ホモジネート中に検出可能なレベルのIL-5を見出した（図1D）。さらに、ほとんどの胸腺好酸球は生涯を通じてIL-5レセプター（CD125）の発現を維持していることがわかった（図1E）。このことは、IL-5シグナルが恒常性発生の間に胸腺好酸球の蓄積に影響を与える可能性を示唆している。

注目すべきは、我々の好酸球のゲーティング戦略によって、CD11cを発現しない胸腺好酸球の集団を同定することができたことである。この集団は特に生後早い時期に顕著で、マウスの加齢とともにその頻度は減少した（図1F）。

3.2 CD11c-胸腺好酸球集団は組織常在で循環していない
血液中を循環する好酸球はCD11cを発現しないことが知られている1。われわれは、われわれが同定したCD11c-好酸球集団が本当に胸腺に常在しているのか、あるいはフローサイトメトリー解析前の胸腺採取時に胸腺血管内を循環していたのかを明らかにしたいと考えた。これを検証するために、我々はPE蛍光標識CD45抗体をマウスに静脈注射し、すべての血中白血球（好酸球を含む）を標識した。この戦略により、血液中の白血球の96％以上がPE蛍光で標識され、mLN中の白血球のバックグラウンド染色は最小限であることが確認された（Fig.）抗CD45-PEを注射したマウスから採取した胸腺では、好酸球の1％未満がCD45-PEで標識された（図2D）。さらに、好酸球の総集団をCD11c+とCD11c-の亜集団に分けたところ、CD11c-胸腺好酸球の大部分はCD45-PEで標識されなかった（図2E）。したがって、我々のデータから、胸腺好酸球はCD11c+とCD11c-の集団からなり、ともに組織常在性であることが明らかになった。

図2.
組織常在好酸球はCD11c+とCD11c-のサブセットを含む。(A）実験概略図。成体（6～7週齢）のC57BL/6J雌雄マウスにPEで蛍光標識した抗CD45を注射するか、対照としてPBSを注射し、3分後に犠牲にした。その後、血液、胸腺、mLNをフローサイトメトリー解析のために採取した。(B）PBS（左）または抗CD45-PE（右）を注射したマウスの血液の代表的なフローサイトメトリーのドットプロット。(C) 抗CD45-PEを注射したマウスの血液およびmLN中の全白血球中のPE標識白血球（CD45+細胞）の割合。(D) 抗CD45-PEを注射したマウスの胸腺好酸球の代表的なフローサイトメトリーのドットプロット（左）と、胸腺好酸球のうちPEで標識されたものとされなかったものの割合（右）。(E) 胸腺好酸球の代表的なフローサイトメトリーのドットプロット（左）は、CD11c+およびCD11c-好酸球のPE標識状態、およびCD11c+でPE標識されていない（胸腺常在好酸球[Thy. Eos]）、CD11c- PE標識されていない好酸球（Thy. Eos）、およびCD11c- PE標識された好酸球（循環好酸球[Blood Eos]）が胸腺組織で検出された全好酸球に占める割合（右）。データは2つの独立した実験からプールしたもので、各実験グループのnは3～4である。エラーバーは標準誤差を示す。統計的比較は、対応のないt検定（C、D）および一元配置分散分析にTukeyの多重比較検定（E）を用いて行った。(A)の図は、BioRender.comの画像を用いて作成した。
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組織常在好酸球にはCD11c+とCD11c-のサブセットがある。(A）実験概略図。成体（6〜7週齢）のC57BL/6J雌雄マウスにPEで蛍光標識した抗CD45を注射するか、コントロールとしてPBSを注射し、3分後に犠牲にした。その後、血液、胸腺、mLNをフローサイトメトリー解析のために採取した。(B）PBS（左）または抗CD45-PE（右）を注射したマウスの血液の代表的なフローサイトメトリーのドットプロット。(C) 抗CD45-PEを注射したマウスの血液およびmLN中の全白血球中のPE標識白血球（CD45+細胞）の割合。(D) 抗CD45-PEを注射したマウスの胸腺好酸球の代表的なフローサイトメトリーのドットプロット（左）と、胸腺好酸球のうちPEで標識されたものとされなかったものの割合（右）。(E) 胸腺好酸球の代表的なフローサイトメトリーのドットプロット（左）は、CD11c+およびCD11c-好酸球のPE標識状態、およびCD11c+でPE標識されていない（胸腺常在好酸球[Thy. Eos]）、CD11c- PE標識されていない好酸球（Thy. Eos）、およびCD11c- PE標識された好酸球（循環好酸球[Blood Eos]）が胸腺組織で検出された全好酸球に占める割合（右）。データは2つの独立した実験からプールしたもので、各実験グループのnは3～4である。エラーバーは標準誤差を示す。統計的比較は、対応のないt検定（C、D）および一元配置分散分析にTukeyの多重比較検定（E）を用いて行った。(A)の図はBioRender.comの画像を用いて作成した。

3.3 胸腺好酸球は各発達時期で異なる細胞表現型とタンパク質発現表現型を示す
次に、胸腺好酸球が1週齢、2週齢、3週齢、6週齢のマウスで異なる細胞特性やタンパク質発現を示すかどうかを評価したかった。我々はまず、細胞の粒状性と内部の複雑さの指標としてSSc値を用いて胸腺好酸球の内部の複雑さを調べた。その結果、胸腺好酸球のSSc値はマウスの加齢とともに増加し続け（補足図3A）、マウスの一生の間に胸腺の好酸球が明確な成熟の変化を経ている可能性が示された。

過去の文献では、CD63は好酸球を含む数種類の白血球の細胞分泌や脱顆粒と関連している23。胸腺環境における細胞表面CD63発現の機能的意義はまだわかっていないが、興味深いことに、マウスの生後2週目には胸腺好酸球の半数以上が細胞表面CD63を発現しており、一方、細胞表面CD63を発現する好酸球の頻度および細胞表面CD63の発現レベルはマウスの加齢とともに減少することがわかった（補足図3B）。これらのデータを総合すると、胸腺好酸球はマウスの加齢に伴って成熟／活性化状態に変化が起こることが示唆される。

次に、発育中の胸腺細胞や他の胸腺常在細胞との相互作用を媒介する可能性のある、胸腺好酸球による様々なタンパク質の発現に変化があるかどうかを調べた。これまでの研究で、胸腺好酸球の集団によるMHCIIの発現が報告されており9、胸腺において抗原提示細胞として機能する可能性が示唆されている。しかし、胸腺好酸球のMHCII発現パターンが生後発育期を通じてどのように変化するかについては、これまで報告がなかった。我々は、生後1週目から2週目にかけてMHCIIを発現する胸腺好酸球の割合が有意に増加することを見出し（図3A、B）、これらのMHCII発現パターンはCD11c+およびCD11c-好酸球亜集団のいずれにも当てはまった（補足図4）。さらに、ほとんどの胸腺好酸球は、評価したすべての時点でT細胞コスティミュレイトリー分子CD80を発現していたが、マウスの加齢とともに発現レベルは低下していた（図3C）。この酵素は様々な文脈でT細胞の活性化と分化過程に影響を及ぼすことが示されているが24、胸腺好酸球によるIDO発現の機能的帰結はまだ不明である。これらの知見は、好酸球が発達中のT細胞との相互作用を可能にするタンパク質を発現していることを示しており、胸腺好酸球が生後発達の異なる時期に異なる機能的能力を持つことを示唆している。

図3.
胸腺好酸球は異なる発生時期において異なるタンパク質発現パターンを示す。1週齢（1W）、2W齢、3W齢、6W齢（±1d）のC57BL/6J雌雄マウスを安楽死させ、胸腺を採取した。(A）各齢群における全好酸球（SSchighSiglecF+ CD11b+ CD45+ 一重項生細胞）中のMHCII発現好酸球の頻度を示す代表的なフローサイトメトリーのドットプロット。(B-D）MHCII（B）、CD80（C）、IDO（D）を発現する胸腺好酸球の割合（左）、それぞれの蛍光強度の中央値（中）、および代表的なヒストグラム（右）。データは2つの独立した実験からプールしたもので、各実験群につきn＝4～5。各記号は1匹のマウスのデータを示す。統計的比較は、一元配置分散分析にTukeyの多重比較検定を加えたもの（B + C、左）、およびKruskal-Wallis検定にDunnの多重比較検定を加えたもの（B + C、中；D、左および中）を用いて行った。* = p < 0.05、** = p < 0.01。
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胸腺好酸球は、発育時期によって異なるタンパク質発現パターンを示す。1週齢（1W）、2週齢、3週齢、6週齢（±1d）のC57BL/6J雌雄マウスを安楽死させ、胸腺を採取した。(A）各齢群における全好酸球（SSchighSiglecF+ CD11b+ CD45+ 一重項生細胞）中のMHCII発現好酸球の頻度を示す代表的なフローサイトメトリーのドットプロット。(B-D）MHCII（B）、CD80（C）、IDO（D）を発現する胸腺好酸球の割合（左）、それぞれの蛍光強度の中央値（中）、および代表的なヒストグラム（右）。データは2つの独立した実験からプールしたもので、各実験群につきn＝4～5。各記号は1匹のマウスのデータを示す。統計的比較は、一元配置分散分析にTukeyの多重比較検定を加えたもの（B + C、左）、およびKruskal-Wallis検定にDunnの多重比較検定を加えたもの（B + C、中；D、左および中）を用いて行った。* = p < 0.05、** = p < 0.01。

3.4 MHCII+胸腺好酸球が最も多く存在するのは胸腺髄質である。
胸腺は、T細胞の発生において機能的に異なる役割を持つ、異なる微小環境に分離されている。胸腺微小環境とそれに対応する好酸球の細胞表面発現を同定することで、胸腺好酸球がどのようなプロセスに関与しているかが示唆されるかもしれない。2週齢のC57BL/6Jマウスの胸腺を酵素的・機械的に消化し、既述のプロトコルを用いて胸腺の異なる領域を濃縮した18。最初の画分は胸腺被膜と胸腺皮質領域に見られる細胞が濃縮され、最後の画分は胸腺髄質領域に見られる細胞が濃縮された（図4A）。フローサイトメトリーを用いて各分画中の皮質胸腺上皮細胞と髄質胸腺上皮細胞の総数を定量することにより（図4B）、これらの分画が異なる胸腺領域に濃縮されていることを確認したところ、最も内側の髄質分画に最も多くの好酸球が存在することがわかった（図4B、C）。さらに、各胸腺分画でMHCIIを発現している胸腺好酸球の総数と割合を定量したところ、最内側髄質領域にMHCII+胸腺好酸球の総数とMHCIIを発現している好酸球の割合の両方が最も多いことがわかった（図4D）。これらのデータは、異なる表面タンパク質発現プロファイルを持つ好酸球の集団が、新生児胸腺内の異なる場所に濃縮されていることを明らかにしている。胸腺細胞の負の選択は主に胸腺髄質で起こるので、我々の所見は、好酸球がこの領域でMHCIIを介した抗原提示を通してこのプロセスに貢献している可能性と一致している。

図4.
MHCII+胸腺好酸球は幼少期に胸腺の髄質領域で最も多く見られる。(A）実験概略図。生後2週（±1日）のC57BL/6J雌雄マウスから胸腺を採取し、酵素的・機械的に消化して6つの画分に分けた；画分番号（fraction no.）1～6。(B）各画分中の皮質胸腺上皮細胞（cTEC）（UEA-Ly51＋EpCAM＋CD45-生細胞）、髄質胸腺上皮細胞（mTEC）（UEA＋Ly51-EpCAM＋CD45-生細胞）、好酸球（SSchighSiglecF＋CD11b＋CD45＋一重項生細胞）の総数をフローサイトメトリーで定量した。(C）各胸腺分画における代表的なフローサイトメトリーのドットプロット。(D）各胸腺分画におけるMHCII+胸腺好酸球の総数（左）およびMHCII発現好酸球の頻度（右）。示されたデータは1つの実験から得られたもので、各実験群につきn = 3から4で、それぞれ独立した2つの実験から得られたデータの代表である。各記号は、与えられた胸腺分画の全マウスの中央値（D、左）または平均値（B、左右；D、右）を表し、エラーバーは標準偏差を示す。統計的比較は、一元配置分散分析にTukeyの多重比較検定を加えたもの（B、右；D、右）、およびKruskal-Wallis検定にDunnの多重比較検定を加えたもの（D、左）を用いて行った。* = p < 0.05、** = p < 0.01、*** = p < 0.001。(A)の図は、BioRender.comの画像を用いて作成した。
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MHCII+胸腺好酸球は、幼少期には胸腺の髄質領域に最も多く存在する。(A）実験概略図。生後2週（±1日）のC57BL/6J雌雄マウスから胸腺を採取し、酵素的および機械的に消化して6つの画分に分けた；画分番号（画分番号）1〜6。(B）各画分中の皮質胸腺上皮細胞（cTEC）（UEA-Ly51＋EpCAM＋CD45-生細胞）、髄質胸腺上皮細胞（mTEC）（UEA＋Ly51-EpCAM＋CD45-生細胞）、好酸球（SSchighSiglecF＋CD11b＋CD45＋一重項生細胞）の総数をフローサイトメトリーで定量した。(C）各胸腺分画における代表的なフローサイトメトリーのドットプロット。(D）各胸腺分画におけるMHCII+胸腺好酸球の総数（左）およびMHCII発現好酸球の頻度（右）。示されたデータは1つの実験から得られたもので、各実験群につきn = 3から4で、それぞれ独立した2つの実験から得られたデータの代表である。各記号は、与えられた胸腺分画の全マウスの中央値（D、左）または平均値（B、左右；D、右）を表し、エラーバーは標準偏差を示す。統計的比較は、一元配置分散分析にTukeyの多重比較検定を加えたもの（B、右；D、右）、およびKruskal-Wallis検定にDunnの多重比較検定を加えたもの（D、左）を用いて行った。* = p < 0.05、** = p < 0.01、*** = p < 0.001。(A)の図はBioRender.comの画像を用いて作成した。

3.5 胸腺好酸球量と表面マーカー発現におけるマウス系統の違い
発育中の胸腺細胞は、胸腺内を移動する際に明確な段階を経る：まずCD4とCD8の両方の表面発現を欠き（二重陰性）、次に両方の表面マーカーを同時に発現し（二重陽性）、最後にこれらのマーカーの一方の発現を停止し、それぞれCD4またはCD8の細胞表面での継続的な発現を維持することにより、Tヘルパーまたは細胞傷害性T細胞の運命にコミットする（単一陽性[SP]）。周産期および新生児期のマウスでは、野生型C57BL/6と野生型BALB/cマウス系統の間で、CD4 SPとCD8 SPの胸腺細胞の比率に顕著な違いがあることが報告されている25。したがって、胸腺好酸球の存在量と表現型がマウス系統間で異なるかどうかを調べることが重要であると考えた。その結果、C57BL/6JマウスとBALB/cJマウスの胸腺白血球の中で胸腺好酸球の頻度には顕著な違いがあり、2週齢と6週齢の両方で、また男女ともにC57BL/6Jマウスの方が胸腺好酸球の頻度が有意に高かった（図5A、B；補足図5A）。さらに、異なるマウス系統間で胸腺好酸球の表現型にわずかな違いがあり、BALB/cJマウスではMHCIIを発現する胸腺好酸球の割合が6週齢のC57BL/6Jマウスに比べてわずかに高く（図5C）、C57BL/6JマウスではCD11cを発現する胸腺好酸球の頻度が2週齢と6週齢の両方でBALB/cJマウスに比べて高かった（図5D）。

図5.
胸腺好酸球の量と表面マーカー発現におけるマウス系統の違い。2週齢（2W）および6W齢（±1d）のC57BL/6JおよびBALB/cJマウスから胸腺を採取し、フローサイトメトリーを用いて解析した。(A)6W齢マウスの代表的フローサイトメトリードットプロットは、灰色で示した白血球（CD45+）のうち、黒色で示した胸腺好酸球（SSchighSiglecF+ CD11b+ CD45+ 一重項生細胞）の頻度を示す。 (B)2W齢マウス（左）と6W齢マウス（右）の全胸腺白血球のうち、胸腺好酸球の頻度。(C、D）MHCII（C）およびCD11c（D）を発現する胸腺好酸球の割合。2W齢のマウスのデータは1回の実験から得られたもので、1実験群あたりn = 4から5、6W齢のマウスのデータは2回の独立した実験から得られたもので、1実験群あたりn = 6から8。各記号は1匹のマウスのデータを示す。統計学的比較は、Mann-Whitney検定（B、左右；C、右；D、左右）および対応のないt検定（C、左）を用いて行った。* = p < 0.05, ** = p < 0.01, *** = p < 0.001, **** = p < 0.0001.
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胸腺好酸球量と表面マーカー発現におけるマウス系統の違い。2週齢（2W）と6W齢（±1d）のC57BL/6JマウスとBALB/cJマウスから胸腺を採取し、フローサイトメトリーを用いて解析した。(A)6W齢マウスの代表的フローサイトメトリードットプロットは、灰色で示した白血球（CD45+）のうち、黒色で示した胸腺好酸球（SSchighSiglecF+ CD11b+ CD45+ 一重項生細胞）の頻度を示す。 (B)2W齢マウス（左）と6W齢マウス（右）の全胸腺白血球のうち、胸腺好酸球の頻度。(C、D）MHCII（C）およびCD11c（D）を発現する胸腺好酸球の割合。2W齢のマウスのデータは1回の実験から得られたもので、1実験群あたりn = 4から5、6W齢のマウスのデータは2回の独立した実験から得られたもので、1実験群あたりn = 6から8。各記号は1匹のマウスのデータを示す。統計学的比較は、Mann-Whitney検定（B、左右；C、右；D、左右）および対応のないt検定（C、左）を用いて行った。* = p < 0.05, ** = p < 0.01, *** = p < 0.001, **** = p < 0.0001.

周産期の腸管における恒常性好酸球の表現型と肺における恒常性好酸球の蓄積は、細菌微生物叢に影響されることが示されている6,8。C57BL/6JマウスとBALB/cJマウスの生後間もない時期における微生物叢組成の違いが、胸腺好酸球集団の違いに関与しているかどうかを調べるために、妊娠末期の数日間に、同系統または反対系統のドナーマウスから妊娠レシピエントマウスへの経口FMTを行った（補足図5B）。得られた仔マウスが2週齢に達した時点で胸腺好酸球集団を調べたところ、系統間のFMTが胸腺好酸球の量や表面マーカー発現に影響を与えることを示唆する証拠は見つからなかった： 2週齢のBALB/cJマウスは、C57BL/6Jマウスよりも胸腺好酸球の頻度が低く、CD11cを発現する胸腺好酸球の頻度もわずかに低かった。5CからE）。したがって、C57BL/6JマウスとBALB/cJマウスの胸腺好酸球集団の差は、異なる微生物叢組成への曝露が主な要因であるとは考えにくく、その代わりに遺伝的要因が胸腺好酸球量の系統差に寄与している可能性が高い。C57BL/6Jマウスでは胸腺好酸球がより豊富であることがわかったので、生後発育中の胸腺好酸球量の増加に寄与するシグナルを調べるために、この系統のマウスを使うことにした。

3.6 抗生物質による細菌マイクロバイオームの減少が、生後早期の胸腺好酸球の量を減少させる
C57BL/6Jマウスで胸腺好酸球の増加が観察された新生児期には、腸管の細菌コロニー形成が着実に増加していた。そこで次に、細菌微生物叢によるコロニー形成が、早期の胸腺好酸球増加を制御する刺激であるかどうかを検討した。細菌性微生物叢を枯渇させるため、妊娠中のダムを生前および生後期間中、幅広いスペクトルの抗生物質カクテルで処理し、仔マウスが2週齢に達した時点で、抗生物質に曝露しなかった対照マウスと比較して、その子孫の胸腺好酸球を評価した（図6A）。その結果、ダムを抗生物質に曝露すると、2週齢の仔マウスの大腸における細菌16S rRNA遺伝子の存在量が劇的に減少することが確認された（図6B）。また、抗生物質を投与した仔マウスは、コントロールマウスと比較して、胸腺好酸球の頻度と総数が有意に低いことがわかった（図6C〜E）。次に、他の胸腺細胞集団に対する細菌叢減少の影響を調べた。これまでに報告されているように27,28、抗生物質に曝露した仔マウスでは、微生物抗原を腸から胸腺に輸送することが報告されているCX3CR1+樹状細胞（DC）の頻度が有意に減少していることが観察され27、抗生物質に曝露した仔マウスでは、全DCおよび形質細胞様DC（pDC）の頻度に変化はなく、胸腺細胞集団に大きな混乱は見られなかった（補足図6）。

図6.
生後早期の細菌叢枯渇は胸腺好酸球量の減少と関連している。(A）実験概略図。妊娠中のC57BL/6Jマウスに、コントロールの飲料水または広域スペクトル抗生物質のカクテルを含む飲料水を出生前および出生後に与えた。雌雄それぞれの仔マウスを2週齢（±1日）で犠牲にし、胸腺をフローサイトメトリーで解析した。(B)仔の全大腸から全DNAを抽出し、定量的リアルタイムポリメラーゼ連鎖反応を用いて相対的16S rRNA遺伝子量を測定した。(C) 代表的なフローサイトメトリーのドットプロットは、灰色で示した白血球（CD45+）のうち、黒色で示した胸腺好酸球（SSchighSiglecF+ CD11b+ CD45+ 一重項生細胞）の頻度を示した。 (D) 胸腺白血球のうち、胸腺好酸球の頻度。(E）胸腺好酸球の総数。(F）胸腺好酸球のSSc値。(G）MHCIIを発現する胸腺好酸球の割合。示したデータは3つの独立した実験からプールしたもので、各実験群につきn＝5から10である。各記号は1匹のマウスのデータを示す。統計的比較は、Mann-Whitney検定（B、E）および対応のないt検定（D、F、G）を用いて行った。** = p < 0.01, *** = p < 0.001, **** = p < 0.0001。(A)の図は、BioRender.comの画像を用いて作成した。
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幼児期における細菌叢の枯渇は、胸腺好酸球量の減少と関連している。(A）実験概略図。妊娠中のC57BL/6Jマウスに、コントロールの飲料水または広域抗生物質のカクテルを含む飲料水を出生前および出生後に与えた。雌雄それぞれの仔マウスを2週齢（±1日）で犠牲にし、胸腺をフローサイトメトリーで解析した。(B)仔の全大腸から全DNAを抽出し、定量的リアルタイムポリメラーゼ連鎖反応を用いて相対的16S rRNA遺伝子量を測定した。(C) 代表的なフローサイトメトリーのドットプロットは、灰色で示した白血球（CD45+）のうち、黒色で示した胸腺好酸球（SSchighSiglecF+ CD11b+ CD45+ 一重項生細胞）の頻度を示した。 (D) 胸腺白血球のうち、胸腺好酸球の頻度。(E）胸腺好酸球の総数。(F）胸腺好酸球のSSc値。(G）MHCIIを発現する胸腺好酸球の割合。示したデータは3つの独立した実験からプールしたもので、各実験群につきn＝5から10である。各記号は1匹のマウスのデータを示す。統計的比較は、Mann-Whitney検定（B、E）および対応のないt検定（D、F、G）を用いて行った。** = p < 0.01, *** = p < 0.001, **** = p < 0.0001。(A)の図はBioRender.comの画像を用いて作成した。

胸腺好酸球の表現型を解析したところ、抗生物質に曝露した仔の好酸球はコントロールの仔と比較してSSc値が減少しており、これは無傷の細菌微生物叢が存在しない場合、好酸球の細胞内複雑性が低いことを示している（図6F）。さらに、抗生物質に曝露された仔マウスでは、MHCIIを発現する胸腺好酸球の頻度が対照動物に比べて有意に低いことがわかった（図6G）。まとめると、生後間もない時期に無傷の細菌微生物叢をコロニー形成することで、胸腺の好酸球の表現型と量が制御されることがわかった。

4 考察
この研究では、好酸球をSiglecF+ CD11b+ SSchi CD45+細胞と定義し、新生児期、生後、成体期におけるマウスの胸腺好酸球の蓄積と表現型を特徴付けた。我々は、胸腺好酸球の総数と他の胸腺白血球中の頻度の両方において、2週齢に有意なピークがあることを報告した。マウス胸腺好酸球をCD11b+ CD11c+細胞として定義した以前の報告では、これらの細胞の存在量における同様の初期ピークが報告されている。血中好酸球はCD11cを発現しないことが知られている29,30。したがって、組織中の好酸球にCD11cが存在しないことが、血中からの好酸球の最近の侵入を規定していると推測されてきた29。ここで我々は、胸腺のほとんどの好酸球がCD11c+であったのに対し、組織常在胸腺好酸球の亜集団はCD11c-であったことを示し、CD11c発現の欠如は循環から胸腺に最近入った好酸球を反映していると考えるのが妥当である。

マウスの時間経過研究から、1日齢のマウスでは好酸球は胸腺にほとんど存在しないことが明らかになっており、胸腺好酸球が出生前に発達しているとは考えにくいことが示唆されている9。したがって、生後から成体に至るまで、胸腺好酸球は他の恒常性好酸球と同様、骨髄造血幹細胞に由来し、成熟した好酸球として血液中に3～24時間の短期間流入した後、組織に移行する可能性が高い31。恒常性好酸球は、組織によってIL-5依存的あるいはIL-5非依存的に、肺、腸、脂肪組織、子宮、乳腺に移動する1,32。IL-5が、恒常性発生の過程で好酸球が胸腺に移動するのに重要であるかどうかは、まだわかっていない。最近、成体マウスにおいて、ILC2がIL-5の胸腺内供給源であることが報告された。さらに、この成体胸腺損傷モデルにおいて、成体ILC2欠損マウス（Rorasg/floxIl7rCre/+）では野生型マウスと比較して胸腺好酸球の数が減少している。IL-5が恒常的な胸腺好酸球にどのような影響を及ぼしているのかはまだ研究されていない。しかしながら、IL-5が果たしうる役割としては、好酸球の胸腺への動員や血液からの侵入、好酸球の増殖、成熟、生存などがあるが、これらに限定されるものではない。

胸腺常在好酸球の決定的な役割または一連の役割はまだ決定されていない。好酸球が減少すると胸腺のアポトーシス細胞クリアランスが障害されること34、また、MHCI依存性ネガティブセレクションの急性モデルにおいて胸腺好酸球の数が急速に増加すること9が以前に報告されている。

我々は、生後発達を通して、胸腺好酸球のかなりの割合がMHCIIを発現し、MHCIIを発現する好酸球の頻度は生後2週にわたって増加し、MHCIIを発現する好酸球の大部分は胸腺の髄質に存在することを示した。これらの観察から、胸腺好酸球の機能的役割は、発達中のT細胞に抗原を提示することである可能性が浮上する。いくつかの実験的アレルギーモデル系では、抗原を負荷した好酸球がプライム化T細胞に抗原を提示し、Tヘルパー2サイトカイン産生を増加させることが示されている35,36。寄生蠕虫感染モデルでは、in vitroで培養した好酸球にStrongyloides stercoralis抗原をパルスすると、MHCIIの発現を劇的に上昇させることが示されている37。

胸腺では、MHCIIの発現は発育中の胸腺細胞への抗原提示に不可欠である。DC、皮質胸腺上皮細胞、および髄質胸腺上皮細胞はすべて、胸腺細胞の選択過程においてMHCIIとT細胞受容体（TCR）の結合を利用している38,39。さらに我々は、胸腺好酸球の大部分が生涯を通じてコスティミュレイトリー分子CD80を発現していることを明らかにしている。単細胞RNA配列決定を用いた最近の研究では、腸好酸球が「活性化」表現型を示すとCD80の転写をアップレギュレートすることが判明した32。胸腺では、中心的寛容を促進するために、発達中の胸腺細胞にCD28が関与するためには、コスティミュレイトリー分子CD80/CD86が必要である40。したがって、胸腺好酸球におけるMHCIIとCD80の発現の組み合わせは、これらの細胞が抗原提示を通じて、発達中の胸腺細胞のレパートリーに影響を与える能力を持つことを示唆しており、注目に値する。

胸腺細胞は、胸腺の様々な微小環境で発生する多くの段階を経る。例えば、髄質では、抗原提示細胞がCD4またはCD8系譜にコミットした単一の陽性発育胸腺細胞に抗原を提示する選択的過程が起こる。われわれは、胸腺好酸球の大部分が胸腺内部の髄質領域に存在することを発見し、これらの領域に存在する好酸球が最も高い頻度でMHCIIを発現することを初めて示した。したがって、胸腺好酸球の位置と表面マーカー発現の両方から、少なくとも胸腺好酸球の亜集団がCD4+胸腺細胞に特異的な選択過程に参加している可能性が示唆される。発育中の胸腺細胞のTCRレパートリーに影響を及ぼす胸腺好酸球の能力を証明するための今後の研究には、胸腺好酸球が発現しているMHCII分子のペプチド配列を同定することが含まれるべきである。しかしながら、胸腺における好酸球の稀少性から、これは困難であろう。また、我々のデータから、異なる機能的役割を持つ可能性のある胸腺好酸球の亜集団が明らかになったので、さらに困難である。

好酸球は、シグナル伝達やサイトカイン産生を介して、T細胞などの他の免疫細胞に対して免疫調節作用を引き起こすことが示されている、非常に汎用性の高い細胞タイプである37,43。興味深いことに、我々はマウスにおいて、ほとんどの胸腺好酸球がIDOという酵素を発現していることを示している。IDOの発現は、トリプトファンをT細胞の停止やアポトーシスを引き起こすキヌレニン代謝産物に異化することにより、T細胞応答を制御することと関連している44,45。トリプトファン代謝産物であるキヌレニンは胸腺で検出可能であり10,46、培養においてキヌレニンはTヘルパー1/2バランスをタイプ2免疫に有利なようにシフトさせることが示されている46。マウス胸腺好酸球が生後ずっとIDOを発現しているという我々の観察は、先天性心疾患のために選択的開心術を受けた小児を対象とした以前の研究と一致している。このことは、マウスやヒトの胸腺好酸球が、T細胞集団の制御に重要な免疫調節能力を持つ可能性を示唆している。この可能性に代わるものとして、IDOの発現は、まだ解明されていない胸腺好酸球に存在するシグナル伝達カスケードに不可欠なものである可能性がある47。例えば、pDCでは、IDOはその酵素活性とは独立した経路で、SHP-1とSHP-2をリクルートしてトランスフォーミング増殖因子β1の転写経路を活性化することにより、サイトカインシグナルに応答するシグナル伝達物質として働くことができる48。このように、胸腺好酸球によるIDO発現は、代謝産物産生を介して、あるいは未同定の経路を介した非酵素的シグナル伝達活性を介して、T細胞集団を調節する好酸球の特異的な調節的役割を与える可能性がある。

好酸球と腸内細菌叢や肺細菌叢の細菌種との関係の複雑さが明らかになりつつある15,16。例えば、好酸球集団は、病原体であるヘリコバクター・ピロリ49やシトロバクター・ロデンティウム32による腸管のコロニー形成や、特定の病原体を含まない細菌叢による無菌マウスのコロニー形成に反応して、表面マーカーに変化を示す6。無菌マウスは、特定の病原体を持たない対照マウスと比較して、腸内の好酸球の数が多いことが示されており、微生物叢が好酸球集団の増殖を抑制できることが示唆されている50が、特に別の研究では、無菌マウスは特定の病原体を持たない対照マウスと同程度の好酸球頻度を保有していた6。

組織常在好酸球は出生前には肺に存在しないが、生後1週間を経て徐々に肺での存在量が増加する8。この時期が微生物叢の確立と一致することから、肺における恒常的好酸球蓄積は微生物叢によって制御されているのではないかと推測されている1。喘息51、慢性閉塞性肺疾患52、アレルギー性鼻炎53などの呼吸器疾患との関連において、肺微生物叢内の特定の細菌群の存在量と好酸球頻度との間に相関があることが報告されているが、同様に、これらは依然として関連であり、これらの関係の潜在的な因果関係は未検証のままである。われわれのデータは、細菌微生物叢が生後早期の好酸球の胸腺への集積に影響を及ぼすことを示しており、これは微生物叢が腸内常在好酸球にどのように影響を及ぼすかについて以前に述べた観察と一致している。しかしながら、微生物叢が肺などの他の組織における恒常的な好酸球の蓄積に影響を及ぼすかどうかはまだ不明である。

ヒトでは、T細胞レパートリーの確立は、生後早期の微生物叢の安定化と同時である54,55。マウスモデルを用いた研究では、抗生物質投与マウスと無菌マウスでは、腸管TCRレパートリーの発現が異なり、T細胞の発達が変化するなど、生後早期の微生物叢の影響が強調されている56,57。われわれのデータは、細菌微生物叢と胸腺好酸球との新しい関係を示しており、広域抗生物質カクテルを用いた抗生物質の枯渇は、生後早期の胸腺好酸球の蓄積を減少させる。この以前の研究では、抗生物質を介した腸内細菌叢の枯渇により、胸腺におけるCX3CR1+ DCおよび微生物叢由来抗原の数が有意に減少した27。将来的には、胸腺のCX3CR1+ DCや好酸球の集団が、抗生物質への曝露が中止され、腸内細菌叢が再確立された後、回復するかどうかを調べることも可能であろう。しかし、胸腺のCX3CR1+ DCや好酸球集団が生後に回復することで、新生児期のこれらの細胞タイプの機能的活性が回復するかどうかは不明である。

まとめると、我々の研究は、マウスの生後発育を通しての胸腺好酸球の蓄積を包括的に特徴付け、マウスの加齢に伴う胸腺好酸球の表現型の変化を記述している。我々は、胸腺好酸球の亜集団が、発達中の胸腺細胞との直接的な相互作用を促進しうるマーカーを発現していることを報告した。さらに、我々は細菌微生物叢が、生後早期における胸腺好酸球量の重要な調節因子であることを明らかにした。この分野での今後の研究は、細菌微生物叢が胸腺好酸球の蓄積に影響を及ぼすメカニズムの確立と、胸腺好酸球が生後早期のT細胞レパートリーに影響を及ぼすかどうかの検討に焦点を当てるべきである。出生後の発達における胸腺好酸球の機能的役割を確立することは、特に好酸球増多症の治療を受けている患者にとって極めて重要であろう。

謝辞
図中の抄録といくつかの図式はBioRender.comを用いて作成した。本研究で使用した動物に素晴らしいケアを提供してくれたビクトリア大学動物ケアチームのメンバーに感謝するとともに、特にいくつかの動物実験に技術的支援を提供してくれたJenn MacDonaldに感謝したい。さらに、詳細な胸腺解離プロトコルを教えてくれた新田剛史博士、高柳浩博士、および彼らの研究室のメンバーに感謝する。

補足資料
補足資料はJournal of Leukocyte Biologyオンライン版で入手可能である。

著者名
D.M.G.は実験計画、実験、データの解析と解釈を行い、原稿を執筆した。C.M.G.は実験計画、実験、データの解析と解釈、原稿の校閲と編集を行った。B.E.M.は実験の設計、実験の実施、データの解析と解釈、原稿のレビューと編集を行った。R.D.F.は実験を行い、原稿のレビューと編集を行った。M.H.E.K.は実験を行い、原稿のレビューと編集を行った。V.P.は実験を行い、原稿の校閲・編集を行った。K.M.E.C.が実験を行い、原稿の校閲・編集を行った。J.S.が実験を行い、原稿の校閲と編集を行った。R.L.C.が実験を行い、原稿の校閲・編集を行った。L.A.R.は、研究の構想、実験の計画、実験の実施、データの解析と解釈、原稿の執筆を行った。

資金提供
本研究は、Canada Foundation for InnovationからL.A.R.へのJohn R. Evans Leaders fund equipment grant（参照番号36419）とBritish Columbia Knowledge Development Fundからのマッチングファンド、Canadian Institutes of Health Research Project GrantからL.A.R.への助成金（参照番号156403）、Michael Smith Foundation for Health Research Scholar AwardからL.A.R.への助成金（参照番号SCH-2021-1582）を受けた。

利益相反声明。申告なし。

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