腸内細菌叢と骨密度、骨微細構造、骨強度との関連に関する2コホート研究

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オリジナル研究論文
Front. 内分泌学, 21 9月 2023
骨研究
第14巻-2023年｜https://doi.org/10.3389/fendo.2023.1237727
この論文は次のテーマの一部です。
健康および疾患における骨量に対する腸内細菌叢の役割

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腸内細菌叢と骨密度、骨微細構造、骨強度との関連に関する2コホート研究

https://www.frontiersin.org/articles/10.3389/fendo.2023.1237727/full

Paul C. Okoro1 Eric S. Orwoll2 Curtis Huttenhower3,4,5,6 Xochitl Morgan4 Thomas M. Kuntz4 Lauren J. McIver4 Alyssa B. Dufour1,7 Mary L. Bouxsein8,9 Lisa Langsetmo10,11 Samaneh Farsijani12,13 Deborah M. Kado14,15 Roberto Pacifici16 Shivani Sahni1,7 Douglas P. Kiel1,7*。
1米国マサチューセッツ州ボストン、ヘブライ・シニアライフ、ヒンダ＆アーサー・マーカス加齢研究所
2オレゴン健康科学大学医学部、オレゴン州ポートランド、アメリカ合衆国
3ハーバード・チャン・マイクロバイオーム公衆衛生センター、ハーバードT.H.チャン公衆衛生大学院、ボストン、マサチューセッツ州、アメリカ合衆国
4米国マサチューセッツ州ボストン、ハーバードT.H.チャン公衆衛生大学院生物統計学科
5米国マサチューセッツ州ボストン、ハーバードT.H.チャン公衆衛生大学院免疫学・感染症学部門
6マサチューセッツ工科大学・ハーバード大学ブロード研究所感染症・マイクロバイオームプログラム（米国マサチューセッツ州ケンブリッジ
7米国マサチューセッツ州ボストン、ハーバード大学医学部、ベス・イスラエル・ディーコネス医療センター医学部
8米国マサチューセッツ州ボストン、ハーバード大学医学部、マサチューセッツ総合病院内分泌ユニット
9米国マサチューセッツ州ボストン、ハーバード大学医学部整形外科およびベス・イスラエル・ディーコネス医療センター整形外科研究センター
10ミネアポリス退役軍人（VA）ヘルスケアシステム、ケアデリバリー・アウトカム研究センター（米国ミネソタ州ミネアポリス
11米国ミネソタ州ミネアポリス、ミネソタ大学医学部
12米国ペンシルベニア州ピッツバーグ、ピッツバーグ大学疫学部
13米国ペンシルベニア州ピッツバーグ、ピッツバーグ大学加齢・人口健康センター
14スタンフォード大学医学部、スタンフォード、カリフォルニア州、アメリカ合衆国
15老年医学研究教育臨床センター（GRECC）、VAヘルスシステム、カリフォルニア州パロアルト、アメリカ合衆国
16米国ジョージア州アトランタ、エモリー大学医学部内分泌・代謝・脂質部門
腸内細菌叢は、破骨細胞形成と骨喪失を刺激する免疫メディエーターや炎症性サイトカインの産生に影響するT細胞への影響を通じて、炎症環境に影響を及ぼす。しかし、ヒトにおける腸内細菌叢と骨格の健康に関する大規模な研究はほとんどない。我々は、Framingham Heart Study（FHS［n=1227、年齢範囲：32～89］）とOsteoporosis in Men Study（MrOS［n=836、年齢範囲：78～98］）の2つの大規模コホートにおいて、ヒトの腸内細菌叢と橈骨および脛骨の高解像度末梢定量コンピュータ断層撮影（HR-pQCT）スキャンとの関連を調査した。研究参加者の便サンプルは、16S rRNA遺伝子のV4超可変領域の増幅と配列決定を受けた。得られた16S rRNAシーケンスデータは、DADA2パイプラインを16S bioBakeryワークフローに組み込んで、コホートごとに別々に処理した。得られたアンプリコン配列のバリアントは、SILVA参照データベースを用いて分類名を割り当てた。複数の共変量をコントロールし、微生物群の存在量とHR-pQCT測定値との関連を、microbiome multivariable association with linear model（MaAslin2）に実装されている一般線形モデルを用いて検定した。FHSでは37属、MrOSでは4属の微生物が、DTU089の骨格指標との関連を含む様々な骨格指標と関連していた（偽発見率[FDR]≤0.1）。分類群と骨との関連をメタ解析したところ（FDR ≤ 0.25）、Akkermansia属とDTU089属の生息数が多いほど、それぞれ橈骨の全vBMDと脛骨の皮質vBMDが低いことが明らかになった。逆に、Lachnospiraceae NK4A136グループおよびFaecalibacterium属の存在量が多いほど、脛骨皮質vBMDが大きくなった。また、各コホートにおいて予測される（16S rRNAアンプリコン配列データに基づく）代謝経路の存在量と骨の表現型との関連を調べることにより、微生物分類群の機能的能力についても調べた。両コホートで一致する機能的関連は観察されなかったが、メタアナリシスにより、ヒスチジン、プリン、ピリミジン生合成のスーパーパスウェイを含む8つのパスウェイが、脛骨皮質コンパートメントの骨測定値と関連していることが明らかになった。結論として、我々の知見は、腸内細菌叢と骨格代謝との間に関連があることを示唆している。

1 はじめに
腸内に生息する常在微生物の群集は、骨格の健康に寄与する修正可能な因子である可能性がある。腸内細菌叢は、マウスにおいて破骨細胞形成と骨喪失を刺激する可溶性免疫メディエーターや炎症性サイトカインの産生に影響を及ぼすT細胞ランドスケープへの影響を通じて、炎症環境に影響を及ぼすことが示されている（1-3）。実際、腸内細菌叢と骨格代謝との間には、短鎖脂肪酸の産生を介した炎症への影響（4）や、ビタミンK（5）、ビタミンD（6）、複合多糖類（7）などの食事成分の代謝など、多くの生物学的関連性が考えられる。腸内細菌叢と骨格との間のこのようなメカニズム的関連については、最近、複数の論文で概説されており、この関係を特徴づけるために「骨微生物学」という用語が用いられている(8)。腸内細菌叢と骨との関連を支持する文献が増えつつあるにもかかわらず、この関連についての大規模な臨床研究はほとんどない。

われわれは最近、Osteoporosis in Men Study（MrOS）から831人の高齢男性（年齢範囲：78～98歳）を抽出し、その便検体を採取して16S rRNA遺伝子V4超可変配列の解析を行い、微生物量が橈骨遠位部および脛骨遠位部の骨密度、微細構造、強度の測定値と関連しているかどうかを調べた(9)。4つの細菌属（Anaerofilum、Methanomassiliicoccus、Ruminiclostridium、Tyzzerella）の存在量は、骨密度、骨構造、骨強度との関連性が弱く、各菌属の関連性の測定方向は、複数の骨測定において概ね一貫しており、骨格恒常性における微生物叢の役割を支持していた(9)。これらの結果から、骨とマイクロバイオームとの関連は観察されるものの、その関連性の大きさは控えめであり、今後の研究にはより大きなサンプルサイズが必要であることが示唆された。加えて、高齢の研究参加者のコア微生物叢は、以前に若年成人について確立されたものとは異なることが報告されていることから（10）、今回、新たな分類群と骨との関連を同定するとともに、コホート間の一貫性を調べるために、主に中年男女からなるより大規模なサンプルを前回の報告に追加した。

2 方法
2.1 研究コホートと参加者の説明
2.1.1 フレミンガム心臓研究
FHSは、1948年にマサチューセッツ州フラミンガム町とその周辺の町から、心臓病の危険因子を研究するために地域住民を対象にしたサンプルを募集したことから始まった。その後数十年にわたって、最初の参加者の子孫がその配偶者とともにオフスプリング・コホートに集められ、最後にオフスプリングの子供とその配偶者が第3世代コホート（Gen3）に集められた。さらに、オフスプリング・コホートの配偶者もGen3参加者とともに評価対象とした。最後に、多民族コホートであるオムニ・コホートが第3世代コホート参加者と同じ町から募集され、第3世代コホート参加者とともに評価された。FHS Gen3、追加配偶者、Omniコホート参加者から腸内細菌叢サンプルを採取する方法は、サブコホート情報も含めて以前の研究でよく説明されている(11)。採便に加えて、過去の大腸手術と採便前30日間の抗生物質の使用について参加者に質問し、この2つの基準を用いて潜在的参加者を解析から除外した。合計1424の便サンプルが16S rRNA遺伝子アンプリコンシーケンシングのために処理された。

2.1.2 男性における骨粗鬆症性骨折研究
MrOSコホートは、2000年から2002年にかけて米国の6つの臨床施設で募集された地域在住の高齢男性で構成されている。このコホートと募集方法については、腸内細菌叢と骨格の表現型に関する小規模な研究（9）を含め、以前に報告されている（12, 13）。MrOSコホートでは、920人の参加者の便サンプルが16S rRNA遺伝子アンプリコン配列決定のために処理された。採便前30日以内の抗生物質使用に関するアンケートを用いて、下流解析前のサンプルを除外した。

2.2 便サンプル採取、16S rRNA遺伝子配列決定、および配列データの前処理
2.2.1 FHS
前述(11)のように、便検体は100％エタノール中で採取し、Qiagenのカスタムプロトコルを用いて細菌DNAを抽出し、-20℃で保存した。 増幅されたPCR産物は、Illumina MiSeqマシンで2 x 150塩基対ペアエンドプロトコルで配列決定された。サンプルあたりの平均リード数は77,509（S.D = 27,957）で、3,990から187,222の範囲であった。

2.2.2 MrOS
前述したように（9, 16）、920の便サンプルを受領し、2つのバッチ（第一バッチ、n=600；第二バッチ、n=320）に分けて処理し、配列決定した(9)。便サンプルは、Omnigene Gut collection kitを用いて研究参加者が自宅で採取し、DNA抽出まで-80℃で保存した。細菌DNAはMO BIO Powersoil DNA Isolation Kitを用いて抽出した。16S rRNA遺伝子V4領域をターゲットとし、515Fおよび806Rプライマーを用いたPCRで増幅した。得られたPCR産物は、2 x 250塩基対ペアエンドプロトコルを用いてIllumina MiSeqマシンでシーケンスした。サンプルあたりの平均リード数は42,310（S.D = 13,404）で、9,765から108,521の範囲であった。

2.3 FHSおよびMrOSにおける16S rRNAサンプルの前処理
各研究コホートについて、得られた16S rRNA遺伝子アンプリコンシーケンスデータを、AnADAMA2 (18)で構築された16S bioBakeryワークフローに組み込まれたDADA2 (17)ノイズ除去パイプラインで別々に処理した。FHSでは36,737個、MrOSでは12,799個のASVが得られた。得られたASVは、SILVA参照データベース(19)を用いて分類名を割り当てた。具体的には、属レベルの分類にはSILVAバージョン132を使用し、種レベルの分類にはバージョン128を使用した。ダウンストリーム解析のために、Phyloseq（20）バージョン1.38.0を使用して、ASVsカウントテーブルから2つの別個の分類群カウントテーブルを作成した。具体的には、属レベルでグローム化された微生物分類群数は、微生物多様性解析および骨表現型との関連性検定に使用され、種レベルの分類群数は分類群-骨関連性検定にのみ使用された。属レベルのカウント表では、FHSでは391属、MrOSでは359属であった。種レベルのカウントテーブルでは、FHSでは275種、MrOSでは273種であった。下流の関連性検定では、得られた微生物分類群数表を相対存在量に変換した。MrOSの16S rRNAデータは2つのバッチで処理されたため、MMUPHin（21）バージョン1.8.2を使用して、分類群数表のバッチ効果を調整した。

2.4 メタゲノム予測
PICRUSt2 ソフトウェア (22) を用いて、16S rRNA アンプリコン配列データから MetaCyc (23) パスウェイの機能量を予測した。これは、多くのアンプリコン配列バリアント（ASV）が機能的特徴量の予測に寄与するように動作するため、微生物分類群にマッチするASVは、必ずしも分類群-骨関連において最も上位のシグナルとして見出されるものとは限らない。FHSでは394、MrOSでは404のパスウェイが予測された。予測された機能的特徴の高い次元を減らし、テストにおける冗長性を減らすために、互いに非常に高い相関（Person Correlation > 0.9）を持つ特徴を取り除いた。このため、Rのcaretパッケージの "findCorrelation "関数を使用した。この関数は、2つの特徴に高い相関がある場合、各特徴の平均絶対相関を考慮し、平均絶対相関が最大のものを削除する。得られたパスウェイ数表は、サンプルの10％未満に存在する機能的特徴を除外するためにさらにフィルタリングされ、その後、相対的存在量に変換された。特に、MrOS については、機能的アバンダンス表のバッチ効果も調整した。最終的に、下流の関連性検定用に保持された機能的特徴の数は、FHSでは112、MrOSでは139であった。

2.5 骨格測定
前述のように(9)、Scanco XtremeCT II (Scanco Medical AG, Brüttisellen, Switzerland)を用いて、橈骨遠位部と脛骨遠位部の骨密度、微細構造、強度を測定するために、高解像度末梢定量的コンピュータ断層撮影(HR-pQCT)を行った。スキャン画像は2つのコホートで同様に取得・処理され、慎重な品質管理とμFEAによる標準的な画像解析が行われた（24-26）。MrOSコホートでは、橈骨のスキャンは手技による四肢測定から得られた遠位4％の部位から開始した。脛骨スキャンは脛骨長の遠位7.3％の部位から開始した。FHSでは、非利き橈骨のスキャン開始部位は腕の長さを測定した後、橈骨長の4%に設定され、右脛骨のスキャン開始部位は脛骨長の7.3%に設定された。品質管理では、5段階の移動アーチファクト評点を用い、評点が大きいほど移動アーチファクトが悪いことを示した(27)。グレード4のスキャンはすべての密度測定に使用されたが、海綿体数（Tb_N）、海綿体厚さ（Tb_Th）、海綿体分離（Tb_Sp）、1/Tb_Nの標準偏差（Tb.1/N.SD1）、皮質空隙率（CtPo）のような微細構造測定には使用されなかった。橈骨および脛骨の骨格表現型は以下の通りである： 1) 全骨密度（Tot_vBMD）、海綿骨密度（Tb_vBMD）、内側海綿骨密度（Tb_Inn_vBMD）および皮質領域の体積BMD（Ct_vBMD）、2) 全骨密度の断面積（Ct_Area）および皮質骨面積率（Ct_BATA）、3) 海綿骨の数と厚さ、4) 皮質の厚さ（Ct_Th）。皮質の気孔率の評価は中程度の大きさの気孔に限られるため、皮質の気孔率を用いる代わりに、気孔による密度の損失を考慮した皮質BMDとの関連を調べることにした。両研究とも、破壊荷重はPistoiaら、2002(28)に記載された方法を用いて推定した。

2.6 共変量測定
本試験では、年齢、性別、肥満度（BMI、kg/m2）、喫煙（あり/なし）、糖尿病（あり/なし）、過去1年間の入院（あり/なし）、使用した薬剤の総数（カウント）、プロトンポンプ阻害薬（PPI）およびメトホルミンの使用、人種（自己申告）、Diet Quality Index（DQI）（26、29、30）、診療部位（MrOSのみ）を臨床的特徴および共変量として調整した。喫煙状況は自己申告に基づき、現在喫煙している人と現在喫煙していない人（過去に喫煙していた人と喫煙経験のない人）に分類した。糖尿病の状態は、糖尿病の治療に適応のある薬剤を現在使用しているか、空腹時血糖値が126mg/dL以上、またはランダム血糖値が200mg/dL以上と定義した。正常血糖値＜126mg/dLで糖尿病治療薬を服用していない参加者は非糖尿病とみなされた。最近の入院が腸内細菌叢を変化させる可能性を考慮し、参加者を過去1年間の入院の有無で分類した。また、腸内細菌叢を変化させる可能性のあるいくつかの薬剤（メトホルミン、プロトンポンプ阻害薬）の使用状況、および薬剤の総数も確認した。参加者は人種をアフリカ系アメリカ人、アジア系、ヒスパニック系、白人、その他の4つのカテゴリーから1つ選んで自己申告した。食事要因については、食物摂取頻度調査票（FFQ）を用いてDQIを作成することにより説明した。FHSのGen3/Omni2/New Offspring Spouse（NOS）コホートでは、2008～2011年にWillett 126項目の半定量的FFQを用いて食事評価が実施された（31）。このFFQの相対的妥当性は、他の研究で栄養素および食品の両方について評価されている（31～34）。FFQが欠落している参加者については、2002～2005年の前回検査の食事情報を使用した。MrOSコホートでは、2014～2016年に69項目の半定量的FFQであるBlock FFQを用いて食事評価を実施した。このFFQは、有効性が確認されたオリジナルのBlock 98 FFQ（35）から派生したものである。

両コホートの食事情報は、エネルギー摂取量が女性で≧2.51MJ/d（600kcal/d）、＜6.74MJ/d（4,000kcal/d）、男性で＜17.54MJ/d（4,200kcal/d）であり、＜13の食品項目が空欄である場合に有効であるとみなされた。食事の質は、DQI改訂版（DQI-R）を用いて評価した。DQI-Rは、国内ガイドライン（26、29、30）に対する食事の質を10成分で推定したものである。DQI-Rは、FHSおよびMrOSのFFQから推定された以下の食事変数を組み込んだ：脂肪からのエネルギー摂取の割合；飽和脂肪からのエネルギー摂取の割合；食事性コレステロール；果物1皿分；野菜1皿分；穀物1皿分；カルシウム摂取量；鉄摂取量；食事の多様性；食事の中庸性。各要素は、0点（最も低い質）から100点（最も高い質）までの総合的な食事の質スコアに最大10点まで寄与する。FHSのFFQから得られる食品項目数はMrOSのFFQより多かったため、FHSのこれらの追加食品項目は、MrOSで得られる食品カテゴリーと一致する単一の食品カテゴリーに折りたたんだ。これにより、DQI-R算出前の適切なデータ調和が確保された。さらに、不健康な食品が人為的に食事多様性スコアを押し上げるのを防ぐため、果物摂取量とタンパク質摂取量のサブカテゴリーからフルーツジュースと加工肉を除外し、食事多様性スコアの算出に使用した。

2.7 統計分析
分析は、R（v 4.1.2）で以下のパッケージを使用して行った： 微生物多様性解析にはPhyloseq (20) (v 1.38.0)、多変量関連モデリングにはMaAsLin2 (36) (v 1.8.0)、バッチ補正およびメタ解析にはMMUPHin (21) (v 1.8.2)、微生物PERMANOVA解析にはVegan (37) (v 2.6.2)を使用した。

2.7.1 分析手法
まず、2つのコホートの共変量とHR-pQCT骨測定値をスチューデントのT検定またはカイ二乗検定を用いて比較し、P値＜0.05を有意とみなした。次に、2つのコホートの腸内細菌叢の存在量とβ多様性を評価し、比較した。微生物分類群の相対存在量プロファイルと骨の表現型について、2つのコホートそれぞれで別々に多変量解析を行った。FHSコホートには男女両方の参加者が含まれていたため、FHSコホートについても性別に特異的な解析を行った。検出された有意な分類群-骨関連数に対するサンプルサイズと性別の影響を調べるために、無作為にサブサンプリングした836サンプル（男性＝384、女性＝452）のFHSコホートを用いて、分類群-骨関連についても検定した。さらに、男性のみの参加者（MrOSの全員とFHSの男性）のメタ分析と、男女両方の参加者（FHSとMrOSの全員）のメタ分析を実施し、2つのコホートを組み合わせた。最後に、個々のコホートにおいて、予測された機能的パスウェイと骨測定値との関連性を検証し、両コホートのパスウェイと骨との関連性のメタ解析も行ったが、性別を特定した解析は行わず、FHSのサブサンプリングも行わなかった。

2.7.2 マイクロバイオームの存在量と多様性：
DADA2 (17)を用いて、2つのコホートの16S rRNAアンプリコン配列データを別々に処理した。得られた分類群数表は、Phyloseq（20）を用いて属レベルでグローム化し、相対存在量に変換した。FHSコホートの男女参加者のマイクロバイオームを、α多様性（Observed genera - richness, and Shannon）、β多様性（Bray-Curtis, and weighted UNIFRAC distances）を用いて比較し、性差の共変量調整PERMANOVA検定を算出した。具体的には、観察された属によって測定される豊かさを推定するために、まずFHS標本を希薄化した。また、FHSとMrOSを組み合わせた豊度表についてBray-Curtis距離を用いてβ多様性を推定し、同胞差については共変量で調整したPERMANOVA検定を算出した。すべてのベータ多様性推定値はNon-Metric Multidimensional Scaling (NMDS)を用いて可視化した。

2.7.3 多変量関連性
MaAslin2(36)に実装されている一般線形モデル（min_abundance=0.0、min_prevalence=0.1、analysis_method="LM"、normalization="TSS"、transform="LOG"、max_significance=0.25）を用いて、すべての共変量、HR-pQCT骨指標、および微生物分類群の存在量を含む一般線形モデルを当てはめた。同じパラメーターを使用し、共変量をコントロールすることで、予測されるMetaCyc（38）経路の存在量とHR-pQCT骨測定値との関連も解析した。MMUPHin (21)を用いて2つの研究コホートのメタ解析を行った。MMUPHinは、まずMaAslin2で多変量回帰分析を行い、その結果を確立された固定/混合効果モデルで集約することで機能する。関連性のP値は、Benjamini & Hochbergの偽発見率（FDR）管理法を用いて多重検定のために補正された。MaAslin2 で実施されたすべての共変量との関連性検定線形モデルは、以下の式で表される。

2.7.3.1 FHS
属の相対的存在量 ～ HRPQCT + SEX + AGE + SMOKING + BMI + DIABETES + HOSPITALIZATION + TOTAL MEDCATIONS + PPI + METFORMIN + RACE + DQI-R

種の相対存在量～HRPQCT＋性＋年齢＋喫煙＋BMI＋糖尿病＋入院＋総合薬＋PPI＋メトフォルミン＋RACE＋DQI-R

経路相対存在量～HRPQCT＋性＋年齢＋喫煙＋BMI＋糖尿病＋入院＋総医薬品＋PPI＋メトフォルミン＋RACE＋DQI-R

2.7.3.2 MrOS
バッチ調整済み世代相対存在量 ~ HRPQCT + 年齢 + 喫煙 + BMI + 糖尿病 + ホスピタリゼーション + 総服薬 + PPI + メトホルミン + RACE + DQI-R | クリニック・サイト

バッチ調整種相対存在量 ～ HRPQCT + 年齢 + 喫煙 + BMI + 糖尿病 + ホスピタリゼーション + 総医薬品 + PPI + メトホルミン + RACE + DQI-R | クリニックサイト

バッチ調整パスウェイ相対存在量～HRPQCT＋年齢＋喫煙＋BMI＋糖尿病＋入院＋総医薬品＋PPI＋メトフォルミン＋RACE＋DQI-R｜クリニックサイト

3 結果
3.1 研究集団と参加者の特徴
本研究では、Framingham Heart Study（FHS）第3世代コホートとOsteoporotic Fractures in Men（MrOS）研究の2つの大規模観察研究の参加者を対象とした。各参加者（FHS=1424、MrOS=920）から採取した便サンプルは、16S rRNAアンプリコンシークエンス用に処理された。過去30日以内に抗生物質を使用していた参加者、または検便前の1年間に結腸手術を受けていた参加者（FHSとMrOSそれぞれn=78と53）は解析から除外した（図1）。また、共変量データに欠損のある参加者（FFQまたは極端なカロリー摂取量に欠損のある参加者、それぞれFHSとMrOSでn=119と31）を除外し、最終的な解析サンプルサイズはFHSとMrOSでそれぞれ1227と836となった。

図1
www.frontiersin.org
図1 16SリボソームRNA（rRNA）配列決定を用いた微生物プロファイリング用に処理された便サンプルのフローチャート。Framingham Heart StudyおよびOsteoporotic Fractures in Men Studyコホートからの検体の除外には、採取後30日以内に抗生物質の使用を報告した参加者、採取前1年間の結腸手術歴、共変量データのない個人の検体など、同一の基準が適用された。

MrOSの参加者はすべて男性で、平均年齢84.2歳（範囲：78～98歳）とかなり高齢であり、平均9.1種類の薬剤を使用していた（SD：5.6）。一方、FHS参加者は44.3％が男性で、平均年齢は55.2歳（範囲；32～89歳）、使用薬剤は少なかった（平均2.7薬剤［SD：3.0］）。両コホートとも、参加者の大多数は人種を「白人」と自己申告した（FHS=91.2％、MrOS=89.5％）。2つのコホートは、メトホルミンの使用と橈骨皮質厚を除くすべての指標において有意に異なっていた（p<0.05）。さらに、FHS男性サブグループとMrOSの比較では、メトホルミンの使用、人種、HR-pQCTスキャンによる橈骨総面積、脛骨海綿体vBMD、海綿体内側vBMDに有意差はなかった。FHS男性とFHS女性の比較では、年齢、喫煙、入院、プロトンポンプ阻害薬の使用、人種、および橈骨皮質vBMDのHR-pQCTスキャンに統計的な差はみられなかった。補足図1に示すように、骨密度、骨構造、骨強度の複数のHR-pQCT測定値が互いに相関していることに注意することが重要である。一般に、同じ骨区画（皮質または海綿）のHR-pQCT測定値は中程度の相関があった（r>0.3）。総骨面積の測定値は、ほとんどの皮質および総vBMD測定値と中程度の逆相関があった。

表1a
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表1A 研究サンプルの特徴。

表1b
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表 1B HR-pQCT スキャンを用いて得られた骨格表現型の測定値。

3.1.1 研究参加者の腸内細菌叢の多様性
両コホートの16S rRNAアンプリコン配列データは、16S bioBakeryワークフロー(18)に組み込まれたDADA2(17)を用いて別々に処理された。最も多い上位10属のうち8属は、2つのコホート間で同じであった（図2A）。一方、アガトバクター（Agathobacter）とローズブリア（Roseburia）はFHSではトップ10に入ったが、MrOSではまれであった。Bray-Curtis距離を用いてβ多様性を測定し、Non-Metric Multidimensional Scaling（NMDS）を用いて2つのコホートを可視化した（図2B）。共変量でコントロールしながら、研究コホートの違いによる微生物叢プロファイルの総変動性は3％であった（PERMANOVA検定、P＝0.001、R2＝0.030）。微生物量の総変動性に対して、2つのコホートのいずれかに属することの寄与は比較的小さいが有意であった。マイクロバイオームの変動に対するコホートの寄与は、Escherichia/ShigellaやAkkermansiaなど、MrOSサンプルと比較してFHSサンプルでは比較的まれであったいくつかの存在量の違い（図2A）に起因すると考えられる。このように、2つのコホートのマイクロバイオームは概ね類似しているが、わずかではあるが重要な差異が存在する可能性がある。

図2
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図2 2つのコホートのマイクロバイオームの多様性。両コホートは微生物組成と多様性について別々に評価された。各コホートにおいて、分類群の存在量は属レベルでグローム化（マージ）された。(A)は、各コホート内で最も存在量の多い上位10属の対数相対存在量のヒートマップを示す。対数変換時に下流のカウント表に0が入るのを避けるため、存在量表に一律に1を加え、各コホート内の相対存在量に変換した。最も存在量の多い10属のうち8属は両コホートで同じである。その他」のグループには残りのすべての属が含まれる。(B)では、Bray-Curtis距離をベータ多様性指標（ストレス=0.21）として用い、非計量的多次元尺度法（NMDS）を用いてデータを順序化した。コホートは微生物量プロファイルの全変動の3.0%を説明した（PERMANOVA、R2 = 0.030、P=0.001）。PERMANOVA検定では、すべての共変量について調整した。

次に、FHSコホートは男女両方の研究参加者で構成されているため、2つの性群のαおよびβ多様性を比較することによって、FHSコホートにおける性差をさらに調査した。その結果、微生物の複雑さ（Shannon index）と豊富さ（Observed genera）、およびNMDSで可視化したβ多様性において、男女間に有意差は見られなかった（補足図2）。実際、Bray-Curtis距離（R2 = 0.005、P=0.001）および重み付けUNIFRAC距離（R2 = 0.009、P=0.001）の共変量調整PERMANOVA検定に基づくと、性別はFHSコホートの微生物存在量プロファイルにおける変動性のごく一部しか説明できなかった。

3.1.2 微生物と骨格指標とのコホート内関連性
2つの研究コホートそれぞれについて、個々の骨 HR-pQCT 測定値と全測定微生物属との関連を調べた。MaAslin2(36)に実装されているように、共変量を調整したコホート固有の多変量線形関連モデルを実施した。この調査はある程度、仮説生成のための解析と考えられ、また一般的な関連パターンを探したかったため、FDR≦0.1というあまり厳密でない値で所見を報告している。

3.1.3 FHSにおける微生物属の存在量と骨格指標との関連性
FHSコホートでは、37の異なる属と18のHR-pQCT骨指標を含む67の分類群-骨関連（陰性38、陽性 29）が観察された（図3；補足図3）。皮質骨測定値との分類群-骨関連は全体の39％、海綿骨区画との関連は27％、全骨測定値との関連は19％、骨強度測定値との関連は15％であった。興味深いことに、橈骨と脛骨の両部位において、総面積測定値との微生物関連はすべて正であり、これは存在量が多いほど骨面積が大きいことを示すが、総vBMDとの関連は負であった。DTU089、Marvinbryantia、Blautia、Akkermansiaの4属は、2つ以上の骨測定値と負の相関を示した。DTU089、Marvinbryantia、Blautia、Akkermansiaである。また、Defluviitaleaceae UCG.011属は、骨指標と正の相関と負の相関の両方を示し、存在量は橈骨および脛骨骨面積と正の相関を示したが、全vBMDおよび橈骨の皮質化率とは負の相関を示した。脛骨と橈骨の両方ですべての関連性が観察されたわけではないが、関連性の方向は骨の部位間で類似していた。表2は、FDR≦0.05に基づく最も強い関連を、個々の検定統計量とともに、骨格骨測定値の4つのカテゴリー（皮質骨、海綿骨、全骨、および破壊荷重によって測定された骨強度）に分類して示している。具体的には、橈骨の骨区画全体において、アッケマンシアが多いほど皮質の厚さ、皮質骨面積の総面積に対する比率、およびvBMDの総量が低いことと関連していた。脛骨部位では、Blautiaの存在量の増加は、皮質の厚さ、皮質骨面積の総面積に対する比、およびvBMDの総計の低下と関連していた。橈骨と脛骨では、また骨区画全体では、DTU089の存在量が多いほど、橈骨と脛骨の内側海綿骨密度、脛骨の海綿骨密度および総vBMD、橈骨の骨強度が低いことと関連していた。属と骨との間のその他の関連は、橈骨または脛骨のいずれか、および単一の骨区画におけるものであった。一般に、皮質区画や海綿区画に特有であったり、単一の骨格部位（橈骨対脛骨）のみに見られる特異的な関連パターンは観察されなかった（補足図4-6）。MrOSコホートからの以前の報告(9)と同様に、体重を支える脛骨、特に皮質骨区画内と脛骨の骨強度（破壊荷重）において、より多くの有意な関連が観察された。一般に、個々の生物の骨格指標において、関連性の方向性は一貫しており、微生物と密度指標との関連性は、骨格面積指標との関連性とは逆の方向性を示す場合もあった（補足図5）。

図 3
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図3 FHSコホートにおける腸内細菌属と骨格指標との関連。これには、MaAsLin2を用いて計算されたFDR<0.1の67の関連すべてが含まれる。関連モデルではすべての共変量を調整した。X軸とY軸は階層的にクラスタ化した。印は、縦軸の微生物量と横軸の骨測定値との間の関連方向を示す。

表2
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表2 FHSコホートにおける微生物属数と骨測定値との関連。

3.1.4 MrOSにおける微生物属の存在量と骨格測定値との関連性
FHSコホートで検出された複数の関連とは対照的に、MrOSコホートでは、FDR≦0.05では微生物属と骨との関連は観察されなかった。しかし、FDR≦0.1では、MrOSコホートでは脛骨の部位で5つの分類群と骨との関連が観察された（表3）。その結果、Methanobrevibacter属およびDTU089属の存在量の増加は皮質vBMDの低下と関連し、Lachnospiraceae NK4A136グループの存在量の増加は皮質vBMDの増加と関連した。Cloacibacillusの存在量が多いほど、海綿体内部vBMDおよび海綿体vBMDがともに高かった。興味深いことに、FHSコホートで観察されたように、DTU089と海綿骨測定値との負の関連は、脛骨皮質vBMDのMrOSコホートでも一貫していた。

表3
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表3 MrOSコホートにおける微生物属数と骨測定値との関連。

3.1.5 FHSおよびMrOSにおける微生物属の存在量と骨格測定値との関連
上記の属レベルで観察された関連性を精緻化するために、種レベルでの微生物分類群の存在量（種レベ ルを決定できた場合）と HR-pQCT 骨格測定値との間の個別の関連性（FDR 値≤0.10）をさらに検証した。FHSコホートでは、8つの微生物種と12の骨指標を含む15の分類群と骨との関連（11が陰性、4が陽性）が観察された（図4）。重要なことは、属レベルの関連で観察されたように、種がほぼ同じ骨測定値と同じ方向に関連することが観察されたことである。MrOSコホートでは、Lachnospira pectinoschizaと橈骨皮質vBMDとの間に有益な関連のみが認められた。

図4
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図4 FHSコホートにおける腸内細菌種と骨測定値との関連。これには、MaAsLin2を用いて計算されたFDR≦0.1の15の関連すべてが含まれる。関連モデルではすべての共変量を調整した。X軸とY軸は階層的にクラスタ化した。印は、縦軸の微生物量と横軸の骨測定値との間の関連方向を示す。

3.1.6 男性、女性、およびサブサンプルFHSにおける微生物属の存在量と骨格指標との関連性
次に、MrOS と比較して FHS で観察された関連性の数が多いのは、男女両方を含む FHS コホートとは対照的に、MrOS コホートが男性のみで構成されていることに基づくものであるかどうかを判断しようとした。そこで、他の共変量をコントロールしながら、FHSコホートの性特異的な分類群-骨関連性を計算した。いずれの性特異的解析でも観察された分類群-骨関連は、男女両方からなるFHSコホートのコホート特異的結果とは異なり、比較的少数であった。具体的には、FHS男性のみの解析（n=544）では、7つの異なる属と8つの骨尺度を含む17の分類群-骨関連、FHS女性のみの解析では、9つの属と11の骨尺度を含む17の分類群-骨関連であった（補足図4）。検出された関連数の減少をさらに調べるため、FHSコホート（男性384人、女性452人）を無作為にサブサンプリングし、MrOSのサンプルサイズに近い836のサンプルサイズにし、微生物属と骨測定値との関連を検定した。その結果、18の属と14の骨指標を含む33の分類群と骨との関連が認められた（補足図4）。したがって、より複雑な推論ではあるが、FHSコホート解析で検出された有意な関連数が、MrOSでは少なかったのに比べ多かったのは、性差とサンプルサイズの違いによるものかもしれない。

FDR≦0.25までのコホート、性特異的、サブサンプリングされたFHS分類群-骨関連の全結果を含む、より包括的な結果を補足図5、6、補足表1-9に示す。

3.1.7 2つのコホートにおける微生物量と骨格指標との関連性のメタ解析
MMUPHin パッケージ(21)に実装されているメタアナリシスを実施することにより、2つのコホートのパワーを活用し、一貫した全体的な効果を同定するために、それらの分類群と骨格の関連を統合した。コホート特異的解析で見られたようにコホート間の差異があるため、またさらなる探索に対応するため、FDR≤0.25という自由な値でメタ解析による関連を報告する。

コホートの違いにもかかわらず、両コホートで骨の表現型と一貫して関連する生物を発見した。属レベルでは、すべてのFHSとMrOSのメタアナリシスの結果、6つの有意な分類群と骨との関連が認められた（図5）。AkkermansiaとClostridium_sensu_stricto_1の存在量が多いほど、橈骨皮質骨面積の総面積に対する比率が低く、Akkermansiaの存在量が多いほど、橈骨の全vBMDが悪いことと関連していた。また、DTU089属、Lachnospiraceae NK4A136グループ、Faecalibacterium属の存在量の増加は、脛骨皮質vBMDの低下と関連していた。興味深いことに、DTU089およびAkkermansiaの脛骨皮質vBMDおよび橈骨全vBMDに対する逆相関は、それぞれFHS男性サブグループおよびMrOSのメタ解析においても同様に観察された。重要なことは、これらのメタアナリシスによる関連は、コホート特異的解析結果と一致していることである。

図5
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図5 微生物属の多さと骨の測定値との関連性のメタ解析。属-骨の関連性のメタ解析はMMUPHinを用いて行われ、FDR≦0.25におけるすべての関連性が示されている。

FHSおよびMrOSコホートから得られた種レベルの関連性のメタ解析では、Akkermansia muciniphilaの存在量と、橈骨の皮質骨面積の総面積に対する比、総vBMD、皮質厚などの橈骨の測定値との直接的な関連性など、属を用いた関連性がさらに確認された。その他、種レベルでの関連を解析した結果、Erysipelatoclostridium ramosumの生息数が多いほど脛骨皮質vBMDが低く、Flavonifractor plautiiの生息数が多いほど橈骨海綿体数が多いことが示された。補足表10-13には、すべてのFHSおよびMrOSのメタ解析、ならびにFHS男性群およびMrOSのメタ解析それぞれについて、FDR≦0.25におけるすべてのメタ解析要約統計量が記載されている。

3.1.8 予測された機能パスウェイの存在量と骨格指標との関連性
骨格指標と予測代謝パスウェイの存在量との関連を検討した（方法参照）。多変量調整後、複数の骨部位とコンパートメントに関連するパスウェイを同定した。

FDR≦0.1において、FHSコホートにおける機能的パスウェイと骨測定値との間に26の関連が観察された（図6A）。関連性の大部分は皮質骨区画で認められ、次いで海綿骨、全骨、骨強度の指標であった。MrOSコホートでは、パスウェイと骨との関連は6つしか発見されなかったが、その大部分は脛骨皮質vBMD測定であった（図6B）。これは、実際の微生物分類群の存在量と骨の表現型との関連を検定したときに検出できた関連数と一致している。補足表14および15は、FHSおよびMrOSそれぞれについて、FDR≤0.25までのすべての経路-骨関連結果を含んでいる。

図6
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図6 予測された代謝パスウェイと骨の測定値との関連。代謝パスウェイはPICRUSt2を用いて予測した。パスウェイと骨の関連はMaAslin2を用いて計算し、FDR<0.1のすべての関連を示した。関連モデルではすべての共変量を調整した。(A)については、FHSコホートにおける関連性のヒートマップを示す。X軸とY軸は階層的にクラスタ化した。印は、縦軸の微生物量と横軸の骨測定値との間の関連方向を示す。(B）はMrOSにおける関連性の表である。

次に、MMUPHinパッケージ(21)を用いて、2つのコホートから得られた経路と骨の関連結果をメタ解析した。FDR ≤ 0.25において、我々は8つのユニークな代謝パスウェイを含む9つの関連性を脛骨皮質骨コンパートメントでのみ見出した（補足図7、表16）。ヒスチジン、プリン、ピリミジン生合成のスーパー経路（PRPP-PWY）の存在量が多いほど、脛骨皮質骨の総面積に対する面積の比率、および脛骨皮質骨の厚さが中程度増加することと関連していた。残りの7つの経路は脛骨皮質の厚さと関連しており、4つの経路は正の方向、3つの経路は負の方向であった。

4 考察
本研究は、幅広い年齢層の男女において、腸内細菌叢と高解像度骨格表現型との潜在的な関連性に焦点を当てた、これまでで最大規模の研究である。独立した2つの大規模コホート（FHSとMrOS）それぞれと、メタアナリシスにより統合されたコホートにおいて、特定の属と骨格表現型との関連を検証することに加え、予測される機能的経路と骨格表現型との関連も評価した。その結果、かなりの数の分類群と骨との関連性が認められ、その大部分は、高齢の男性MrOSコホートとは対照的に、より大規模で、より若く幅広い年齢層の男女の研究参加者で構成されるFHSコホートで観察された。

FHSコホートでは、脛骨と橈骨の両部位で、海綿骨と皮質骨の両部位、および骨強度の測定において、様々な複数の骨表現型と微生物との67の関連が認められた（図3、4）。対照的に、MrOSコホートでは、皮質骨および海綿骨区画のvBMD測定値との関連は5分類群のみであった。このようなコホート間の違いは、サンプルサイズ、FHSには女性が含まれていたがMrOSには含まれていなかったこと、年齢差などいくつかの要因によって生じたと考えられる。我々は、コホート間で観察された関連数の差に対するこれらの因子の寄与を明らかにしようと試みた。FHSとMrOSでは男性の方が少なかったにもかかわらず、FHSコホートの男性544人（17分類群-骨関連）では、MrOSコホートサンプルの男性836人（5分類群-骨関連）と比較して、有意な関連数が多かった。さらに、MrOSコホートと同数のFHS参加者（n=836）をサブサンプリングしても、より多くの分類群-骨関連（33対5）が観察された。このことは、この差は主にコホート間のサンプルサイズや性差によるものではなく、むしろ他の未定義の差によるものである可能性を示唆している。どちらのコホートも参加者全員が地域居住者であったため、コホート間の差が、長期療養中の高齢者の食事や微生物叢が地域居住者と異なることを報告したClaessonら（39）のような変化によるものではないと思われる。同グループはまた、地域居住の高齢者では、高齢者参加者のコア微生物叢は、以前に若年成人について確立されたものとは異なっており、バクテロイデス属の割合が高く、クロストリジウム群の存在パターンが異なっていたことも報告している(10)。MrOSコホートの参加者はFHSコホートより約30歳年上であったので、この年齢の相違がコホート間の所見の相違を説明するかもしれない。

標本数、性、年齢分布の点で2つのコホート間に違いがあるにもかかわらず、我々は、Clostridiales菌の1つであるDTU089属が、2つのコホートの両方で一貫して骨密度の低下と関連していることを観察した。興味深いことに、MrOSコホートにおける最近の研究では、DTU089はより低い蛋白質摂取量と有意に関連していた(40)。2つのコホートのメタアナリシスにより、骨格の表現型と関連する微生物の属および種がさらに明らかになった（図5；補足表10、11）。AkkermansiaおよびDTU089の存在量が多いほど、それぞれ橈骨全体のvBMDおよび脛骨皮質のvBMDが低いことと関連していた。注目すべきことに、マウス研究では、生殖腺非内在マウスを低温殺菌アッケマンシアで処理すると、海綿骨および皮質骨量が減少することが示された(42)。DTU089に関する所見は、FHSコホート内の性特異的関連を調べた際にも、FHS男性サブグループをMrOSでメタ解析した際にも、これらのサブセット解析のサンプルサイズが小さくなったにもかかわらず、一貫していた（補足図4-6）。逆に、Lachnospiraceae NK4A136グループおよびFaecalibacteriumの存在量が多いほど、脛骨皮質vBMDが高いことと関連していた。また、予測された代謝経路と骨の表現型との関連を調べることで、微生物分類群の機能的能力についても調べた。予想通り、MrOSと比較してFHSコホートではより多くの関連が観察されたが、FDR≦0.1では両コホートで一致する関連は観察されなかった（図6）。さらに2つのコホートの機能的関連をメタ解析したところ、脛骨皮質コンパートメントの骨測定値と関連する8つの代謝パスウェイが見つかり、最も有意なものはヒスチジン、プリン、ピリミジン生合成のスーパーパスウェイであった（補足図7、表16）。実際、骨リモデリングにおけるプリン代謝の重要性は、これまでにも報告されている(43)。興味深いことに、最近のマウス研究では、プリン代謝の障害が骨粗鬆症に関与していることが示唆されている(44)。このような2つのコホートにおける特異的な所見は、腸内細菌叢と骨代謝を結びつける生物学的な経路が存在する可能性を示唆している。加えて、橈骨において微生物叢が骨密度と負の相関を示したが、骨面積とは正の相関を示したパターンは、加齢に伴って観察されるのと同様に、ある種の微生物が骨密度を犠牲にして骨膜の拡張に影響を及ぼす可能性を示唆している（45）。

我々の研究は、MrOSコホート単独でHR-pQCTを用いて測定された腸内細菌叢と骨格の表現型に関する以前の解析を発展させたものである（9）。この報告と、MrOSとFHSの両コホートを用いた今回の解析には、いくつかの注目すべき相違点があった。第一に、Orwollらの研究では、自己評価による総合的な健康状態、身体活動、因子分析を用いて得られた異なる食事摂取量変数、すなわち「西洋型」と「慎重型」の食事パターンなど、今回の複合コホート解析には含まれていない独自の共変量について調整した(9)。また、解析に含まれるHR-pQCT骨表現型の数や種類にも違いがあった。例えば、今回の論文では皮質間隙率を含めなかったが、これは体積皮質骨密度には皮質間隙の寄与が含まれるのに対し、皮質間隙率は中程度の大きさの間隙しか検出できないためである。前回のMrOSの報告とは対照的に、我々は二重エネルギーX線吸収測定法（dual energy x-ray absorptiometry）由来の表現型を検討しなかった。また、今回の報告では、腸内細菌叢の骨格サイズへの寄与を断面積を含めて調査し、さらに橈骨と脛骨の海綿体区画の内側に限局した海綿体密度の測定も行った。今回のMrOS解析と、以前に発表されたMrOSコホートのみに関する論文（9）とのもう一つの重要な違いは、関連解析が属レベルに限定されていた以前のMrOS論文とは対照的に、我々は属レベルと種レベルで分類群存在度を別々に解析したことである。このような違いがあるにもかかわらず、FDR≤0.25というそれほど厳密でない条件で、MrOSコホートの前回と今回の独立した解析による分類群と骨の関連結果を比較すると、かなりの程度一致していた。前回のMrOS解析と今回のMrOS解析でそれぞれ検出された37属と25属のうち、19属の存在量が両方の解析でさまざまな骨の測定値と関連していることが観察された。

我々は、2つの独立したコホートを用いて、幅広い年齢層にわたる男女の腸内細菌叢と骨格指標との関連を明らかにすることができた。とはいえ、いくつかの限界があることを認識すべきである。両コホートは、同じ表現型を同じ世代のスキャナーを用いて測定し、同じ除外基準を用い、同じ共変量で調整し、rRNA遺伝子のV4領域のアンプリコンシークエンシングを行ったが、2つの異なるシークエンシングラボが関与し、シークエンシングの深さはMrOSと比較してFHSの方が深く、その結果、コホート間で観察された差異が生じた可能性がある。本研究はこれまでで最大規模の研究であるにもかかわらず、総サンプル数はまだ控えめであり、この要因によって関連性が見逃された可能性がある。

本研究には多くの長所がある。第一に、マイクロバイオームと骨格の表現型に関する最近の論説で示唆された問題点の多く、すなわち、研究課題の設定と研究デザイン、シーケンス技術、データ解析法の重要性に取り組んだことである(46)。われわれは、橈骨と脛骨のHR-pQCT画像から得られた骨密度、微細構造、および強度の最新測定値を持つ、年齢幅の広い男女の大規模サンプルにおいて、16S rRNAアンプリコンシークエンシングを用いて、微生物叢と骨との関連を調査した。また、属レベルの関連や、可能であれば種レベルの関連についても、骨の測定値との関連を調べる方法を採用した。両コホートのデータを用いてパスウェイ解析を行った。2つのコホート間で所見には明らかな違いがあったが、コホート間で再現できたいくつかの一貫した所見があった。本研究のもう一つの長所は、FHSとMrOSの両コホートが広範に表現型解析されたコホートであるため、研究参加者の臨床的特徴に関する十分な情報が得られたことである。最後に、特定の細菌種に関する動物実験に基づく生物学的妥当性のある所見がいくつかあった。

結論として、腸内細菌叢と骨格指標との間にいくつかの一貫した関連性が認められたことから、腸内細菌叢と骨格代謝との間に関連性がある可能性が高いことが示唆された。より多くのサンプルと将来的なショットガンシーケンスの利用が可能になれば、骨格に影響を及ぼす特定の生物種に関するさらなる洞察を得ることができるかもしれない。これにより、骨格の健康に影響を与える腸内細菌叢のターゲティングが可能になるかもしれない。

データの利用可能性に関する声明
本研究で紹介したデータセットはオンラインリポジトリで見ることができる。リポジトリ名とアクセッション番号は以下の通り： https://www.ncbi.nlm.nih.gov/gap/, pht006014.v3.p14. https://mrosonline.ucsf.edu/, 本解析で使用したコードは https://github.com/hebrewseniorlife/FHS-MrOS-16S, https://www.ncbi.nlm.nih.gov/, PRJNA758252, https://www.ebi.ac.uk/ena, PRJEB26012。

倫理声明
ヒトを対象とした研究は、Advarra Institutional Review Boardの承認を得た。本研究は、現地の法律および施設の要件に従って実施された。参加者は、本研究への参加について、書面によるインフォームド・コンセントを提供した。

著者の貢献
PCOが解析を行い、原稿を作成し、結果の解釈に貢献した。ESOとDPKは、データ収集、研究のコンセプト立案、解析計画の立案、データ管理、正式な解析、結果の解釈、原稿の査読、研究の監督に貢献した。SSは解析、結果の解釈、原稿の査読に貢献した。CHはデータ管理、結果の解釈、原稿の査読に貢献した。XMとTMKはデータ管理、解析、結果の解釈、原稿の査読に貢献した。RPは結果の解釈と原稿の査読に貢献した。MLBはデータキュレーション、結果の解釈に貢献した。DMKはMrOSのデータ収集と原稿の査読に貢献した。LJMはデータキュレーション、解析に貢献した。ABDはデータキュレーション、解析、結果の解釈に貢献した。LSとSFは原稿の査読に貢献した。すべての著者が論文に貢献し、提出された原稿を承認した。

資金提供
The Osteoporotic Fractures in Men (MrOS) StudyはNational Institute on Aging、National Institute of Arthritis and Musculoskeletal and Skin Diseases、National Center for Advancing Translational Sciencesの支援を受けた； National Institutes of Health Roadmap for Medical Research（助成金番号U01 AG027810、U01 AG042124、U01 AG042139、U01 AG042140、U01 AG042143、U01 AG042145、U01 AG042168、U01 AR066160、R01 AG066671、およびUL1 TR002369）。DPKとSSの努力、および腸内細菌ゲノム遺伝子型解析の一部は、National Institute of Arthritis and Musculoskeletal and Skin Diseases R01 AR061445の助成を受けた。この研究は、米国国立心肺血液研究所のフラミンガム心臓研究（FHS［契約番号HHSN268201500001IおよびN01-HC 25195］）からも資金提供を受けた。FHSの16S rRNA遺伝子の配列決定は、助成金番号R01HL131015の支援を受けた。SFの研究は、National Institute on Aging (K01 AG071855)およびPittsburgh Older Americans Independence Center Scholar (P30AG024827)からのキャリア開発賞の支援を受けた。

謝辞
Framingham Heart Study（FHS）およびOsteoporotic Fractures in Men（MrOS）研究の参加者に感謝する。また、Thomas G. Travison博士（Marcus Institute for Aging Research, Hebrew Senior Life, Biostatistics core）の統計的支援と助言に感謝する。著者らは、Maria Rizzo Depaoli氏（Marcus Institute for Aging Research, Hebrew Senior Life）とLily Lui氏（California Pacific Medical Center, Research Institute）のデータ管理サポートに感謝する。

利益相反
ESO： Amgen社、Bayer社、BioCon社、Radius社からのコンサルティング、Mereo社からの研究支援、OI財団からの出張費。DPKは、Amgen, IncおよびRadius Healthから所属機関に助成金を受領しており、Solarea Bio、Radius Health、Pfizerから科学諮問委員会委員としてのコンサルティング料、Agnovosからデータ・安全性モニタリング委員会委員としての報酬、Wolters KluwerのUpToDate誌への掲載によるロイヤルティを受領している。SSは、Dairy Management Inc.から2022年9月末まで、Solarea Bio Inc.から2022年3月までの機関助成金を報告し、American Egg Board's Egg Nutrition CenterおよびNational Dairy Councilの助成金を審査した。DMKはアムジェン社およびウルトラジェニックス社から科学諮問委員会（Scientific Advisory Boards）委員としてのコンサルティング料、ウォルターズ・クルワー社（Wolters Kluwer）のUpToDate誌への掲載料、スターキー社（Starkey）からの助成金を受けている。

残りの著者は、本研究が利益相反の可能性があると解釈される商業的または金銭的関係がない状態で実施されたことを宣言している。

発行者注
本論文で表明された主張はすべて著者個人のものであり、必ずしも所属団体や出版社、編集者、査読者の主張を代表するものではない。本論文で評価される可能性のあるいかなる製品、またはその製造元が主張する可能性のある主張も、出版社によって保証または支持されるものではない。

補足資料
本論文の補足資料は、https://www.frontiersin.org/articles/10.3389/fendo.2023.1237727/full#supplementary-material に掲載されている。

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キーワード：腸内マイクロバイオーム、16Sアンプリコンシークエンシング、骨密度、骨微細構造、コホート研究、加齢

引用 Okoro PC, Orwoll ES, Huttenhower C, Morgan X, Kuntz TM, McIver LJ, Dufour AB, Bouxsein ML, Langsetmo L, Farsijani S, Kado DM, Pacifici R, Sahni S and Kiel DP (2023) A two-cohort study on the association between the gut microbiota and bone density, microarchitecture, and strength. Front. Endocrinol. doi: 10.3389/fendo.2023.1237727.

受理された： 09 June 2023; Accepted: 24 August 2023；
発行：2023年9月21日

編集者

オーウェン・クローニン、ボン・セクール病院コーク、アイルランド
査読者

ヤン・ヨゼフ・ステパン、カレル大学、チェコ
サディク・ウマール、イリノイ大学シカゴ校、米国
Copyright © 2023 Okoro, Orwoll, Huttenhower, Morgan, Kuntz, McIver, Dufour, Bouxsein, Langsetmo, Farsijani, Kado, Pacifici, Sahni and Kiel. 本記事は、クリエイティブ・コモンズ 表示ライセンス（CC BY）の条件の下で配布されるオープンアクセス記事である。原著者および著作権者のクレジットを明記し、学術的に認められている慣行に従って本誌の原著を引用することを条件に、他のフォーラムでの使用、配布、複製を許可する。これらの条件に従わない使用、配布、複製は許可されない。

*文責：ダグラス・P・キール ダグラス・P・キール kiel@hsl.harvard.edu

免責事項：本論文で表明されたすべての主張は、あくまで著者個人のものであり、必ずしも所属団体、出版社、編集者、査読者の主張を代表するものではない。本記事で評価される可能性のあるいかなる製品、またはその製造元が主張する可能性のあるいかなる主張も、出版社によって保証または支持されるものではありません。

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