バーチャルスクリーニングとエッセンシャルダイナミクスによる強力なACE2活性化剤としての胆汁酸誘導体の発見

2023年9月10日 09:33

J Chem Inf Model. 2022 Jan 10; 62(1)： 196-209. オンライン公開 2021年12月16日. doi: 10.1021/acs.jcim.1c01126
PMCID: PMC8691454PMID: 34914393
バーチャルスクリーニングとエッセンシャルダイナミクスによる強力なACE2活性化剤としての胆汁酸誘導体の発見

https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC8691454/

Bianca Fiorillo † Silvia Marchianò ‡ Federica Moraca †§ Valentina Sepe † Adriana Carino † Pasquale Rapacciuolo † Michele Biagioli † Vittorio Limongelli †∥ Angela Zampella † Bruno Catalanotti † *† and Stefano Fiorucci‡.
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アンジオテンシン変換酵素II（ACE2）は、血管の収縮、炎症、酸化ストレスの軽減を制御する重要な分子である。さらに、ACE2は、COVID-19パンデミックを引き起こすウイルスSARS-CoV-2との闘いにおいて、ウイルススパイクタンパク質の宿主における最初の受容体であることから、重要な役割を担っている。ACE2へのスパイクタンパク質の結合は、最終的にウイルスが宿主細胞に侵入し、そのライフサイクルを開始させる一連の出来事を引き起こす。同時に、SARS-CoV-2感染は、特に肺におけるACE2の発現をダウンレギュレートし、酵素によって制御される生化学的シグナルを変化させ、COVID-19疾患の末期を特徴づける予後不良の一因となる。その重要な生物学的役割にもかかわらず、ACE2活性化因子の数は非常に限られている。ここでは、インシリコと実験を組み合わせたアプローチにより、ウルソデオキシコール酸（UDCA）誘導体がACE2活性化剤として働くことを示す。詳細には、ドッキングバーチャルスクリーニングキャンペーンを通じて、2つの強力なACE2リガンド、BAR107とBAR708を同定し、マイクロ秒分子動力学計算中に観察された酵素の本質的なダイナミクスから、その作用機序を解明した。インシリコの結果は、in vitroの薬理学的アッセイによって確認され、新たに同定された化合物は、これまで知られている中で最も強力なACE2活性化剤であるDIZEに匹敵するACE2活性を示した。我々の研究は、SARS-CoV-2感染症、炎症、および他のACE2関連疾患に対する治療可能性のある化合物の設計に有用な、ACE2/リガンド結合相互作用に関する構造的洞察を提供するものである。

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はじめに
アンジオテンシン変換酵素II（ACE2）は、I型膜貫通型モノカルボキシペプチダーゼであり、最近、COVID-19の流行の原因であるSARS-CoV-2ウイルスのヒト受容体としての役割で話題になった1。より具体的には、スパイク（S）糖タンパク質を用いて、SARS-CoV-2はウイルス複製戦略の第一段階として上皮細胞表面のACE2に結合する。Sタンパク質は、宿主細胞のレセプターACE2と結合するレセプター結合ドメイン（RBD）を含むS1サブユニットと、宿主細胞膜との融合を仲介するS2サブユニットの2つのサブユニットから構成されている2。Sタンパク質がRBDを介してACE2に強く結合すると、膜貫通型セリンプロテアーゼ2（TMPRSS2）によるS2サブユニットのタンパク質分解切断が活性化され、ウイルスが細胞内に侵入し、ウイルスの複製と細胞間伝播が促進され、その結果、宿主全体にコロナウイルスが拡散する3。

ACE2は、肺、動脈、心臓、腎臓、消化管などいくつかの組織で発現しており4-6、血圧調節、体液・電解質バランス、心・腎機能に重要な役割を果たしている。ACE2の生物学的役割は、過去10年間に広く研究されており、本質的には、血管収縮ペプチドであるアンジオテンシン（Ang）IIを血管拡張ペプチドであるAngに変換する細胞外酵素作用に関係している（1-7）。レニン-アンジオテンシン系（RAS）では、アンジオテンシン変換酵素（ACE）がAng IをAng IIに変換し、Ang IIタイプI受容体（AT1R）を介してシグナルを伝達し、血管収縮、体液貯留の増加、心肥大および血管肥大、酸化ストレス、組織の線維化をもたらす7-10。 -10逆に、ACE2はAng IIをAng (1-7)に加水分解するため、Ang IIの利用可能性が減少し、AT1Rシグナル伝達による炎症促進作用と血管収縮作用が抑制される。さらに、Ang (1-7)はMas Gタンパク質共役型受容体(MasR)を活性化し、血管拡張を促進し、一酸化窒素、プロスタグランジンE2、ブラジキニンの放出による酸化ストレスと炎症を抑制する11-13。特に、Ang (1-7)は白血球の遊走、サイトカインの発現と放出、線維化経路を抑制する11。この見解と一致して、ACE2欠損は血管細胞接着分子（VCAM）、サイトカイン、ケモカイン、MMPの発現を増加させることにより、ApoEノックアウトマウスにおいて血管炎症とアテローム性動脈硬化症を促進する14。対照的に、ACE2/Ang (1-7)/MasR軸の活性化は、TNFα、IL-1β、IL-6、MCP-1などの炎症性メディエーターの発現を減少させ、抗炎症性サイトカインIL-10の発現を増加させる14-16。さらに、ACE2/Ang (1-7)/MasR軸とがん増殖との関係が報告されており、がん抑制におけるACE2の活性化の治療可能性が示唆されている17。

SARS-CoV-2細胞の浸潤は、ACE2発現のダウンレギュレーションを誘導し、その結果、Ang IIとAng (1-7)の間の生理学的バランスが変化し、Ang IIを介するRASシグナル伝達が増加し、他方では、ACE2/Ang (1-7)/MasR軸によって媒介される保護効果が枯渇する。これらの現象は、サイトカインストームや凝固障害など、COVID-19患者の特異的な臨床状態に関連している18,19。したがって、ACE2活性の強化は、COVID-19疾患における最悪の合併症につながる過剰な炎症反応によるダメージを抑えるための潜在的なアプローチかもしれない20。

ACE2活性化剤の治療可能性にもかかわらず、現在利用可能な薬剤は限られている21,22。その中でも、ジミナゼン酢酸エステル（DIZE）は、ACE2活性化剤23としても働く抗トリパノソーマ症の動物用医薬品であり、高血圧24、心筋梗塞25、肝障害26、腎臓病の実験モデルにおいて保護効果をもたらした27。さらに、DIZEは、NF-κB依存的に炎症を抑制し28、虚血誘発性心病態生理において保護作用を発揮する25。これらの理由から、COVID-19患者の保護剤としてDIZEの使用が提案されているが29、治療用量では細胞毒性の副作用を示した30。

ACE2の3次元立体構造は、PDB（Protein Data Bank）で公開されており、標的に対して高い親和性と選択性で結合する可能性のある薬剤候補を同定するための、構造に基づく創薬アプローチへの道を開いている。ACE2を活性化する安全かつ薬剤性の高い活性化因子の不足を考慮し、我々はACE2を活性化する新規天然化合物を発見するために、構造ベースのバーチャルスクリーニングを行った。内因性胆汁酸（BAs）がSスパイクとACE2の相互作用を阻害する可能性があることを示した以前の研究に促されて、ここでは新規ACE2活性化剤として一連のウルソデオキシコール酸（UDCA）誘導体を報告する。インシリコと実験を組み合わせたアプローチにより、新規化合物の作用機序を明らかにすることができ、酵素の特異的なリガンド誘起構造挙動が関与していることがわかった。シリーズの中で最も優れた2つの化合物であるBAR107とBAR708は、DIZEによって誘発されるのと同等のACE2活性化を促進する。したがって、これらの薬剤は、コロナウイルスが媒介する感染症や炎症の予防と治療、およびRAS/Masシグナリングの機能不全に関連する他の疾患における治療の可能性がある。

本研究の結果は、Spike/ACE2相互作用を低下させる能力と、ACE2/Ang (1- 7)/MasR軸の活性化に由来する保護効果を併せ持つ、二重活性の薬剤候補を開発するために、ステロイド骨格を持つ化合物が有用であることを示唆している。

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方法
計算科学的研究
バーチャルスクリーニングホモサピエンスACE2のオープンアポ型（PDB ID 1R42）31の結晶構造は、Protein Data Bankウェブサイトからダウンロードした。コレクトリン相同ドメインの無秩序セグメントと水分子を除去した。受容体は、Maestro ver. 11.832に実装されているProtein Preparation Wizardツール32で処理し、結合順の割り当て、水素原子の追加、ジスルフィド結合の調整、pH7.4での残基のプロトン化状態の割り当てを行った。
バーチャルスクリーニング(VS)は、67種類の胆汁酸(BA)、10種類の天然および57種類の半合成誘導体からなる社内ライブラリで行われ、これまでに同定されたACE2活性化物質、ヒドロキシジン、ミニチクセン、DIZEが豊富に含まれていた21。5.832で計算し、Supporting InformationのFigure S1のプロットに示した。ステロイドの些細な構造変化でも潜在的な生物学的活性を生み出す可能性があるため、典型的なステロイドの足場を形成する4つの縮合環からなる炭素原子17個の骨格を共有する化合物を含むように、社内のBAsライブラリーを構築した。これらの化合物は、置換基の位置と名前が互いに異なっている。当社のライブラリーで置換されているステロイドの炭素水素は以下の通りである： (i)3位と7位の水素は、異なる配置（αとβ）の両方でヒドロキシル基に置換されている。(ii)C7の水素は、異なる配置（αとβ）の両方でエチル基に置換されている。ドッキング計算は、ACE2活性化因子の発見に関する既報に従い、Protein Data Bankに寄託されたACE2のオープンコンフォーメーション構造（PDB ID 1R42）を用いて、ACE2のヒンジ曲げ領域を含むボックス内で行った。採用したVSプロトコールは、我々の以前の研究 35 で説明したものと同じである。我々のドッキングプロトコールをさらに評価するため、強力なACE2阻害剤MLN-4760をACE2 結合部位（PDB ID 1R4L）にドッキングし直した。リガンドを配位するZn2+イオンの存在を考慮し、改良されたAutoDock4(Zn)力場が計算に使用された。

AutoGrid4ツールは、46 × 46 × 46 Åの立方体のボックスを定義することで、2つのリガンドとレセプター原子のタイプを考慮して相互作用グリッドを計算した。その後、各グリッドについて、AutoDock4はレセプターに対する与えられたリガンドの親和性を表す相互作用エネルギー（ADscore）を計算した。画像はすべてUCSF Chimeraを使用してレンダリングした37。

BAR708 および BAR107 と複合体化したアポ ACE2 および ACE2 の分子動力学（MD）MD シミュレーションは、Amber ff14SB40 を使用して AMBER18 スイートの CUDA バージョン38,39 を使用してタンパク質を処理し、リガンドの電荷は拘束静電ポテンシャル（RESP）フィッティング手順を使用して計算した41。次に、Antechamber43とgeneral amber force field (GAFF2)パラメータを用いた2段階のフィッティング手順により、RESP電荷とリガンド力場パラメータを得た44。次に、系をTIP3P水分子の平衡化済み八面体ボックスに浸し、系を中和した。その後、先に記述したように、多段階の手順で系を最小化し、連続的に平衡化した35。具体的には、エネルギー勾配収束基準を0. 01 kcal/mol Å2に設定した： (i) 水素原子のみの最小化ステップ5000回（最急降下で2500回、共役勾配で2500回）、(ii) 水と水素原子の最小化ステップ20000回（最急降下で10000回、共役勾配で10000回）； (iii) タンパク質の側鎖、水、水素原子のみを50,000ステップ（最急降下で25,000ステップ、共役勾配で25,000ステップ）最小化し、(iv) 100,000ステップ（最急降下で50,000ステップ、共役勾配で50,000ステップ）完全最小化する。続いて、水分子、イオン、タンパク質側鎖を3つのステップで熱平衡化した： (i)ランジュバンサーモスタットを用いて、0Kから300Kまで徐々に加熱しながら、溶質の拘束を10kcal/mol Å2から1kcal/mol Å2まで徐々に変更して5nsのNVT平衡化、(ii)ベレンセンサーモスタットを用いて、拘束を1.0kcal/mol Å2から0.1kcal/mol Å2まで徐々に変更して5nsの1気圧でのNPT平衡化、(iii)拘束なしの5nsのNPT平衡化。最後に、タイムステップ2fsで、各系500nsの独立したMD計算を3回行った。水素原子を含む結合には、圧力と温度が一定の周期境界条件、長距離静電相互作用の処理には粒子メッシュEwald (PME)45、非結合相互作用には10Åのカットオフを併用したSHAKE アルゴリズムを使用した。
主成分分析アポ ACE2 と BAR708 および BAR107 と複合体化した ACE2 の主成分分析（PCA）46 は、AMBER18 スイートの CPPTRAJ モジュール47 を用いて行った。まず、それぞれの系の1.5μsのMD軌道全体から溶媒とイオンを取り除いた。次に、ACE2の内部ダイナミクスを考慮するために、最初のMDフレームのタンパク質重原子にストリップされた軌道をフィッティングすることにより、タンパク質のグローバルな回転/翻訳運動を除去した。これにより、各システムのタンパク質の平均構造を生成することができ、これをPCA解析の参照構造とした。最後に、座標共分散行列を生成して対角化し、最初の4つの主成分（PC）を固有ベクトルと固有値として得ました。次に、タンパク質の動きの擬似軌跡をVMDのNormal Mode Wizard GUI（NMWiz）48にインポートして可視化し、固有ベクトルの大きさと方向を矢印で表した各動きのヤマアラシプロットを生成した（図11C-F）。画像はすべてUCSF Chimera.37を用いてレンダリングした。
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図1
ネイティブACE2の動的挙動。(A)開いた状態のアポACE2（PDB ID 1R42）のX線構造（緑の漫画）と、強力な阻害剤MLN-4760（PDB ID 1R4L）と複合化した閉じた状態のACE2（マゼンタの漫画）; (B)1.5μsのMDシミュレーション後に得られたアポACE2の最も人口の多い3つのクラスター： Cluster0（母集団32％、薄紫色の漫画）、Cluster1（母集団20％、薄緑色の漫画）、Cluster2（母集団18％、薄赤色の漫画）；（C-F）アポACE2の1.5μMDシミュレーション後のPCA解析から同定された最初の4つの固有ベクトル（PC1-4）のポーキュパインプロット。矢印は顕著な運動の方向を示し、長さは対応する固有値の大きさを示す。

ACE2 Inhibitor Screening Assay Kit ACE2 Inhibitor Screening Assay Kit（BPS Bioscience Catalogue # 79923）は、ACE2のエキソペプチダーゼ活性を測定する。活性型 ACE2 が蛍光基質を切断し、遊離の蛍光体を放出する能力を利用するもので、蛍光マイクロプレートリーダーを用いて容易に定量することができる。ACE2 特異的阻害剤の存在下では、酵素はペプチダーゼ活性を失い、その結果、蛍光強度が減少し、一方、活性化剤の存在下では、蛍光の増加が観察される。酵素活性の陽性対照としてDIZEを用いた。
簡単に説明すると、精製 ACE2 を解凍し、ACE2 バッファーで 0.5 ng/μL ACE2 の濃度に希釈する。この酵素溶液（20μL）を、「陽性対照」および「試験阻害剤」として指定された96ウェルプレートの各ウェルに添加する。逆に、「ブランク」と指定されたウェルには ACE2 バッファー（20μL）のみを入れる。次に、Test Inhibitorと指定された各ウェルにTest Inhibitor溶液を5μLずつ加える。Positive ControlとBlankと表示されたウェルには、Inhibitor緩衝液（水中10％DMSO）を5μL加える。最後に、25μL の ACE2 発蛍光基質をすべてのウェルに添加し、直射日光を避けて室温で 60 分間インキュベートする。インキュベーション後、サンプルの蛍光強度（λ excitation = 555 nm; λ emission = 585 nm）を FluoStar Omega マイクロプレートリーダーで測定する。

ACE2-SARS-CoV-2 Spike Inhibitor Screening Assay Kit ACE2-SARS-CoV-2 Spike Inhibitor Screening Assay Kit (BPS Bioscience Catalogue #79936 )は、この相互作用の阻害剤をスクリーニングし、プロファイリングするために設計された。このキットには、精製した ACE2 と SARS-CoV-2 Spike (RBD)-Fc タンパク質、HRP 標識抗マウス Fc 領域抗体、アッセイバッファーが含まれています。本キットの特長は、Fcタグ付きSpikeタンパク質をHRP標識抗マウス-Fcで高感度に検出できることです。
簡単に説明すると、ACE2タンパク質を解凍し、PBSで1μg/mLに希釈し、ニッケルコートした96ウェルプレートに室温でゆっくり振盪しながら1時間付着させる。コーティング後、プレートを洗浄し、ブロッキングバッファーで10分間インキュベートする。次に、Test Inhibitorと指定された各ウェルに、試験する化合物を含む阻害剤溶液を10μLずつ加え、室温でゆっくり振とうしながら1時間インキュベートする。陽性コントロールとブランクには、インヒビターバッファー（5％DMSO溶液）を10μL加える。次に、SARS-CoV-2 Spike (RBD)-Fcを解凍し、アッセイバッファー1で0.25 ng/μL (約5 nM)に希釈し、Positive ControlとTest Inhibitorと表示された全てのウェルに添加します。反応は室温でゆっくり振盪しながら1時間インキュベートする。3回洗浄し、ブロッキングバッファーでインキュベート（10分）した後、プレートを抗マウス-Fc-HRPで処理し、ゆっくり振盪しながら室温で1時間インキュベートする。最後に、HRP 基質をプレートに加えて化学発光を生じさせ、FluoStar Omega マイクロプレートリーダーを用いて測定する。

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結果
バーチャルスクリーニング
新規で薬剤化可能なACE2活性化因子を探索するため、67種の天然化合物と半合成胆汁酸誘導体からなる自社ライブラリーのVSキャンペーンを行った。特に、Protein Data Bankから取得したACE2のオープンコンフォメーション（PDB ID 1R42）31のX線構造中のリガンドに対して、リガンドとタンパク質の結合相互作用を研究するために選択される方法である分子ドッキング49-52を行った。ドッキング計算は、ACE2活性化因子の結合部位として以前に提案されたヒンジ屈曲領域で行われた。

VSの結果、いくつかのBA誘導体のADスコア（表1）は、これまでに同定されたACE2活性化物質のADスコア（Supporting Information Table S1）と同等であった。

表1
試験した胆汁酸誘導体a,b,cのAutoDock4ドッキングスコア（ADscore）、酵素活性、およびACE2/スパイク相互作用阻害率
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a10μMで試験した化合物のACE2活性に対する効果で、いずれの化合物も存在しない場合の活性（100）を基準としている。結果は平均値±標準誤差で表した。*p < 0.05 vs データは平均±SE、n = 3。
b10μMで試験した各化合物のSpike-RBD/ACE2結合阻害率を％±SEで表した。
cデータは文献(35)から引用。
ドッキングの結果は、すべての化合物について、ACE2ヒンジ屈曲領域内で類似した結合様式を示し、サブI（Lys94、Leu95、Glu98、およびGlu102-ヘリックスα3）およびサブII（Tyr202、Asp206-ヘリックスα7、Val209、Asn210-ヘリックス310 H3、Pro565、およびTrp566-ヘリックスα19）の両方の残基と接触した（Supporting Information Figure S3；二次構造の番号付けについては、Supporting Information Figure S4を参照）。

インビトロ活性アッセイ
有望なドッキング結果に促されて、上位スコア化合物のACE2に対する活性を実験的に調べた（表1、図S5参照）。ACE2 活性は、ACE2 Inhibitor Screening Assay Kit を用い、ACE2 基準活性化剤として DIZE を用いて評価した。表1に報告されるように、試験された化合物のいずれもACE2活性を阻害しなかったが、BAR708、BAR712、BARn501、BAR501-6α、およびBAR107は、ACE2活性を有意に増加させ（表1、*p < 0.05 n = 3反復）、BAR708およびBAR107は、ACE2を活性化することにおいてDIZEと同程度に有効であることが見出され、したがって、ACE2を結合および活性化することができるUDCA誘導体の可能性に関するドッキングの予測を確認した。

最後に、最近BA誘導体がACE2/SARS-CoV-2 RBD領域の結合プロセスを阻害する可能性が発見されたことを考慮し35、表1に挙げた化合物がSpike-RBDとACE2の結合に影響を与えるかどうかをSpike/ACE2 Inhibitor Screening Assay Kitを用いてさらに検討した35。Spike-RBDをUDCA、T-UDCA、およびいくつかのUDCA誘導体とインキュベートしたところ、Spike-RBDのACE2への結合は濃度依存的に効果的に減少した（表1、n = 3 replicates）。特にBARn501とBAR501-6αはin vitroでRBDとACE2の相互作用を約40%阻害したが、他の多くの化合物は約30%阻害した。

ACE2の構造とダイナミクス
ACE2活性化因子の作用機序を明らかにする目的で、まずACE2メタロプロテアーゼドメイン（PDドメイン）の構造と動的挙動を調べた。Protein Data Bankに登録されているヒトACE2の2つのX線立体構造（それぞれPDB ID 1R42と1R4L）を用いた。 31この2つの構造は、開いた状態（ネイティブ）と完全に閉じた状態（阻害剤結合）の2つの異なるコンフォメーション状態を表しており、N末端サブドメインI（Sub I；残基19-102、290-397、および417-430）とC末端サブドメインII（Sub II；残基103-289、398-416、および431-615）の2つの非連続サブドメインの相対的な位置が異なる2つの状態間の平衡の可能性を示唆している（FigureFigure11A）。ACE2がこれらの状態間で自発的にコンフォメーション平衡をとるかどうかを確立するために、ACE2アポ（PDB ID 1R42）の500ナノ秒ずつの3つの独立した分子動力学（MD）シミュレーションが、合計1.5μ秒のシミュレーション時間にわたって行われた。シミュレーション中にACE2が訪れたすべてのコンフォーメーションを収集し、階層的クラスタ化によって解析した。クラスター解析の結果、全集団の1/3(32%)を占める最も人口の多いクラスター族は、ACE2/阻害剤複合体の結晶構造(PDB ID 1R4L)で観察された酵素の閉じた形に対応することが示された。2番目(20%)と3番目(18%)の最も人口の多いクラスターは、それぞれネイティブACE2の結晶構造に匹敵する完全に開いたコンフォメーションと中間コンフォメーション(FigureFigure11B, Supporting Information Figure S6)を表していた。

続いて、3つのMDシミュレーションから得られた本質的な運動を、主成分分析（PCA）を用いて分析した。統合された軌跡に対して計算されたPCA分析では、サブIのサブIIに向かう動きからなる最初の2つの主成分が示された。最初の成分（PC1; FigureFigure11C）では、Sub IIのヘリックスα4とβ1-β2シートのヘリックスα2およびα10とβ4の間のループへの動きが観察され（Supporting Information Video S1）、2番目の成分（PC2）では、ヘリックスα1とα2のヘリックス310 H2への接近が説明された（PC2; FigureFigure11D;Supporting Information Video S2）。PC3成分は、サブIに対するサブIIのスライド運動を記述した（PC3; FigureFigure11E; Supporting Information Video S3）。これらの動きを総合すると、ACE2が開いたコンフォメーションになるようにコンフォメーション平衡を変化させ、酵素活性を高めることができる。PC1とPC2によると、ACE2の構造的柔軟性を可能にする重要な領域は、α4、α6のC末端側、およびヘリックス310 H3によって区切られていた。興味深いことに、この領域はヒンジ屈曲領域内にあり、ドッキング計算によって同定されたBAs結合部位に対応している。

ACE2活性化のメカニズム
VSキャンペーンで得られたリガンドに関する実験データに促され、我々は、ドッキング計算の結果得られた最良のリガンドポーズを開始コンフォメーションとして、各システムについて用いて、最も活性の高い化合物BAR107およびBAR708と複合体化したACE2のMDシミュレーションを行った（それぞれSupporting Information Figure S3B,C）。それぞれ 500 ns の独立した MD を 3 回実行し、合計シミュレーション時間を 1.5 μs とした。酵素の動的挙動を解析するために、それぞれの系のシミュレーションを統合した。マージしたMDシミュレーションの解析から、BAR107とBAR708の結合様式は安定で収束していることが、RMSDとSASAの経時変化から示された（参考情報図S7）。同様に、階層的クラスター解析は、一般的な結合様式（BAR708とBAR107について、それぞれ母集団の85%と76%）をもたらした（参考情報図S7E,F）。2回目のMDランの最後の50ナノ秒において、BAR107の結合様式に変化が見られ、結合部位におけるリガンドの結合配向の反転が観察された。しかしながら、このようなコンフォメーション変化は統計学的にはあまり関連性がなく、人口の少ないクラスターに属している（Supporting Information Figure S7D,F）。リガンドの位置とコンフォメーションの変化をより詳しく調べるために、溶媒接近性表面積（SASA）をさらに計算した。具体的には、BAR708のSASA(Supporting Information Figure S7I)は、BAR107のSASA(Supporting Information Figure S7J)に対して、3回のMD実行の全てにおいて小さな変動があり、より溶媒に露出した環境へ移動する傾向が少ないことを強調している。

続いて、BAR708とBAR107の結合が、MDシミュレーションで観察されたアポACE2レセプターのコンフォメーション挙動に影響を与えたかどうかを調べた。軌跡の解析から、BAR708の結合が酵素のダイナミクスに強く影響し、サブIからサブIIへの完全な閉鎖を妨げていることが示された。実際、BAR708/ACE2複合体シミュレーションの主要クラスター（母集団の85％）は、X線開閉型との重ね合わせで示されるように、アポACE2のX線開構造に非常によく似た開構造を示す（それぞれ図22A,B）。BAR708/ACE2のMDシミュレーションの上位4主成分（PC1-4）で表されるタンパク質の相関運動の解析（Supporting Information Videos S5-S8）は、ベクトルの長さが著しく減少し、異なる順序で、アポACE2で見つかったのと同じ成分を明らかにした。特に、PC2はサブIとサブII間のスライド運動を表し（図22D；アポACE2のPCAにおけるPC3；Supporting Information Video S6）、PC3成分はヘリックス310 H2に向かうヘリックスα1とα2の接近を表す（図22E；アポACE2のPCAにおけるPC2；Supporting Information Video S7）。これらの結果は、ヒンジ屈曲領域におけるBAR708の結合がACE2のダイナミクスを変化させ、サブIのサブII上への自然閉鎖を妨げることを強調し、したがって、ACE2活性化の分子機構の証拠を提供する。

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図2
ACE2と活性化因子BAR708の複合体の動的状態。(A,B)BAR708/ACE2複合体の1.5μs MDで最も多く存在するクラスター（オレンジの漫画）とオープンアポACE2のX線構造（PDB ID 1R42；緑の漫画）、および(B)1. B）BAR708/ACE2複合体（オレンジ色の漫画）と、強力な阻害剤MLN-4760（PDB ID 1R4L、マゼンタ色の漫画）と複合化したクローズドACE2の5μs MD。(C-F)BAR708/ACE2複合体の1.5μs MDシミュレーションにおけるPCA解析から得られた相関運動で、最初の4つのベクトル(PC1-4)のヤマアラシプロットで表される。タンパク質の骨格はリボンで表され、矢印は運動の方向を示し、長さは対応する固有値の大きさを表しています。

BAR107のMDシミュレーションの解析は、我々の発見をさらに裏付けている。特に、BAR107/ACE2複合体のタンパク質クラスタリゼーションでは、主要なクラスター（母集団の76％；Supporting Information 図S7F）が得られ、これはオープン構造に対応した（Supporting Information 図S8A,B）。BAR107/ACE2のMDシミュレーションの上位4つの主成分（PC1-4）の解析（参考情報図S8C-F、ビデオS9-S12）は、BAR708/ACE2で観察されたのと同じ挙動を示し、サブIのサブIIに対する閉鎖が顕著に減少した。

タンパク質の全体的なダイナミクスを説明するために、異なる系における残基の揺らぎ（RMSF）も計算した。その結果（図33）、ACE2活性化因子の結合が3つの領域におけるタンパク質の運動に影響を与え、アポACE2のMDと比較して、3つの領域すべてにおいて残基の揺らぎの振幅が著しく減少したことが強調された。予想通り、アポACE2のRMSF（黒線）は、活性化因子結合複合体（茶線とマゼンタ線）と比較して高い揺らぎを示している。

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図3
(A）異なる系におけるACE2残基のRMSFプロット： ACE2アポ型（黒線）、BAR708と複合体化したACE2（茶線）、BAR107（マゼンタ線）。(B）RMSF分析から最も変動する残基を強調したACE2のオープンネイティブ状態。RMSFはSub IIのα-へリックス上に整列したCα原子で計算した。

ACE2におけるBA誘導体の結合様式
MDシミュレーションの解析は、ACE2活性化剤、BAR708およびBAR107のACE2レセプターへの結合によって誘導される非常に類似した挙動を示した。BAR107とBAR708の両方が、化学的性質とステロイド足場上の置換基の位置に関連する相互作用のパターンに若干の違いが観察されたとはいえ、ヘリックスα3、α7とα8の間のループ、およびα18とα19を結ぶループの間に積み重なった特異的結合ポケットで相互作用した（FigureFigure44）。

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図4
(A) BAR708/ACE2複合体（オレンジの漫画）とBAR107/ACE2複合体（シアンの漫画）のMDから得られた最も人口の多いクラスターの全体像。黒い四角は、アゴニスト結合部位となるヒンジ曲げ領域を示す。(B）BAR708/ACE2複合体のCluster0（85％）結合様式（タンパク質はオレンジ色の漫画、リガンドは薄紫色の棒で表現）。(C）BAR107/ACE2複合体のCluster0（76％）結合様式（タンパク質はシアンの漫画、リガンドは茶色の棒で表現）。(D) BAR107/ACE2複合体のクラスター1とクラスター0のBAR708/ACE2複合体の重ね合わせ（タンパク質はオレンジ色の漫画、BAR708は淡紫色の棒、BAR107は濃い灰色の棒で表される）。

特に、ACE2におけるBAR708の結合様式は、合計1.5μsのMDシミュレーションを3回実施した結果、かなり安定であった（Supporting Information Figure S7）。最もポピュラーなクラスター（母集団の85％）のセントロイドは、ステロイド骨格が両親媒性ポケットに位置し、Val212とLeu392の疎水性側鎖とLys562のメチレン鎖との接触を可能にし、一方3β-OHはGln102の側鎖とH結合し、一方7β-OHはGlu208の骨格とH結合していることを示している。また、C17のリガンド側鎖はLeu395とPro565の側鎖との疎水性接触を通して結合に寄与している。最後に、C24側鎖の水酸基はSer253の側鎖とさらにH結合を作る（図44B）。

一方、リガンドRMSDに基づいてMDシミュレーション中に探索されたBAR107/ACE2複合体のコンフォーメーションのクラスター化では、母集団の75%を占めるメインクラスターと、母集団の19%を含む第二の人口クラスターが得られた（図S7F）。メインクラスターの結合様式では、BAR107はBAR708と同じ両親媒性ポケットに、ヘリックスα3とα7とα8の間のループの間に配置される（図44C）。しかしながら、このポーズでは、リガンドはBAR708と比較してステロイド足場の軸に沿って回転しており、3α-OHとGln102の側鎖カルボニルとの間のH結合、およびC24鎖とPro565との疎水性相互作用が維持されている。さらに、ステロイドの足場はLeu95とLys562のメチレン鎖と疎水的な接触をし、C21のメチル基はVal212と相互作用し、最後にC17のリガンドアルキル鎖はLeu91と接触する。さらに、3α-OHはGln102の側鎖とH結合し、C19メチル基はAsn210とGlu208の側鎖のメチレンに向かっている。最後に、側鎖のC24の水酸基はLys562の骨格カルボニルとH結合した。注目すべきことに、2番目のクラスターはBAR708と非常によく似た結合様式を示し（FigureFigure44D）、タンパク質のバックボーンについて計算された非常に低いRMSD値（1.8Å）が示すように、タンパク質のコンフォメーションに大きな違いは見られない。

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考察と結論
本研究では、原子論的MDシミュレーションとリガンド/ACE2系の最も遅い自由度（すなわちPCA）の調査によって、強力なACE2活性化剤としてのUDCA誘導体の発見と、その作用機序に関する構造的洞察を報告した（図55）。

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図5
提案されている作用機序の模式図。

ACE2活性化に対する関心は、高血圧や炎症を含む様々な疾患において、この酵素が保護的な役割を果たしていることから生じている。第一に、ACE2はAng IIを加水分解し、RASの活性化を抑える。第二に、加水分解の産物であるAng (1-7)はGPCR Mas受容体を活性化する。MasRの活性化は、血管拡張、一酸化窒素、プロスタグランジンE2、ブラジキニンの放出を含むいくつかの生物学的効果をもたらし、その結果、酸化ストレスと炎症が軽減される11。 -さらに、Ang(1-7)は、白血球の遊走、サイトカインの発現と放出、線維化経路を抑制し、11 TNFα、IL-1β、IL-6、MCP-1などの炎症性メディエーターの発現を減少させ、抗炎症性サイトカインIL-10の発現を増加させる。ACE2の薬理学的活性化に対する関心は、ACE2活性化による抗炎症作用のため、最近、COVID-19患者の重篤な症状を特徴づける病態とも関連している。このシナリオにおいて、ACE2を活性化できる新規胆汁酸誘導体を同定するために、バーチャル・スクリーニング・キャンペーンを実施した。我々は、ヒンジ屈曲領域を標的とする天然化合物および半合成誘導体のデータベースをスクリーニングし、次いでin vitro酵素アッセイを行った。その結果、一連のUDCA誘導体が有望なACE2活性化剤として同定された。特に、BAR107とBAR708の2つの化合物は、酵素アッセイにおいて通常参照化合物として使用される、最も研究されたACE2活性化剤23-28であるDIZEに匹敵するACE2活性化を示した。BAs誘導体によるACE2の活性化機構を明らかにするために、まず、ネイティブACE2の結晶構造（PDB ID 1R42）から1.5μsのMDシミュレーション解析を行い、アポACE2 PDドメインのコンフォメーションダイナミクスを解析した。MDシミュレーションの結果、ACE2の開いたアポ状態は、ある領域（サブドメインI）が別の領域（サブドメインII）に向かって運動する構造変化を起こし、強力な阻害剤MLN-4760（PDB ID 1R4L）と複合体化したACE2の立体構造に似た完全閉鎖構造に至ることが明らかになった（図Figure55）。ACE2のMD軌跡の主成分分析（PCA）から、開閉運動において重要な役割を果たすのは、ヘリックスα3を含むヒンジ屈曲領域のセグメント、α7とα8の間のループ、およびα18とα19をつなぐループであることが示唆された。BAR107とBAR708のACE2への結合によって誘導されるコンフォメーション変化を、3回のMDシミュレーションによって、合計1.5μsのシミュレーション時間で調べた。BAR107およびBAR708複合体のMDシミュレーションを、PCA、RMSF、およびコンフォメーションクラスタ化によって解析した結果、これらの化合物がACE2のダイナミクスに効果的に影響し、サブドメインIのサブドメインIIへの完全な閉鎖を妨げないまでも、減少させることが証明された。特に、BAR708とBAR107は、PCAから得られるRMSFとポーキュパインプロットの両方によって示されるように、アポACE2のMDで観察される運動の振幅を減少させる（図11）。一方、2つの化合物の結合様式は、3α/β-OHとGln102の側鎖の間（Sub Iに帰属）と、リガンドの4環式コアの側鎖とPro565の間（Sub II）の2つの共通した相互作用が観察されたものの、同じ結合ポケット内で異なるリガンドの配向を示している。さらに、ヘリックスα3上の疎水性残基（Leu91とLeu95；Sub I）、およびヘリックスα7とα8の間のループ残基（Sub II）には、4環式コア構造の異なる面が関与しているにもかかわらず、重要な疎水性相互作用が関与している。したがって、ステロイドの足場上の異なる化学的置換基（例えば、3-OHの異なる立体化学や、BAR708に対するBAR107の6α-エチル基の欠如）は、異なる結合様式をもたらすかもしれないが、しかし、ACE2のコンフォメーションの自由度に対する同様の効果を持つ共通の特徴を共有し、最終的に同等の活性をもたらす可能性がある。我々は、ACE2 PDドメインの本質的なダイナミクスが、活性化因子の結合部位の柔軟性を決定し、ステロイドの足場に異なる化学修飾を施したBA誘導体の適応を可能にすると結論づけた。このため、構造活性相関を定義することは非常に困難である。本研究で分析した一連のBA誘導体は、以下の点で異なっている： (i)3位のヒドロキシ基の立体化学、(ii)6位のエチル基の存在と立体化学、(iii)4環式コアのC-17の側鎖の長さ、そして最後に側鎖上の官能基の末端についてである。これらの化合物の結合様式の分析から、単一の置換基の特異的な立体化学は重要な役割を果たさないことが明らかになった。したがって、酵素活性に対するステロイド骨格の化学修飾の効果について、より深い調査が必要である。

最後に、SARS-CoV-2スパイクタンパク質RBDとACE2との相互作用に影響を及ぼすUDCAおよび他のBA誘導体のin vitroにおける能力に関する最近の知見を考慮し、SARS-CoV-2/ACE2相互作用アッセイにおいて、この一連のUDCA誘導体に挑戦したところ、2つの新規BA誘導体、BARn501およびBAR501-6αは、RBD/ACE2相互作用を約40％阻害する一方、穏やかなACE2活性化剤であることがわかった。一方、このシリーズで最も優れたACE2活性化剤は、ACE2とRBDの相互作用をin vitroで非常に弱く阻害した。興味深いことに、参照化合物であるDIZEはRBD/ACE2相互作用に影響を及ぼさなかった。このデータは、UDCA誘導体がACE2とSARS-CoV-2 Spike-RBDの両方に結合できることを示唆している。ACE2の活性化は、BA誘導体の阻害能とは無関係であった（表1）。したがって、ACE2の活性化とRBD相互作用の阻害との間には関係がないことが示唆され、ACE2の結合および活性化がスパイク結合部位に干渉する可能性は排除された。ごく最近、全長ACE2二量体とグリコシル化RBDとの細胞膜内での相互作用に関するマイクロ秒スケールのMDシミュレーションが報告された53。これらのデータは、ACE2ホモ二量体の高い柔軟性とACE2/RBD界面の高い安定性を示している。著者らはPDドメインの本質的な柔軟性を解析していないが、彼らのデータは、高い柔軟性を持つ状況下でのRBD/ACE2相互作用の安定性を指摘している。これは、ACE2 PDの柔軟性がSARS-CoV-2スパイク親和性に影響を与えないことを報告した、SARS-CoV-2スパイクタンパク質とACE2の相互作用に関する先行研究とも一致する54。ACE2による保護作用を考慮すると、この酵素の阻害はAng IIの炎症促進作用の増加につながるため、新しいCOVID-19治療薬の設計には不適切である。

以上のことから、UDCA誘導体はSpike-RBDとACE2の両方に結合して効果を発揮するという我々の仮説が支持され、Spike/ACE2相互作用を低下させ、Mas軸の活性化によって誘発される保護作用を活性化することができる新規な二重活性抗ウイルス化合物の開発のためのリード足場としてのUDCAの可能性が確認された。

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謝辞
本研究は、イタリアMIUR/PRIN 2017の助成金（2017FJZZRC）により部分的に支援された。B.C.は、欧州地域開発基金-PORカンパニアFESR 2014/2020（サテン）からの支援に感謝する。V.S.とF.M.はUniversity of Napoli "Federico II" (Grant FRA - Line B - 2020- MoDiGa)の支援に感謝する。V.L.は欧州研究会議(ERC) (Grant coMMBi; agreement No. 101001784)およびスイス国立スーパーコンピューティングセンター(CSCS) (project ID u8)の支援に感謝する。

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用語集
使用した略語
ACE2 アンジオテンシン変換酵素II型
ACEアンジオテンシン変換酵素
Ang アンギオテンシン
AT1R Ang II I型受容体
BAs 胆汁酸
DIZE 酢酸ジミナゼン
GAFF一般的な琥珀力場
GPCR Gタンパク質共役型受容体
G-UDCA グリコウルソデオキシコール酸
HRP 西洋ワサビペルオキシダーゼ
IL-1βインターロイキン-1β
IL-6インターロイキン-6
IL-10インターロイキン-10
LGA ラマルク遺伝的アルゴリズム
MD 分子力学
MasR Mas Gタンパク質共役型受容体
MCP-1 単球走化性タンパク質-1
MD 分子動力学
MMP マトリックスメタロプロテアーゼ
PCA 主成分分析
PCs 主成分
PD ペプチダーゼドメイン
PME 粒子メッシュ・エワルド
RAS レニン-アンジオテンシン系
RBD 受容体結合ドメイン
RESP 拘束静電ポテンシャル
RMSD 二乗平均平方根偏差
RMSF 二乗平均平方根ゆらぎ
SASA 溶媒アクセス可能表面積
UDCA ウルソデオキシコール酸
TMPRSS2膜貫通セリンプロテアーゼ2
T-UDCA タウロウルソデオキシコール酸
UDCA ウルソデオキシコール酸
VCAM 血管細胞接着分子
VSバーチャルスクリーニング
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参考情報
Supporting Informationはhttps://pubs.acs.org/doi/10.1021/acs.jcim.1c01126。

既知のACE2活性化物質のAD4スコア（kcal/mol）（表S1）；インハウスライブラリに属する67化合物の化学的/物理的特性分布（図S1）；AutoDock4の再ドッキング手順（図S2）；表1で報告されたすべての化合物の最良のドッキングポーズの重ね合わせ（図S3 A）；BAR708とBAR107の最良のドッキングポーズ（図S3）；ACE2の配列と二次構造標識（図S4）；ACE2： SARS-CoV-2スパイク阻害剤スクリーニングアッセイ（図S5 A）およびACE2活性アッセイ（図S5 B）の結果；アポACE2のクラスター解析および動的状態（図S6）；BAR708およびBAR107 RMSDの時間発展（μs）（図S7）；1. 5μsのMD（図S7）；BAR708およびBAR107と複合体化したタンパク質RMSDの時間発展（μs）（図S7）；BAR708およびBAR107の溶媒アクセス可能表面積（SASA）の時間発展（μs）（図S7）；および活性化因子BAR107と複合体化したACE2のPC1-4ベクトルの動的状態とヤマアラシプロット（図S8）（PDF）。
ACE2/BAR107複合体のpdb形式3次元構造 (PDB)
ACE2/BAR708複合体のpdb形式3D構造(PDB)
原稿で紹介した化合物のSMILESを提供するcsvファイル (XLSX)
アポACE2のPC1-4（ビデオS1-S4）；BAR708と複合体化したACE2（ビデオS5-S8）；およびBAR107（ビデオS9-S12）に関するサポートアニメーションビデオS1（MP4）
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著者貢献
B.F.、F.M.、V.L.、B.C.が計算実験を行い、データを解析した。V.S.、P.R.、A.Z.が化学合成を行った。A.C.、S.M.、M.B.、S.F.がin vitroデータを作成し、データ解析を行った。V.L.、A.Z.、B.C.、S.F.は本研究の構想を行った。著者全員が原稿を起草し、最終的な提出原稿を執筆した。

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注釈
著者らは以下の競合する金銭的利害関係を宣言する：著者らは以下の利害関係を宣言する： SF、AZおよびBCは、本論文に記載された化合物の一部について、BAR Pharmaceuticals S.r.L.名義でイタリア特許出願第102020000011092号および国際特許出願PCT/IB2021/054142号を出願している。SF、AZ、BCはBAR Pharmaceuticalsより研究助成を受けている。

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注釈
ACE2/BAR107およびACE2/BAR708複合体の3次元構造は、サポート情報としてpdb形式で提供されている。他の全てのデータは、リクエストに応じて入手可能である。

参考資料
補足資料
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ci1c01126_si_002.pdb(759K, pdb)
ci1c01126_si_003.pdb(760K, pdb)
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