病原体に対する腸内細菌叢のコロニー形成抵抗性を解析する計算手法

哉百名

セルリポーツ・メソッド
3巻 9号 2023年9月25日 100576号
論文
病原体に対する腸内細菌叢のコロニー形成抵抗性を解析する計算手法

https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S2667237523002205

著者リンク オーバーレイパネルを開くShanlin Ke 1 5, Yandong Xiao 2 5, Scott T. Weiss 1, Xinhua Chen 3, Ciarán P. Kelly 3, Yang-Yu Liu 1 4 6
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https://doi.org/10.1016/j.crmeth.2023.100576
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ハイライト

GMPTはコロニー形成抵抗性におけるマイクロバイオームの役割を効果的に明らかにする。

GMPTは古典的なGeneralized Lotka-Volterraモデルを用いて検証可能である。

GMPTは、合成微生物叢と2つのマウス研究への適用に成功している。

動機
微生物叢は病原体による感染から宿主を直接保護することができる（コロニー形成抵抗性として知られる現象）が、特定の病原体に対する微生物叢媒介コロニー形成抵抗性に関与する微生物を同定することは、優れた課題であった。ここでは、病原体に対する微生物叢介在コロニー形成抵抗性に直接影響を与える原因微生物の候補を同定するための計算フレームワークである一般化微生物表現型三角測量（GMPT）を紹介する。

概要
哺乳類の腸内細菌叢は、しばしば有害な外来微生物の侵入に対してコロニー形成抵抗性（CR）を介して宿主を保護しているが、特定の病原体に対する腸内細菌叢媒介CRの原因微生物を正確に同定することは依然として課題である。この限界に対処するため、われわれは一般化微生物表現型三角測量（GMPT）という計算手法を開発した。まず、群集生態学における古典的な個体群動態モデルを用いてGMPTを系統的に検証し、ベースラインの手法よりも優れていることを実証した。次に、実コミュニティ（GnotoComplex microflora）から推定した生態系ネットワークから生成したシミュレーションデータと、Clostridioides difficile感染に関する2つのマウス研究の実マイクロバイオームデータを用いてGMPTをテストした。我々は、GMPTが、微生物叢を介した病原体に対するCRに関与する可能性のある微生物の発見を効率化できることを実証した。GMPTは、CRメカニズムの理解を進め、腸内感染症を予防・治療するための微生物ベースの治療法の合理的な設計を促進することが期待される。

グラフィカル抄録

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キーワード
腸内細菌叢耐性原因推論感染症
研究テーマ
CP: 微生物学CP: システム生物学
はじめに
健康な人の腸内細菌叢は、抗菌性産物の分泌、栄養競合、病原体に対するコロニー形成抵抗性（colonization resistance: CR）を複数のメカニズムを通じて提供している、 しかし、特定の病原体に対する腸内細菌叢が介在するコロニー形成抵抗性（CR）の原因となる微生物を正確に特定すること、すなわち病原体の増殖を直接阻害する原因微生物を特定することは、マイクロバイオーム研究における基本的な課題となっている3,4,5,6,7,8,9。

微生物間の相互作用は、バクテリオシンの分泌、10,11 栄養競合、12 代謝性相互摂食、13 あるいは宿主免疫系の調節によって媒介されることがある。統計的相関関係は、いくつかの理由から微生物相互作用の推定には適さない。第一に、定義上、統計的相関関係は無向性（または双方向性）であるのに対し、微生物相互作用は有向性（または単方向性）である可能性がある。第二に、統計的相関関係は時間または状態に強く依存する可能性がある。第三に、たとえ定常状態に注目したとしても、微生物相互作用の強さと種量の統計的関連性の間には単純な関係はない21。しかし、これらの手法には高品質の時系列データ22,23か、あるいは多数の定常状態サンプル24が必要であり、実用的な応用には大きな制限がある。

ヒトの腸内細菌叢については、表現型に関連する微生物を同定するための標準的なアプローチとして、ある表現型に関連する遺伝子変異を同定するために一般的に用いられるゲノムワイド関連研究に類似した、微生物ワイド関連研究（MWAS）が用いられてきた。標準的なMWASでは、対象となる2つの集団（例えば、疾患と健常者）の間で微生物組成を比較し、対象となる表現型と相関する、異なる発現量の微生物が同定される25。しかし、ヒト腸内細菌叢の広範な複雑さ、特に微生物の相互作用のため、MWASでは通常、疾患バイオマーカーとして関与する微生物種の長いリストが作成されるが、疾患発症との関連性は明確ではない26。

最近、疾患発症に影響を及ぼす可能性の高い原因微生物を特定するために、微生物-表現型三角法（MPT法）が開発された26。この方法は、表現型が異なる（例えば、疾患に対する感受性が異なる）宿主グループの微生物群集を比較して、原因微生物を特定するものである。MWASのように2つの表現型グループ間で比較すると、多くの場合、存在量の異なる微生物の長いリストが得られるが、複数の表現型グループを比較し、それらの重複をチェックすることで、このリストを少数の微生物に減らすことができる。例えば、MPT法は、化学的に誘導された大腸炎からマウスを保護する微生物を同定するために適用されている26。MPT法の重要な前提は、もし本当に疾患発症に関連する分類群があれば、異なる表現型グループのすべてのペアワイズ比較に存在するはずだということである。しかし、その結果、例えばMPT研究で報告されたLachnospiraceae科のような、分類学的に非常に高いレベルの原因分類群が候補となることが一般的である。実際、MPTの枠組み全体は比較的経験的なものであり、群集生態学の観点からの厳密な正当性を欠いている。

MPTの先行研究26に触発され、我々は病原体に対するCRを媒介する微生物を系統的に同定するために、一般化された微生物-表現型三角測量（GMPT）法を提案する。GMPT法は次のような重要な仮説に基づいている：表現型のペアワイズ比較のほとんどに現れ、その存在量が病原体の存在量と強い負の（または正の）相関を示す差次的存在量の種は、病原体の増殖を直接阻害（または促進）する予防的（または寛容的）原因種である傾向がある。本来のMPT法と異なり、GMPT法は理論的に検証可能である。本研究では、群集生態学における古典的な個体群動態モデルを用いてGMPTを系統的に検証し、基本的な計算手法であるMWASやMPTよりも優れていることを実証した。次に、GnotoComplex微生物叢（ヒト常在細菌の混合株）のシミュレーションデータを用いてGMPTの性能を検証した。最後に、Clostridioides difficile感染症（CDI）に関する2つのマウス研究から得られたマイクロバイオームデータにGMPTを適用し、CDIの病因に直接関係すると考えられる予防的および寛容的微生物種の包括的リストを同定した。本手法は、CDIやその他の感染症を予防・治療するためのマイクロバイオームに基づく治療法の合理的な設計に光を当てるものである。

研究結果
GMPT法のワークフロー
GMPT法の概要を図1に示す。まず、マイクロバイオームサンプルを
�
の異なる「表現型」グループに分ける（図1A）。ここで
�
「表現型」グループは、必ずしも臨床的に異なる表現型に対応するわけではない。ここでは
�
をチューニングパラメーターとして考える。固定数のマイクロバイオームサンプルがある場合、次のように設定する。
�
を十分な大きさに設定するが、それでも各「表現型」グループのサンプルサイズが十分であることを保証する。
�
(
�

1
)
/
2
"表現型 "のペアはまだ統計的に意味がある。次に、標準的なツール、例えばALDEx2(27)を用いて、各表現型のペアに対してDAAを実行し、差次的に豊富な生物種のプールを得る（図1B）。次に、すべてのペアワイズDAAに存在する頻度に基づいて、すべての生物種を降順にランク付けする（図1C）。もし同数であった場合は、さらにその区別可能性に基づいて種を降順にランク付けする。ALDEx2において、種の差異性を定量化するためにエフェクトサイズ（すなわち、相対的な倍数差）を使用する。第三に、各生物種について、スピアマン相関係数（�と表す）を計算する。
�
˜
) を計算した。
1
)間のスピアマン相関係数(species
m
の間の
(
�
1
(
1
)
,
...
,
�
1
(
�
)
)
) と種
�
(
(
�
�
(
1
)
,
...
,
�
�
(
�
)
)
). もし病原体量が全サンプルで得られず、罹病度スコアのみが得られた場合
(
�
(
1
)
,
...
,
�
(
�
)
)
が利用可能であれば
(
�
(
1
)
,
...
,
�
(
�
)
)
a
s
a
p
r
o
x
y
o
f
(
�
1
(
1
)
,
...
,
�
1
(
�
)
)
において
�
˜
を計算する。を計算する。
�
˜
はそれぞれ、病原体の増殖を直接促進（または阻害）する原因候補種を表す。最後に、GMPTは（すべてのペアワイズDAAにおける出現率に基づいて）推定原因種としての候補のランキングを提供する。

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図1. 全体的なワークフローの概要

(A）腸内細菌叢は、外因性微生物によるコロニー形成に対する抵抗力を提供する上で重要である。微生物叢組成の変化、およびそれに伴うCRの崩壊の可能性は、食事や抗生物質などの様々な環境要因によって引き起こされる可能性があり、それによって病原体が腸内にコロニー形成し、最終的に疾患を引き起こす機会がもたらされる。

(B）ヒトのコホートや動物モデルから得られた微生物サンプルは、表現型（病原体のコロニー形成に対する抵抗力）に基づいてグループ化することができる。可能性のある各対比較について、存在量の差分析を実施する。差次的存在量の微生物プールは各対比較分析から得られ、ベン図は全ての比較における差次的存在量の微生物の頻度分布を示す。

(C) 差異的に豊富な分類群は、すべての一対比較に現れる頻度と差異性（降順）に基づいてランク付けされる。さらに、全サンプルにおける種の相対的な存在量と、病原体に対するコロニー形成抵抗性を付与する能力の昇順ランク指数（例えば、特定の病原体の存在量や病気の重症度スコア）を用いて、スピアマン相関係数(
�
˜
). ここで正（負）
�
˜
は病原体の許容（予防）分類群を表す。また
�
˜
は病原体の増殖に対して中立であることを意味する。

特定の表現型に対する腸内細菌叢の影響を調べる効果的な方法は、罹患動物と非罹患動物を同居させることである。以前の研究では、化学的に誘導された大腸炎に罹患しやすいマウスと罹患しにくいマウスを同居させると、罹患しやすいマウスは保護されるが、罹患しやすいマウスはより罹患しやすくなることが示された26。この現象から、私たちはGMPT法をシリコで系統的に検証することを思いついた。

群集生態モデルを用いたGMPTの検証
のグローバルな種プール（または「メタコミュニティ」）から集められた異なる「ローカルコミュニティ」として、異なる宿主の腸内細菌叢をモデル化する。
�
特に、どのようなローカルコミュニティーの個体群動態も、対になる微生物間の相互作用を伴う常微分方程式（ODE）で記述できると仮定する：
式1
d
�
�
(
�
)
d
�

�
�
(
�
)
[
�
�
+
∑
�

1
�
�
�
�
�
(
�
�
(
�
)
,
�
�
(
�
)
)
]
,
�

1
,
...
,
�
,
であり、宿主が異なれば、最終的な地域社会における現存種が異なるだけである。ここで
�
�
(
�
)
は種の存在量を表す
�
の存在量を表す。
�
,
�
�
∈
�
は種の固有成長率
�
,
�

(
�
�
�
)
∈
�
�
×
�
は種の相互作用の強さの行列であり
�
(
�
�
(
�
)
,
�
�
(
�
)
)
:
�
×
�
→
�
は種の相互作用の形をモデル化したものである。単純な関数形
�
(
�
�
,
�
�
)

�
�
は古典的なGLV（Generalized Lotka-Volterra）モデルに相当し、宿主関連微生物群集の既存の生態学的モデリング研究で多く用いられている。
�
は生態ネットワーク
�
(
�
)
有向辺
(
�
→
�
)
∈
�
(
�
)
もし
�
�
�
≠
0
. GLVモデルでは
�
�
�

0
(
<
0
) は、種
�
の成長を促進(抑制)することを意味する。
�
. エッジの太さは�の絶対値に対応する。
�
�
�
すなわち相互作用の強さである。GLVモデルでいう相互作用とは、ある生物種が他の生物種に及ぼす全体的な影響であり、接触阻害、生態学的競争、バクテリオシンの分泌、宿主の免疫調節など、あらゆる種類のメカニズムが考えられる。本研究では、GMPT法を検証するために、GLVモデルを用いて合成データを作成する。特に、病原体の増殖を直接促進または阻害する種を特定したい。

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図2. 生態モデリングフレームワークを用いたGMPTの検証

(A）30種の種プール（またはメタコミュニティ）に関連する合成生態系ネットワーク。青（または赤）のエッジは、ある種の他の種に対する阻害（または促進）効果を意味する。エッジの太さは相互作用の強さの絶対値に対応する。緑色の領域は、3つの要素からなるXのエゴネットワークをカバーする： (1)焦点となる種X（「エゴ」と呼ぶ）、(2)病原体Xと直接相互作用する種（「アルター」と呼ぶ）、(3)エゴとアルター間、アルター間の相互作用。GMPTはこれらの直接相互作用因子を同定することを目的としている。

(B)2つのベースライン表現型AとBからそれぞれ得られた2つのサンプル（「ローカルコミュニティー」）の時間的存在量と対応する生態系ネットワーク。灰色のノードは、表現型AまたはBに存在しない種を示す。病原体Xの侵入後、表現型Aでは成長せず、表現型Bで開花する。

(C）我々のモデリングフレームワークは、表現型Aの宿主と表現型Bの宿主を同居させた中間表現型AB-0.5を生成するために、同居プロセスを模倣する。
50
%
の種が前者に移行した。共同飼育後、元のA宿主は中間表現型を持つことになる： AB-0.5。B）と（C）では、シミュレーション中に測定ノイズを加えていないことに注意。

(D) 異なる表現型にわたる種の平均相対存在量の3Dプロット。表現型軸は、病原体Xの平均相対存在量の昇順でソートされている。各表現型のペアについて、ALDEx2を適用して、それらの異なる存在量の種を同定する。種軸は、すべてのペアワイズDAAにおけるそれらの存在頻度の降順で種に対応する。

(E）スピアマン相関係数
�
˜
�
の
�
(病原体Xを除く）の
�

(
�
1
,
...
,
�
�
)
そして
�

(
�
1
,
...
,
�
�
)
ここで
�
�
はサンプル中の病原体 X の相対量である。
�
であり
�
�
は生物種の相対存在量
�
の相対存在量である。
�
. GMPTの場合、病原体Xのプロモーターかインヒビターかは、以下の符号で決定される。
�
˜
�
. 青/赤/灰色は病原体Xに対する直接的な阻害/促進/無影響のグランドトゥルースを示す。

(F) MWAS1を用いた各生物種の効果量。これは2つの極端な（またはベースライン）表現型を用い、ケースとコントロールのサンプルは、それぞれ病原体Xの存在量が最も高い表現型と最も低い表現型に対応する。

(G) MWAS2を用いた各生物種の効果量。この方法では、(D)に示した8つの表現型を、病原体Xの存在量の降順に従って、症例または対照サンプルに均等に分割する。(D)-(G)において、ALDEx2では、絶対効果量が0.5より大きくなければならないという基準で、異なる存在量の種を選択していることに注意。

(HとI) 直接相互作用因子または間接相互作用因子の推論における二値分類のF1スコアと幾何平均（すなわち、感度と特異度の積の平方根）。
�
種の関数としての直接相互作用因子または間接相互作用因子の推論における二値分類の平均（感度と特異度の積の平方根）。

(J)阻害剤とプロモーターの推論精度。完全な推論は厳密に単調増加曲線である。
�
種が因果的相互作用であり、正しく推論できたと仮定するためである。GMPTでは
�
の値は
x
軸の�値は、すべてのペアワイズDAAにおける存在頻度の降順でソートされている。MWAS1とMWAS2については
�
値は
x
軸の�値は、症例サンプルと対照サンプルのDAAによる絶対効果量の降順でソートされる。

のメタコミュニティを考える
�
種のメタコミュニティーを考える。図2Aは、�種のメタ群集に関連するランダムに生成された生態学的ネットワークを示している。
�

30
中央のノードXは脱コロニーしたい病原体を表し、Xと直接相互作用する種は緑色の円でハイライトされている。緑色でハイライトされたサブグラフはXのいわゆるエゴネットワークであり、焦点となる種（「エゴ」、すなわち病原体X）、Xが直接相互作用する種（「アルター」と呼ばれる）、Xとそのアルター間のリンク／相互作用、アルター間のリンク／相互作用から構成される。エゴネットワークの構造を知ることで、病原体を脱コロニーするための効果的な制御戦略（プロバイオティクス・カクテルなど）をデザインするのに役立つことが示されている19。

まず、メタコミュニティから2つのベースライン表現型（「A」と「B」と表記）を生成する。この2つのベースライン表現型は、病原体はAでは生き残れないが、Bでは開花するという基準に基づいて選択される（図2Bに、病原体侵入前後の種の存在量の時間的挙動のシミュレーションを示す。） ベースライン表現型を生成するための詳細な手順は、STAR Methodsに示されている。

次に、"co-housing "プロセスをシミュレートして中間表現型を生成する。特に、ある宿主から別の宿主へ、ある割合の種を移し、移された種の割合は共棲時間に比例すると仮定する。例えば、AB
�
は、表現型Aの宿主（地域社会）が表現型Bの宿主（地域社会）と同居したことを意味し、その分率
�
の種がA宿主に移動したことを意味する。最後に、コミュニティは新しい中間表現型（AB-と表記）に進化する。
�
. なお、AB-
�
はBA- �とは異なる。
�
. 図2Cは表現型Aの群集の分離飼育、共同飼育、病原体侵入における時間的挙動を示す。ここで
�

0.5
の場合、Bの種の50％がAに移動し、より感受性が高い表現型となり、そこでは病原体がかなりの量でコロニー形成に成功する（Aよりは高いが、Bよりは低く、したがって中間的な表現型となる）。チューニングにより
�
を調整することで、様々な中間表現型を生み出すことができる。図2Dの表現型軸は、8つの異なる表現型を病原体Xの平均相対存在量によって昇順にランク付けしたものである（緑色のバーを参照）。

仮に合計で
�
の表現型（2つのベースライン表現型を含む）が生成されたとする。そして、すべての
�
(
�

1
)
/
2
表現型のペアを、例えばALDEx2を用いて、異なる存在量の種を同定する。我々は、すべてのペアワイズDAAにおけるそれらの出現数に基づいて、それらの差次的に豊富な種（病原体Xを除く）をランク付けする。次に、各差異的に豊富な種について
�
(病原体Xを除く)について、スピアマン相関係数
�
˜
を計算する。
�

(
�
1
,
...
,
�
�
)
そして
�

(
�
1
,
...
,
�
�
)
ここで
�
�
はサンプル中の病原体 X の相対量である。
�
であり
�
�
は生物種の相対存在量
�
の相対存在量である。
�
. 正の（または負の）
�
˜
�
は、種
�
は、病原体の存在量が高いサンプルでは存在量が高い（または低い）傾向があることを示す。

我々の重要な仮説は、正（または負）の��を持つ異なる存在量の生物種は、��の��が高い（または低い）傾向があるということである。
�
�
を有し、かつペアワイズDAAにおける出現率が高い種は、それぞれ病原体の増殖を直接促進（または抑制）する確率が高いはずである、というものである。図2Aに小規模な合成微生物群集を示す。ベクター
�
と
�
をそれぞれ図2Dの3Dバーで示した。図2Dの種軸は、すべてのペアワイズDAA（ここではALDEx2を使用してDAAを実行した）における種の出現率の降順で示した。スピアマン相関係数
�
�
は、図2Dに示した結果から計算した。その結果、以下のことがわかった： (1)病原体Xと直接相互作用する種（「直接相互作用種」、青と赤で着色）は、Xと直接相互作用しない種（「間接相互作用種」、灰色で着色）よりも、ペアワイズDAAでより頻繁に現れる。
�
�
はそれぞれ正（または負）である。その結果、すべてのペアワイズDAAとスピアマン相関係数における出現率を組み合わせることで、病原体の増殖を直接促進または阻害する種を実際に特定できることが示された。したがって、GMPTは病原体との直接的な相互作用の信頼度が高い順に、生物種をランク付けしたリストを提供する。相互作用のタイプはスピアマン相関係数で示される。

病原体に対する微生物叢を介したCRの原因菌種を推定するGMPTの可能性を実証するために、ベースラインアプローチ、すなわちMWASおよびMPTの性能と比較した。公正な比較のため、すべてのアプローチ（MWAS、MPT、GMPT）において、同じDAA法（すなわち、ALDEx2）を使用し、同じ基準（絶対効果サイズが0.5より大きい）に基づいて、異なる豊富な種を選択した。

まず、合成データにMPTを適用した。
�

8
表現型）に対してMPTを適用した（図2A）。
�

30
の種は28のペアワイズDAAすべてに現れなかった。このことは、MPTがこの合成群集に対して病原体と直接相互作用する種を推定できないことを示唆している。

次に同じ合成データにMWASを適用した。与えられた
�
(1)MWAS1は、病原体の存在量が最も高いものと低いものの2つのベースライン（または極端な）表現型のみを考慮するもので、(2)MWAS2は、すべてのサンプルを病原体の存在量の降順にランク付けし、サンプルを病原体の存在量が高いものと低いものの2つのグループに分けるものである。MWAS1とMWAS2で得られた推論結果をそれぞれ図2Fと2Gに示す。MWASの推論結果は以下のように解釈できる。すべての生物種は、DAAにおける絶対効果量の降順でランク付けされた（参照
x
軸を参照）。DAAによって得られた差次的に豊富な種（絶対効果量が0.5より大きい、図2Fと2Gの破線を参照）を、病原体Xと直接相互作用する種（「直接相互作用種」）とし、残りを病原体Xと間接的に相互作用する種（「間接相互作用種」）とした。これらの直接相互作用因子について、その効果量の符号を用いて正の相互作用（「促進因子」）または負の相互作用（「阻害因子」）を決定する。

GMPTとMWASはともに直接相互作用因子をリストの上位にランク付けする傾向があるので、それらの上位の相互作用因子を「促進因子」（"promoters"）または「阻害因子」（"inhibitor"）と仮定することができる。
�
種が直接相互作用体で、残りの種は間接相互作用体であると仮定できる。次に、以下の2つのステップで推論性能を比較した。
�
を1から
�
. まず、直接対話者と間接対話者の判別性能を比較した。
�
種を識別する性能を比較した。そのために、標準的な性能指標（例えば、F1スコア：精度と想起率の調和平均、G平均：感度と特異度の幾何平均）を用いることができる2値分類問題を定式化した。図2Hと図2Iに示すように、幅広い
�
の広い範囲において、GMPTはMWAS1とMWAS2を直接相互作用因子と間接相互作用因子の識別において上回った。第二に、阻害剤とプロモーターの判別において、上位�の中でGMPTとMWAS1の性能を比較した。
�
種の中で、阻害剤とプロモーターを識別する性能を比較した。上位�種の中には間接的な相互作用因子が存在する可能性があるため
�
の間に間接的な相互作用因子が存在する可能性があるため、これは純粋な二値分類問題ではない。異なる手法の性能を比較するために、阻害剤やプロモーターとして正しく同定された種の数と、上位�種の中の阻害剤やプロモーターの真の数との比として、精度を計算する。
�
種の中の真の阻害剤とプロモーターの数との比として計算した。図2Jに示すように、すべての
�
の全ての範囲において、GMPTはMWAS1とMWAS2よりも阻害剤とプロモーターの識別において有意に優れている。実際、GMPTの性能は完全推論に近く（グレーの曲線）、全ての直接相互作用因子が間接相互作用因子よりも上位にランクされ、全ての阻害剤とプロモーターが上位�の中から正しく同定される。
�
種の中で正しく同定されている。

GMPTがMPTやMWASより優れているのは、GMPTやMWASで用いられている特定のDAA手法によるものではないことを強調したい。我々は、症例と対照のマイクロバイオームサンプルの比較から有意に豊富な種を同定するために、数多くのDAA法が開発されてきたことを知っている。最近のメタアナリシスでは、ALDEx2とマイクロバイオーム組成解析（ANCOM）が38の研究にわたって最も一貫した結果をもたらし、14の異なるアプローチによる結果の交点と最もよく一致することが示された34。DAA法としてANCOMを使用した場合、28のペアワイズDAAすべてに現れる生物種は依然として存在せず、MPTが原因生物種を同定できないことを示唆している。さらに、DAA法としてANCOMを用いても、GMPTはMWAS1とMWAS2よりも優れている（図S1参照）。

GMPTの頑健性を系統的に評価するために、異なるパラメーター（例えば、生態系ネットワークの構造特性、表現型グループごとのサンプルサイズ
�
DAA手法、DAAで使用される統計的基準など）に対する頑健性を系統的に評価するため、さらに合成マイクロバイオームデータ(
�

100
種）の10表現型（2つのベースライン表現型と8つの中間表現型）をGLVモデルを用いて作成した。図3に示すように、GMPTのMWAS1やMWAS2に対する優位性は、特にサンプルサイズが大きい場合に顕著である（図3C、3F、3I）。さらに、GMPTの性能は、異なるDAA手法、異なる統計的閾値（それぞれALDEx2のエフェクトサイズとANCOMのWスコア）、異なる表現型に対して非常に頑健である（図S2-S5参照）。生態学的ネットワークのトポロジーと相互作用の強さ、すなわち、ネットワークの連結性、次数分布のべき乗指数、および�の標準分散を系統的に調整することにより、�の標準分散が変化する。
�
�
�
GMPTの性能は、生態系ネットワークの異なる構造特性に対して頑健であることが示された（図S5）。また、表現型の数がGMPTの有効性を左右する重要なパラメータであることがわかった。合成データの推論結果は、GMPTの表現型を8個にするまでは継続的な改善が見られた。それ以降は、表現型の数を増やしても、推論精度にそれ以上の有意な改善は見られなかった（図S5参照）。

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図3. 特定の病原体と直接相互作用する原因種の同定におけるGMPT法と従来のMWAS法の評価

列（左から右へ）：表現型ごとに異なるサンプルサイズ。

(A-F)2値分類問題（直接相互作用種と間接相互作用種）のF1スコアと幾何平均。
�
.

(G-I）インヒビターとプロモーターの推論精度。
�
. GLVモデルに従って合成データをシミュレーションした。
�

100
とスケールフリーの生態ネットワーク (
�

2.5
). 3つの推論手法では、ALDEx2を用いて、絶対効果値が0.5より大きいという基準で差次的に豊富な種を選択する。ネットワークの接続性
�

0.2
相互作用強度の標準分散
�

0.2
そして、種の存在量の測定ノイズレベル
�

0.05
. 性能曲線は 10 の異なる生態系群から計算された。エラーバーは10個の独立した生態系コミュニティから計算した平均の標準誤差（SEM）を表す。

さらに、合成ネットワークが未知のグランドトゥルースを持つ実際のネットワークとどの程度一致するかを定量化することはできなかったが、グランドトゥルースを持つ実際の微生物群集にGMPTパイプラインを適用した。いわゆるGnotoComplex microflora22（ヒト常在細菌タイプの混合株）とマウスデータから推定したC. difficileを含む生態系ネットワークを用いて、実際のコミュニティのネットワークから生成したデータに対してGMPTが機能するかどうかを検証した。具体的には、まず無菌マウスをGnotoComplex微生物叢であらかじめコロニー化し、常在細菌叢を28日間定着させた。その後、マウスにC. difficileの芽胞を感染させ、さらに28日間モニターした。生態系ネットワーク（図4A）から、種-4（Clostridium scindens）と種-13（Roseburia hominis）がC. difficileの増殖を直接阻害できることがわかった。この生態ネットワークは、細菌群集がGLVの動態に従うという我々と同じ仮定に基づいて推論されたことに留意されたい。この生態ネットワークに対するGMPTの性能をテストするために、GLVダイナミクスを実行することによって、いくつかのベースライン（図4B）と中間表現型（図4C）を生成することができる。我々のGMPTを適用した結果、C. difficileに対する2つの直接阻害剤の推定に成功し、最初の2位にランクされた（図4Dと4Eの青いバーを参照）。さらに、他の2つのMWAS法とも比較した。MWAS1では、2つの間接種14と2（すなわち、大腸菌とClostridium hiranonis）が直接種4の前にランク付けされた（図4F）。MWAS2では、推論精度はGMPTと同じであった（図4G）。しかし、Bacteroides vulgatus、E. coli、C. hiranonisは誤って表示された。全体として、GnotoComplex微生物叢の生態学的ネットワークにおいて、我々のGMPTはC. difficileの直接阻害剤をすべて推論することに成功している。

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図4. 実際の群集から推定された生態系ネットワークから生成されたシミュレーションデータ（GnotoComplex微生物叢）に対するGMPTと他のMWAS手法の推論性能の比較

(A）マウスデータからGnotoComplex微生物叢（ヒト常在細菌の混合）とC. difficileを含む生態ネットワークを推定した。ノードCはC. difficileを表す。エッジの幅とノードのサイズは、それぞれ種間相互作用の強さと固有増殖率を示す。赤（または青）のエッジはそれぞれ直接促進（または阻害）を示す。

(B)2つのベースライン表現型AおよびBからそれぞれ得られた2つのサンプル（「ローカルコミュニティ」）の時間的存在量と対応する生態系ネットワーク。灰色のノードは、表現型AまたはBに存在しない種を示す。C. difficileの侵入後、表現型Aでは成長せず、表現型Bで開花する。

(C）我々のモデリングフレームワークは、表現型Aの宿主と表現型Bの宿主を同居させ、後者から前者に50％の種が移行するという中間表現型AB-0.5を生成する同居プロセスを模倣する。共同飼育後、元のA宿主は中間表現型を持つことになる： AB-0.5。

(D）異なる表現型にわたる種の平均相対存在量の3Dプロット。表現型軸はC. difficileの平均相対存在量の昇順でソートされている。各表現型のペアについて、ALDEx2を適用し、絶対効果値が0.5より大きいという基準で、差次的に存在する種を同定する。種軸は、すべてのペアワイズDAAにおける存在頻度の降順で種に対応する。

(E) GMPTについては、スピアマン相関係数
�
˜
�
の
�
(C.difficileを除く)の2つのベクター間の
�

(
�
1
,
...
,
�
�
)
そして
�

(
�
1
,
...
,
�
�
)
ここで
�
�
はサンプル中のC. difficileの相対存在量です。
�
であり
�
�
の相対量である。
�
の相対存在量である。
�
.

(F）MWAS1を用いた各生物種の効果量。これは2つの極端な（またはベースライン）表現型を用い、ケースとコントロールのサンプルは、それぞれC. difficileの存在量が最も高い表現型と最も低い表現型に対応する。

(G) MWAS2を用いた各生物種の効果量。この方法では、(D)に示した8つの表現型を、C. difficileの存在量の降順に従って症例または対照サンプルに均等に分割する。(D)-(G)において、ALDEx2では、絶対効果量が0.5より大きくなければならないという基準で、差次的に豊富な生物種を選択し、青/赤/灰色は、C. difficileに対する直接阻害/促進/無効効果のグランドトゥルースを示していることに注意してください。

構成性の問題はマイクロバイオームデータ解析における一般的な落とし穴である。GLVモデルから生成された合成データを用いると、GMPTとMWAS2の推論結果は相対的存在量と絶対的存在量のどちらを用いてもほとんど変わらないが、絶対的存在量を用いるとMWAS1の推論精度が著しく向上することがわかった（図S6）。さらに、絶対量を用いると、GMPTとMWAS1ではスピアマンの相関係数と効果値がそれぞれ大きくなることがわかった。これらの結果から、原因生物種の推定における絶対存在量の重要性は、特定の手法に依存することが示唆された。

実データへの応用
提案された方法論を説明するために、我々はまず、C. difficileに対するCRに対する抗生物質誘発効果の研究から得られたネズミの腸内微生物サンプルにこの方法を適用した35、 このデータセットは、複数の異なる摂動（例えば、異なる抗生物質クラス、用量、回復時間）を組み合わせたもので、C. difficileのコロニー形成に対する様々な感受性を示す明確な群集プロファイルを作成することができた。次に、C. difficileにチャレンジしたサンプルだけを得るために、追加のフィルタリングステップを適用した。合計132匹のマウスから得られた132サンプルを解析した。まず、このコホートをマウスのC. difficileコロニー形成レベル（STAR法）に基づいて8群に分けた（図5Aおよび5B）。主座標分析（PCoA）プロットからも、異なるグループ間で明確な微生物構造（PERMANOVA検定、p値＝0.0001、Bray-Curtis非類似度）が示された（図5C）。次に、ALDEx2を用いて、全28（8つのグループから可能なすべての組み合わせ）のペアワイズ比較において、差次的に豊富な細菌を同定した。これらのマウスの根底にある微生物源の違いを考慮すると、すべてのペアワイズ解析で、少なくとも1つのペアワイズ比較で提示された119の差次的に豊富なASVの分類群プールが得られた。ペアワイズ比較で提示された差次的に豊富なASVの最大頻度は11であり、これら11のペアワイズ比較から同定されたASVはわずか3つ（ASV5: Muribaculum intestinale; ASV22: Eubacterium ventriosum; ASV60: Unclassified Clostridiales）であった。C. difficileに対するCRは決して単一の微生物に起因するものではなく、むしろ複数の相互作用する微生物種の結果であることが示唆された。上位30の候補プロモーターまたは阻害剤を図5Dおよび表S1に示す。

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図5. データセットIでGMPTにより同定されたC. difficile感染関連分類群

(A）異なる表現型グループを得るためのフローチャート。

(B）各グループにおけるC. difficileの存在量（CFU/g糞便）の比較。棒グラフは平均値±SEMを表す。

(C）抗生物質によって誘導された腸内微生物群集の不均一性を示す、マウスの糞便微生物叢のPCoAプロット。

(D）GMPTを用いて同定されたC. difficile感染関連ASVを示す系統樹。横棒の色はファミリーレベルを表し、ASVと分類学情報の色の違いは寛容な分類群または保護的な分類群を表す。

腸内細菌叢と疾患との間の先行研究では、しばしば複雑な結果が得られており、これはマイクロバイオーム分野における古典的な問題である。我々の手法の優位性をさらに示すために、腸内細菌叢とC. difficileのコロニー形成に関連する2番目のデータセット36を解析し、その結果を最初のデータセットと比較した。当初の研究は、C. difficileのコロニー形成の消失と同時に腸内細菌群集がどのように変化するかを明らかにすることを目的としていた。C. difficileのコロニー形成の状態（すなわち、コロニー形成されていない、クリア、およびコロニー形成されている）に基づいて、このコホートを7つのグループに分類した（図6Aおよび6B、STAR Methods）。図6Cに示すように、PCoAの結果から、異なる表現型からの糞便サンプルは異なるクラスタリングがなされていることが示された（PERMANOVA検定、p値=0.0001、Bray-Curtis非類似度）。パイプラインに従って、すべてのペアワイズ解析（7グループから21のペアワイズ比較）を行った結果、少なくとも1つのペアワイズ比較を提示した153の差異のある豊富なASVの分類群プールが得られた。C.difficileの上位30個の候補プロモーターまたは阻害剤を図6Dと表S2に示す。

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図6. データセットIIのGMPTによって同定されたC. difficile感染関連分類群

(A）異なる表現型グループを得るためのフローチャート。

(B）各群におけるC. difficileの存在量（CFU/g糞便）の比較。棒グラフは平均値±SEMを表す。

(C）抗生物質によって誘導された腸内微生物群集の不均一性を示す、マウスの糞便微生物叢のPCoAプロット。

(D）GMPTを用いて同定されたC. difficile感染関連ASVを示す系統樹。横棒の色はファミリーレベルを表し、ASVと分類学情報の色の違いは寛容な分類群または保護的な分類群を表す。

重要なことは、2つのデータセットから40％（30個中12個、上位30個）の重複するASVが同定されたことである。これら12種の重複する分類群のうち、ほとんどのASV（91.67%、12種中11種）がC. difficileと一貫した関係を示した（図S7、表S1およびS2）。このことは、GMPTパイプラインが類似したデザインの研究間で、疾患に関連する微生物の特徴を頑健に同定できることの証拠となる。2つのデータセット間で相反するASVは、ラベリング、表現型の数、および各表現型におけるサンプルサイズによって説明される可能性がある。これら11の原因菌候補のうち、10種の予防的ASV（すなわち、Muribaculum intestinale、Anaerostipes butyraticus、Akkermansia muciniphila、Anaeroplasma abactoclasticum）と1種の寛容的ASV（すなわち、Escherichia/Shigella）を同定した。以前の研究では、Muribaculum intestinale37、Anaerostipes38,39,40、Akkermansia muciniphila41,42がC. difficile陽性被験者で減少するか、C. difficileの増殖を阻害することも示されていた。Escherichia/Shigellaは、C. difficile陽性被験者またはC. difficileと重複感染している被験者で有意に濃縮されていることが示されている43,44,45。これらの結果は、微生物叢を介したCRに関与する微生物の発見を効率化するGMPTの能力を示している。

図7Aに示すように、GMPTはデータセットI（80.00%、30件中24件）とデータセットII（90.00%、30件中27件）の両方で、ALDEx2とANCOMの間で重複する候補リストを高度に同定した。さらに、ALDEx2とANCOMを使用した2つのデータセットから、それぞれ36.67%（30件中11件、上位30件）と53.33%（30件中16件、上位30件）が重複するASVが同定された（図7B）。興味深いことに、ANCOMとALDEx2を用いて同定されたデータセットIとデータセットII間のオーバーラップしたASVも、高い一貫性を示した（図7C）。この結果は、病原体の増殖を潜在的に阻害（または促進）する微生物を同定するGMPTの頑健性を示している。

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図7. GMPTとALDEx2およびANCOMから推定した異なる存在量差解析手法との性能比較

(A) 各データセットにおいてALDEx2とANCOMによって同定された重複する分類群。

(B) ALDEx2とANCOMによってそれぞれ同定されたデータセットIとデータセットIIの重複する分類群。

(C）両データセットから同定されたALDEx2とANCOMの重複する分類群。これらの重複したASVを示す系統樹。横棒の色は科を表し、ASVの分類情報の色の違いは許容的または保護的な分類群を表す。各テスト／データセットから上位30候補のみを比較に含めた。異なる検査／データセットでC. difficileとの関係が異なる分類群は、重複リストから除外した。

考察
特定の病原体にコロニー形成または感染した被験者の腸内細菌叢の組成については多くの研究が記述しているが、生態学的観点から見たCRの喪失とその後の疾患の発症に関連する特定の変化は依然として不明である。基本的な関連性を超えて、GMPTの方法論を系統的に正当化するために、古典的なGLVモデルを採用した。シミュレーションと実験の両方のデータセットにおいて、GMPTは病原体によって引き起こされる感染症における阻害因子と促進因子の候補を推論するための頑健で改善された性能を示した。

生態モデリングフレームワークにより、特定の病原体（例：C. difficile）感染に関連する多くの異なる表現型（CR）を生成することができた。我々は、GMPTにおいて病原体の存在量が異なる「表現型」に対して差分解析を行ったが、これは古典的な差分解析の使用法（臨床的に明確で明確に定義された表現型、例えば症例対対照）ではないことを強調する。GLVモデル（病原体と直接相互作用する原因菌種を正確に知っている）を用いたGMPTの系統的検証は、この型にはまらない差分解析の使い方が、実際に原因菌種の推定に役立つことを示している。我々のアプローチは、もしある分類群が真にCRに関連しているとすれば、それらは一対の存在量の差分比較のほとんどに存在するはずだという、明確に定義された仮定に基づいている。我々は、CRの原因菌は特定の微生物ではなく、小さな細菌群であるべきだと推論した。このモデルベースのアプローチで病原体関連微生物叢を推定することで、ある病原体に対するCRに対する分類学的に多様な細菌の相対的な寄与を推定することができた。従来のMWASと比較して、GMPTの有効性が実証された。さらに、我々のモデリングフレームワークは、異なるサンプルサイズ、表現型数、ネットワーク接続性、およびDAAに対する効果量（または検出閾値）を考慮した場合のGMPTパイプラインの頑健性を明確に示した。これらの知見は、微生物に関連した研究の実験デザインにおいて、研究者の指針となるかもしれない。特筆すべきは、GLVモデルでは腸内栄養、温度、pHなどの因子を明示的に考慮することはできないが、GMPTパイプライン自体は、DAAに潜在的な交絡因子を組み込むことができることである。

抗生物質治療（抗生物質のクラス、投与量、回復期間など）は、宿主の腸内細菌叢を代替的なdysbiotic状態に変化させることができる47,48,49。CDIのデータセットでは、CDIの病因に関連する多くのASVが同定され、それらの上位候補のプロモーターまたは阻害剤のほとんどは、複数の先行研究によってもCDIとの潜在的関連性が報告されている。興味深いことに、GMPTはまた、いくつかの保護種、例えば、ポルフィロモナド科に関連する分類群（Muribaculum intestinaleおよびAlistipes）および許容種（例えば、Escherichia）を確実に同定した35,36。最終的に、GMPTは、C. difficileに対するCRを媒介しうる腸内細菌叢の包括的なリストを同定することができた。本研究ではC. difficile感染を例として取り上げたが、腸内マイクロバイオームが介在するCRに関する一般的な原則は、細菌（例：大腸菌、サルモネラ菌）、ウイルス（例：HIV、SARS-CoV-2）、真菌（例：Candida auris、アスペルギルス症）などの病原体にも適用できる。GMPTパイプラインの性能を実証するためにALDEx2とANCOMを適用しましたが、GMPTは特定のDAAによって制限されるものではありません。ユーザーは常に、自分のデータに適した異なるDAAツールを選択することができます。

研究の限界
これらの知見を考慮すると、今回の方法論にはまだ限界がある。第一に、ヒトマイクロバイオームにおけるコミュニティタイプの起源と制御に関する我々の先行研究31、およびFMTのシミュレーションプロセス19に基づき、我々は今回のモデリングの枠組みにおいて確率的効果を無視できるものとして扱った。一般的に、確率的効果をモデル化の枠組みで考慮することは可能であるが、それが我々の共同飼育プロセスに根本的な影響を与えることはないと考えている。第二に、特定の病原体に対する生物種の正味の影響度は、主にGLVモデル（線形機能応答と一対の微生物相互作用のみを考慮）に基づいている。非線形の機能的反応や高次の相互作用を持つ複雑な集団モデルにおいて、正味の影響を系統的に計算する方法は依然として課題である。第三に、さらなる実験的検証のために、候補リストから許容種または予防種を選択するための厳しい閾値は設けなかった。その代わりに、異なるデータセットから得られた、あるいは異なるDAAツールを用いて得られた、重複する結果に注目することを提案する。さらに、生態学的観点から候補種の原因メカニズムを評価するためには、in vivoまたはex vivoでの追加実験が必要である。

結論
要約すると、群集生態学における古典的な個体群動態モデルを用いて、GMPT法を理論的に正当化した。その結果、GMPTパイプラインは、特定の病原体に対するCRに対する分類学的に多様な微生物の相対的な寄与、および疾患発症におけるそれらの決定因子を同定するための強力なツールであることが示された。この方法は、微生物の組み合わせの合理的な設計への道を開くものであり、特定の病原体によって誘発される疾病に合わせた、より良い予防・治療アプローチにつながる可能性がある。

STAR★メソッド
主要リソース表
試薬またはリソースソースの識別子
寄託データ
GnotoComplex microflora Bucci et al., 201622 https://doi.org/10.1186/s13059-016-0980-6
マウスCDIデータセットI Schubert et al.
マウスCDIデータセットII Lesniakら, 202136 PRJNA674858
ソフトウェアとアルゴリズム
classical Generalized Lotka-Volterra Bucci et al., 201622 https://doi.org/10.1186/s13059-016-0980-6
QIIME2 Bolyen et al., 201950 https://qiime2.org/
DADA2 Callahan et al., 201651 https://benjjneb.github.io/dada2/
ALDEx2 Fernandes et al., 201427 https://doi.org/10.1186/2049-2618-2-15
ANCOM Mandal ら、201546 https://doi.org/10.3402/mehd.v26.27663
IQ-TREE Trifinopoulos 他、201652 http://www.iqtree.org/
iTOL Letunic et al., 202153 https://itol.embl.de/
MATLAB Mathworks https://www.mathworks.com/products/matlab.html
R Rコアチーム https://www.r-project.org/
カスタム解析コード 本研究 https://doi.org/10.5281/zenodo.8193075

リソースの有無
リードコンタクト
詳細情報のリクエストは、リードコンタクトのYang-Yu Liu (yyl@channing.harvard.edu)までお願いします。

材料の入手可能性
本研究では新たな生物学的試料は作成していない。

方法の詳細
微生物群集の個体群動態
ヒトのマイクロバイオームの詳細なモデルには、微生物間のメカニズム的相互作用、特定の身体部位の空間構造、および宿主とマイクロバイオームの相互作用が含まれる。簡略化のため、我々のモデリングの枠組みでは、任意の微生物が他の微生物の存在量に与える影響を探ることに焦点を当てる。そのために、個体群動態モデルを常微分方程式（ODE）の集合として記述する：
式2
d
�
�
(
�
)
/
d
�

�
�
(
�
)
�
�
(
�
(
�
)
)
,
�

1
,
...
,
�
.
ここで
�
�
(
�
(
�
)
)
は群集の個体群動態を特徴づける不特定の関数である、
�
(
�
)

(
�
1
(
�
)
,
...
,
�
�
(
�
)
)
T
∈
�
�
は
�
-次元ベクトルであり
�
�
(
�
)
のアバンダンスを表す。
�
-第
�
. 分類群内および分類群間の相互作用はヤコビアン行列
�
(
�
(
�
)
)
∈
�
�
×
�
行列要素
�
�
�
(
�
(
�
)
)
≡
∂
�
�
(
�
(
�
)
)
/
∂
�
�
そして
�
�
�
(
�
(
�
)
)

0
(
<
0
または

0
) は、タクソン
�
の成長を促進する（抑制する、あるいは影響を与えない）ことを意味する。
�
の増殖を促進する（阻害する、または影響する）ことを意味する。微生物間の相互作用は、バクテリオシンのような物質の直接分泌10,11、微生物間の生態学的競争12、代謝産物の交換13、および/または免疫系の調節によって媒介されることがある14,15,54。

古典的な個体群動態モデルの多くは、式2の形をしている。多くの古典的な個体群動態モデルは式2の形をしている。
(式3)
d
�
�
(
�
)
d
�

�
�
(
�
)
[
�
�
+
∑
�

1
�
�
�
�
�
(
�
�
(
�
)
,
�
�
(
�
)
)
]
,
�

1
,
...
,
�
.
ここで
�
�
∈
�
の固有成長率である。
�
,
�

(
�
�
�
)
∈
�
�
×
�
は相互作用行列であり、生態ネットワーク
�
(
�
)
は行列のグラフ表現とみなすことができる。
�
には有向辺
(
�
→
�
)
∈
�
(
�
)
もし
�
�
�
≠
0
. 微生物の相互作用を推測し、生態系ネットワークをマッピングするために、様々な方法が開発されてきた。
�
(
�
)
図2A）は、ノードが微生物分類群を表し、エッジが2つの分類群間の対をなす直接的な生態学的相互作用（阻害や促進など）を表す。ここで説明する生態ネットワークは、類似性に基づく手法、例えば相対存在量データのピアソン相関やスピアマン相関、存在-不在データの超幾何分布などから構築される無向性アソシエーション・ネットワークとは根本的に異なる17。なお、関数
�
(
�
�
(
�
)
,
�
�
(
�
)
)
:
�
×
�
→
�
は群集生態学におけるいわゆる機能的応答で、消費者の摂取率を餌密度の関数としてモデル化したものである。線形機能応答
�
(
�
�
,
�
�
)

�
�
は古典的なGLV（Generalized Lotka-Volterra）モデルに相当し、既存の宿主関連微生物群集の生態学的モデリングで多く用いられている。

一般化微生物-表現型三角測量の検証
本節では、本文で紹介した一般化微生物表現型三角測量（GMPT）の検証の詳細について述べる。のメタコミュニティーを考える。
�
種のメタ群集を考える。
�
と固有成長率ベクトル
�
. 一般性を損なうことなく、ここでは種-Xを病原体とする。

ステップ1 相互作用行列
�
と固有成長率ベクトル
�
. 生態ネットワーク
�
(
�
)
は、有向スケールフリー・ネットワーク・モデル55,56 を用いて構築される。
�
ノード、接続性
�
(を持つ有向スケールフリー・ネットワーク・モデル55,56 を用いて構築される。
�
)、べき乗指数
�
(すなわち、次数分布はべき乗則に従う。
�
(
�
)
∼
�

�
). ここで
�

2.5
に設定した。相互作用行列
�

[
�
�
�
]
∈
�
�
×
�
各辺
(
�
→
�
)
∈
�
(
�
)
で
�
≠
�
とすると
�
�
�
を正規分布
�
(
0
,
�
2
)
標準偏差
�

0.2
. もし
�
�
�

0
(または
<
0
)、エッジは種の促進(または抑制)効果を表す。
�
の成長に対する
�
. もし
�
�
�

0
の直接的な影響はない。
�
の成長に直接的な影響はない。
�
. さらに、負の自己ループ
�
�
�

1
を各ノードに与え、システムの安定性を確保する。固有成長率ベクトル
�

[
�
�
]
∈
�
�
の各エントリーを描く。
�
�
を一様分布
�
[
0,1
]
.

ステップ2 病原体に対して極端なコロニー形成抵抗性（CR）を持つ2つのベースライン表現型を生成する。2つのベースライン表現型（"A "と "B"）は次の条件を満たすべきである：病原体は表現型Aの群落では生育できないが、表現型Bの群落では開花できる。表現型A（またはB）の群落を生成するために、種プールからランダムに種のサブセットを選んで局所群落を形成し、その群落が定常状態に達するまでGLV動力学を実行する。もし、定常状態における病原体Xの存在量が
10

3
(または0.2より大きい)19 ならば、この地域コミュニティーはそれぞれ表現型A(またはB)に属するとみなす。そうでない場合は、再びランダムに種のサブセットを選択し、各表現型について十分なローカル・コミュニティ（"サンプル"）が生成されるまで、このプロセスを繰り返す。種の選択は純粋にランダムであることに注意。ベースライン表現型A（またはB）の微生物群集から、インヒビター（またはプロモーター）と呼ばれる病原体の増殖を直接阻害（または促進）できる種を明示的に除外することはしない。そうでなければ、インヒビターやプロモーターは、2つのベースライン表現型の微生物群集において異なって豊富に存在することになり、それらの同定は些細なことになる。したがって、2つのベースライン表現型の微生物群集について、病原体Xの定常状態での存在量に関する要件に加えて、因果推論におけるプロモーターやインヒビターのアンバランス問題を回避するために、プロモーターの数とインヒビターの数が同等であることも要件とする（それらの比率を[0.5, 2]の範囲とする）。本文中の図2Bは、それぞれ表現型AとBの2つのローカルコミュニティを示した。病原体チャレンジ（時間ステップ50で病原体をコミュニティへ導入）をシミュレートした結果、図2Bは、Aコミュニティの病原体がほぼゼロに抑制される（存在量が
10

3
)、一方B群集では病原体が急激に増殖している(存在量が0.2より大きい)。シミュレーションでは、種の存在量の測定ノイズを次のように模倣している。
�
�

�
�
+
�
�
[

�
�
,
�
�
]
.
�
は一様分布を表し
�
は測定ノイズレベルである。

ステップ3 共棲過程のシミュレーション。2つのベースライン表現型から出発して、ある被験者から別の被験者へ種を移動させることによって、多くの媒介表現型を生成する共同収容過程をシミュレートする。たとえば、AB-0.1は、A被験者がB被験者と共同飼育され、共同飼育の過程でA被験者に移入される種がB被験者に10％あったことを意味する。移入過程は、まずランダムに
10
の非絶滅種をランダムに選択し、A の被験者に導入して GLV ダイナミクスを実行する。なお、移入過程では、移入された種の存在量や種の相互作用タイプの基準は強制的に設定されない。本文中の図2Cは、仲介表現型AB-0.5の、分離飼育、同居飼育、および病原体チャレンジの期間における時系列的な存在量を示している。

ステップ4 表現型のペア比較から、異なる存在量の生物種を得る。異なる表現型を作成した後、すべての表現型ペアで異なる存在量の種を同定するために、差分存在量分析（DAA）を実行する。次に、すべてのペア比較からDAAにおける各生物種の存在頻度をカウントし、降順にソートする。オリジナルのMPTでは、すべての対比較に存在する差次的に豊富な生物種が、疾患に対して直接的な因果関係を持つことが検証されているので26、DAAに高い頻度で存在する生物種は、特定の病原体に対して直接的な影響を持つ可能性がある。

ステップ5 特定の種に対するプロモーターと阻害因子を特定する。DAA（病原体を除く）における存在頻度が高い順にランク付けされた各生物種について、スピアマン相関（�）を計算する。
�
˜
�
)を計算する。
�

(
�
1
,
...
,
�
�
)
そして
�

(
�
1
,
...
,
�
�
)
ここで
�
�
はサンプル中の病原体の平均相対存在量です。
�
であり
�
�
の平均相対存在量である。
�
の平均相対存在量である。
�
. 正の相関は、サンプル中の病原性の高い種が存在量が高い傾向にあることを示し、負の相関は逆の意味である。従って、正（または負）のスピアマン相関を持つ上位K種をプロモーター（またはインヒビター）と特定する。ここでtop-Kは最初の
�
は、全てのペアワイズDAAにおける存在頻度の降順に基づく最初の�種を示す、
�
-軸である。

備考1
1.
我々のモデリングフレームワークは、阻害剤またはプロモーターを上位から�軸に同定することができる。
�
レベルで同定できる。ここで
�
は相互作用因子と非相互作用因子を区別するための閾値であり、微生物群集の根底にある生態ネットワークによって決まる。

我々のモデリングフレームワークが病原体上の中立種を推論できない理由は、(i)中立種が差次的に豊富な種である可能性がないこと、(ii)ステップ5で計算された中立種の相関は生態学的意味を欠き、正と負の値の間で変動する可能性があること、である。また、本文の図2に示した合成データについて、我々のGMPTフレームワークでANCOM46を実施し、差次的に豊富な種を同定した。図S1Aでは、最も頻度の高い種25は、28組の表現型ペア全てではなく、17組の表現型ペアにのみ現れることが観察された。また、図S1にはGMPTとMWAS1, MWAS2のANCOMによる推論結果を示す。本文中のALDEx227を用いた結果と同様に、GMPTもMWASを上回った。

3.生態ネットワークのトポロジーと相互作用の強さ、すなわち、ネットワークの接続性、次数分布のべき乗指数、および�の標準分散を系統的に調整することにより、GMPTはMWASを上回った。
�
�
�
GMPTの性能は、生態系ネットワークの異なる構造特性に対して頑健であることが示された（図S5）。

ネットワークの接続性
を系統的に調整した。
�
を系統的に調整した（すなわち、2つの順序を持つ種の間に有向エッジが確率�で存在する）。
�
). でのGMPTの頑健性を検証する。
�

0.2,0.3,0.4
. GLVモデルに従って合成データをシミュレートした。
�

100
相互作用強度の標準分散
�

0.2
とスケールフリー生態ネットワーク
�

2.5
. 我々のGMPTでは、ALDEx2を用いて、絶対効果値が0.5より大きく、種の存在量の測定ノイズレベルが
�

0.05
. 図 S5I は、ネットワークの接続性が増加するにつれて、推論精度がわずかに低下することを示している。

次数分布のべき乗指数
GMPTのロバスト性を検証するために、次数分布のべき乗指数を調整することにより、ネットワーク・トポロジーを系統的に調整した。生態系ネットワークの次数分布はべき乗則に従うと仮定する。
�
(
�
)
∼
�

�
べき乗指数
�
はネットワーク構造を制御し、 指数が小さいほどハブが多くロバストなネットワーク構造を示し、 指数が大きいほどハブが少なくランダムなネットワーク構造を示す。ここでは、GMPT の頑健性を検証する。
�

2.5,3,4
. GLVモデルに従って合成データをシミュレートした。
�

100
ネットワーク接続性
�

0.2
と相互作用強度の標準分散
�

0.2
. 我々のGMPTでは、ALDEx2を用いて、絶対効果値が0.5より大きいという基準で差次的に存在する種を選択し、種の存在量の測定ノイズレベル
�

0.05
. 図 S5II は、より大きな
�
の方が小さい
�
. この結果は、ハブが少なくランダム性が高い生態系ネットワークにおいて、GMPTの性能が優れていることを示している。

標準分散
�
�
�
種間相互作用の重みを系統的に調整する。
�
�
�
を系統的に調整する。
�
. によるGMPTの頑健性を検証する。
�

0.2,0.3,0.4
. GLVモデルに従って合成データをシミュレートした。
�

100
ネットワーク接続性
�

0.2
とスケールフリーの生態学的ネットワーク
�

2.5
. 我々のGMPTでは、ALDEx2を用いて、絶対効果値が0.5より大きく、種の存在量の測定ノイズレベルが
�

0.05
. 図S5IIIは、推論精度がj
�
�
.
4.
表現型の数はGMPTの有効性を左右する重要なパラメータであるため、表現型の数を変えて病原体の直接プロモーター／阻害因子に関するGMPTの推論精度を評価した。図S5より、より多くの表現型を用いることで、GMPTの精度が向上することがわかった。なお、合成データには10個の模擬表現型が含まれている。図S5Iに示す精度は、すべての表現型のGMPT精度を平均したものである。
(
�
10
)
の組み合わせの平均値である。
�
の組み合わせでGMPTの性能を比較した。

16S rRNA 遺伝子アンプリコン配列データの解析
C.difficile感染のオリジナル実験は、過去の論文で報告されている35,36。

データセットI
このデータセットはSchubertらによって収集された35。彼らは様々な抗生物質の摂動を用いて多様な腸内細菌叢構造を作り出し、それをC. difficileの芽胞でチャレンジした。このデータセットでは、C.difficileにチャレンジしたサンプルだけを含んでいる。全体として、これらのマウスは8つのグループに再編成された（図5A）。詳細には、まずサンプルをC. difficile陰性(
�

34
)と陽性(
�

98
)群に分けた。C.ディフィシル陽性マウスは7群に均等にグループ分けされた(
�

14
群）に均等にグループ分けした。これらのマウスについては、0日目（C. difficileチャレンジ前）の糞便サンプルのみを解析した。

データセット II
このデータセットはLesniakら36 が行った研究からダウンロードしたもので、彼らはC. difficileチャレンジの前に異なるタイプ／用量の抗生物質でマウスを処理し、その結果コロニー形成なし (
�

11
)、コロニー形成とクリアランス(
�

28
)、そして持続的コロニー形成(
�

24
図6A）。コロニー形成とクリアランスがみられた群のマウスをさらに3群に分類した： 1）コロニー形成と3日以内のクリアランス、
�

9
2）コロニー形成し、4～6日目に消失した群
,
�

11
3)コロニー形成から7日目から9日目の間に消失した、
�

8
. 次に、コロニー形成持続群のマウスを3群に等分割した (
�

8
CFU/g糞便）に等分割した。これらのマウスについては、0 日目（C. difficile チャレンジ前）の糞便サンプルのみを分析した。

両試験の微生物組成は、Illumina Miseqプラットフォームを用い、便サンプルから抽出したDNAの16S rRNA遺伝子配列決定（V4領域）により決定した。QIIME2（V.2020.11）50とDADA2（V.2020.11.1）によるノイズ除去51を使用して、RDPで補足されたNCBI RefSeq 16S rRNA遺伝子配列データベースへの分類の割り当ては、dada2（V.1.14.1）Rパッケージの "assigTaxonomy "機能を使用して達成した51,57,58。

定量化と統計解析
主座標分析プロット（PCoA）は、Bray-Curtis非類似度指標によるデータの可視化に使用した。ALDEx2,27は、128個のディリクレモンテカルロインスタンスから生成されたデータのclr変換事後分布を使用して、組成データセット内の有意に異なる特徴を決定する。効果量の測定は、p値よりも再現性が高いことが示されているため、ALDEx2の "aldex.effect "関数を使用して、有意に豊富な分類群の効果量を計算した。効果量（｜eff｜> 0.5/0.75/1）を持つフィーチャーは、GMPTパイプラインに含まれました。また、ANCOM（マイクロバイオーム組成解析）を適用して、有意水準5%でBenjamini-Hochberg補正を行い、同時に（利用可能な表現型データに基づいて）ケージ／性別の調整を行った。次に一連の検出しきい値（すなわち、60％、70％、80％）を適用し、その分類群について公称有意水準に達した補正p値の数が、有意な比較の可能な最大数の60/70/80％より大きい場合に、差のある豊富な分類群を同定した。各対比較で少なくとも10％のサンプルを示したASVのみが、存在量の差の分析に含まれた。特定の病原菌の病原体形成における原因候補分類群の役割は、スピアマン相関係数を用いて同定した。C.difficile感染に関連するASVの系統樹は、最尤法によるIQ-TREEを用いて推定した52。本研究の統計解析は、R（V.3.6.3）およびMATLABソフトウェアを用いて行った53。

謝辞
Y.-Y.L.は、米国国立衛生研究所からの助成金（R01AI141529、R01HD093761、RF1AG067744、UH3OD023268、U19AI095219、U01HL089856）を受けている。Y.-Y.L.およびC.P.K.は、Milky Way Life Sciences社から研究助成を受けている。Y.X.は、中国国家自然科学基金会（助成金番号61902418）からの資金援助を受けている。

著者貢献
Y.-Y.L.がプロジェクトを発案・設計した。Y.-Y.L.、Y.X.およびS.K.は計算法を開発した。S.K.はシミュレーションデータとすべての実データを解析した。Y.X.はすべての数値シミュレーションとシミュレーションデータの解析を行った。原稿はS.K.、Y.X.、Y.-Y.L.が執筆。S.T.W.、X.C.、C.P.K.は原稿のレビューと編集を行った。著者全員が原稿を承認した。

利益申告
C.P.K.は、Artugen社、Facile Therapeutics社、Ferring Pharma社、First Light Biosciences社、Finch社、Matrivax社、Merck社、Milky Way Life Sciences社、Recursion社、RVAC Medicines社、Seres Health社、Summit Therapeutics社、Vedanta社の有料コンサルタントを務め、Merck社から助成金の支援を受けている。X.C.はArtugen社およびRVAC Medicines社の有料コンサルタントを務めている。X.C.はまた、メルク社から助成金支援を受けており、Milky Way Life Sciences社の取締役を務めている。

補足情報

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ドキュメントS1。図S1-S7、表S1、S2。

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資料S2。論文と補足情報。

データとコード

最初のCDIデータセット35のシーケンスデータは、SRAアクセッション番号SRP057386 (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/sra/?term=SRP057386)で公開されている。2番目のCDIデータセット36のシーケンスデータはhttps://www.ncbi.nlm.nih.gov/bioproject/PRJNA674858。本論文で報告された他のすべてのデータは、要請があれば、主担当者が共有する。

解析コードとユーザーフレンドリーなチュートリアルはhttps://doi.org/10.5281/zenodo.8193075。

本論文で報告されたデータを再解析するために必要な追加情報は、要請があれば担当責任者から入手可能である。

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