空腸粘液層におけるMuc2依存的な微生物コロニー形成は、食事感受性であり、腸管病原体感染に対する局所抵抗性を付与する

記事|42巻2号112084頁、2023年2月28日発行
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空腸粘液層におけるMuc2依存的な微生物コロニー形成は、食事感受性であり、腸管病原体感染に対する局所抵抗性を付与する
ジョージ・M・H・ビルケナウ 6, 7
Bjoern O. Schroeder 6
Sinan Sharba
Sara K. Lindén
Fredrik Bäckhed
グンナー・C・ハンソン
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脚注を表示するオープンアクセス公開日:2023年02月06日DOI:https://doi.org/10.1016/j.celrep.2023.112084
PlumX メトリクス

ハイライト

欧米型の食事は小腸空腸の粘液層を破壊する

粘液層は空腸の微生物叢にとって不可欠な生息地である。

空腸内細菌叢は腸内病原体のコロニー形成に対する抵抗力を提供する。

粘液は微生物叢にニッチを提供することにより、コロニー形成抵抗性を支えている。
まとめ
腸管粘膜のバリアは通常、微生物の感染を防ぐが、食事に依存した内腔環境の変化には敏感である。我々は、西洋式食事（WSD）を与えたマウスが、食事誘発性粘液凝集によって小腸空腸の粘液バリアが部位特異的に破壊されることを示した。また、WSDや染色体Muc2欠損による粘液バリアの破綻は、常在空腸内細菌叢の崩壊を引き起こし、腸内病原体Citrobacter rodentiumによる非定型空腸コロニー形成に敏感になることがわかった。空腸粘液層が微生物の生息場所であることを示し、微生物叢の地域特異的な粘液依存性と空腸ニッチの特徴的な特性を関連づけた。これらの結果から、空腸粘膜と微生物叢の共生関係は、通常は空腸病原菌のコロニー形成を防ぐが、WSDへの曝露によってその関係が大きく崩れることが明らかになった。

図解要約
図のサムネイルfx1
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キーワード
空腸
粘液
結腸抵抗性
洋食
シトロバクター・ローデンティウム
小腸
研究テーマ（複数可）
CP:微生物学
CP：免疫学
はじめに
欧米型食生活（WSD）は、肥満大流行の主要な要因である。1 肥満や糖尿病の人は、特に粘膜表面で感染症にかかるリスクが高いことが示唆されている。
上皮性杯細胞から分泌される粘液は、特に胃腸管における感染に対する粘膜防御の重要な要素である。ゴブレット細胞は、ゲル形成性ムチンMuc2の大きなポリマーを分泌し、これが上皮表面を覆う粘液層の構造的バックボーンとなっている5。これらのバリアシステムは、胃腸管の場所によって異なっている6,7。小腸では、より緩い粘液層が、上皮の腸細胞やパネス細胞から分泌される抗菌タンパク質を濃縮し、殺菌勾配を形成し、生きた微生物との上皮の接触を禁止しています。
大腸粘液バリア機能は、食事10,11,12および宿主代謝に関連する因子によって影響を受ける。13,14 マウスでは、WSDによる粘液の悪化は、複合食多糖の不足による微生物叢と因果関係があることが分かっている11,12。さらに、粘液バリア機能の喪失は、感染、炎症、腫瘍形成に対する過敏性をもたらす。15,16,17 このように、食事、微生物叢、大腸の粘液バリアの関連性と健康への潜在的影響は、確立されている。しかし、小腸粘膜バリアは一般的な感染部位であり、食事と粘膜の主要な相互作用部位であるにもかかわらず、これまでほとんど注目されてこなかった。
研究成果
WSDへの曝露は、小腸粘膜バリア機能障害を部位特異的に引き起こす
小腸粘膜バリアー特性に対する食餌の影響を明らかにするため、マウスにWSDを投与し、通常のチャウ食（CD）を与えた動物との比較を行った。CDとWSDの両群のマウスを8週間後に死亡させた。組織は、十二指腸中部（SI5）および回腸末端（SI8）領域から採取し（図1A）、粘液の厚さとバリア機能を定量化するためのマイクロスフィア浸透アッセイを使用して粘液特性を分析した18。逆に、SI8ではなくSI5の粘液透過性は、CDを与えたマウスと比較してWSDで有意に増加した（図1Bおよび1D）。
図 サムネイル gr1
図1WSDによる空腸粘液バリアー機能障害
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SI5粘液バリア機能障害の動態を評価したところ（図1E）、WSD曝露後3日から7日の間に生じたSI5粘液厚の減少と粘液透過性の増加が観察された（図1F-1H）。WSD誘発のSI5粘液バリア機能障害はWSD28日まで維持され、微小球が粘液を透過して絨毛の基部まで到達することが特徴的であった（図1F）。
固定組織切片における小腸粘液の性状評価は、粘液の保存状態が様々であるため、困難である。それでも我々は、CDおよびWSD投与マウスのアルシアンブルー/過ヨウ素酸シッフ（AB/PAS）染色固定組織切片を調べ、WSD曝露によってSI5固定組織または粘液に変化が生じたかどうかを調べた（図1I）。SI5で予想されたように、CD飼育マウスでは粘液の保存性は悪かった。しかし、WSD飼育マウスでは、強く染色された粘液の不連続な層が確認され、WSDによる変化が粘液の特性を変え、保存性に影響を与える可能性があることが示された。
これらの結果から、比較的短期間のWSD暴露は、空腸（SI5）粘液特性に悪影響を及ぼすが、回腸（SI8）粘液特性には影響を及ぼさないことが示され、小腸の粘液バリア機能に対する食事の部位特異的効果が証明された。
WSDによる空腸粘液バリアー機能不全における微生物叢の役割
大腸における食事や肥満による粘液バリア機能の低下は、微生物叢の変化と因果関係があるとする研究がある11,12,13 。我々は、16S rRNA遺伝子シーケンスを用いて、SI5内腔および粘膜コンパートメントにおける微生物叢の構成を調査した。16Sβ多様性（Bray-Curtis非類似度）の比較から、内腔および粘膜区画の両方で、微生物相の群集構造が食事に依存して大きく異なることが示された（図2Aおよび2B ）。どの16Sアンプリコン配列バリアント（ASV）が異なる食事と有意に相関しているかを明らかにするために、線形判別分析効果サイズ（LEfSe）分析を採用した（図2C）。その結果、WSDを与えたマウスでは、CDを与えたマウスと比較して、いくつかの分類群が濃縮される一方、ほとんどの判別分類群が減少していることが確認された。WSD飼育マウスにおける分類群の減少傾向は、α多様性の有意な減少に反映された(Figure 2D)。CD群とWSD群の差は、CD群ではASVの大部分（平均74.4%）を占めるMuribaculaceae, Faecalibaculum, Bifidobacterium属が大きくシフトし、WSD群ではMuribaculaceaeとBifidobacteriumが大きく減少、Faecalibaculumが濃縮されたことによりもたらされたと考えられる。
図サムネイルgr2
図2WSDによる粘液バリア機能不全における微生物叢の役割
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WSDによるSI5粘液バリア機能障害は、局所的な微生物相の構造の変化と一致していることが明らかになったが、これらの変化の因果関係は不明なままであった。そこで、WSDを6週間摂取させた後、CD摂取マウス（CD-MT）またはWSD摂取マウス（WSD-MT）の糞便から微生物叢を移植する実験を行った（図2E）。CD飼育マウスのSI5で通常検出されるほとんどの細菌分類群は、属（図2F）および種レベル（図S1A）の両方で、大腸ドナー材料で検出された。しかし、CD-MTおよびWSD-MTマウスのSI5微生物叢β多様性は、全体的群集構造の分岐を確認できず（図S1B）、CD微生物叢移植がWSD誘発性の変化を逆転できないことが示された。3つの主要なWSD感受性細菌分類群のうち、有意差は、WSD-MTと比較してCD-MTで濃縮されたBifidobacteriumについてのみ観察され（図2G）、この細菌分類群はCD-MTマウスにうまく移植されたことが示された。しかし、SI5粘液の厚さと浸透性は、WSD-MTと比較してCD-MTでは変化せず、ビフィズス菌はWSD誘発粘液機能不全を防ぐのに十分ではないことが示された（図2Hおよび図2I）。
さらに、CD飼育マウスをWSDに切り替える前に、広域スペクトル抗生物質の組み合わせで処理することにより、微生物叢の因果関係を検証した。7日間のWSD曝露後のSI5粘液特性は、ビヒクル（H2O）投与群および抗生物質（ABX）投与群の両方で同様であり（図2Jおよび2K）、微生物相の枯渇がWSD誘発粘液機能不全に影響を及ぼさないことが示された。
その結果、空腸の微生物叢は食事の変化に非常に敏感である。しかし、大腸とは異なり、空腸はCD関連細菌による再コロニー化に対して屈折しており、WSDによる空腸環境の変化がこの過程を阻害していることが示唆された。さらに、微生物相と食事依存的な大腸粘液バリアー破壊との因果関係は、空腸粘液バリアー機能不全との関連では再現されず、小腸におけるこの現象の別のメカニズムを示唆した。
WSDによるバリア機能障害は粘液の凝集に起因する
WSDによるSI5粘液バリアー機能障害の原因を調べるために、CDおよびWSD飼育マウスから採取したSI5およびSI8粘液の質量分析に基づくプロテオーム解析を実施した。プロテオミクスデータの主成分分析により、サンプルは食餌よりも小腸の部位に基づいてクラスタリングされることが示された（図3A）。SI5粘液プロテオームの変化が粘液機能障害に対応しているかどうかを確認するために、WSDを7日間以上与えたマウス（浸透性粘液）とWSDを7日間未満与えたマウス（浸透性粘液）を比較した（Figure 3B）。これらのグループのSI5を比較した結果、非常に偏ったデータが得られ、浸透性粘液グループと非浸透性粘液グループで多くの（49%の）タンパク質が濃縮された（図3B; 表S1）。この濃縮はSI5に特異的であり、SI8サンプルの同一比較（図3B；表S2）や微生物叢移植実験から得られたSI5粘液（図S2AおよびS2B）では観察されなかった。濃縮されたSI5タンパク質は、全体的な存在量や分子量によって区別されなかった（図S2CとS2D）。注目すべきは、SI5粘液で変化したタンパク質には、粘液機能を維持する役割が確立または示唆されている高濃度のコア粘液成分がほとんど含まれていないことである（図S2E）。その結果、WSDによるSI5粘液バリア機能障害は、コア粘液プロテオームの変化と明確な関連はなく、SI5粘液タンパク質の大部分を濃縮することと一致することが示唆された。
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図3WSDによる空腸粘液凝集の誘導
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しかし、いくつかの酵素がMuc2の膨張（Mep1a、Mep1b）、プロセシング（Clca1）、イソペプチド架橋（Tgm2、Tgm3）に関与していることが分かっている。Mep1aやMep1bに違いは見られなかったが、SI8ではSI5ではなくClca1の一時的な増加が確認された（図S2F-S2H）。Tgm3はどのサンプルでも検出されなかった。しかし、Tgm2レベルはSI5粘液で特異的に増加し、7d WSD曝露後にピークに達した（図3C）。Tgm2はグルタミンとリジン残基をトランスアミド化し、ポリペプチド間で共有結合のイソペプチド架橋を形成する。Muc2のGln1047とLys1057の間に架橋が検出された（図S2I）。この架橋の検出は、7日間のWSD暴露後のサンプルで増加し、食餌依存性の粘液機能障害と相関していた（図3D）。続いて、Tgm2-/-マウスにWSDを与えて、Tgm2の関連性を検証した。WSDを与えた同腹のTgm2+/+マウスではSI5粘液透過性の増加が検出されたが、WSDを与えたTgm2-/-マウスでは同じ影響は検出されず、WSDによるSI5粘液障壁機能不全がTgm2に依存していることが示された（図3Eおよび図3F）。
Muc2架橋の増加は、粘液の組織化に影響を与える可能性がある。WSDが粘液層構造の変化を誘発するかどうかを調べるために、我々は生きた腸管組織で粘液を可視化するレクチンベースのアプローチを採用した22。我々はCD飼育マウスで、蛍光結合したUlex Europaeus Agglutin I（UEAI）およびWheat Germ Agglutin（WGA）レクチンを組み合わせてSI5粘膜を染色し、レクチンと組織の共焦点顕微鏡による画像を作成し、このアプローチの妥当性を検証した（Figure 3G）。WGAは上皮膜を染色し、おそらくグリコカリックスに結合していると考えられる。UEA1とWGAはともに上皮性杯細胞から出現した物質を染色し、腸絨毛の間を満たしていた（図3G-黄色枠）。UEA1/WGA染色体を高倍率撮影すると、高分子Muc2ネットワークに対応する連続した網目（図3G-オレンジ色のボックス）が確認された。同じ方法をWSDを7日間与えた同胞にも適用したところ（図3H）、粘液の組織化に劇的な影響が見られ、絨毛間物質が高度に凝集して、全体の粘液ネットワークに大きな隙間が生じた（図3H-紫の囲み）。粘液凝集体積の比較定量化により、WSD投与群で有意な増加が見られた（Figure S3A and S3B）。CD飼料サンプルにおける凝集した粘液は、大部分が上皮性杯細胞から出現する離散的な物質に限られていたが、WSD飼料サンプルでは連続的な凝集体が観察された（図S3C）。
このことから、CD食マウスのSI5粘液は、上皮性杯細胞から分泌された高分子物質のネットワークで構成され、これが膨張して腸絨毛の間を埋めていることが示された。WSDに暴露されると、粘液が凝集したり、膨張していないためにこれらの空間を埋めることができなくなり、コアプロテオームの変化とは無関係に粘液バリア機能の喪失が生じた。WSDはTgm2の増加とMuc2のイソペプチド架橋を誘発し、これが粘液の機能障害と関連していることがわかった。
粘液バリアー切除は空腸の非定型Citrobacter rodentium感染を可能にする
食餌によって誘発されるSI5粘液機能不全の基礎を確立した後、その結果を明らかにすることを目指した。腸管粘液バリアー機能の破綻は、大腸感染症や微生物叢による炎症への感受性の増加と関連しているが、空腸はそのような研究において無視されてきた。先行研究23 と一致するように、我々は、野生型（WT）CD 飼育マウスに腸内細菌病原体 C. rodentium を感染させると、遠位結腸粘膜の一次コロニー形成と高い病原体便負荷をもたらし、小腸組織へのコロニー形成は限られ、腸間膜リンパ節への移行は検出されないことがわかった（図 S4A）。このコロニー形成パターンは、C. rodentiumのより特異的なトロピズムというよりも、小腸と大腸の粘膜防御の違いに影響されていると考えられる。したがって、食餌によるSI5粘液バリアの破壊が、この領域を病原体のコロニー形成に対してより感受性にする可能性があると仮定した。
この仮説を検証するために、CDで飼育したMuc2+/+とMuc2-/-の同腹子をC. rodentiumに感染させて、粘液喪失が病原体のコロニー形成に及ぼす影響を調べた（図4A）。Muc2-/-マウスは加齢とともに大腸の炎症を起こすので、感染実験の妨げになる可能性があるが、非感染マウスでは空腸の炎症の兆候は検出されなかった（図S4B）。感染マウスは、宿主反応やクリアランスの過程よりも、病原体のコロニー形成に注目するために、感染後4日目に検査された。既報の通り、遠位結腸内腔および粘膜試料中のC. rodentium負荷量は、Muc2+/+マウスと比較してMuc2-/-で有意に高かった（図4Bおよび図4C）。しかし、SI5内腔および粘膜サンプルにおいても同様の違いが観察され（図4Dおよび4E）、このことは、Muc2-/-マウスのSI5固定組織切片における間膜および上皮に関連したC. rodentiumの免疫組織化学的検出によって裏付けられた（図4FおよびS4C）。その結果、粘液層の破壊が非典型的な腸管ニッチへの病原体のコロニー形成を可能にするという考えが支持された。
図 サムネイル gr4
図4遺伝的または食餌誘導による粘液の破壊は、空腸のC. rodentium感染に対する感受性を増加させる
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次に、食餌誘導によるSI5粘液バリアの破壊がC. rodentiumのコロニー形成感受性に及ぼす機能的影響を検討した。WTマウスにWSDを3日間（粘液が浸透しない）または7日間（粘液が浸透する）与え、CDを与えたコントロールと比較した（図4G）。WSDを与えたグループは、感染の1日前にCDに切り替えて、C. rodentiumに対するWSDの影響ではなく、宿主に対する食餌の影響を識別するようにした。このことは、別のグループで検証され、WSDによって誘発されたSI5バリア機能不全がCDに切り替えてから少なくとも3日間持続することが確認された（図4HおよびS4D）。SI5内腔、結腸内腔、および結腸粘膜におけるC. rodentium負荷の比較では、CD、WSD 3d、およびWSD 7d給餌群間で有意差は検出されなかった（図4Iおよび4J、S4E）。しかし、WSD 7d給餌群ではCDおよびWSD 3d給餌マウスの両者と比較してSI5粘膜負荷の大幅かつ有意な増大が観察された（図4K）。WSD 7d食群の小腸排出MLN（siMLN）においてC. rodentiumがほぼ独占的に検出されたことは、病原体がこれらのマウスにおいて小腸バリアを突破することができたことを示した（図4L）。C. rodentium負荷データは、固定したSI5組織切片の染色によって支持され、WSD 7 dfedマウスにおいて間膜および上皮に関連するC. rodentiumを検出した（図4M、S4FおよびS4G）。
これらのデータから、WSDに暴露すると、SI5 C. rodentiumの感染感受性が誘導され、それは粘液バリア機能の喪失と一致することが示された。したがって、重要な粘液構造成分であるMuc2を欠損したマウスの感染から、空腸粘液バリアの破壊が、通常では主に遠位腸に関連する病原体のこの腸管領域への非定型なコロニー形成を可能にするという考え方が支持された。
空腸の微生物群コロニー形成は無傷の粘液層に依存する
感染症に対する感受性が高まることを考えると、食餌依存的なSI5粘液バリアの機能不全が、空腸の細菌負荷の増加をもたらすかもしれないと推論した。このことは、我々の生きた組織画像データ（図3Gおよび3H）に基づいている。非感染WSD飼育マウスの絨毛先端の粘液凝集体は、微生物細胞の密集したクラスターと頻繁に関連していたことから（図S5A）、食事誘導性の粘液凝集は、小腸における細菌のコロネーションおよび過剰繁殖を促進するかもしれないということを示している。
小腸の微生物叢コロニー形成に対する食餌と粘液の相互作用を調べるために、CDおよびWSDで飼育したMuc2+/+およびMuc2-/-同腹子マウスの内腔および粘膜SI5およびSI8サンプル（図5A）の細菌負荷を16S rRNA遺伝子qPCRによって定量した（図5B〜5E）。驚くべきことに、16S定量により、WSDを与えたMuc2+/+マウスの粘膜における細菌量は100倍減少しており（図5Bおよび5C）、WSDが粘膜コロニー形成を抑制していることが示された。さらに、CDで飼育したMuc2-/-マウスは、Muc2+/-同腹子と比べて内腔（25倍）および粘膜（1000倍以上）の細菌密度が有意に減少し、これはWSD曝露によってさらに変化しないことが確認された（図5Bおよび図5C）。SI5におけるWSDとMuc2欠損の両方による微生物叢の抑制は、SI8の内腔および粘膜のいずれのサンプルにおいても細菌密度に対する食事や遺伝子型に依存した影響を検出しなかったことから、部位特異的であった（図5Dおよび図5E）。
図5gr5
図5空腸粘膜の微生物叢コロニー形成は、無傷の粘液層に依存している。
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我々のデータは、SI8ではなくSI5の粘膜微生物叢がMuc2の存在に依存していることを証明した。Muc2-/-マウスのWSD曝露は細菌量に影響を及ぼさないことから、これらの知見はWSD曝露による微生物叢の減少をSI5粘膜層の破壊と関連付ける可能性がある。このことは、無傷の空腸粘液層の存在に依存するSI5粘膜微生物叢の存在を示唆するものであった。粘液関連細菌の存在は、固定したMuc2+/+ SI5組織における16S rRNA蛍光in situハイブリダイゼーション（FISH）により検証され、腸絨毛間の粘液中に細菌細胞が検出された（図5F）。注目すべきは、粘液に付着した細菌は上皮細胞と接触しておらず、高い近接性にもかかわらず機能的な分離が維持されていることであった。qPCRのデータに従って、Muc2-/-マウスとWSDで飼育したMuc2+/+マウスの組織切片で細菌をイメージングすると、腸絨毛の間にはほとんど細菌が存在せず、存在するものはしばしば上皮細胞と直接接触しているか、絨毛先端の粘液凝集体に見られた（図5F-紫枠部分）。
WSDとMuc2ノックアウトは細菌の量と分布に同様の影響を与えることから、粘膜微生物叢の構造にも同様の影響を与える可能性があると仮定した。微生物叢のβ多様性を比較したところ、Muc2欠損はCDマウスで有意な影響を及ぼしたが、WSD飼育マウスでは影響を及ぼさなかった（図5G）。注目すべきは、CD飼育Muc2-/-マウスの微生物叢は、CD飼育Muc2+/+対照と比較して、WSD飼育マウスに近いクラスターを形成していることである。WSDとMuc2欠損が分類群存在量に及ぼす影響を比較すると、いくつかの分類群（例えば、BifidobacteriaとAkkermansia）は主に食事の影響を受け、Muc2欠損の影響を受けないことが確認された。しかし、大半の分類群に対する影響は同様であり、その結果、WSDとMuc2ノックアウトの影響には有意な正の相関が見られた（図5H）。逆に、Muc2+/+およびMuc2-/-マウスにおけるWSD曝露の影響の比較解析では、分類群存在量に有意な相関は検出されず（図S5B）、微生物叢組成に対するWSD曝露の影響は、Muc2の存在または不在によって影響を受けることが示唆された。
このように、我々は、SI5微生物叢の負荷、分布、および群集構造におけるWSD曝露とMuc2欠損の間に顕著な類似性を確認した。どちらの要因も、粘膜関連微生物叢の生息場所として機能する拡大した粘液ネットワークの喪失をもたらす。その結果、我々のデータは、無傷の粘液層の存在に依存する粘膜微生物叢の存在を支持し、食事によって空腸粘液ニッチが失われることに非常に敏感であることを明らかにした。
Muc2依存性は、細菌の生活様式や環境中の抗菌力低下と相関する
続いて、空腸粘液の微生物生息地としての役割を促進する可能性のある因子を特定することを目指した。まず、SI5粘膜微生物群の構造、管腔粘膜の分布、およびWSDによる粘液破壊に対する感度を評価するために、2つの独立した実験（図2および図5）から得られた16S rRNA遺伝子配列のデータを調べた（図6A）。この結果、粘膜環境を支配する細菌分類群（Muribaculaceae、Bifidobacterium、Faecalibaculum、Lactobacillus）は管腔環境にも豊富に存在し、2つの区画の間で継続的に相互作用していることが示された。逆に、内腔のStreptococcaceaeや粘膜のCandidatus Arthromitus（分割型糸状菌：SFB）のような区画に富む属は、SI5群集のマイナーな構成要素であった（図6A）。粘膜：管腔、CD：WSDの存在比には有意な正の相関があり、粘膜区画での濃縮はWSDによる抑制に対する感受性の増加と相関していることが示された。
図1.サムネイルgr6
図6空腸・回腸粘液ニッチにおける微生物と宿主の因子
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我々は、微生物群構造の違いがSI5とSI8の間のMuc2依存性のばらつきを説明する可能性があると仮定した。SI5とSI8サンプルの16S配列データをLEfSeで比較解析したところ、SI5と比較してSI8の内腔および粘膜環境で有意に濃縮されている限られた分類群の1つがSFBであることが確認された（図6B）。SFBはSI8の粘膜環境で特に多く存在し、支配的な細菌分類群であった。画像データによると、SI5粘液中の細菌は浮遊性細胞として存在し（図6C）、SI8にコロニーを形成するSFBは上皮に付随するフィラメントとして存在していた（図6CおよびS6A）。したがって、SI5とSI8の粘膜微生物叢の生活様式は、ニッチに特異的なMuc2依存性とともに変化していることが明らかになった。
パネス細胞と腸管細胞による抗菌ペプチド（AMP）の分泌は、微生物叢が小腸粘液層に定着する能力を制御する要因である。24 そこで、SI5とSI8の粘液プロテオームを解析したところ（図6Dおよび表S3）、大半のタンパク質（96.5%）が両環境で同様に検出されることが判明した。複数のパネス細胞および腸管細胞由来のAMPがSI5およびSI8粘液の両方で検出され、腸管細胞由来のAMPであるReg3gおよびReg3bはSI5ではSI8粘液と比較して著しく低いレベルで検出された（図6Dおよび図6E）。最後に、微生物叢がSI5およびSI8における全体的な抗菌ランドスケープにどのような影響を及ぼすかを、我々の以前のデータセット25を利用して調べた（図S5B）。以前の研究26 と同様に、Reg3b と Reg3g の発現は両方の領域で微生物叢に依存しており、SI5 と SI8 粘液におけるこれらのタンパク質の検出の差は、微生物の誘導の程度の違いによって決定されていることが示唆された。
空腸粘液と回腸粘液は非常に異なった環境であることが示された。回腸粘液は、腸管細胞由来のAMPが多く存在し、上皮に埋め込まれたSFBによってコロニー形成されていることによって区別された。逆に空腸粘液は抗菌力が低く、より多様な分類群の浮遊性細菌細胞にコロニー形成されていた。これらのデータは、空腸粘液層と回腸粘液層の多様な固有特性が、Muc2への依存度が異なる微生物群集の形成と因果関係がある可能性を示している。
空腸の微生物叢は非定型C. rodentium感染に対する抵抗性を付与する
微生物叢は、腸内病原体のコロニー形成に対する抵抗性を提供することができる。WSD曝露とMuc2欠損の両方が空腸粘液バリア機能とMuc2依存性細菌の同時喪失をもたらしたことから、空腸C. rodentium感染に対する感受性は、粘液バリア機能の直接的喪失というよりむしろコロニー形成抵抗性の破壊に起因している可能性が示唆された。
そこで、空腸感染におけるコロニー形成抵抗性と粘液バリア機能の役割を区別するために、CDFマウスにABXを投与し、SI5粘液バリア機能を維持したまま微生物叢を枯渇させることを目指した。マウスを7日間ABXに曝露し、SI5細菌負荷と粘液バリア性を評価することで、このアプローチを検証した（図7A）。ABX処理は、内腔細菌負荷を抑制し（1,000倍）、粘膜細菌負荷を検出不可能なレベルまで低下させた（図7B）。ABX処理後、細菌負荷は徐々に回復したが、粘膜負荷はABX曝露後7日目まで有意に減少したままであった。同期間におけるSI5粘液バリア特性の定量化により、SI5粘液の厚さおよびバリア機能のいずれにもABX曝露の影響は認められなかった（図7C〜7E）。
図 サムネイル gr7
図7C. rodentiumに対する感受性を媒介する空腸内細菌叢
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マウスはその後、ABXを7日間投与して微生物叢を枯渇させ、通常の飲料水に切り替えた後、C. rodentiumに感染させた（図7F）。ABX投与マウスと対照マウスのC. rodentium負荷を比較すると、ABX投与により便中のC. rodentiumの内腔負荷が高くなり（図6G）、微生物叢枯渇が病原体の典型的ニッチにおけるC. rodentiumのコロニー形成を促進することが示唆された。しかし、ABX投与により、SI5内容物および粘膜試料中のC. rodentium負荷は大幅に増加し（図6Hおよび図6I）、微生物叢の枯渇が非定型空腸C. rodentium感染への感受性を誘導することが明らかとなった。重要なことは、ABX投与マウスのsiMLN試料からは生きたC. rodentiumのみが検出されたことである（図6J）。これは、微生物叢の枯渇が病原体の小腸バリアを突破することも可能にすることを示している。
コロニー形成抵抗性は、抗菌因子の産生やコロニー形成ニッチの占有など、いくつかのメカニズムによって微生物叢から付与される可能性がある。小腸粘液にC. rodentiumを標的とする抗菌因子が含まれているかどうかを調べるため、SI5およびSI8由来の可溶性粘液タンパク質（SMP）で培養し、細菌膜透過性を定量化した。大腸菌とC. rodentiumはともに抗生物質Polymyxin Bで効率的に透過化されたが、SI5またはSI8からのSMPは大腸菌のみを透過化でき、C. rodentium膜の完全性には検出可能な影響を与えなかった（図7Kおよび7L）。このことから、C. rodentiumは我々のSMP準備物に見られる微生物群の抗菌因子に対して耐性があると考えられた。我々は、Muc2+/+およびMuc2-/-同腹のABXを介した微生物叢枯渇の状況下でC. rodentiumのコロニー形成を調べることにより、空腸粘液ニッチのコロニー形成を阻害する微生物叢の潜在的役割を検討した。ABX処理したMuc2+/+とMuc2-/-の間でSI5内腔のC. rodentium負荷に違いは検出されなかったが（図7M）、SI5粘膜サンプルの病原体負荷はABX処理したMuc2+/+とABX処理したMuc2-/-サンプルで有意（>10倍）だったことから（図7N）、粘液によって、微生物相が存在しなくてもC. rodentiumコロニーの形成を促すことが示された。
このように、C. rodentiumによる非定型空腸への耐性は、微生物叢に機能的に依存していることが示された。空腸粘液が微生物叢に占有されない限り、空腸粘液は病原体のコロニー形成のバリアとなるのではなく、むしろ病原体のコロニー形成を促進することが明らかとなった。C. rodentiumは空腸粘液中の抗菌因子に抵抗性を示すことから、微生物相が空腸粘液ニッチを占有することにより、受動的にコロニー形成抵抗性を生み出していることが示唆された。
考察
粘液バリアシステムは、微生物を上皮表面から隔離し、宿主と微生物叢のバランスを保ちながら、微生物の挑戦に対処するために発達してきた。これまでの研究は大腸に焦点を当てたものであったが、今回、我々は、WSDへの曝露が空腸粘液に悪影響を及ぼし、細菌感染に敏感になることを明らかにした。さらに、Muc2依存的な微生物叢が存在することで、細菌感染に対する耐性が生じることを明らかにした。この結果は、宿主が積極的に耐コロニー形成をサポートする新しいメカニズムを明らかにし、この共生関係が食事の乱れに対して敏感であることを示すものである。
ヘリコバクター、ムチスピリルム、SFBなどの粘液の専門家は、他の微生物がアクセスできないような腸管粘液のニッチを形成するが、大腸および回腸粘液層には、通常、微生物がほとんど存在しない状態が続いている。逆に、空腸の微生物相がMuc2に依存していることや、粘液層内の細菌細胞を示す画像（図5参照）から、空腸粘液はバリアというよりむしろ生息場所として機能していることがわかる。しかし、腸管由来の抗菌物質が回腸粘液に比べて空腸で少ないことは注目に値する（図6E）。Bifidobacterium longumがReg3g発現を抑制することが以前に示されており30、微生物-宿主間のコミュニケーションが空腸粘液の生息環境を調整する役割を果たす可能性が示唆される。
この結果は、食事、粘液、コロニー形成抵抗性の間の新しい相互作用を浮き彫りにするものである。WSDや低繊維食が大腸粘液バリアやC. rodentiumに対するコロニー形成抵抗性に及ぼす影響を調べた先行研究では、一貫して微生物叢との因果関係が示されている11, 12, 31, 32。腸管粘液がコロニー形成抵抗性を支えているのではないかと推測されている33,34。しかし、大腸粘液のバリア機能は、Muc2ノックアウトが大腸の宿主-微生物相互作用に多面的に作用するため、コロニー形成抵抗性におけるその役割の解析は困難であった。空腸粘液がバリアーとしてではなく、微生物の生息場所として機能しているという事実は、この複雑さを取り除き、現在、粘液をC. rodentiumに対するコロニー形成抵抗を積極的にサポートする宿主因子として定義することを可能にしている。
WSDによる大腸粘液バリアー機能不全における微生物叢の因果関係は確立されているが、空腸におけるその役割はあまり明確でない。WSD曝露前に微生物叢を抗生物質で枯渇させても粘液特性への影響は防げず、WSDの影響はdysbiosis非依存的であることが示唆された。しかし、WSDを与えたマウスに正常な微生物叢を再導入することに成功しなかったことから、この点については疑問が残る。しかし、WSDを与えた空腸の再接種に対する抵抗性は、正常な空腸の微生物叢が無傷の粘液層に依存しているという所見と論理的に一致する。
腸内細菌感染症は先進国では比較的まれであるが、抗生物質の使用、糖尿病、肥満はすべて小腸細菌過剰増殖（SIBO）の危険因子であり、小腸内の細菌の異常な拡大により慢性下痢と吸収不良を引き起こすことが特徴である35,36が、機能的にコロニー形成抵抗性の喪失と関連している可能性が考えられる。腸内細菌感染症のリスクが高い地域に欧米の食習慣が拡大した結果、空腸のコロニー形成抵抗性が低下した個体が、そのような欠損を利用できる病原体にさらされることが多くなったと推測される。
本研究の限界
我々は、いくつかの異なる実験的介入（例えば、食事、C. rodentium感染、ABX、遺伝子ノックアウト）が小腸に及ぼす影響に焦点を当てて解析を行ったが、すべてが腸全体に沿って影響を及ぼすことに留意すべきである。今回の実験では、小腸環境で定量化した宿主-微生物叢相互作用への影響について、具体的な結論を出すことができるようになった。しかし、小腸の微生物叢を選択的に枯渇させることができない現状や、領域特異的な条件付き遺伝子ノックアウトモデルのため、空腸の微生物叢のコロニー形成が宿主全体の健康に与える特定の影響を切り分けることができないのが実情である。
STAR★Methods
主要リソース表
試薬またはリソースのソース IDENTIFIER
抗体
ウサギ大腸菌 O 152 抗血清 デンカ生研 295774
Goat anti-Rabbit IgG (H + L) Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor™ 488 ThermoFisher A-11008; RRID:AB_2633280
細菌・ウイルス株
Citrobacter rodentium（シトロバクター・ロデンティウム）ICC169株 Sara K Linden N/A
Escherichia coli K12 strain W3110 Fredrik Bäckhed N/A
化学物質、ペプチド、リコンビナントタンパク質
オートクレーブ マウスブリーダーダイエット LabDiet 5021
脂肪調整飼料 Envigo TD.96132
アンピシリン メルク A9518-100G
メトロニダゾール メルク M3761-5G
バンコマイシン メルク V2002-5G
ネオマイシン メルク N6386-100G
イソフルラン クローナンス・アポテック N01AB06
SYTO™ 9 Green Fluorescent Nucleic Acid Stain サーモフィッシャー社 S34854
FluoSpheres™ カルボキシル基修飾マイクロスフェア ThermoFisher F8816
ライジングマトリックスE MPBio 116914100
cOmplete Protease Inhibitor Cocktail ロシュ 11873580001
GuHCl 8M ThermoFisher 24115
DTT Merck D9163
ヨードアセトアミド Merck I6125
LysC 和光 125-05061
トリプシン Promega V5111
Ulex Europaeus Agglutinin I (UEA I), DyLight™ 649 Vectorlabs DL-1068-1
Wheat Germ Agglutinin (WGA), Rhodamine Vectorlabs RL-1022
MacConkey 寒天 ThermoFisher CM0007B
ルリアブロス・ベース ThermoFisher 12795027
Nalidixic acid メルク N8878-5G
Xylene Substitute メルク A5597
Hoechst 34580 Merck 63493
cOmplete™ Protease Inhibitor Cocktail Merck 11697498001
SYTOX™ Green核酸染色剤 ThermoFisher S7020
ポリミキシンB硫酸塩 ミリポア 5291
重要な市販アッセイ
Five Prime ホットマスターミックス Quantabio 733-2474
NucleoSpin Gel and PCR Clean-up kit Macherey-Nagel 740609
Quant-iT PicoGreen dsDNA kit サーモフィッシャー社製 P11496
Agencourt AMPure XP Beckman Coulter A63880
QIAamp PowerFecal Pro DNA キット Qiagen 51804
SsoFast™ EvaGreen® Supermix Bio-Rad 1725203
Pierce™ BCA Protein Assay Kit サーモフィッシャー 23225
寄託データ
Silva v.138 参照配列データベース Quast et al.37 N/A
質量分析プロテオミクスデータ PRIDEpartnerリポジトリ PXD028613
16S DNAシーケンスデータ ENAシーケンスリードアーカイブ PRJEB47610
実験モデル 生物種・系統
C57BL/6J インハウス N/A
C57BL/6J チャールズリバー社 000664｜Black 6
Muc2tm1Avel Velcich et al.17 N/A
Tgm2tm1Gml Laurenzi & Melino38 N/A
オリゴヌクレオチド
V4 領域 515F および 806R プライマー Kozich et al.39 N/A
EUB338 16S FISH プローブ（Alexa Fluor™ 555 コンジュゲート） Amann et al.40 N/A
ソフトウェアおよびアルゴリズム
Zen（バージョン 2.3） Carl Zeiss http://www.zeiss.com
Imaris ×64 (バージョン 9.5.0) オックスフォード・インストゥルメンツ http://imaris.oxinst.com/
Prism (バージョン 9.4.1) GraphPad http://www.graphpad.com/
QIIME 2 (バージョン 2020.11) Bolyen et al.41 N/A
DADA2 Callahan et al.42 N/A
MAFFT (バージョン 7.407) Katoh et al.43 N/A
FastTree 2 Price et al.44 N/A
q2-feature-classifier Bokulich et al.45 N/A
LEfSe Segata et al.46 N/A
MaxQuant (v1.5.7.4) Cox & Mann47 N/A
Perseus (v1.6.2.2) Tyanova et al.48 N/A
StavroX (バージョン3.6.6) Gotze et al.49 N/A
R (v4.1.1) The R Project for Statistical Computing https://www.r-project.org/
その他
レーザー走査型共焦点イメージングシステム Carl Zeiss LSM 700
Illumina MiSeq Illumina http://www.illumina.com/systems/sequencing-platforms/miseq.html
Nanosep 10K Omega Pall Life Sciences OD010C35
EASY-nLC システム 1000 ThermoFisher LC120
逆相カラム（150 × 0.075 mm 内径、C18-AQ 3 μm） 自社製 N/A
QExactive Hybrid Quadrupole-Orbitrap Mass Spectrometer ThermoFisher IQLAAEGAAPFALGMAZR
T 10 basic ULTRA-TURRAX® IKA 0003737000
RapidFISH スライドハイブリダイザー Boekel Scientific 240200
ファストプレップ-24™ MPバイオメディカルズ 116004500
CFX96 Touch リアルタイムPCR検出システム Bio-Rad 1845097
SpectraMax® M2 マルチモードマイクロプレートリーダー Molecular Devices https://www.moleculardevices.com/products/microplate-readers/multi-mode-readers/spectramax-m-series-readers
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リソースの有無
リード連絡先
リソースや試薬に関する情報やリクエストは、リードコンタクトのGeorge Birchenough (george.birchenough@gu.se)までお願いします。
試薬の入手方法
この研究では、新たな試薬は生成されませんでした。
実験モデルおよび被験者の詳細
実験に使用したすべてのマウスは、社内で繁殖させたものか、Charles River社(ドイツ)から購入したものである。購入したマウスは、自家繁殖マウスの使用済み寝具を入れたケージで3週間施設馴化させた。すべてのマウスはC57BL/6バックグラウンドであり、12時間の明暗サイクルで餌と水に自由にアクセスできる特定の病原体フリー条件下で飼育された。実験群は、各実験の図に示されるように、年齢をマッチさせた12-17週齢の雄マウス、または雄と雌のバランスのとれた混合マウスで構成されていた。マウスには、標準的な低脂肪、低糖、高繊維のチャウ食（5021、LabDiet）または高脂肪、高糖、低繊維の西洋式食（TD.96132、Envigo）を与えた。Muc2 および Tgm2 ノックアウトマウスについては既報の通りであり、17,38 ヘテロ接合体の交配ペアを用いてリッター実験マウスを作製した。抗生物質処理実験のために、バンコマイシン（0.5 mg/mL）、ネオマイシン（1 mg/mL）、アンピシリン（1 mg/mL）およびメトロニダゾール（1 mg/mL）をメルクから購入し、1％w/vショ糖を含む飲料に表示濃度に溶解させた。動物はイソフルランを使用して麻酔し、サンプルを収集する前に頸椎脱臼によって殺された。動物を用いたすべての実験手順は、ヨーテボリにあるSwedish Laboratory Animal Ethical Committeeの承認を得ている。
メソッドの詳細
小腸粘液バリア特性の生体外での定量化
小腸粘液の厚さとバリア機能の測定は、大腸組織における同様の特性の研究に使用された以前のex vivo方法を応用した18。簡単に言うと、異なる小腸領域から約3cmの組織を氷冷酸素添加クレブス緩衝液で流し、内腔含分を取り除き、縦方向に開き、以前に詳述したように水平灌流槽にマウントした50。組織は、Syto9細胞色素（25μM、ThermoFisher）および1μm crimson carboxylate修飾Fluospheresマイクロビーズ（1：20希釈、ThermoFisher）の混合物を含むKrebsバッファで覆い、15分間インキュベートされた。その後、組織を0.5 mLのKrebsバッファーで洗浄し、2 mLの新鮮なKrebsバッファーに浸し、イメージングを行った。
組織とマイクロビーズは、20倍の水浸対物レンズ、488/639nmレーザー、およびZen取得ソフトウェア（Carl Zeiss）を備えたLSM700レーザー走査共焦点顕微鏡を使用して画像化された。組織（小腸絨毛）およびマイクロビーズの蛍光シグナルをImarisソフトウェア（Oxford Instruments）を用いてマッピングし、個々の絨毛先端およびマイクロビーズのz軸位置を記述するデータを抽出した。粘液層の厚さは、平均的な絨毛先端-マイクロビーズz軸距離を計算することにより、絨毛先端との関係で定量化された。粘液バリア機能（規格化透過性）は、粘液層内のマイクロビーズ分布の分析により定量化した。Prism 9ソフトウェア（GraphPad）を用いて、小腸絨毛の基部からのマイクロビーズz軸距離の頻度分布曲線を各zスタックについて作成した。曲線は最大頻度値で正規化し、粘液表面の位置で正規化し、粘液表面より上のマイクロビーズからのデータを除外するために切り取った。最後に、異なるサンプルの粘液層へのマイクロビーズの浸透を定量的に比較できるようにするため、正規化浸透性として表される曲線下の面積データを作成した。
16S rRNA遺伝子配列決定による腸内細菌叢のプロファイリング
515Fおよび806Rデュアルインデキシングプライマー39とV2キット（2×250 bpペアエンドリード）を用いて、Illumina MiSeq（Illumina RTA version 1.17.28; MCS version 2.5）で16S rRNAのV4領域の配列決定により細菌性マイクロバイオータ組成をプロファイリングした。内容物サンプルは二重に、粘膜サンプルは三重に増幅した。25 μLの反応液にはFive Prime Hot Master Mix (Quantabio), プライマー (200 nM), BSA (0.4 mg/mL), DMSO (5% v/v), DNA 20 ng (内容物) または 100 ng (粘膜)を加えた。PCR条件は、94℃で3分間の変性、94℃で45秒間の変性、52℃で60秒間のアニーリング、72℃で90秒間の伸長を25サイクル（内容物）または26サイクル（粘膜）行い、最終伸長工程を72℃で10分間とした。複製をプールし、NucleoSpin Gel and PCR Clean-up kit (Macherey-Nagel) で精製し、Quant-iT PicoGreen dsDNA kit (ThermoFisher) で定量を行った。等量の精製されたPCR産物をプールし、配列決定前に短い増幅産物を除去するためにAmpure magnetic purification beads (Agencourt) を用いて再度精製を行った。
生配列データは、デマルチプレックスとクオリティフィルターを行い、DADA2 でノイズ除去した42。 44 α多様性指標（Shannon diversity index H）、β多様性指標（Bray-Curtis dissimilarity）および主座標分析（PCoA）は、多様性コアメトリクス-系統樹コマンドを使用して推定された。分類学は、Silva v.138 参照配列データベースに対して q2-feature-classifier45 classify-sklearn naïve Bayes taxonomy classifier を用いて ASV に割り当てた。
質量分析に基づく粘液プロテオームのプロファイリング
サンプルは、上記のように水平灌流槽に取り付けられた腸管組織から生体外で採取された。粘液は、Maximum Recovery ピペットチップ (Axygen) を用いて粘膜表面から吸引し、2x cOmplete protease inhibitor cocktail (Merck) と混合して、分析まで -80°C で保存した。
12 簡単に言うと、粘液を6 M グアニジナム塩酸塩、0.1 M Tris/HCl (pH 8.5), 5 mM EDTA, 0.1 M DTT (Merck) で一晩還元した後、10 kDaカットオフフィルター (Pall Life Sciences) を用いて、以前に開発したプロトコル52に準拠したフィルター補助サンプル調製を行った。タンパク質をヨードアセトアミド (Merck) でアルキル化し、フィルター上でLysC (Wako) とトリプシン (Promega) で順次消化した。NanoLC-MS/MSは、ナノエレクトロスプレーイオン源を介してQExactive Hybrid Quadrupole-Orbitrap Mass Spectrometer (ThermoFisher) に接続したEASY-nLC 1000システム (ThermoFisher) で実施しました。ペプチドは、自社製充填逆相C18カラムを用い、4-32%アセトニトリルグラジエントを60分間かけて分離した。320-1,600 m/zの分解能70,000でマススペクトルを取得し、最も強度の高い12ピークを断片化して、分解能35,000、自動ダイナミック排除を使用してタンデムマススペクトルを取得しました。
タンパク質の同定は、MaxQuant (v1.5.7.4)47 を用いて、マウスUniProtタンパク質データベース（ダウンロードしたものにマウスムチン配列 (http://www.medkem.gu.se/mucinbiology/databases/)を追加したもの）を検索して行った。検索は、完全なトリプシン特異性、最大2回の切断ミス、再キャリブレーション検索のための20ppmの前駆体許容度と最終検索のための7ppm、フラグメントイオンの0.5 Daを使用しました。修飾は、システインのカルバミドメチル化（固定）、メチオニン酸化（可変）、タンパク質N末端（可変）とした。FDRはペプチドレベル、タンパク質レベルともに1%に設定し、最小ペプチド長は6アミノ酸に設定した。タンパク質は、少なくとも2つのペプチドを用いたラベルフリー定量（LFQ）を用いて定量した。
LFQ データは Perseus (v1.6.2.2) を用いて解析した。48 タンパク質は、潜在的な汚染物質と少なくとも 50% のサンプルでの検出をフィルターにかけた。データはlog10変換され、欠損値はデフォルト設定を使用して正規分布からインプットされた。実験グループ間のタンパク質量の違いを特定するために、Permutation-based FDR による 2 標本検定 (Student's t-test または Welch's t test) を使用した。主成分分析（PCA）は、異なるサンプルグループのクラスタリングを可視化するために使用し、グループ間の類似性は、R（v4.1.1）で実行されるVeganパッケージ（v2.5-7）のPERMANOVAとブレイ・カーティス非類似度法を使用して決定された。
アイソペプチドが架橋したMuc2ペプチドの検出
イソペプチド架橋ペプチドのMSデータの解析は、以前に記載したように行った。54 簡単に言うと、Mascot汎用ファイル（mgf）を、StavroXエンジン（バージョン3.6.6）を用いてマウスMUC2の理論的イソペプチド架橋に対して検索した49。検索には完全トリプシン特異性と最大3つのミス切断を用いた。システインのカルバミドメチル化は固定修飾として、GlnとLysは架橋部位として設定し、架橋剤の組成は-NH3/-17.03 Daに設定した。親イオンとフラグメントイオンの誤差はそれぞれ2 ppmと30 ppmに設定された。生成されたスペクトルは、その後、手動で評価された。
細菌と粘液構造のエクスビボ・イメージング
小腸の組織は、上記の水平灌流チャンバーにマウントした。腸管上皮細胞、粘液関連細菌細胞および粘液を、25μM Syto9細胞色素（ThermoFisher）、50μg/mL Ulex Europaeus Agglutinin I（UEA1）-DyLight649結合レクチン（Vectorlabs）および50μg/mL Wheat Germ Agglutin（WGA）-Rhodamine結合レクチン（Vectorlabs）で補充したKrebsバッファを用いて15分間に渡って染色した。組織は0.5 mLのクレブスバッファーで洗浄後、2 mLの新鮮なクレブスバッファーに浸漬してイメージングを行った。上皮細胞、細菌細胞、レクチン結合粘液を、×20水浸対物レンズ、488/555/639nmレーザー、Zen acquisitionソフトウェア（Carl Zeiss）を備えたLSM700レーザースキャン共焦点顕微鏡を用いて画像化した。空腸サンプルにおける粘液凝縮を定量化するために、Imarisソフトウェア（Bitplane）を使用して、チャウ食マウスの小腸からの画像を最初に分析して決定した閾値レベルに基づいて、UEA1シグナルに等値面をマッピングするために使用された。次に、他の実験グループの画像に同様の等値面マッピングパラメータを適用し、等値面の総体積と離散的な等値面の数を記述したデータを抽出した。粘液中の細菌細胞の画像化は、Syto9染色した細菌細胞がSyto9染色した上皮細胞と容易に区別できる領域の高倍率・高解像度共焦点Zスタックを取得することによって実施した。画像はImarisで処理され、高い（上皮細胞）蛍光シグナルをマッピングし、低い（細菌細胞）蛍光シグナルをマッピングしないように手動で定義した閾値を使用してSyto9蛍光に等値面をマッピングすることによって、細菌と上皮細胞を区別した。
Citrobacter rodentiumのマウスへの感染
ナリジクス酸耐性C. rodentium株ICC169（O152血清型）をすべての感染実験に使用した。感染用接種菌は，LBブロス中，37℃，回転式インキュベーターで一晩培養して調製した．一晩培養した菌体を4000RCFで10分間遠心分離して10倍に濃縮し、LBブロスで再懸濁した。マウスに200μLの感染接種物（1-3 x 109 CFU）を投与した。マウスを犠牲にし、無菌状態でサンプルを採取することにより、感染後の特定の時点における異なる解剖学的部位でのC. rodentium負荷を測定した。約3cmの空腸、回腸および遠位結腸組織を剥離し、4mLの滅菌PBSで洗浄した。セグメント内容物と洗浄した組織を別々に採取した。腸管リンパ節を採取して、腸管排出リンパ管構造におけるC. rodentium負荷を調べた。実験に応じて、MLNを一括してサンプリングするか、小腸を排出するノード（siMLN）と盲腸および近位結腸を排出するノードとに注意深く分離した。すべてのサンプルは、70％エタノール（×2）および滅菌PBSで順次洗浄したUltra-Turrax T10分散器（IKA）を用いて滅菌PBS中でホモジナイズした。C. rodentiumは，10μg/mLのナリジクス酸を添加したMacconkey寒天培地で連続希釈し，37℃で一晩培養して細菌CFUを定量することによりホモジネートから計数した．各サンプルについて、最小希釈倍率での1コロニーの検出に基づいて理論的な検出限界（LOD）を算出した。各実験の同じ種類のすべてのサンプルについて計算された平均LODは、すべてのCFUグラフに示されている。
組織学
管腔内容物を含む腸組織をメタノール-カルノー溶液に24時間以上浸漬して固定し、固定組織をパラフィン包埋し、厚さ5μmの縦切片に切断した。組織切片はキシレン代用液（60℃で20分；Merck）、100％（5分）、95％（5分）、70％（5分）、30％（5分）エタノールで順次洗浄し脱パラフィン化した。組織化学的染色では、組織切片をアルシアンブルー染色と過ヨウ素酸シッフ染色（AB/PAS）で既報の通り染色した8。蛍光染色では、10mMクエン酸バッファーに切片を浸漬して抗原賦活を行った（95℃、30分）。切片をPBSで洗浄し、0.1% vol/vol Triton X-100 (Merck) を用いて5分間透過処理し、5% vol/vol FCSでブロッキングした。C. rodentium ICC169 を検出するために，ウサギ抗O152一次抗体（1:100，デンカ生研）と共に切片を4℃で一晩インキュベートした．切片をPBSで洗浄し、ヤギ抗ウサギAlexa 488標識二次抗体（1:2,000; ThermoFisher）で室温で2時間染色した。最後に、スライドをPBSで洗浄し、Hoechst DNA dye (5 μg/mL; Merck) と UEA1-DyLight647 conjugated lectin (10 μg/mL, Vectorlabs) の混合物で15分間カウンターステインした。スライドをdH2Oですすぎ、ProLong Gold Antifade mountant（Thermofisher）を用いてカバースリップし、LSM700共焦点顕微鏡（Zeiss）を用いて画像化した。
Citrobacter rodentiumの分布解析
C. rodentiumで染色した全組織切片を、LSM700共焦点顕微鏡（Zeiss）でタイルスキャン機能を用いて画像化した（前の方法のセクション参照）。Raw.cziファイルをImaris (v.9.5.0; Bitplane)にインポートし、解析用に.imsフォーマットに変換した。組織空間データはDNA（Hoeschst）信号に基づいて手動でマッピングし、絨毛先端と陰窩基部の位置を特定した。絨毛の長さは、絨毛の先端から最も近いクリプト基部までの距離から算出した。C. rodentiumは、Imarisのスポット機能を用いて、O152陽性細胞を識別するために自動的にローカライズされた。個々のC. rodentium細胞と直近のクリプト基部との距離を計算し、クリプトまでの距離≦絨毛長の細胞をintervillus C. rodentiumと分類した。このアプローチの一例を図S4Gに示す。
蛍光in situハイブリダイゼーション
細菌16S rRNAのFISH染色は、上述の組織切片を用いて行った。切片は、キシレン代用液（60℃で20分間；Merck）、100％エタノール（5分間）、および95％エタノール（5分間）で順次洗浄することにより脱パラフィン化した。スライドを風乾し、Alexa 555標識ユニバーサルバクテリアFISHプローブEUB33840（1 mM）を添加したハイブリダイゼーションバッファー（40% vol/vol formamide, 0.1% wt/vol SDS, 0.9 M NaCl, and 20 mM Tris, pH 7.4 ）で浸漬させた。スライドを RapidFISH Slide Hybridization Oven (Boekel Scientific) で37℃にて一晩インキュベートし、その後洗浄バッファ（0.9 M NaClおよび25 mM Tris, pH 7.4）に浸し、50℃にて20分間インキュベートした。最後に、スライドを二重蒸留水ですすぎ、Hoechst色素（5 μg/mL; Merck）およびUEA1-FITC結合レクチン（10 μg/mL, Vectorlabs）で15分間カウンターステインを行った。染色したスライドは、LSM700共焦点顕微鏡（Zeiss）を用いて画像化した。
16S rRNA遺伝子qPCRによる管腔および粘膜細菌の定量化
異なる腸管領域および区画における細菌密度を評価するため、約3cmの空腸、回腸および遠位結腸組織を解剖し、4mLの0.22μmフィルター滅菌PBSでフラッシュ洗浄した。セグメントの内容物（管腔サンプル）と洗浄した組織（粘膜サンプル）は、サンプルの相互汚染を防ぐために、無菌条件下で、清潔/滅菌された解剖器具を用いて別々に採取した。内腔サンプルは、DNA抽出の前に直ちに-20℃で保存した。粘膜サンプルは、粘膜上皮を露出させるために縦に開き、1mLのフィルター滅菌したPBSに移した。粘膜組織細胞は、サンプル間にRBS洗剤（Merck）、70％エタノール、フィルター滅菌したddH2Oで順次洗浄したUltra-Turrax T10分散器（IKA）を用いて短時間ホモジナイズすることで選択的に溶解させた。組織溶解液を10,000 RCFで10分間遠心分離し、細菌細胞と組織破片をペレット化し、溶解液上清を廃棄した。細菌ペレットは、さらに処理する前に-20℃で保存した。QIAmp PowerFecal Proキット（Qiagen）を用いて、Fast-Prep System（MPBio）を用いて4.5 m/s、40秒のビーズビーティングを4回行い、内腔サンプルと粘膜サンプルの両方からDNAを抽出した。DNA抽出物は、0.3μMのユニバーサルプライマー926f（5′-AAACTCAAAKGAATTGACGG-3′）および1062r（5′-CTCACRRCACGAGCTGAC-3′）と45ng鋳型DNAを用いてSsoFast EvaGreen Supermix（バイオ・ラッド）を用いてqPCRにより分析された。反応はCFX96プラットフォーム（Bio-Rad）を用いて実施され、モニターされた。大腸菌から精製した全16S遺伝子アンプリコンのqPCRから作成した標準曲線を用いて、絶対的な細菌16Sコピー数を定量化し、データを最初のサンプル（管腔内容または粘膜組織）質量に対して正規化した。
粘液殺菌活性の定量化
可溶性粘液タンパク質（SMP）は、新鮮な小腸の解剖組織から調製された。組織を採取し、氷冷した10mMリン酸ナトリウム（SP）緩衝液で穏やかに洗浄し、管腔内含有物を除去した。洗浄した組織を縦に開き、粘膜側を上にして解剖皿に固定し、マイクロピペットを用いて粘液を採取した。SMPは、サンプルを10分間ボルテックスし、6000RCFで10分間遠心分離した後に上清を回収することにより調製した。SMPにプロテアーゼ阻害剤（1 mM EDTA, 2x cOmplete Protease Inhibitor Cocktail; Merck）を加え、BCA assay (Pierce) で定量し、使用するまで-20℃で保存した。殺菌活性試験に用いた細菌細胞（C. rodentium ICC169およびE. coli K12 W3110）は、新鮮なLB培地に接種し、OD600 0.5まで増殖させたオーバーナイト培養物から調製した。細菌をOD600 0.2に希釈し、遠心分離と1 mM EDTAを補充した10 mM SPバッファーへの再懸濁により2回洗浄した。Sytox Green (2 μM; ThermoFisher) を細菌細胞懸濁液に加え、暗所で10分間インキュベートした後、100 μLをバック96ウェルプレートのウェルに分注した。細菌は、500μg/mLの総タンパク質濃度に調整した100μLのSMP調製物、または100μg/mLのポリミキシンB（メルク）抗生物質とt reatedされた。SpectraMax プレートリーダー（Molecular Devices社製）で1時間にわたり30秒間隔で Sytox Green 蛍光を読み取り、データはt0でのシグナルに正規化した。
定量と統計解析
各実験の統計的詳細は、図の凡例に記載されている。各実験について、「n」は、使用した生物学的複製（動物）の数を意味する。すべてのヒストグラムは、中央値と四分位範囲を示す。16S rRNA遺伝子シーケンス結果の統計的検定は、QIIME241 v.2020.11 (Figures 2A, 2B, 5G, and S1B) または Linear discriminant analysis Effect Size46 (Figure 2, Figure 6C and 6B) を用いて実施された。MSプロテオームデータの統計的検定は、Perseus48 v1.6.2.2 (図3BとS2BとS2E)、またはR v4.1.1 で Vegan v2.5-7 パッケージを使って行った (図3AとS2A). その他の統計学的検定は、Prism v.9.4.1 (GraphPad)で行った。ノンパラメトリック検定はすべてのケースで使用され、実験サンプルサイズを事前に決定する方法は使用されなかった。
データおよびコードの入手可能性

データの入手性 質量分析プロテオミクスデータはPRIDEpartnerリポジトリ経由でProteomeXchange Consortiumに寄託されており、データセットIDはProteomeXchange.PXD028613である。PXD028613 微生物相の16S rDNA遺伝子配列決定結果は、ENA sequence read archiveに寄託されており、アクセッション番号はENA: PRJEB47610である。

コードの有無 コード有無：本論文はオリジナルコードを報告していない。

本論文で報告されたデータの再解析に必要な追加情報は、要求に応じてリードコンタクトから入手可能です。
謝辞
この論文で報告されたデータの再解析に必要な追加情報は、リードコンタクトから入手可能である。Valentina Tremaroli, Heiko Kuhn, Zakarias Gulic, Oskar Persson, and the Center for Cellular Imaging at the University of Gothenburgに感謝する。G.M.H.B.は、スウェーデン研究評議会（2018-02278）、国立アレルギー・感染症研究所（5U01A1095545-08）、分子・トランスレーショナル医学ワレンバーグセンターから支援されました。B.O.S.は、Human Frontier Science Program (LT000109/2014-L), Swedish Research Council (2018-02095).and Laboratory for Molecular Infection Medicine Sweden (MIMS) -The Nordic EMBL Partnership for Molecular Medicine at Umeå University, Swedenから支援を受けている。S.K.L.は、スウェーデン研究評議会（2019-01152）、Cancerfonden（19 0301 Pj）、および抗生物質耐性防止財団からの助成金によって支援されています。
著者による貢献
コンセプト立案。G.M.H.B.、B.O.S.、F.B.、G.C.H.、方法論。方法論：G.M.H.B., B.O.S.; 調査・解析：G.M.H.B., B.O.S: G.M.H.B., B.O.S., S.S., L.A., C.V.R., M.V.S., K.T.H., F.P.B., B.Y.; Writing - Original Draft（原稿執筆）: 執筆-原案：G.M.H.B.、執筆-レビュー・編集：G.M.H.B: G.M.H.B., B.O.S., S.S., L.A., C.V.R., M.V.S., S.K.L., F.B., G.C.H.; Visualization: G.M.H.B.、監修・資金援助。G.M.H.B.、B.O.S.、S.K.L.、F.B.、G.C.H.
利害関係の宣言
著者らは、競合する利害関係を宣言しない。
補足資料
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表S3. SI5粘液とSI8粘液のプロテオーム比較、図6に関連
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記事情報
掲載履歴
オンライン公開 2023年2月6日
受理されました。2023年1月23日
改訂版受理 2022年12月12日
受理：2022年12月12日 2021年9月20日
身分証明書
DOI: https://doi.org/10.1016/j.celrep.2023.112084

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図のサムネイルfx1
図版の概要
図のサムネイル gr1
図1WSDによる空腸粘液バリア機能障害
図1WSDによる空腸粘液バリア機能障害
図2WSDによる粘液バリアー機能障害における微生物叢の役割
図1WSDによる空腸粘液バリア機能障害
図3WSDによる空腸粘液凝集の誘導
図サムネイルgr4
図4遺伝的あるいは食事により誘発された粘液の乱れは、空腸のC. rodentium感染に対する感受性を高める
図3.gr5
図5空腸粘膜の微生物叢コロニー形成は無傷の粘液層に依存している
図1-6.
図6空腸・回腸粘液ニッチにおける微生物と宿主の因子
図サムネイルgr7
図7C. rodentiumに対する感受性の媒介となる空腸の微生物叢
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