乳酸菌のゲノムワイド代謝ランドスケープの系統的評価により、食餌および菌株特異的なプロバイオティクスの特異性が明らかになった

2024年1月27日 20:11

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記事|41巻、10号、111735、2022年12月06日

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乳酸菌のゲノムワイド代謝ランドスケープの系統的評価により、食餌および菌株特異的なプロバイオティクスの特異性が明らかになった

https://www.cell.com/cell-reports/fulltext/S2211-1247(22)01613-8?_returnURL=https%3A%2F%2Flinkinghub.elsevier.com%2Fretrieve%2Fpii%2FS2211124722016138%3Fshowall%3Dtrue

ロカナンド・コドゥル 5
メイヤッパン・ラクシュマナン 5
イー・チン・リー
マズリナ・バヌ
デイブ・シアク・ウェイ・オウ
ドン・ユップ・リー 6
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脚注を表示オープンアクセスDOI:https://doi.org/10.1016/j.celrep.2022.111735
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ハイライト

個別化されたプロバイオティクスの選択と設計のための合理的な枠組みを提示する

プロバイオティクスの能力を評価するためのマルチオミクスデータと代謝モデリングの統合

プロバイオティクスのコロニー形成とポストバイオティクスの可能性における食餌特異的パターンを解明する。

L.カゼイは調査したLABの中でより望ましいプロバイオティクス特性を示すことが判明した。
まとめ
乳酸菌（LAB）はヒトに健康効果をもたらすことがよく知られているが、その機能的代謝ランドスケープは未解明である。ここでは、マルチオミクスとインシリコモデリングを組み合わせることで、代表的な6種類のLABの増殖、腸内持続性、ポストバイオティクス生合成の違い、および11の食事レジーム下における15種類の腸内細菌との相互作用を解析した。LABの短期持続性と常在菌との相互作用に関する予測は、セカルマイクロバイオームの存在量と使用済み培地実験を用いて確認した。解析の結果、プロバイオティクスの特性は食餌および種特異的であり、ゲノム解析だけでは説明できないことがわかった。例えば、Lacticaseibacillus caseiとLactiplantibacillus plantarumは、多様な能力を持つ同程度のサイズのゲノムをコードしているが、L. caseiはより望ましい表現型を示す。さらに、「高脂肪／低炭水化物」食は、ほとんどのLABにとって有害な結果をもたらす可能性が高い。これらの結果を総合すると、プロバイオティクスは "一長一短 "の健康補助食品ではなく、個別化されたプロバイオティクス設計の基礎を築くものであることが明らかになった。
図解抄録
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キーワード
乳酸菌
スマート・プロバイオティクス
システム生物学
高脂肪食
微生物間相互作用
腸内持続性
ポストバイオティクス
ゲノムスケール代謝モデル
マルチオミクス
化学培地
研究テーマ
CP: 代謝
はじめに
乳酸菌（LAB）は、主に六糖類を乳酸に発酵させる好気性のグラム陽性菌の一群を指す2。LABには、エンテロコッカス属、ラクトバチルス属（この属は最近、他の25属に再分類された3）、ラクトコッカス属、ロイコノストック属、オエノコッカス属、ペディオコッカス属、ストレプトコッカス属があり、機能的には、糖質異化から生じる発酵産物によって、ホモラクティック、通性ヘテロラクティック、義務的ヘテロラクティックの3つの主要な発酵グループに分類される4。LABはヒトの食物生息域に常在する種であり、乳環境、野菜、肉などの栄養豊富な様々なニッチに偏在している5。さらに、大腸や小腸、結腸粘膜層におけるヒトマイクロバイオームの一部を構成し、宿主や他の微生物叢との複雑な分子クロストークを示すことで、以下のようないくつかの有益な健康効果をもたらしている、抗菌作用、6,7,8,9 免疫調節作用、サイトカイン刺激作用、10,11 フリーラジカル消去作用、12,13 抗腫瘍作用などである。
Lactiplantibacillus plantarum（旧Lactobacillus plantarum）、Ligilactobacillus salivarius（旧Lactobacillus salivarius）、Lacticaseibacillus casei（旧Lactobacillus casei）などの特定のLABは、一般的にプロバイオティクスとして使用されているが、その有益な効果は、種、属、株によって大きく異なる可能性がある。いくつかの研究では、in vitroとin vivoの両方の実験によって、そのばらつきが広く実証されているが、18,19,20,21,22,23,24,25 また、様々な菌株や種でさえも、相応の健康促進効果が少ないという報告もある26,27,28,29。このような相反する観察結果は、評価方法の違いや作用機序の違いなど、無数の要因に起因している可能性がある。例えば、胆汁耐性30や粘膜接着性31,32のような有益な作用の中には、属を超えて共通するものもあれば33、生理活性化合物の合成、すなわちポストバイオティクスのような、ニッチまたは菌株に特異的なものもあるかもしれない。したがって、LABのユニークな代謝能力を総合的に調べ、その栄養嗜好性とポストバイオティクス生合成機能を文脈特異的に明らかにすることは、非常に重要である。この点に関して、現在1,000株以上のLABの全ゲノム配列が入手可能であるにもかかわらず34,35、栄養摂取や様々な抗微生物物質を生産する能力における多様性を示唆する比較ゲノム解析は、限られた数しか行われていない2,36。ここでは、比較ゲノム解析、トランスクリプトーム解析、インシリコモデリングに基づく統合的なフレームワークと、新たに調製した化学的定義培地（CDM）から得られた増殖および生化学的プロファイルを用いて、属、種、発酵グループの異なる6つの代表的なLABのゲノムワイドな機能代謝能力を系統的に評価した。続いて、プロバイオティクスを与えたマウスとLAB-腸内常在菌の共培養実験から得られた短期間の腸内持続性データを用いてインシリコ予測を検証したところ、その予測は非常に一貫していることが確認された。このような比較解析により、様々な食餌体制下におけるLABと一般的な腸内常在微生物および病原性微生物との相互作用の可能性と、プロバイオティクスの決定要因を明らかにすることができる。
結果
LABの比較ゲノム解析により、プロバイオティクス能力の汎ゲノム基盤が明らかになった
LAB間でプロバイオティクスの特性がどのように異なるかを理解するため、代表的な6株、L. plantarum WCFS1株（LbPt）、L. casei subsp. casei ATCC 393株（LbCs）、L. salivarius ATCC 11741株（LbSv）、Limosilactobacillus fermentum（旧Lactobacillus fermentum）ATCC 14931株（LbFm）、Lactococcus lactis subsp. cremoris NZ9000 (LcLt)、およびLeuconostoc mesenteroides subsp. mesenteroides ATCC 8293 (LeMt)を、異なる属から集め、異なる種および多様な発酵グループにわたるLABの広い範囲をカバーするようにした。旧ラクトバチルス属のメンバーの多くはプロバイオティクスとして確立されているが、ここでは種の多様性という点で良いバランスを提供するために、LABの他のよく研究されている属、ロイコノストック属とラクトコッカス属から代表的なものをあえて選んだことに留意されたい（図1A ）。まず、ここで検討した6種すべてのシングルコピー・コア遺伝子ファミリーを用いて、他の4種のLABとアウトグループである枯草菌（BcSt）の系統樹を構築した（STAR Methods参照）。驚くことではないが、Lactobacillus属の3株は一緒にクラスタリングされているのに対し、LbCsは別のサブクレード内に配置されている（図1B）。このことは、Lactobacillus属が多系統であるという従来の観察結果を裏付け、LAB種の遺伝的多様性が顕著であることを強調している2。このような多様性のため、近年、ラクトバチルス属の全種は25属に分類し直され、その中には23の新規属が含まれている3。
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図1乳酸菌株のゲノム特性、増殖特性、発酵表現型
キャプション
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LbPtとLbFmのゲノムサイズはそれぞれ最大（3.84 Mb）と最小（1.86 Mb）であり（表S1）、これはプロバイオティクス形質が異なる可能性を示している。LABのゲノムカタログが互いにどのように異なるかを包括的に特徴づけるために、次にオーソログ遺伝子に基づいて遺伝的冗長性を定量化した（STAR Methods参照）。全LABから得られた合計13,412遺伝子のうち、11,068遺伝子（82.5%）が他の生物種にオルソログを持ち、2,386のオルソログ遺伝子ファミリーグループ、あるいは単に「オルソグループ」として知られるグループに分類される（表S1）。549のシングルコピー遺伝子を含む、合計691の "コア "遺伝子ファミリーがすべてのLABに存在する。少数のLABで共有される1,455の「シェル」遺伝子ファミリーと2,585の「クラウド」遺伝子ファミリーも同定され、ゲノムサイズが小さいにもかかわらず、並外れた遺伝的多様性が強調された（図1C）。また、同定されたさまざまなオルソグループの78％がLbPtに存在したことから、この菌株が最も多様性に富んでいることが示唆された（表S1）。また、LbPt株では重複遺伝子が34%と非常に多く同定され、他のLAB株（18%-25%）と比較してゲノムの冗長性が高いことが示された。コアゲノム、クラウドゲノム、シェルゲノムの機能アノテーション（STAR Methods参照）により、翻訳、リボソームの構造と生合成、複製（2%と1%に対して19%）、翻訳後修飾、タンパク質のターンオーバー、シャペロン（2%と1%に対して4%）などのハウスキーピングプロセスが、クラウドゲノムやシェルゲノムに比べてコアゲノムで非常に濃縮されていることが浮き彫りになった（図1D）。さらに、エネルギー代謝、脂質代謝、ヌクレオチド代謝など、いくつかの代謝経路はLAB種間で高度に保存されていた。一方、雲ゲノムおよび殻ゲノムでより濃縮された機能性には、炭水化物、アミノ酸、無機イオン、補酵素、その他の二次代謝、および "転写 "や "機能不明遺伝子 "のようないくつかの非代謝性カテゴリーが含まれる。クラウドおよびシェルゲノムにおける代謝遺伝子、特に炭水化物代謝とアミノ酸代謝の顕著な濃縮は、ミルク、植物、動物などの栄養環境への優先的適応の違い37,38,39や、プロバイオティクス能力の違いを突き止めるものである40。さらに、LABのクラウドおよびシェルゲノムにおける "機能不明遺伝子 "カテゴリーの遺伝子ファミリーの高い割合（806/900）は、現在の理解におけるギャップと、そのような遺伝子の包括的な機能アノテーションの必要性を示唆している。
代謝の柔軟性とは別に、LABは酸、酸化、胆汁のストレスに抵抗するため、抗菌活性を付与するため、タンパク質を溶解するプロテアーゼのため、宿主の粘膜層表面に細胞を固定するためなど、様々なタンパク質を合成する。これらのタンパク質はすべて、プロバイオティック生物がヒトの腸内の過酷な環境に定着し、それを維持するために不可欠なものであるため、我々は6種のLABすべてのゲノムを調査し、関連タンパク質を同定した（STAR Methods参照）。注目すべきは、全てのLABが複数の細胞接着因子をコードしていることである。ストレス抵抗性のカテゴリーでは、全てのLABが少なくとも1つのタンパク質をコードしているが、中には2つ以上のタンパク質を持つものもある（図1E）。例えば、LbPtゲノムには5種類の胆汁耐性遺伝子と4種類のユニークな酸耐性遺伝子が含まれている。多くのLABはまた、バクテリオシンとして知られる抗微生物ペプチドを産生・分泌する。バクテリオシンは3つのクラスに大別できる：(1)クラスIバクテリオシン、小さな熱安定性翻訳後修飾ペプチド、(2)クラスIIバクテリオシン、小さな熱安定性翻訳後非修飾ペプチド、(3)クラスIIIバクテリオシン、やや大きな熱-難燃性安定ペプチド41。クラスIIバクテリオシンをコードする遺伝子は、LbPtで8個、LeMtとLbCsで各1個同定された（図1E）。また、LbSvにはクラスIIIのバクテリオシンをコードする潜在的な遺伝子も同定された。乳環境中のカゼインペプチドをより短いペプチド／アミノ酸に切断して栄養源として利用する細胞外皮プロテアーゼ（CEP）を放出する能力も、ほとんどのLABの主要な特性である。さらに、いくつかのLABのCEPは、炎症性メディエーターに作用することにより、炎症性腸疾患を変化させることが示されている。そこで、我々は全てのLABゲノムを調査し、全てのLABが少なくとも一つのそのようなCEPを産生する可能性があることを同定した（図1E）。
LABの増殖特性やその他の表現型を偏りなく評価するための、化学的に定義された新規培地の開発
試験したすべてのLABの生育をサポートするCDMを新たに処方した。このような新規なCDMの設計は、一般的にいくつかの栄養素、特にアミノ酸とビタミンに対して補助栄養性である6つのLAB株すべての偏りのない包括的な代謝特性評価を可能にするために非常に必要である。ここで、M17やラクトバチルス・ブロスのような豊富な栄養培地はLAB株の生育をサポートするかもしれないが、そのような培地中の化学的に定義されていない成分は、バッチ間のばらつきや基質／生成物の測定に不確実性をもたらす可能性があることを強調しておく。しかし、この培地はLcLtとLbSvの増殖にしか対応できなかった。しかし、この培地ではLcLtとLbSvの増殖にしか対応できなかった。そこで、各LABの既知の増殖要求量に基づき、いくつかの主要代謝産物を含ませることで、LABの無制限増殖のために反復的に改良した（以下、LAB定義培地（LABDM）と呼ぶ）。重要な点は、LABDMに含まれるビタミンや微量塩などの微量栄養素を、酵母の培養に広く使用されている市販の微量栄養素製剤である酵母窒素ベース（YNB）に置き換えることで、複数の微量栄養素を調製する必要性をなくしたことである。YNBを最適に添加することで、ほとんどのLAB株でラグフェーズを最小限に抑え、適切な生育が確認された（STAR MethodsおよびTable S2参照）。
次に、LABDMでLAB株を培養し、嫌気条件下でのバッチ増殖特性を評価した。ほとんどの菌株は同程度の速度で増殖したが、LbSvとLeMtは他のLABに比べて増殖が非常に遅かった（図1F-1IおよびS1A；fold change <0.75；p値=0.007、Kruskal-Wallis検定）。また、LABDM中のグルコースやアミノ酸などの主要栄養素、および一次副生成物であるL-乳酸や酢酸の濃度を、指数期にわたってモニターした（図S1BおよびS1C）。グルコースからのバイオマス収量は、LcLt、LbSv、LeMtがわずかに低かったものの、LAB間で有意差は認められなかった（図1H；p値=0.033、Kruskal-Wallis検定）。グルコースからのL-乳酸産生量に関しては、LcLtとLbPtは他のLABよりもほぼ2倍高い乳酸産生量を示した（図1I；p値＝0.0065、クラスカル・ワリス検定）。
LABのゲノムワイド・トランスクリプトーム配列決定により、分類群に関係なくユニークな遺伝子発現プロファイルが明らかになった。
様々な分類群間のゲノムワイドな転写制御についてより深く洞察するために、LABDMで増殖させた全株から指数関数期中期のRNAを収集し、RNA-seqを行った。最初に、様々な発現範囲に該当する遺伝子の分布を分析することで、グローバルな遺伝子発現プロファイルを比較した。LbSvとLbFmは低発現レベルの遺伝子が多く、LbPt、LbCs、LeMtは高発現範囲にやや偏った遺伝子発現分布をしている（図2A 、表S3、図S2）。その後、これらの遺伝子発現カテゴリーにおける非教師付きオーソロググループ（NOG）用語の濃縮解析（STAR Methods参照）を行ったところ、高発現範囲にハウスキーピング機能、すなわち翻訳、リボソーム構造、生合成（偽発見率[FDR]調整p値＝8.830×10-30-1.805×10-17、フィッシャーの正確検定）が同定された（図2B）。また、特にLbPt、LbCs、LcLtでは、低発現域で糖質輸送と代謝が有意に濃縮されており（FDR調整p値=1.341×10-10-3.128×10-7、フィッシャーの正確検定）、ゲノムの大きいLABの代謝は重要な転写制御下にある可能性が示された。注目すべきは、機能未知の遺伝子が広範囲に発現していることで、LABの表現型を支配する遺伝子の役割をさらに明らかにする必要がある。
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図2LABDMで指数関数的に増殖するLABのトランスクリプトーム特性
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グローバルなトランスクリプトーム解析に加えて、まず549の1-1オルソログ（195の代謝遺伝子を含む）を同定し、種特異的なバイアスを補正するためにハウスキーピング遺伝子のセットを用いてそれらの正規化発現値を調べることにより、種間のトランスクリプトームランドスケープと様々な代謝およびプロバイオティクス能力に対するそれらの素因を比較した（STAR Methodsおよび図S3参照）。これらの遺伝子の発現プロファイルを、2つの個別かつ相補的な指標を用いて解析した：(1)主成分分析（PCA）と(2)ペアワイズでの相関。驚くべきことに、遺伝子発現パターンは、LbSvとLbCsのような系統的に近い種間では著しく異なるが（スピアマン相関、r = 0.673）、LbFmとLcLtのような遠い種（スピアマン相関、r = 0.96）では非常に類似している（図2Cと2D）。発現量の異なるオルソログ遺伝子を階層的にクラスタリングした結果、9つの主要なグループが得られ、各クラスタは主に特定のLABで発現量が増加した遺伝子で表された（図2E）。これらの遺伝子における機能カテゴリーの濃縮により、炭素代謝や、DNA複製（FDR調整p値=3.162×10-17、修正フィッシャーの正確検定）、リボソームとDNAミスマッチ修復（FDR調整p値=0. 0031、修正フィッシャーの正確検定）は、LbPt、LbCs、LcLtのようなゲノムの大きいLABで発現が増加し、なぜこれらの種が他の種よりはるかに速く成長するのかのさらなる証拠となった（図2FとS4）。LeMtは、嫌気性呼吸（FDR調整p値=0.0034、フィッシャーの正確検定）、すなわちF1ATPaseとメナキノン生合成の遺伝子発現が高く、先に報告されたように、酸化還元制御代謝が迅速な成長を支配していることを示している43。
各LABの転写制御は、系統的に近い種間でも有意に異なるため、さらに代謝遺伝子発現に着目してPCAを行った。第1および第2PCはそれぞれ約32％と25％の変異を占め、増殖に関連する機能カテゴリー（代替炭素代謝、アミノアシルtRNA生合成、ヘテロ乳酸発酵、酸化的リン酸化、デンプンおよびスクロース代謝）と生理活性物質の生合成（プロトン酸代謝、ブタン酸代謝、リポテイコ酸生合成、ビタミン代謝）が大きく寄与している（図2G-2I）。これらの結果は、LAB間の遺伝子発現のばらつきは、分類学的な違いよりもむしろ、様々な環境に適応し、関連する生物活性化合物を生産する能力によって、よりよく捉えることができることを明確に示唆している。
LABのゲノムスケール代謝モデルでは、一次代謝の宿命として低エネルギー生産経路の利用が強調されている。
比較ゲノム解析の結果、LABの代謝および生理学的能力がこれまでにないほど多様であることが明らかになったので、まずLbPt、44 LcLt、45 LeMt43の既存のゲノムスケール代謝モデル（GEM）を、更新されたゲノムアノテーションに基づいて更新し、その範囲とカバレッジを大幅に改善した（図S5）。さらに、LbCs、LbFm、およびLbSvについて、標準的な手順46（STAR Methods参照）に従って新しいGEMを再構築し、6つのLABの機能的代謝状態をさらに調べた。得られたGEMは、平均で686±139遺伝子、1,042±65反応、906±29ユニーク代謝物を含んでおり、LbFmとLbPtがそれぞれ最小モデルと最大モデルであった（表S5）。
GEMの再構築に続いて、LABDMで培養したLABのバッチ培養データを用いてモデル予測値を検証した（STAR Methodsおよび表S4参照）。フラックスバランス解析（FBA）により予測されたin silicoの初期増殖速度は、実験的に測定されたものと同程度であった。しかしながら、ほとんどのLABモデルは乳酸分泌のシミュレーションに失敗し、代わりに他の発酵産物（例えば、酢酸、エタノール、ギ酸、アセトイン、ジアセチル）を放出した。このことが、LABの表現型を正確に予測するために、さらなる動力学的制約を組み込む動機となった。この点に関して、高分子クラウディング制約を追加したFBAの実装（FBAwMC）は、Escherichia coliにおける低収量の酢酸オーバーフロー47、がん細胞におけるWarburg効果48,49、Saccharomyces cerevisiaeおよびLcLtにおける低収量代謝と高収量代謝の切り替えにおける酸化還元補因子の役割50を記述するのに成功したと報告されている。そこで我々は、各LABの機能的代謝状態を調べるために、実験的に測定されたクラウディング係数を用いたFBAwMCに基づくアプローチを開発した（STAR Methods、表S6；図S6とS7参照）。驚くべきことに、予測された増殖速度および乳酸分泌速度は、培養実験と高い一致を示した（ピアソン相関、r > 0.85; 図3Aおよび3B ）。したがって、低エネルギー収量経路の使用が優勢であることが、LABの特徴であることが確認された44,51。
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図3LAB GEMの表現型予測
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次に、検証されたLABモデルを用いて、LABDM条件から得られた細胞内フラックス分布を調べることにより、中枢代謝における主要な違いを特徴付けた（図3C）。予想通り、エムデン-マイヤーホフ経路（EMP）は、グルコース-6-リン酸の形の一次炭素が2molの乳酸に完全に分解されるホモ発酵性グループに属するLcLtで活性であることが判明した唯一の解糖経路である。偏性ヘテロ発酵LAB（LeMtとLbFm）は、グルコース代謝にEMPの代わりにホスホケトラーゼ経路（PKP）を積極的に利用した。この経路は、1molのグルコース-6-リン酸を同量のアセチル-リン酸とグリセルアルデヒド-3-リン酸に代謝し、乳酸とともに酢酸やエタノールなどの発酵副生成物をもたらした。通性ヘテロ発酵LABであるLbPtは、EMPとPKPの両方を通過するフラックスを持ち、その結果混合酸生成物を生成した。他の生成物に対する乳酸の割合は、EMPを通過するフラックスとPKPを通過するフラックスの比率に依存する。トリカルボン酸（TCA）サイクルのフラックスは、経路活性に不可欠な複数の酵素が存在しないため、すべてのLABでほとんど存在せず（図3C）、LABは好気呼吸をしないというよく知られた事実に合致している52。しかし、分類学的な割り当てによれば、それぞれ通性ヘテロ発酵性グループとホモ発酵性グループに属するはずのLbCsとLbSvで、経路活性の例外が観察された。これらの不一致をさらに調べるために、LAB GEMが、環境中の酸素利用可能性の関数として既知の発酵プロフィールをシミュレートする能力を、3つの主要なグループ、すなわちホモラクティック、通性ヘテロラクティック、義務的ヘテロラクティックへの機能分類によって評価した。LeMtとLbFmモデルは、無酸素状態では高乳酸と高エタノールから、高酸素状態では高乳酸と高酢酸に切り替わるという、義務的ヘテロ発酵グループ43のよく知られた発酵プロフィールをうまく再現することができた。しかし、LcLtモデルでは、EMPへの単独依存性、すなわち偏性ホモ発酵代謝と一致する、乳酸のみを生産する発酵プロフィールが得られた。LbPt GEMによるシミュレーションでは、酸素の利用可能性に依存しない混合乳酸-酢酸プロフィールが示されたが、これは主にEMPとPKPの両方を利用できる柔軟性に起因する（図3D）。興味深いことに、カゼイ菌は通性ヘテロ発酵菌に属するが、LbCsはLcLtで観察されたようなホモ発酵性代謝プロフィールを示すことが観察された。さらに文献調査を行ったところ、この研究で使用した特定の菌株、すなわちATCC 393は、PKPをコードしているにもかかわらず、ホモ発酵性表現型を示すことがわかった53。同様に、LbSvがLABのホモ発酵性グループに属することが知られているにもかかわらず、我々のシミュレーションでは、トランスケトラーゼ反応を介した過剰なペントースリン酸経路（PPP）フラックスにより、かなりの量の乳酸と酢酸が生成されることが示された。これは、LABが高いPPPフラックスを持たないというよく知られた事実に反する。そこで、RNA-seqデータを用いて、異なるLAB間でトランスケトラーゼの遺伝子発現レベルを比較したところ、LbSvとLbFmではトランスケトラーゼの発現レベルはごくわずかであった。その後、シミュレーション中にLbSvとLbFmのGEMでトランスケトラーゼ反応、すなわちTKT1とTKT2を不活性化した。LbFmのプロフィールはこの不活性化の影響を受けなかったが、LbSvは無酸素状態ではホモ発酵性代謝を示し、酸素供給量の増加とともに混合発酵性プロフィールを示した。これは以前の報告と一致している54,55。
LAB GEMの比較により、多様な代謝レパートリーと栄養補助要求性の違いが明らかになった。
ゲノムワイドなリアクトームに基づいて計算された2つのGEMのペア間の代謝距離を用いて、LAB GEMを比較したところ、すべてのLactobacillus株が分類学的に離れたLeMtとLcLtよりも多くの反応を共有していることが観察された（図4A ）。さらに、"コア"（6つのGEM全てに存在する反応）と "クラウド"（1つのGEMに存在する反応、あるいは数種類に存在するが全てには存在しない反応）の代謝レパートリーを同定し、全反応の49％が保存されていることを見出した。リアクトームで高度に保存されている代謝サブシステムは、アミノアシルtRNA生合成（100％）、リジン生合成（84％）、ペプチドグリカン生合成（78％）、グリセロリン脂質代謝（72％）、脂肪酸生合成（68％）である。一方、クラウドリアクトームの大部分は炭水化物とアミノ酸の代謝で占められており、比較ゲノム解析によって明らかになったように、LABは様々な栄養素を異化する能力において高い多様性を持っていることが確認された。
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図4GEMにより明らかになったLABのコア代謝能力とクラウド代謝能力
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次に、LABの一部が特定の栄養素に対して従属栄養である理由を解明するために、LABの様々なアミノ酸やビタミンを生産するための適切な生合成酵素の利用可能性を調べた（図4B）。すべてのLABの中で、LeMtはほとんどすべてのアミノ酸の生合成酵素を含むため、グルタミン酸を除くすべてのアミノ酸に対して従属栄養ではない。多くのLABが3つの分岐鎖アミノ酸、すなわちイソロイシン、ロイシン、バリン全てに従属栄養であることはよく知られている56,57,58。これに対応して、2-(S)-アセト乳酸を(R)-ジヒドロキシイソバレレートに変換する酵素ケトール酸レダクトイソメラーゼをコードする重要な遺伝子（ilvC）が、LeMtとLcLtを除く全てのLABで欠損していることがわかった（図4C）。すべての生合成遺伝子が存在するにもかかわらず、LcLtはバリンとイソロイシンに従属栄養であることから、これらの遺伝子の一部が発現していないか、不活性である可能性が示された。一部のLABは、芳香族アミノ酸（AAA）、フェニルアラニン、トリプトファン、チロシンに対しても従属栄養であった。これは、コリスメート（AAA前駆体）合成の主要遺伝子である3-デオキシ-7-ホスホヘプツロナーゼ合成酵素をコードするaroHが欠損しているためである。ビタミンの面では、6つのLAB全てが、NAD(P)生合成の重要な前駆体であるニコチン酸を合成できず、細胞増殖に必須であるため培地から摂取する必要がある。葉酸は、デノボヌクレオチド生合成に必要なもう一つの重要なビタミンである。いくつかのLABは、ジヒドロテロエート合成酵素をコードするfolP遺伝子がないため、このビタミンを合成できなかった（図S8）。興味深いことに、LeMtを除くすべてのLABは、パントテオン酸（CoA前駆体）とビオチン（アセチル-CoAカルボキシラーゼ補酵素）の生合成の最終段階を担う酵素をコードするpanC遺伝子とbioD遺伝子もそれぞれ欠損しており、脂肪酸代謝に重要なこれらのビタミンを合成することができない。さらに我々は、遺伝子発現データを用いて、あるLABが他のLABより低濃度のビタミンを必要とする理由を解明した。そのために、ビタミン補助栄養データとビタミン生合成経路の対応する遺伝子発現の平均Zスコアを組み合わせた指標を用いた。その結果、LbCs、LbFm、LbSvは、LbPt、LcLt、LeMtに比べて、ビタミン生合成の補助栄養加重Zスコアが全体的に低いことがわかった（表S7）。これはCDM最適化反復中に得られた観察結果（表S2）と一致しており、LbCs、LbFm、LbSvは一般的にLbPt、LcLt、LeMtと比較して、最適生育のために高いビタミン濃度を必要とした。また、LABの様々な炭水化物を発酵させる能力についても調べたところ、すべての乳酸菌株が六糖、五糖、二糖、三糖など多様な糖を代謝できるのに対し、LeMtとLcLtの能力は限られていた（図4D）。
LAB GEMのインシリコ解析は、プロバイオティクスの持続性とポストバイオティクス合成における食餌特異的パターンを明らかにした。
以前、いくつかのコホート研究が、腸内細菌叢の組成は民族や地理的な構成よりも食習慣に敏感であることを報告している59,60,61。同様に、我々は、いくつかのプロバイオティクスは、特定の食餌においてより良く生存し、有益な化合物を産生する可能性があるという仮説を立て、これをインシリコで検証した。ベジタリアン、ビーガン、EU平均、地中海、DACH、高タンパク質、グルテンフリー、高繊維質、糖尿病、高脂肪・低炭水化物、高脂肪・高炭水化物など11種類の食事条件下におけるLABのプロバイオティクス能力を、モデル駆動型解析（STAR Methods参照）を用いて調べた。その結果、成長パターンは食餌特異的な表現型が非常に明瞭であった：ほとんどのLAB、特に偏性ホモ発酵菌は糖尿病食と高繊維質食を好んだが、高脂肪食ではすべてのLABが非常に低い成長率を示した（図5A-5FおよびS9; p値 < 1 × 10-150, Kruskal-Wallis検定）。高繊維食や糖尿病食は通常、イヌリンタイプのフラクトオリゴ糖が豊富で、（ホスホ）フラクトフラノシダーゼ（BfrAまたはSacA/ScrB）酵素が関与する高ATP産生経路で異化されるため、増殖率が上昇するのである62。我々はさらに、異なるLABの全食餌において、各交換反応の減少コスト63を計算することにより、異なる食餌がLABの増殖にどのような影響を与えるかを評価した（STAR Methods参照）。この解析から、高繊維食や糖尿病食のような食餌に含まれる栄養素の減少コストと取り込みフラックスは、ほとんどのLABの増殖に有利であることが示されたが、高脂肪／低炭水化物食では最も不利であった（表S8）。高脂肪／低炭水化物食は脂肪酸含量が高く、LbCs、LcLt、LeMtは脂肪酸トランスポーターを通してごく少量摂取し、細胞膜に取り込まれた。一方、LbSv、LbPt、LbFmはそのようなトランスポーターを持たないため、脂肪酸を消費しなかった。さらに、すべてのLABはβ-酸化などの脂肪酸異化経路を持たないため、脂肪酸からエネルギーを得ることができない64。これらを総合すると、高脂肪／低炭水化物食（表S4）では、容易に代謝可能なエネルギー源、すなわち炭水化物の割合が低いことが、LABの成長不良の一因となっている。また、異種発酵LAB（LbFmとLeMt）の増殖速度が、異なる飼料間でほとんど変化しないことが観察されたが、これは主に、多様な炭水化物から同レベルのATPを生成する、堅くて収率の低いホスホケトラーゼ経路を使用することと、アミノ酸を代替エネルギー源として利用する能力が限られているためである43。まとめると、我々のインシリコシミュレーションの結果は、高繊維食がプロバイオティクスの成長と機能性を促進する一方で、高脂肪食はパフォーマンスの低下につながることを示しており、これは以前に発表された臨床データと高い一致を示している65,66,67。
図サムネイルgr5
図5インシリコでシミュレートされたLABの食事依存性プロバイオティクス特性
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有益な効果をもたらすためにプロバイオティクスが腸内に持続することが不可欠であるかどうかはまだ議論されているが68、滞留性と体力の増加は、望ましい免疫調節と病原体排除に十分な時間を提供することができる。プロバイオティックLABでコロニー形成されたブタとマウスが、それぞれより優れた免疫調節効果69とサイトカイン刺激70を示すことが、以前に示されている。71,72,73,74実際、腸内環境に定着して持続するプロバイオティクスの中には、抗生物質耐性など、本質的にストレス耐性を持っているものもある75,76,77,78,79。さらに、環境ストレスに抵抗する能力は、菌株におけるドミナントポジティブなエピスタティックランドスケープの存在と関連していることが広く報告されている。これらからヒントを得て、異なる食餌条件下でLAB GEMの全反応ペア間の正のエピスタシスの有病率を調べた（STAR Methods参照）。これらのシミュレーションから、もともとヒト環境から分離されたLbCsとLbSvは、正のエピスタシスの有病率が高いことが示された（図5G）。インシリコで推定された正のエピスタシスの有病率が、プロバイオティクスの腸内生存率を予測する指標となるかどうかを評価するために、関連するマウス実験を行った（STAR Methods参照）。各プロバイオティックLAB株を摂取させたマウスおよび対照群（すなわち、プロバイオティックサプリメントなし）の腸管盲腸からサンプルを採取し、マイクロバイオームシークエンシングを行った。16S rRNAシークエンシングからアノテーションされた操作菌株ユニットの存在量の差分析から、プロバイオティクスを与えたマウスでは、対応するLABの量が有意に多く（コントロールの量と比較；表S6）、2週間の介入期間中、LABが腸内環境に持続していることが明らかに示された。さらに、プロバイオティクスLABを与えたマウスにおけるLAB種の存在量のコントロールマウスのそれに対する倍数変化とポジティブエピスタシスの有病率のシミュレーションとの間に有意な正の相関（スピアマンの順位相関、r = 0.9078；図5H）が観察され、プロバイオティクス種の短期的な腸内生存を推測するために提案された指標の有用性が強調された。特に、LbSv株とLbCs株を与えたマウスは、他のLAB株よりもマウスの腸内に留まることができたが、LcLt株は腸内に留まる能力が限られていた（log2FC(LbSv)=8.89、log2FC(LbCs)=7.67、log2FC(LcLt)=0.76）。この観察はシミュレーションと一致していた。これらのエピスタシス反応ペアの代謝サブシステムをさらに解析したところ、バイオマス形成に必須な反応が有意に濃縮されていることがわかった（表S9）。さらに、ペプチドグリカンの生合成やポリケチド糖単位の生合成87など、腸内環境におけるプロバイオティクスの接着、生存、抗生物質耐性に関連する経路も有意に濃縮されており、おそらくポジティブ・エピスタティック・ランドスケープの存在が、腸内環境で持続する能力を菌株に付与していることを説明している。
次に、酪酸、プロピオン酸、酢酸などの短鎖脂肪酸（SCFA）など、健康に有益な生理活性化合物（ポストバイオティクス）を生産するLABの能力を評価した。そのために、バイオマスフラックスを達成可能な最大値の50%に制限しながら、様々なポストバイオティクス化合物の理論的な最大収量を計算した（詳細はSTAR Methodsを参照）。LABによって分泌される代謝物の中には、健康状態を悪化させるものもあることが知られている。例えば、リポテイコ酸（LTA）はTNF-α誘導のような炎症反応を促進する88。従って、宿主に対するLABの全体的な有益性は、有益な代謝産物と有害な代謝産物の産生バランスに依存する。LbPtとLcLtは、SCFA、アミノ酸、ビタミンなどの様々な有益なポストバイオティック化合物の生育に連動した生産量が、すべての飼料で比較的多い（図5I）。一方、LeMtとLbFmは比較的低レベルのSCFAを合成した。また、SCFA、ジアセチル、UDP-グルコース、UDP-ガラクトース、トリプトファンなど、ある種のポストバイオティクス生合成経路は、LbCsとLbPtでは高発現していたが、LbFmとLbSvでは発現が低下していた（表S8）。さらに、異なる食餌で観察された成長パターンと同様に、有益代謝産物の産生レベルは、炭水化物が豊富な食餌、例えばEU平均食、DACH食、高繊維食、糖尿病食では高く、高脂肪／低炭水化物食では低い。興味深いことに、ビーガン食、地中海食、糖尿病食のような植物性食では、いくつかのLABで一貫してビタミンの生産量が多かった。発酵経路における遺伝子発現のユニークなパターンがそれぞれのLABで観察されたので、トランスクリプトームデータに基づく追加的な制約条件を加えて、それらのポストバイオティクス生産能力を再度予測した。これらの新しいシミュレーションから、乳酸や酢酸のような一次代謝産物の生産は遺伝子発現に大きく影響されないが、LbCsやLeMtを含むいくつかの種では、他の代謝産物は転写産物レベルで部分的に制御されている可能性があることが示された（図S10）。ここで、我々はLABの生合成能力を分析したが、従属栄養分析（図4B）から示唆されるように、LABの一部は、他のLABによって合成された特定のアミノ酸やビタミンを含むポストバイオティクスも消費／分解する可能性があり、このことが有益な効果を部分的に損なう可能性があることに留意すべきである。
一般的な腸内微生物と相互栄養するLABの能力をインシリコで評価すると、常在菌種との良好な関係が明らかになった。
プロバイオティクスは、腸内細菌叢と選択的に相互作用し、その存在量を変化させることも示されている89,90。ここでは、プロバイオティクス（Bifidobacterium adolescentis）、常在菌（Akkermansia muciniphila、Bacteroides thetaiotaomicron、Escherichia coli W3110、Faecalibacterium prausnitzii、Roseburia hominis）、日和見病原体（Klebsiella pneumoniae、緑膿菌）、病原体（Salmonella enterica ser. Typhimurium, Shigella flexneri, Staphylococcus aureus）であった（STAR Methods参照）。インシリコシミュレーションによると、ほとんどのLABはF. prausnitziiやR. hominisのような常在菌の増殖を促進することができた（図6A ）。緑膿菌や黄色ブドウ球菌のような一部の病原菌では、LABは顕著な増殖促進効果を示さなかったが、肺炎桿菌や腸炎菌のような一部の病原菌では、ヌクレオシドやビタミンを交差供給することによって増殖を促進した。興味深いことに、すべてのLABの中で、LbCはB. thetaiotamicron、大腸菌、R. hominisなどのいくつかの常在菌の成長を促進する優れた能力を持っている。これらのシミュレーション結果をさらに検証するため、まず広範な文献調査を行い、LABが特定の常在菌と実際に正の相互作用を持つことを確認した。例えば、以前の研究で、LcLtとLactobacillus paracaseiの培養上清は、ビタミンB群と乳酸／酢酸を補充することによってF. prausnitziiの増殖を刺激することが報告されている91。しかし、LABとA. muciniphilia、B. thetaiotamicron、R. hominisなどの他の主要な腸内常在菌との間で同様の相互作用があるという証拠は見つからなかった。そこで我々は、LABとA. muciniphilia、B. thetaiotamicron、大腸菌、R. hominisとの相互摂食を評価するために、新たに細胞培養実験を行った（STAR Methods、図6B-6E参照）。実験的に評価された合計24の組み合わせ（6つのLAB×4つの常在菌）のうち、17の組み合わせがモデルの予測とよく一致した（マシューズ相関係数=0.40242）。実験観察と一致して、LbCsはB. thetaiotamicron、大腸菌、R. hominisを含む様々な常在細菌叢に対して最も優れた増殖促進効果を持つことがシミュレーションで示された。LABとこれらの種の間で交雑した代謝物の詳細な解析から、LbCsが分泌するピルビン酸、グリシン、乳酸、N-グルコサミンは常在菌にプラスの影響を与えることが示された（表S10）。シミュレーションでは、LbCがA. muciniphilaに対してわずかながらプラスの効果を示したが、実験では抑制効果が示された。このようなモデル予測と実験観察の不一致は、少なくとも2つの理由に起因すると考えられる：(1)細菌細胞に対する代謝毒性は代謝モデルでは説明できない、(2)LABによるバクテリオシンなどの抗微生物化合物の生産は代謝モデルでは把握できない。同様に、シミュレーションではLbPtが大腸菌の増殖を促進することが示唆されたが、我々の実験や先行研究92ではLbPtが大腸菌の増殖を抑制することが示唆されており、これはLbPtが複数のバクテリオシンを産生するLABの1つであることに起因している可能性がある。
図サムネイルgr6
図6他の腸内微生物に対するLABの交差摂食効果の可能性
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考察
従来のプロバイオティクスは、一般的に胃腸の健康を維持するための食品サプリメントとして開発されてきたが、次世代のプロバイオティクスは、様々な疾病状態に介入するための予防・治療手段を提供することが期待されている93。この点で、重要な課題は、マイクロバイオーム内およびマイクロバイオームとの相乗的相互作用に基づいて、コンビナトリアルプロバイオティクス処方を設計することである。さらに、ヒトの健康をターゲットとしたプロバイオティクスのスクリーニングと機能的分類のための合理的な枠組みは存在しない。従って、本明細書では、in silicoのモデルガイドアプローチを用いて有望な候補を選び出し、さらにin vivoで検証するためのファーストパス合理的スクリーニング方法を提供する。
ゲノムおよびトランスクリプトーム解析の結果、LbPtとLbCsは、酸、胆汁、酸化ストレスに対する抵抗性、バクテリオシンとCEPの産生、粘膜接着を介した消化管生存をサポートする機能的関連遺伝子の割合が高い共通のLABであることが示唆された。興味深いことに、どちらのLABも比較的大きなゲノムを持ち、偶然にも通性嫌発酵性グループに属している。もう一つの興味深い発見は、LABのクラウドとシェルゲノムが非常に多様であることで、特に炭水化物とアミノ酸の代謝に富んでいる。実際、我々のモデル駆動型解析では、高脂肪／低炭水化物（ケトジェニック）食はプロバイオティクスのパフォーマンスに劣り、イヌリンタイプのフラクトオリゴ糖が豊富な食が一般的に望ましいという、食餌特異的パターンが確認された。最近の臨床研究でも、高脂肪・低炭水化物食は腸内細菌叢の好ましくない変化と糞便中のSCFAsの減少を引き起こすことが示されており、これはプロバイオティクス細菌の除去に起因している可能性がある。このようなプロバイオティクスの合理的な投与は、生きたバイオ治療薬として使用する上で、より重要な意味を持つ。この点に関して、我々の結果はLbPt、LcLt、LeMtがポストバイオティクス産生能が最も高いことを示しているが、炎症性サイトカインの刺激に大きく関与するLTAの合成量も増加している88ため、炎症性腸疾患（IBD）患者に推奨する際には注意が必要である。LbCsは、IBDと強い逆相関があると報告されている2つの常在菌（A. muciniphiliaおよびF. prausnitzii）の増殖を選択的に促進し95、in vivoで優れた腸管蠕動能力を示すことから、我々のシミュレーションは、LbCsがIBDの治療／管理に有望なプロバイオティクス候補となる可能性も示唆している。また、LbCs株がIBDや大腸がんに対して一貫して抗炎症作用や保護作用を示すことも、先行研究で数多く報告されている96,97,98,99,100,101。しかし、LbPtとLeMtは、病原体と常在菌の増殖の両方と正の相互作用を示したため、消化管病原体を排除する自然な能力が一般的に制限されている免疫不全患者の治療には避けた方がよい102。これらの観察結果は、広く用いられている比較ゲノム解析と比較して、マルチオミクスに基づくシステムアプローチを採用することの利点を明らかに示している。特に、LbCとLbPtはより大きなゲノムをコードし、多様な機能を持つが、我々の解析では、LbCが有益なポストバイオティクス化合物を選択的に合成し、有益な常在菌の増殖を促進し、腸内環境で持続する優れた能力を持つことから、プロバイオティクスとしてより優れた機能特性を持つことが明らかになった。ここで、ポストバイオティクスの収量は、宿主に対する潜在的な利益の理論的推定値を提供し、菌株の優先順位付けに使用できることに留意すべきである。しかし、これらの推定値は、実験的／臨床的背景の違いによって異なる可能性がある。
したがって、ここでは、LbPt、LcLt、LbCsの3種のLAB菌株の代謝およびプロバイオティクス能力を評価し、このような違いが異なる種間で観察されるものと同程度かどうかを評価した。この目的のために、我々はまず、オーソログ遺伝子を用いて、代表的な菌株から対応する菌株特異的GEMを再構築した。さらに、各菌株固有のゲノムの含量を考慮して、各菌株固有のモデルをキュレーションした（詳細な再構築手順についてはSTAR Methodsを参照）。菌株特異的GEMの再構築に続いて、まず32種類の炭素基質の発酵能力と、20種類のアミノ酸と8種類のビタミンに対する補助栄養要求性を調べることにより、異なる菌株の代謝能力を比較した。その結果、菌株によって若干の違いはあるものの、他種の菌株よりも同種の菌株に類似していることが明らかになった（図7A ）。また、「EUの平均的な」食事において、異なる菌株がどのような性能を発揮するのか、ヒト腸内の他の代表的な生物種との細胞適合性や代謝的相互作用の観点からも比較した。同じ種の異なる菌株の達成可能な最大増殖率は非常に類似していたが（図7B）、これはおそらく、菌株固有の高分子組成データが利用できないため、菌株間で同じバイオマス係数を使用したためであろう。EUの平均的な食餌条件下でのポストバイオティクス生産能力に関しては、種間で比較した場合、菌株特異的な差はわずかであるが（図7F）、発酵グループへの依存性があることに気づいた。すなわち、義務的ヘテロ発酵LAB、すなわちLeMtとLbFmは、属は異なるものの、同等のポストバイオティクス生産能力を示しており、このような機能性を制御する上で、炭素中心代謝が支配的な役割を担っていることを示唆している。
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図7LABの代謝およびポストバイオティクス能力における菌株特異的変異
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研究の限界
(1)代謝モデルベースの解析では、宿主の遺伝、ライフスタイル、環境に関連する交絡変数が考慮されない。(2) ここで使用したプロバイオティクス菌株のゲノム品質にはかなりのばらつきがある。さらに、プロバイオティクスの評価項目の一部、例えば一過性菌株と持続性菌株が宿主の健康に及ぼす影響については、まだ不確かである。
このような限界はあるものの、本研究は、モデルガイドに基づいた適切なプロバイオティクスの選択のための基礎となるものであり、地域社会全体で十分に管理された臨床試験を予見する努力を行うことで、宿主の遺伝や実際の食生活など、臨床現場における交絡因子を考慮することで、さらに拡張することができる。全体として、提案されたアプローチは、従来のラクトバチルスやビフィドバクテリウムの種を超える複数の候補のプロバイオティクス能力の特徴付けを加速し、近い将来、個別化されたスマートなプロバイオティクスの合理的な設計を加速する態勢が整っている。
STAR★メソッド
主要リソース表
試薬またはリソースのソース IDENTIFIER
細菌およびウイルス株
ロイコノストック・メセンテロイデス亜種 ATCC 8293 ATCC 8293
ラクタセイバシラス・カゼイ ATCC 393 ATCC ATCC 393
ラクチプランタラム WCSF1 ATCC ATCC BAA-793
リギラクトバチルス・サリバリウス ATCC 11741 ATCC ATCC 11741
リモシラクトバチルス・ファーメンタム ATCC 14931 ATCC 14931
ラクトコッカス・ラクティス・サブスピーシーズ・クレモリス NZ9000 ボカ・サイエンティフィック ELS09000-01
アッカーマンシア・ムチニフィラ ATCC BAA-835 韓国株培養コレクション KCTC 15667
バクテロイデステタイオタオミクロン VPI-5482 韓国株培養コレクション KCTC 5723
大腸菌 W3110 韓国KCTC2223コレクション
Roseburia hominis A2-183 韓国クローンKCTC 5845
化学物質、ペプチド、組換えタンパク質
グルコース（Gluc） Sigma Aldrich Cat#G7021
L-ヒスチジン（His）Sigma Aldrich Cat#H6034
L-イソロイシン（Ile）Sigma Aldrich Cat#I7403
L-ロイシン（Leu）Sigma Aldrich Cat#L8912
L-メチオニン（Met）Sigma Aldrich Cat#M5308
L-バリン（Val）Sigma Aldrich Cat#V0513
L-アルギニン（Arg）Sigma Aldrich Cat#A8094
KH2PO4 シグマ・アルドリッチ Cat#P5655
K2HPO4 シグマアルドリッチ Cat#P5655
L-グルタミン酸（Glu） Sigma Aldrich Cat#G8415
L-フェニルアラニン（Phe）Sigma Aldrich Cat#P5482
L-プロリン（Pro）Sigma Aldrich Cat#P5607
L-アスパラギン（Asn）Sigma Aldrich Cat#A4159
L-アスパラギン酸（Asp）Sigma Aldrich Cat#A7219
L-グルタミン（Glx）Sigma Aldrich Cat#G8540
L-セリン（Ser）Sigma Aldrich Cat#S4311
L-スレオニン（Thr）Sigma Aldrich Cat#T8441
L-システイン（Cys）HCl Sigma Aldrich Cat#C7352
L-アラニン（Ala）Sigma Aldrich Cat#A7469
グリシン（Gly）Sigma Aldrich Cat#G8790
L-リジン（Lys）HCl シグマアルドリッチ Cat#L8662
L-トリプトファン（Trp）Sigma Aldrich Cat#T8941
L-チロシン（Tyr）Sigma Aldrich Cat#T8566
リポ酸 Sigma Aldrich Cat#T1395
Tween 80 シグマ・アルドリッチ Cat#P4780
アデニン Sigma Aldrich Cat#A2786
グアニン Sigma Aldrich Cat#G6779
ウラシル Sigma Aldrich Cat#U1128
キサンチン Sigma Aldrich Cat#X3627
MOPS シグマ・アルドリッチ Cat#M3183
トリシンSigma Aldrich Cat#T5816
CoCl2.6 H2O シグマ・アルドリッチ Cat#C8661
EDTA Sigma Aldrich Cat#E6758
チオグリコール酸ナトリウム Sigma Aldrich Cat#T3758
(NH4)2SO4 シグマ・アルドリッチ Cat#A2939
ビオチン Sigma Aldrich Cat#B4639
葉酸 Sigma Aldrich Cat#F8758
アミノ酸および硫酸アンモニウムを含まない酵母窒素ベース Sigma Aldrich Cat#Y1251
重要な市販アッセイ
RNAprotect Qiagen Cat#76104
RNaseZAP サーモフィッシャーサイエンティフィック Cat#AM9780
RNeasy Mini キット Qiagen Cat#74106
Turbo DNA-free kit サーモフィッシャーサイエンティフィック Cat#AM1907
Bacterial Ribo-Zero Magnetic kit イルミナ Cat#MRZB12424
TruSeq Stranded mRNA ライブラリー調製キットイルミナ Cat#20020595
SuperScript II 逆転写酵素 Thermo Fisher Scientific Cat#18064022
QIAamp PowerFecal Pro DNA キット Qiagen Cat#51804
Nextera XT DNA Library Prep Kit イルミナ Cat#FC-131-1096
Nextera Index Kit イルミナ Cat#FC-131-2001
酢酸アッセイキット（比色） Abcam Cat#ab204719
ブラッドフォードタンパク質アッセイキット Bio-Rad Cat#5000201
寄託データ
生シーケンスリード（トランスクリプトーム）本論文 NCBI BioProject： PRJNA574885
生シーケンスリード（マイクロバイオーム）本論文 NCBI BioProject： PRJNA882996
実験モデル生物/株
マウス C57BL/6 OrientBio C57BL/6NCrlOri
ソフトウェアとアルゴリズム
MATLAB MathWorks N/A
R N/A www.r-project.org
GraphPad N/A GraphPad Software, Inc.
COBRA toolbox Heirendt et al.63 https://opencobra.github.io/cobratoolbox/stable/
Growthcurver Sprouffske and Wagner106 https://cran.r-project.org/web/packages/growthcurver/vignettes/Growthcurver-vignette.html
Orthofinder2 Emms and Kelly107 https://github.com/davidemms/OrthoFinder
MAFFT Katoh and Standley108 https://mafft.cbrc.jp/alignment/software/
RAxML Stamatakis109 https://cme.h-its.org/exelixis/web/software/raxml/
STAG Emmsら110 https://github.com/davidemms/STAG
STRIDE Emms and Kelly111 http://www.stevekellylab.com/stride
iTOL Letunic and Bork112 https://itol.embl.de/
eggNOG マッパー Huerta-Cepas 他113 http://eggnog-mapper.embl.de/
BAGEL De Jong et al.114 http://bagel4.molgenrug.nl/
FastQC Andrews115 https://github.com/s-andrews/FastQC
Trimmomatic v0.32 Bolger et al.116 https://github.com/usadellab/Trimmomatic
STAR v 2.5.3a Dobin et al.117 https://github.com/alexdobin/STAR
RSEM v1.3.0 Li and Dewey118 https://deweylab.github.io/RSEM/
偽発見率調整 Benjamini and Hochberg119 https://doi.org/10.1111/j.2517-6161.1995.tb02031.x
RUVseq Peixoto et al.120 https://bioconductor.org/packages/release/bioc/html/RUVSeq.html
DEseq2 Love ら121 https://bioconductor.org/packages/release/bioc/html/DESeq2.html
DAVID Dennis ら122 https://david.ncifcrf.gov/
DADA2 Callahan et al.123 https://benjjneb.github.io/dada2/tutorial.html
HiMAP2 Segota および Long124 https://doi.org/10.1101/565572
gapFind Kumar および Maranas125 https://doi.org/10.1371/journal.pcbi.1000308
dbCAN2 Zhang ら 126 https://github.com/linnabrown/run_dbcan
HMMER Finn et al.127 http://hmmer.org
DIAMOND Buchfink et al.128 https://github.com/bbuchfink/diamond
CAZy Cantarel et al.129 http://www.cazy.org/
MEMOTE Lieven et al.130 https://memote.io/
InParanoid Sonnhammer and Östlund131 https://inparanoid.sbc.su.se/cgi-bin/index.cgi
その他
ゲノムスケール代謝モデル本試験 MODEL2210190001; MODEL2210190002; MODEL2210190003; MODEL2210190004; MODEL2210190005; MODEL2210190006; MODEL2210190007; MODEL2210190008; MODEL2210190009; MODEL2210190010; MODEL2210190011; MODEL2210190012
LAB プロバイオティクス評価フレームワーク本試験 https://github.com/skku-pdse/LAB-probiotic-evaluation-framework
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リソースの有無
リードの連絡先
データセットおよび/またはプロトコールに関する詳細情報およびリクエストは、リードコンタクトのDong-Yup Lee (dongyuplee@skku.edu)までご連絡ください。
資料の利用可能性
本研究では新規のユニークな試薬は作成していない。
実験モデルと被験者の詳細
LAB株、培地および増殖条件
LAB株、Leuconostoc mesenteroides subsp. mesenteroides ATCC 8293、Lacticaseibacillus casei ATCC 393（旧Lactobacillus casei subsp. casei ATCC 393）、Lactiplantibacillus plantarum WCSF1（旧Lactobacillus plantarum WCSF1）、Ligilactobacillus salivarius ATCC 11741（旧Lactobacillus salivarius ATCC 11741）、Limosilactobacillus fermentum ATCC 11741（旧Lactobacillus fermentum ATCC 14931）はATCCから、Lactococcus lactis subsp. cremoris NZ9000はBoca Scientificから入手した。凍結乾燥した培養液は、まずアンプルの内容物をMRS培地とGM17培地各10mLに無菌的に均等に移すことで復活させた。復活させた培養液は、安定性を確保するため、同じ培地を用いて再培養した。6株すべてのLAB株を培養できる化学的に定義された培地（LABDM）は、すでに確立されたCDM42の構成要素を繰り返し変更することで開発された（表S2参照）。発酵実験用の種LAB培養は、10%(v/v)培養液をLABDMに移し、30℃で一晩培養することで調製した。LABの生物学的3倍体は、50mLのコニカル組織培養チューブ（Thermo Fisher Scientific社製）で、還元剤であるチオグリコール酸ナトリウム（1g/L）を添加し、嫌気的条件を維持するためにヘッドスペースを空けない静置培養として増殖させた。サンプリング中の通気性を避けるため、各時点で別々の培養管を維持した。
LAB上清を用いた共存培養
常在菌であるA. muciniphila ATCC BAA-835、B. thetaiotaomicron VPI-5482、E. coli W3110およびR. hominis A2-183は、Korean Collection for Type Cultures (KCTC, https://www.kctc.kribb.re.kr)から入手した。4種の常在菌の培養には、ヘム、N-アセチルグルコサミンを添加したLABDMを用いた。培地は使用前にN2ガスでパージし、酸素がないことを確認した。LAB株はまず、Man Rogosa Sharpe（MRS）ブロス（BD, Sparks, MD, USA）中で30℃で一晩静置培養した。同時に、常在菌をLABDM培地に接種し、37℃で一晩増殖させた。LAB培養液10% v/vの上清を、培養チューブで新しく調製したLABDMに移した。一晩生育させた常在菌培養液をこのチューブに最終OD600が0.1～0.2になるように播種した。実験はすべて3連で行い、嫌気チャンバー内で行った。培養チューブを嫌気ジャーに入れ、GazPak EZ sachets（Becton-Dickinson社製）を入れる前に10分間N2でパージした。密封後、ジャーを37℃のインキュベーターに入れた。常在菌の増殖は、12時間培養後にODを測定して記録した。
マウス補充用LAB培養
LAB6株すべてをまずMRS寒天培地（BD, Sparks, MD, USA）で培養した。ストリーキング後、37℃で48時間培養し、単一コロニーを得た。各コロニーをMRSブロスとともに37℃で培養した。L.plantarum、L.salivarius、L.fermentum、L.caseiは24時間培養し、L.lactisとL.mesenteroidesは48時間培養した。培養株は洗浄後、遠心分離し、1×109 CFU/100μLの濃度でリン酸緩衝生理食塩水（PBS）に懸濁した。
マウス試験デザイン
OrientBio社（韓国、ソウル）から供給された6週齢のC57B/6雄性マウスを、22±2℃、湿度45±10％、12時間の明暗サイクルに制御された滅菌ケージに収容し、普通飼料（4.5 Kcal %、リサーチ・ダイエット、ピュリナ社、韓国、城南）と濾過水を自由摂取させた。マウスはこの条件で1週間馴化させた。次に、馴化させたマウスを7群（n = 10）に分け、高脂肪飼料（脂肪60 Kcal %, Research Diet, New Brunswick, NJ, USA）を与えた。LAB溶液100μL（各群1株、対照群を除く）を1週間毎日経口投与した。プロバイオティクスLAB投与中止1週間後に盲腸組織を採取し、マイクロバイオーム解析に用いた。マウス試験に対する倫理承認は、株式会社アトジェンのInstitutional Animal Care and Use Committee (IACUC)により行われた（登録番号：ATG-IACUC-SKK-200713およびATG-IACUC-SKK-200904）。
方法の詳細
培養上清の増殖および生化学的解析
LABDMで培養した生物学的3連LAB培養物から細胞および上清を定常期まで1時間ごとに採取し、様々な増殖およびその他の生化学的アッセイを行った。島津 UV-1700 分光光度計で 600nm の光学濃度（OD600）を測定した。乾燥細胞重量（DCW）は、2mL の細胞培養液を遠心分離し、その後ペレットを 100℃で一晩乾燥させ、天秤を用いて秤量することにより求めた。OD600対gDCWの標準曲線をプロットし、変換係数を推定した。エクスポネンシャル期にまたがる異なる時間間隔でのグルコースとL-乳酸のプロフィールは、YSI®生化学分析装置を用いて分析した。アミノ酸プロファイルは、Waters ACQUITY-UPLCシステム、AccQ⋅Tag™ Ultraカラム（2.1 × 100 mm）、およびAccQ-Tag誘導体化キットを用い、製造元の指示に従って測定した。細胞培養上清中の酢酸は、Acetate Assay Kit (Colorimetric) (abcam®)を用い、メーカーの推奨する手順に従って測定した。全てのサンプル測定には生物学的三連複を用いた。
細胞容積および細胞数の測定
LcLtとLeMtの形状を球形に、LbPt、LbCs、LbSv、LbFmの形状を円筒形に近似することで、LAB単細胞の体積を推定した。光学顕微鏡を用い、油浸下で100倍の倍率で測定した少なくとも100個の細胞の平均直径と長さを用いて、単一細胞の体積を推定した。細菌培養液は、細胞が適切に分散するよう、顕微鏡測定の前に1000倍に希釈した。同じ希釈培養液の一定体積中の細胞数は、プレーティングと自動CFUカウンター（Scan 1200, Interscience, Saint Nom, France）を用いて計数した。
総タンパク質含量の測定
総タンパク質含量は、Bradford assayを用いて測定した132 。簡単に述べると、指数関数的に増殖した細胞10 mLから得た細胞ペレットを、10 mM Tris-HCL、pH 8.0、1 mM EDTA、および100 ulのリゾチーム（10 mg/mL）を含む氷冷溶解バッファー1 mLに懸濁し、氷上で15分間インキュベートした。次に、細胞を周波数20kHzで10×30秒間超音波処理し、各音波処理サイクルの間に1分間のインターバルを置いた。超音波処理を10回繰り返すと、タンパク質は「ほぼ完全に」遊離し、その後タンパク質濃度は飽和した。標準ウシ血清アルブミン（BSA）溶液を用いたBradford protein assay kit（Bio-Rad®）を用いて、超音波処理した100μL中のタンパク質濃度を推定し、希釈率とOD600からgDCWへの換算係数を考慮して、グラムDCWあたりの総タンパク質含量に換算した（表S6）。
全RNA抽出と精製
全RNAを抽出するために、LABDMで培養した生物学的3連LAB培養物から、それぞれの指数関数中期に対応する時点で10 mLのアリコートを採取した。まず10 mLのQiagen RNAprotect試薬と混合し、周囲温度で10分間インキュベートしてRNAを安定化させた。RNA作業に使用したベンチとバイオセーフティキャビネットの表面は、RNaseZAP（Thermo Fisher Scientific）で除染し、サンプルとRNaseの接触を最小限にした。RNAprotect試薬を含むサンプル分注の半分（10 mL）を6000×gで10分間遠心した。残りのサンプルは-80℃で4週間保存し、後で使用できるようにした。RNA抽出の前に、細胞ペレットを、10 mM Tris-HCL、pH 8.0、1 mM EDTA、100 uLのリゾチーム（10 mg/mL）を含む氷冷溶解バッファー1 mLで処理した。溶解液はさらに、RNAの最大放出を確実にするため、ヌクレアーゼフリーのガラスビーズとサーモミキサーを用いた機械的細胞破砕にかけた。Qiagen RNeasy Miniキットを用いて、製造元の指示に従って細胞ペレットから全RNAを抽出した。ゲノムDNAコンタミネーションを除去するため、Turbo DNA-free kit（Thermo Fisher Scientific）を用いてDNase処理を行った。抽出されたRNAの完全性と品質は、まずアガロースゲル電気泳動に供したサンプル中の16sおよび23s rRNAの存在によって確認し、その後Agilent Bioanalyzerを用いて確認した。Bacterial Ribo-Zero Magnetic kit（Illumina）を用いて、製造元の指示に従って、サンプル中のrRNAを除去し、mRNAを濃縮した。Agilent Bioanalyzer を使用して、cDNA ライブラリーを調製する前に、すべてのサンプルから rRNA を確実に除去した。
cDNA ライブラリーの調製と RNA シークエンシング
rRNAが枯渇したmRNAサンプルのフラグメンテーションとそれに続くcDNAライブラリーの調製は、Illumina TruSeq Stranded mRNA Library Preparation kit（Low Sample Protocol）を用い、メーカーの指示に従って行った。逆転写ポリメラーゼ連鎖反応（RT-PCR）における最初のcDNA鎖合成は、SuperScript II逆転写酵素（Thermo Fisher Scientific）とともにメーカーから提供された試薬を用いて行った。インデックス化したcDNAライブラリーをプールし、Illumina HiSeq 2500 Rapid V2プラットフォームで51 bpのリード長までシングルエンドシーケンスを行った。
マイクロバイオームDNA抽出およびシーケンスライブラリー構築
QIAamp PowerFecal Pro DNA Kit（Qiagen, Hilden, Germany）を用いてマウスの盲腸からDNAを抽出した。その後、Nextera XT DNA Library Prep KitおよびNextera Index Kit（Illumina、カリフォルニア州サンディエゴ、米国）を用いて16S rRNA遺伝子のV4領域を増幅およびインデックス化し、ペアエンドシーケンスライブラリーを作成した。その後、Illumina iSeq 100（Illumina）を用いてシーケンスした。
定量化と統計解析
LAB増殖特性の統計解析
LABの増殖特性は、4つのパラメーターに基づいて評価した：(1)総個体数が制限されない場合に起こりうる最大増殖速度、(2)倍加時間、(3)グルコースに対するバイオマス収量、および(4)グルコースに対するL-乳酸収量。簡単に言えば、最大成長率とは、対数変換した成長曲線に沿った傾きの最大値である。倍加時間は、培養液のODが最大値の半分に達するのに要する時間である。グルコースに対するバイオマス収量およびグルコースに対するL-乳酸収量は、それぞれ、消費されたグルコースgに対する培養中に蓄積されたLAB gDCWの比率、および消費されたグルコースgに対する生産されたL-乳酸gの比率である。最大増殖率と倍加時間は、Growthcurver.106を用いて培養データにロジスティック方程式を当てはめることにより算出した。
比較ゲノム解析
系統樹の再構築：本研究で調べたLAB株の進化の観点を理解するため、Orthofinder2を用いて、すべての種に存在するコアタンパク質のセットに基づいて系統樹を構築した107。簡単に説明すると、OrthoFinder2は、まず、オルソグループに基づいて、すべての種にわたって1コピーのオルソログタンパク質を同定し、デフォルトパラメータでMAFFT,108を使用して多重配列アラインメント（MSA）を実行した。STAG（全遺伝子からの種樹推論）アプローチに従って、RAxMLを用いてシングルコピー遺伝子のMSAを連結したものから、根付かない種系統樹を推論した。
LABのコア、シェル、クラウドゲノムの同定と機能アノテーション：コア、シェル、クラウドゲノムを同定するために、まず、Orthofinder2 を用いて、LABの全6種間のオルソグループを確立した。一つの生物種にのみ存在するオルソグループを「クラウド」ゲノムとした。残りのオルソグループはすべて「シェル」ゲノムとした。コアゲノム、シェルゲノム、クラウドゲノムの機能的濃縮は、NOGカテゴリーに基づいたeggNOG mapperを用いて行った。
非代謝性プロバイオティック決定因子のゲノム比較：酸、酸化、胆汁ストレスに抵抗するタンパク質、タンパク質を溶解するプロテアーゼ、および宿主粘膜層表面のアンカー細胞をコードするORFを同定するために、BLASTpオルソロジー検索を用いてLABゲノムを調査した。そのために、まず、様々なLABにおいてプロバイオティック特性に関連することが知られている遺伝子を調査した。適切なカットオフ値（Identity >50%, query coverage >70%, E-value < 1E-06）133を用いてオルソログを選択した。LABゲノム中の潜在的なバクテリオシンオペロンは、BAGEL.114を用いて検索した。
トランスクリプトームデータ解析
トランスクリプトームのアライメントと遺伝子発現の定量：その後、Trimomatic v0.32119を用いてアダプターおよび低品質リードをトリミングし、STAR v2.5.3a120を用いてトリミングリードをそれぞれのゲノムアセンブリとアライメントした。最後に、RSEM v1.3.0121を用いて、アライメントファイルからカウント、FPKM、TPMの観点から発現量を定量した（表S3）。
遺伝子発現カテゴリーの機能的濃縮：最初に、遺伝子はTPM値に基づいて3つのグループに分類される：i) 低発現範囲（log2(TPM+1) < 2.5）、ii) 中発現範囲（log2(TPM+1) > 2.5 & < 10）、iii) 高発現範囲（log2(TPM+1) > 10）。その後、以下のように2×2の分割表を作成し、フィッシャーの正確検定を使用して、異なる遺伝子発現グループにおけるNOGカテゴリーの濃縮の有意性を表すためにp値を計算する：最初の行は、濃縮スコアを計算するパスウェイに含まれる全遺伝子の情報を含む。1行目の1列目には、特定のパスウェイに属する入力中の全遺伝子が含まれ、同じ行の2列目には、そのパスウェイの残りの全遺伝子数が含まれる。2行目の1列目と2列目には、それぞれそのパスウェイに属さない入力中の総遺伝子数と、そのパスウェイに属さないゲノム全体の総遺伝子数が記載されています。Fisherの正確検定から得られたp値は、以前に提案された方法に基づいて偽発見率について調整される119。
オルソログ遺伝子における遺伝子発現の比較： LAB種間の遺伝子発現を遺伝子単位で直接比較することは、ゲノムサイズが異なるだけでなく、ゲノムの機能性も異なるため不可能である。したがって、LAB間で同じ機能を持つ遺伝子の発現レベルを比較するために、まず前述のように1対1のオルソログを同定した。ハウスキーピング遺伝子は以下の基準で同定した：i）各LABで95パーセンタイル以上の発現を持つ遺伝子、ii）1対1のオルソログリストに存在する遺伝子（表S1）。次に、オルソログ遺伝子の発現プロファイルをPCAとスピアマン相関を用いて一対比較した。
異なる発現遺伝子の同定 DEseq2121を用いて、6つのLAB間で発現量の異なる1対1のオルソログ遺伝子を同定した。遺伝子長は同じ遺伝子でもLABごとに異なるので、このステップでは各LABの遺伝子長を追加の正規化因子として用いたことに注意。FDRで調整したp値が0.01未満の遺伝子を有意差のある発現遺伝子とした。
差次的発現遺伝子の機能濃縮： FDRで調整したp値が0.01未満のパスウェイとGOタームのみをさらなる解析の対象とした。
マイクロバイオームデータ解析
まず、マイクロバイオームシーケンス（16S rRNA）リードの品質をFastQCで評価した115。その後、DADA2123（バージョン1.16）パイプラインで配列データをトリミング、ノイズ除去、マージした。キメラリードも同じパイプラインで除去した。HiMAP2124パイプラインによって構築されたデータベースを用いて、得られたノイズ除去配列またはアンプリコン配列バリアント（ASV）をアノテーションした。次に、R環境のDESeq2121パッケージ3（https://www.r-project.org/）を用いて、対照群と比較してプロバイオティクス投与群ごとに異なる豊富なOSU IDを同定した。さらに、種の同一性を確認するために、6つのLABとしてアノテーションされたOSUの塩基配列を取得し、NCBI rRNA_typestrains/16S_ribosomal_RNAデータベースに対してBLASTn検索を行った。
LABゲノムスケールモデルの再構築
まず、LbPt、LcLt、LeMtのGEMを、人手でキュレーションされた既発表モデルを拡張することで構築した43,44,45。そのために、これらのGEMのネットワークギャップをgapFindアルゴリズムを用いて同定し125、続いて、その解消のために文献情報に基づいて新しい反応を追加した。さらに、文献58,134から入手可能なアミノ酸オーソトロフィーのデータを用いて、実験や制約条件ベースのシミュレーションで観察されたオーソトロフィーの矛盾を減らし、3つのGEMを手動でキュレーションした。また、HMMER127、DIAMOND128、CAZy129ツールを用いて、クエリーされたゲノムを糖質酵素データベースと照らし合わせて検索するdbCAN2126を用いて、6つのLABの糖質活性酵素（CAZymes）の検索を行った。既知のEC番号アノテーションを持つ有意なヒット（E-value <1e-15 and coverage >0.35 for HMMER + dbCAN2; E-value <1e-102 for DIAMOND + CAZy）は、BLASTpアルゴリズムを用いて全6LABのゲノムと照合し、その存在を確認した。カットオフ（Identity >50%、query coverage >30%、E-value < 1E-06）を通過したヒットは、対応するLABモデルに追加された（表S5）。次に、発酵性基質表現型データ135,136,137に関する文献データを用いて、モデル予測と実験との一致を検証し、その後、関連する代謝・輸送反応を追加することで矛盾を排除した。
LbFm、LbSv、LbCsのGEMを新たに再構築するために、まずこれらのLABのゲノムアノテーションに基づく代謝経路情報をKEGG138とMetaCyc139データベースから収集した。次に、これらのデータベースからの情報と、既存のLABモデル（LbPt、LcLt、LeMt）の遺伝子オルソログに基づく情報を組み合わせて、ドラフト反応ネットワークを組み立てた。次に、指数関数的に成長する細胞の代謝フラックスを予測するために、FBAフレームワークの目的関数として一般的に使用されるバイオマス反応140 を、実験および文献情報に基づいて、新しく開発された各モデルに追加した（表S5参照）。タンパク質はバイオマスの主要な高分子成分であるため、異なる LAB の総タンパク質含量を実験的に測定し、バイオマス反応の定式化に使用した（表 S5）。これらのドラフトネットワークにおけるギャップは、gapFind アルゴリズム125 を用いて特定し、その後、文献情報に基づいて新しい反応を追加することで埋めた。次に、遺伝子-タンパク質-反応（GPR）関係を定式化し、元素、電荷の不均衡を含むモデルの不整合を修正した。また、LbCs58のアミノ酸オーソトロフィーのデータを用いて、対応するGEMを手作業でキュレーションし、オーソトロフィーにおけるモデル予測の不整合を減らした。
6つのLAB GEMすべてにおいて、成長と非成長に関連するATP維持コストは、既存のGEMから採用するか、利用可能な培養データに基づいて推定した（表S5）。最後に、再構築されたモデルの品質と一貫性をオンラインツールMEMOTEを用いて評価した。
LbCs、LbPt、LcLtの株特異的モデルは、4段階のアプローチに従って再構築した。まず、InParanoidを使用して、GEMが利用可能な基本株とGEMを再構築する株の間の1対1のオルソログを同定した131。次に、1対1のオルソログを使用して、GPRの対応する遺伝子座を置換し、新菌株に存在しない遺伝子と関連する反応を削除することにより、基本株から各新菌株のドラフトGEMを組み立てた。次に、一対多および多対一の遺伝子関連を手作業でキュレーションし、GEMを更新した。新菌株とGEMが利用可能な他のすべてのLAB種との間で、1対1のオルソログ遺伝子を再度同定した。その後、inParanoidのオルソロジーに基づいて、この新菌株には存在するが基本株には存在しない新しい反応を追加した。最後に、GEMが再構築された新菌株の基質表現型データを用いて、関連する遺伝子、反応、代謝物を追加・削除することにより、このモデルを手動でキュレーションした。
Auxotrophy-weighted transcriptome Z score メトリック
まず、GPRマッピングを用いてRNA-seqデータのTPM値を各LAB GEMにマッピングした。次に、各モデルにおける全反応の発現レベルにわたるZスコアを以下の式で計算した：
�

�

�
�

ここで、x = 観測値、μ = サンプルの平均、σ = サンプルの標準偏差。次に、各ビタミンの生合成遺伝子に関連するすべての反応を同定し、対応するZスコアを各LABで平均した。さらに、生合成経路が不完全なビタミンのZスコアに0を乗じることで、スコアを精緻化した。
高分子クラウディング制約を用いた制約ベースのフラックス解析
LABDMや異なる食餌レジームなどの様々な環境条件下でのLABの代謝表現型を解析するために、高分子のクラウディング制約47を用いた制約ベースのフラックス解析を用いた。対応する最適化問題は、数学的には以下のように表すことができる：
最大
�

∑
�
�
�
�
�
(1)

に従う。
∑
�
�
�
�
�
�

0
∀
代謝物
�
(2)

�
�
�
�
�
≤
�
�
≤
�
�
�
�
�
∀
反応
�
(3)

∑
�

1
�
�
�
�
�
≤
1
(4)

ここで、Z は細胞目的、cj はバイオマス形成に対する各代謝反応の相対的な重みである。Sijは反応jの代謝物iの化学量論係数、fjは反応jを通るフラックス、fjminとfjmaxはそれぞれ反応jを通るフラックスの下限と上限である； aj=C-vj/bjは「クラウディング係数」と呼ばれ、Cは実験的に測定する必要がある細胞質密度、bjは酵素回転数47に基づく動力学定数、vjはタンパク質（酵素）のモル質量（Mj）と比容積を用いて以下のように計算される：
�
�

�

�
�
�
�
�
�
�
�
�
�
(5)

タンパク質の比体積(
�
�
�
�
�
�
�
�
�
�
)は、細胞によってほとんど変化しないことが知られている141 ので、先に報告された平均値(0.73 mL/g)を使用した47。
FBAwMCの追加制約である式4は、単純にS行列自体に実装することができる。そのためには、化学量論的行列Sijとフラックス・ベクトルfjが以下のように表されると考える：
�
�
�

[
�
11
�
12
⋯
�
1
�
⋮
⋮
⋮
⋮
�
�
1
�
�
2
⋯
�
�
�

�
�

[
�
1
⋮
�
�
]

ここで、クラウディング係数に基づくFBAwMCの追加制約は、次のようにシンクフラックスが0から1の間で変化することが許される擬似代謝物を含むダミー反応の形でS行列に都合よく含めることができる。
�
(
�
+
1
)
(
�
+
1
)

[
�
11
�
12
⋯
�
1
(
�
+
1
)
�
1
...
�
2
...
⋯
�
(
�
+
1
)
...
�
(
�
+
1
)
1
�
�
2
⋯
�
(
�
+
1
)
(
�
+
1
)
]

�
�
+
1

[
�
1
�
�
�
...
�
�
+
1
]

ここで、a1, a2 ... a(j+1)は、1 ... (j+1)のすべての反応に加えられる単一の擬似代謝物の係数である。(j+1). なお、a1, a2 ... a(j+1)は反応1 ... (j+1)のクラウディング係数と同じである。(j+1). ダミー反応、バイオマス目的反応、非遺伝子関連反応、交換反応の混雑係数はゼロに設定される。fdrはダミー反応のフラックスを表し、酵素容量制約を満たす0と1の範囲で変化することが許される。
LABDMで指数関数的に増殖するLABの生理をシミュレートするために、バイオマス反応を最大化すると同時に、グルコースと20種類のアミノ酸すべての取り込み/分泌速度を実験的に測定された値で制約した（表S4）。未知のC値を持つ反応を考慮するため、各シミュレーションで5000通りの並べ替えを行い、5000のフラックス解を得たことに注意されたい。得られた対数正規分布の最大値を囲むフラックス溶液の幾何平均は、平均的な細胞状態を正確に表しており142、その後、LABの表現型（成長速度／副産物分泌）を評価するために使用された。すべてのシミュレーションは、COBRA toolbox143とGurobi7 (http://www.gurobi.com)最適化ソルバーを用いて実施された。
細胞混雑係数の推定 (a)
クラウディング係数の推定には、2種類の実験データが必要であった。酵素動力学パラメータ、すなわちターンオーバー数、kcat (s-1)と細胞質密度である。酵素のターンオーバー数はBRENDAデータベースから入手した。しかし、どの酵素についてもLABで測定されていない場合は、対応する反応の全体的なフラックスを制限する可能性のある、より小さなターンオーバー数（より高いクラウディング効果）の組み込みを避けるために、どの生物からも報告されている最大値を使用した。各LABの細胞質密度は、以前に測定されたDCW値、1つの細胞が占める体積、与えられた培養容積内の細胞の総数を用いて推定した。細胞質密度は細胞体積に対する細胞質量の比として定義されるため、必要な希釈係数を考慮した上で算出したことに留意されたい。
酸素の関数としてのLAB発酵プロファイルのシミュレーション
グルコースの取り込みを10 mmol/gDCW/hr、アミノ酸の取り込みを1 mmol/gDCW/hrに制約すると同時に、FBAwMCを実施して、酸素の関数としてのLABの発酵プロファイルをシミュレーションした。なお、無機化合物は自由に交換できるようにした。酸素摂取量を0から10 mmol/gDCW/hrまで0.1のステップサイズで徐々に変化させ、FBAwMCを実施して各ステップの5000フラックス溶液を得た。各ステップにおける酢酸、乳酸、エタノール、ジアセチルおよびプロピオン酸を含む主要発酵生成物の交換フラックスを収集し、それらの平均値を用いて発酵プロファイルをプロットした。GraphPad Prism（バージョン9.3.1; www.graphpad.com）で、平滑化スプライン関数を用いて発酵傾向を可視化した。
LAB GEMにおける正および負のエピスタシスの評価
LAB 代謝ネットワークにおけるエピスタシス相互作用は、先に提案した乗法的定式化に基づいて評価した145。
�

�
�
⋅
�
�

ここでWxyは遺伝子/反応xとyの二重欠失後の適合度、WxとWyは対応する一重欠失後の適合度である。
ここで、フィットネス値が1より小さい場合に誤ったエピスタティック効果を避けるため、定式化を少し修正した。
�

�
�
�

最小
(
�
�
,
�
�
)

遺伝子/反応 x と y の間のエピスタシスは ↪Ll_3F5 が正(例えば ↪Ll_3F5 > 0.0001)なら正/バッファリング(positive/buffering)、 ↪Ll_3F5 が負(例えば ↪Ll_3F5 < -0.0001)なら負/悪化(negative/aggravating)となる。そうでなければ（ϵ≈ 0）、xとyは互いにエピスタシスを示さない可能性が高い。正のエピスタシス反応ペアは、「遺伝子発現カテゴリーの機能的濃縮」のセクションで前述したように、2×2の分割表を作成し、フィッシャーの正確検定を使用して、各GEMに記述されている代謝経路に基づいて機能的に濃縮された。
様々な飼料におけるLABの表現型のインシリコ解析
ベジタリアン、ビーガン、EU平均、地中海、DACH、高タンパク、グルテンフリー、高繊維、糖尿病、高脂肪-低炭水化物、高脂肪-高炭水化物を含む11種類の食事条件の組成をVirtual Metabolic Humanデータベース（https://www.vmh.life/#nutrition）から入手し、プロバイオティクスの能力を評価するためのシミュレーションに利用した。これらの食餌条件は、確立された食餌調査に基づいて策定され、脂肪酸、アミノ酸、炭水化物、食物繊維、ビタミン、ミネラル、および微量元素の1日消費量を含む。一方、高脂肪・低炭水化物食は、脂質が多く炭水化物が少ないケトジェニックダイエットに似ている150 が、高脂肪・高炭水化物食は、食物繊維は少ないが、単糖、飽和脂肪酸、コレステロールを多く含むため高カロリーである。さらに、国や地域によっても食事は異なる。例えば、1002人を対象にしたオーストリアの調査に基づいて作られたEUの食事は、炭水化物が主なエネルギー源である151。一方、2つの調査に基づいて作られた地中海の食事は、新鮮な植物性食品、最小限の加工食品、オリーブオイルが豊富で、肉の量が少ないという特徴がある152,153。さらに、スイス、ドイツ、オーストリアの栄養学会が制定したDACH食は、健康的な栄養状態を達成するために、炭水化物、タンパク質、脂質をバランスよく含んでいる。さらに、2型糖尿病患者用の食事は、低カロリーで、ビタミンとミネラルを多量に含んでいる154。
様々な食事におけるLABの細胞増殖をシミュレートするために、交換反応を対応する取り込み速度で制約した（表S4）。未知の C 値を持つ反応を考慮するために、各食餌のシミュレーションで 5000 通りの順列を用い、各食餌について 5000 通りのフラックス解を得た。その結果得られた対数正規分布の最大値を囲むフラックス溶液の幾何平均を、LABDMシミュレーションで行われているように、その食餌における表現型を報告するために使用した。さらに、各食餌がLABの増殖表現型にどのように異なる影響を与えるかを理解するために、対数正規分布の最大値を囲む最適解の削減コストを抽出し、その平均値をさらなる分析に使用した。各反応の低減コストは、対応する反応に単位 flu× を担わせた場合に、目的がどの程度低減（減衰）するかを示す指標である155 。各飼料の全交換反応の平均フラックスと低減コストを表S8に示す。
ポストバイオティクス代謝物の理論的収量を計算するために、それらの分泌を表す擬似反応を追加し、目的関数として反復的に使用した。バイオマスは最適値の 50%に制約した。FBAwMCはCOBRA toolbox63の機能を用いて実装され、各食餌についてVMHデータベースで提供された対応する取り込み率で交換反応を制約しながら、各LABのin silicoポストバイオティック収率を得るために目的が最大化された。未知のC値を持つ反応を考慮するため、各FBAwMCシミュレーションに5000通りの順列を用いた。その結果得られた対数正規分布の最大値を囲む5000個のフラックス溶液の幾何平均は、平均的な細胞状態を正確に表しており142、次にポストバイオティック収量の計算に用いられた。最後に、各ポストバイオティック化合物の収量を、異なる飼料とLABの最大値で正規化した。
一般的な腸内微生物と相互摂食するLAB能力のインシリコ検査
一般的な腸内微生物を交雑摂食するLABの能力を、以下のアプローチに基づいてインシリコで評価した。簡単に述べると、嫌気条件下でMRS培地で生育する各LABの生育表現型を、まず先に述べたFBAwMCアプローチを用いてシミュレートした（表S4）。次に、LABによって合成された発酵産物およびその他の副産物を、培地中で利用可能な追加代謝産物としてLABDMに添加し、嫌気性条件下での腸内微生物の増殖表現型を、これまでに発表されている常在性または病原性微生物の対応するGEMを用いてシミュレーションした156,157,158,159,160,161,162,163,164,165,166。LABを添加したLABDMで得られた各腸内微生物の増殖率を、LABを添加しないシミュレーションで得られた値で正規化した。
データとコードの入手可能性

新たに配列決定されたトランスクリプトームとマイクロバイオームのリードは、NCBI SRA (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/sra)で入手可能である： PRJNA574885およびPRJNA882996。

本研究で使用したFBAwMC in silico解析コードは、https://github.com/skku-pdse/LAB-probiotic-evaluation-framework。すべてのLAB GEMはBioModels1データベースに寄託されており、以下のアクセッションで利用可能である： L. casei subsp. casei ATCC393： L. casei subsp. casei ATCC393: MODEL2210190001, L. casei BL23: MODEL2210190002, L. casei LC5: MODEL2210190003, L. fermentum ATCC14931： MODEL2210190004, L. plantarum WCFS1: MODEL2210190005, L. plantarum ATCC8014： MODEL2210190006、L. plantarum JDM1： MODEL2210190007、L. salivarius ATCC11741：MODEL2210190008、L. lactis subsp. cremoris NZ9000：MODEL2210190009、L. lactis subsp： MODEL2210190010、L. lactis subsp： MODEL2210190011、L. mesenteroides subsp： MODEL2210190012。すべてのLABモデルのSBMLファイルもGitHubリポジトリで公開されているhttps://github.com/skku-pdse/LAB-probiotic-evaluation-framework。

本論文で報告されたデータの再分析に必要な追加情報は、要請があれば主担当者から入手可能である。
謝辞
本研究は、シンガポールのA∗STAR（科学技術研究庁）のBiomedical Research Council、A∗STARのIndustry Alignment Fund (PRE-POSITIONING) Program H18/01/a0/C11（Food Structure Engineering for Nutrition and Health）の支援を受けた、の資金提供による韓国国立研究財団（NRF）助成金（2020R1A2C2007192）および韓国イノベーション財団助成金（2021-DD-UP-0369）、農林水産省の資金提供による韓国食品農林水産技術企画評価院（iPET）（32136-05-1- HD050）。著者らは、RNA-seqライブラリー調製ステップに関するアドバイスをくれたShawn HoonとFong Tian Wong、トランスクリプトームシークエンシング実験に協力してくれたElena Heng、HPLC分析に関するアドバイスとサポートをくれたTessa Tanに感謝する。
著者貢献
L.K.、M.L.、D.S.-W.O.、D.-Y.L.がプロジェクトを発案。L.K.、P.-Y.L.、M.B.、W.X.L.はLAB実験を行い、S.K.N.の助言を得て培養上清のプロファイリングを行った。 P.L.H.とD.-S.P.は常在菌培養実験を行った。L.K.、P.-Y.L.、M.L.はトランスクリプトームシークエンシングと関連バイオインフォマティクス解析に関与した。L.K.とM.L.は比較ゲノム解析を行った。Y.Q.L.とD.K.はM.L.の助言を得てマイクロバイオームデータの解析を行った。L.K.とM.L.はY.Q.L.の助力を得てゲノムスケールモデルの再構築、インシリコ手法の開発、実装を行った。L.K.、M.L.、D.S.-W.O.、D.-Y.L.が原稿の編集と校閲に携わった。D.S.-W.O.とD.-Y.L.はプロジェクトの監督と調整を行った。
利害関係
著者らは、競合する利益はないと宣言している。
補足情報
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ドキュメントS1. 図S1-S11
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表S1. LABの比較ゲノム解析
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表S2. LABDMの開発と構成
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表S3. 遺伝子発現値
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表S4. インシリコシミュレーションで使用したフラックス境界値
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表S5. すべてのポストバイオティック化合物、アミノ酸、ビタミンの生合成経路の反応とZスコア
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表S6. 食餌交換反応のフラックス溶液と削減コストの平均値
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表S7. ペアワイズ相互作用シミュレーションのフラックス溶液と使用済み媒体移動実験からの実験測定データ
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表S8. GEM再構成に利用したバイオマス組成、Kcat値、CAZyme反応に関する情報
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表S9. エピスタティック反応ペアの代謝サブシステム濃縮値
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表S10. プロバイオティクス摂取マウスにおけるLABの細胞質密度と存在量の違い
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要旨
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日本学術振興会特別研究員
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グーグル奨学生
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グーグル奨学生
エムズ D.M.
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クロス
グーグル奨学生
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Interactive Tree of Life (iTOL) v4：最近のアップデートと新たな展開。
Nucleic Acids Res.
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クロスフィルム
グーグル奨学生
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Szklarczyk D.
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クック H．
メンデ D.R.
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グーグル奨学生
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日本学術振興会特別研究員 (0)
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グーグル奨学生
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グーグル・スカラー
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論文リスト
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グーグル奨学生
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ドレンコウ J.
ザレスキー C.
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バトゥット P.
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クロスリファレンス
グーグル奨学生
リ・ビー
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グーグル奨学生
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グーグル・スカラー
Peixoto L.
リッソD.
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データ解析は、複雑なデータセットにおけるRNA-seq研究のパワー、再現性、生物学的洞察にどのように影響するか。
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スコープス (55)
PubMed
Crossref
グーグル奨学生
ラブM.I.
フーバーW.
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DESeq2によるRNA-seqデータのフォルドチェンジと分散のモデレート推定。
ゲノム生物学 2014; 15: 550
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論文掲載
PubMed
クロスリファレンス
グーグル奨学生
デニス G.
シャーマン B.T.
ホザック D.A.
ヤン J.
ガオ W.
レーン H.C.
Lempicki R.A.
DAVID：アノテーション、可視化、統合的発見のためのデータベース。
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PubMed
クロスフィルム
グーグル奨学生
キャラハン B.J.
マクマーディ P.J.
ローゼン M.J.
ハン A.W.
ジョンソン A.J.A.
ホームズ S.P.
DADA2：イルミナアンプリコンデータからの高分解能サンプル推定。
Nat. Methods. 2016; 13: 581-583
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クロスフィルム
グーグル奨学生
セゴタ I.
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16S配列決定のための高分解能パイプラインは、ヒトマイクロバイオームにおける細菌株を同定する。
bioRxiv. 2019; (Preprint at)
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スコープス (0)
Crossref
グーグル奨学生
クマール V.S.
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GrowMatch: in silico/in vivoの成長予測を調整するための自動化手法。
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スコープス (164)
クロスレビュー
グーグル奨学生
Zhang H.
ヨーエ T.
Huang L.
エントウィッスル S.
ウー P.
ヤン Z.
Busk P.K.
Xu Y.
Yin Y.
dbCAN2: a meta server for automated carbohydrate-active enzyme annotation.
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スコープス (0)
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Crossref
グーグル奨学生
フィン R.D.
クレメンツJ.
Eddy S.R.
HMMERウェブサーバー：対話的配列類似性検索。
Nucleic Acids Res.
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筑波大学
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クロスフィルム
グーグル奨学生
ブッフフィンク B．
謝 C.
Huson D.H.
DIAMONDを用いた高速かつ高感度なタンパク質アライメント。
Nat. Methods. 2015; 12: 59-60
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スコープス (5232)
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クロス
グーグル奨学生
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ロンバード V.
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糖鎖活性酵素データベース（CAZy）：グリコゲノミクスのためのエキスパートリソース。
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筑波大学
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クロスリファレンス
グーグル奨学生
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バーグマン F.T.
アタマン M.
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スコープス (9)
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グーグル奨学生
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InParanoid 8：主に真核生物の273プロテオーム間のオーソロジー解析。
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相互ベストヒットとしてオルソログをよりよく検出するためのBLASTオプションの選択。
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グーグル奨学生
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グーグル奨学生
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後藤慎一郎
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藤渕和男
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グーグル奨学生
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グーグル奨学生
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要旨
全文
全文PDF
グーグル奨学生
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食事の質、時間の経過とともに変化する用語。
Int. J.ビタミン。Nutr. 研究 2012; 82: 144-147
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スコープス (0)
パブコメ
クロス
グーグル奨学生
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スコープス (1740)
PubMed
要旨
全文PDF
グーグル奨学生
ベレンセンA.
サントロA.
ピニ E.
チェベニーニ E.
オスタン R.
ピエトルーシュカ B．
ロルフ K.
カノ N.
カイユ A.
リヨン＝ベルギーN.
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欧州高齢者における炎症老化とその結果に対する健康的な食事の効果に関する並行ランダム化試験：NU-AGE食事介入研究のデザイン。
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論文で見る
スコープス (38)
PubMed
クロス
グーグル奨学生
ネルソン K.M.
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NHANES III
成人の2型糖尿病患者における食事と運動：第3回国民健康栄養調査（NHANES III）からの所見。
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記事で見る
スコープス (331)
PubMed
クロス
グーグル奨学生
オルトJ.D.
ティーレ I.
パルソン B.Ø.
フラックスバランス解析とは何か？
Nat. Biotechnol. 2010; 28: 245-248
論文で見る
スコープス (2328)
PubMed
クロス
グーグル奨学生
モンクJ.M.
シャルサンティP.
アジズR.K.
ラーマンJ.A.
プレミオジンN.
オルトJ.D.
フィースト A.M.
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大腸菌複数株のゲノムスケール代謝再構築により、栄養環境への菌株特異的適応が明らかになった。
Proc. Natl. Sci. USA. 2013; 110: 20338-20343
論文で見る
スコープス (183)
パブコメ
クロス
グーグル奨学生
ボシ E．
モンク J.M.
アジズ R.K.
フォンディ M.
ニゼット V.
パルソン B.
黄色ブドウ球菌の比較ゲノムスケールモデリングにより、病原性に関連する菌株特異的代謝能力が明らかになった。
Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2016; 113: 3801-3809
論文で見る
スコープス (0)
PubMed
クロス
グーグル奨学生
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サルモネラ・チフスムリウムの宿主-病原体相互作用における代謝能力の制約に基づく解析。
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(127件)
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クロスリファレンス
グーグル奨学生
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ヘリコバクター・ピロリ（iIT341 GSM/GPR）の拡張代謝再構築：単欠失変異体と二重欠失変異体のin silicoゲノムスケールでの特性解析。
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論文で見る
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PubMed
クロス
グーグル奨学生
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Pseudomonas putida KT2440のゲノムスケール代謝再構築：細胞工場としてのiJN746。
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クロス
グーグル奨学生
オーバーハルトM.A.
プチャウカJ.
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マルティンス・ドス・サントスV.A.P.
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日和見病原体緑膿菌PAO1のゲノムスケール代謝ネットワーク解析。
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日本
PubMed
クロス
グーグル奨学生
ヴァイスN.
ソルハイムM.
ファン・グリンスベンK.W.A.
オリビエ B.G.
レヴェリング J.
グロッセホルツ R.
ヒューゲンホルツ J.
ホロ H．
ネス I．
テューシンク B.
クマー U.
エンテロコッカス・フェカリス（Enterococcus faecalis）V583のゲノムスケール代謝モデルを用いて、アミノ酸の取り込みとその中枢代謝への影響を評価。
Appl. Environ. Microbiol. 2015; 81: 1622-1633
論文で見る
スコパス (18)
PubMed
クロス
グーグル奨学生
オットマン N.
ダビッド M.
スアレス・ディエス M.
ボーレン S.
シャープ P.J.
マルティンス・ドス・サントス V.A.P.
スミット H.
ベルザー C.
デ・ヴォスW.M.
アッカーマンシア（Akkermansia muciniphila）のゲノムスケールモデルとオミックス解析による代謝能力から、優先的にムチンを分解する生活様式が明らかになった。
Appl. Environ. Microbiol. 2017; 83 (e01014-17)
論文で見る
スコープス (125)
PubMed
クロス
グーグル奨学生
エルセンマンI.E.
カールソン F.H.
ショアイ S.
ヌーカウ I.
ソリマン T.H.
ニールセン J.
Bifidobacterium adolescentis L2-32とFaecalibacterium prausnitzii A2-165のゲノムスケール代謝再構築とそれらの相互作用。
BMC Syst. Biol.
論文で見る
スコパス (0)
PubMed
クロス
グーグル奨学生
ハインケン A.
サフー S.
フレミング R.M.T.
Thiele I.
哺乳類腸内における宿主-微生物代謝共生のシステムレベルでの特徴づけ。
Gut Microb. 2013; 4: 28-40
論文で見る
PubMed
クロスフィルム
グーグル奨学生
リャオ Y.-C.
ホアン T.-W.
チェン F.-C.
チャルサンティ P.
ホン J.S.J.
チャン H.-Y.
ツァイ S.-F.
パルソン B.O.
Hsiung C.A.
Klebsiella pneumoniae MGH 78578, iYL1228の実験的に検証されたゲノムスケール代謝再構築。
J. Bacteriol. 2011; 193: 1710-1717
論文で見る
スコープス (0)
PubMed
クロス
グーグル奨学生
論文情報
出版履歴
出版 2022年12月6日
受理受理：2022年11月7日
改訂版受理 2022年6月24日
受理：2022年6月24日受理：2022年6月9日
識別
DOI: https://doi.org/10.1016/j.celrep.2022.111735

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図3LAB GEMの表現型予測
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図3LAB GEMの表現型予測
図5インシリコでシミュレーションしたLABの食事依存性プロバイオティクス特性
図5シリコでシミュレートしたLABの食事依存性プロバイオティクス特性
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