機能性T細胞は、超多数細胞分裂と長寿が可能である
公開日：2023年1月18日
機能性T細胞は、超多数細胞分裂と長寿が可能である
https://www.nature.com/articles/s41586-022-05626-9
アンドリュー・G・ソエレンス、マルコ・キュンツリ、...デビッド・マソプスト 著者紹介を表示する
Nature (2023)この記事を引用する
236 Altmetric
指標詳細
概要
分化した哺乳類体細胞は、種特異的な分裂制限を持つと考えられており、がん化を防ぐ一方で、寿命を制限している可能性がある1,2,3。CD8+T細胞は、一過性の刺激を受けると、異常な速さで細胞分裂を繰り返し、その後、静止状態の長寿命メモリー細胞を形成し、その後の免疫学的チャレンジの際に再増殖できる態勢を維持する。我々は、T細胞が時間的あるいは細胞分裂的な制約を本質的に受けているのかどうかを調べた。我々は、マウスのT細胞を、急性異種混成プライムブーストブーストワクチン接種により生体内で活性化し4、膨張した細胞を新しいマウスに移植し、このプロセスを繰り返した。10年以上（マウスの寿命を大幅に超える）5、51回の接種を繰り返しても、T細胞はワクチン接種に応答する能力を維持していた。このとき、T細胞は刺激と刺激の間に十分な休息を必要とした。このように、T細胞は少なくとも1040倍に増殖する可能性があるにもかかわらず、増殖制御の喪失は見られず、若い細胞の混入に起因する結果ではありませんでした。慢性感染症や癌による持続的な刺激は、T細胞の増殖性老化、機能的枯渇、死を引き起こす可能性がある6。私たちは、反復的な急性刺激によって、この細胞でも消耗型マーカー（PDCD1とも呼ばれるPD1やTOXなど）の持続的発現とエピジェネティックなリモデリングが誘導されるものの、依然として増殖、抗菌機能の実行、静止メモリー細胞の形成が可能であることを見いだした。これらの結果は、メモリー細胞の分化、疲弊、がん、老化をよりよく理解するためのモデルを提供するとともに、機能的に有能なT細胞は、生物としての寿命をはるかに超えて、並外れた集団拡大と長寿の可能性を保持できることを示すものである。
主な内容
哺乳類の体細胞がどの程度まで増殖できるのかについては、これまで議論がなされてきた。ニワトリ胎児の心臓細胞が試験管内で何十年も増殖し続けるという初期の報告は、生物は老化するが、細胞は不死であることを示唆していた7,8。このセンセーショナルな実験は再現性がなく、細胞の形質転換や新鮮な細胞の継続的な導入が原因であるとされた9。文献10の著者らは 10の著者らは、2倍体細胞の不死性を一応否定し、ヒトの細胞は50〜60回に制限されるという分裂カウンターを報告した。これは「ヘイフリック限界」と呼ばれ、テロメア短縮3,11が原因であるとされ、癌を減らすが寿命は制限されると提案されている。また、種特異的なin vitro細胞分裂限界と長寿（マウス細胞は分裂回数が少なく、カメ細胞は多い）には相関があるとされている2, 12, 13。種特異的な寿命の制限は、複製依存性のDNA変異を含む他の基本的な生物学的プロセスに内在している可能性がある。例えば、マウスは3年の寿命の間に細胞あたり同程度のDNA変異を蓄積し、ヒトは80年の寿命の間に蓄積することから、おそらく保存された寿命の境界線が明らかになった14。細胞の長寿や増殖能力を阻害するその他の要因としては、プロテオスタシスや代謝的適性の喪失が挙げられる。
CD8+Tリンパ球は、何年も静止状態を維持することができるが、活性化後数分で分化プログラムに取り組み、その後、異常な数の急速な細胞分裂を蓄積する。一次活性化された細胞は、約15-20回の細胞分裂のプログラムバーストを行い、少なくとも1日に3回の細胞分裂が可能である15。この結果、大規模なクローン拡大が起こり、適応免疫に特徴的な特異性と記憶の基礎となる。T細胞の累積分裂能が本質的に有限か無限かは、慢性あるいは反復する感染症の制御、癌、ワクチンブースティング、加齢に伴う免疫老化、養子細胞療法に関連するとともに、哺乳類の細胞生物学に関する基本的な疑問である。
1970年代以降、T細胞が時折培養で維持されることが報告されているが16,17、これが形質転換の結果かどうかは議論されており18、in vitroでの増殖限界と生物学との関連性には疑問が呈されている19,20。抗癌T細胞を試験管内で増殖させるという初期の試みは、巨大な集団を生み出したが、患者への移植時には生存率が低かった21,22,23。これは、T細胞が耐久性のある「幹細胞性」を持たないことに起因するとされている24,25。異種の娘細胞を生み出す能力を持つ抗原経験豊富なT細胞は、幹細胞と呼ばれ、移植時に耐久性と拡張性のある生着が得られる26。メモリー幹細胞」は通常、CD62Lを含むナイーブT細胞と共通のマーカーを持つとされているが、無制限の分裂能を持つという性質は検証されていない27。実際、慢性感染症や癌に反応する内在性T細胞は、増殖能の低下、エフェクターサイトカインの発現能の低下、免疫標的の除去不能によって定義されるin vivoでの「疲弊」を進行させる6。休眠状態のメモリーT細胞を連続的に継代し、生体内で一過性の感染症で刺激した場合、4-7世代以内にそれ以上の刺激に反応しなくなる4,28,29。これらのデータは、抗原刺激が慢性的であろうと周期的であろうと、T細胞の増殖能には本質的な限界があるというモデルを支持している。しかし、この結果は特定の実験条件に依存している可能性がある30。
増殖と長寿の可能性
我々は、老化、疲弊、死が累積的な刺激、分裂、あるいは種の寿命の制約による必然的な結果なのか、あるいはT細胞が本質的に無限に増殖する可能性を持っているのかを検証したいと考えた。我々は、慢性的刺激と累積的刺激の潜在的に異なる効果を分離し、種の寿命の制限を乗り越え、中和抗体の干渉と豊富な記憶T細胞集団による抗原の競合を克服して、繰り返し強力なCD8+ T細胞のブーストを可能にする実験を計画した。CD45.1+のC57Bl/6雌マウスに、3種類の異種プライムブースト免疫（水疱性口内炎ウイルス亜型ニュージャージー（VSVnj）； VSV Indiana（VSVind）核タンパク質を発現するワクシニアウイルス（VVn）；および VSVind（方法参照））を60日以上間隔に免疫した結果、VSV30の「N52-59」ペプチドに対して特異的に豊富に増殖し長寿の3°メモリCD8+T細胞集団が形成されることになった。その後、H-2Kb/N52-59主要組織適合性複合体Iテトラマー+CD8+T細胞を脾臓とリンパ節から選別し、1×105をコンジェニックCD45.2レシピエントに移植し、その後60日以上の間隔で3回の追加免疫（4° VSVind, 5° VVn, 6° VSVnj）を受けた。C57Bl/6雌マウスは約1100日しか生きられないが5、CD45.1+集団が免疫後に増殖能力を失うことがなかったため、この選別、移植、3回の免疫のプロセスを合計51回の累積免疫イベントとして約10年間続けることができた（図1a）。これらの細胞はまた、非リンパ性組織にも存在していた（Extended Data Fig.） これらのデータから、T細胞の増殖能は、由来集団の年齢や刺激イベントの回数によって制限されないことが示された。
図1: CD8+T細胞は、刺激と刺激の間に休ませると、一見無制限に増殖することができる。
図1
a, CD45.1+ VSV/N52-59特異的メモリーCD8+ T細胞を繰り返し選別し、CD45.2+マウスに移植し、3回の異種免疫のそれぞれの間に60日以上おいてマウスあたり3回ブースティングした。グラフは、血中の総リンパ球のうち、移植されたCD45.1+反復ブースト細胞（赤）または新たに生成したCD45.2+レシピエントH-2Kb/N52-59特異的細胞（青）からなる割合である。N-tet+ = H-2Kb/N52-59-tetramer。 b,c, 28-34日（b）または7日（c）間隔でブーストを行った以外はaの場合と同様。同様の結果が、13、21、31回（60日以上間隔）、または15回（28-34日間隔）の刺激を受けた後続コホートで観察された。 cは、3°でn = 4、6°と9°でn = 3で同様の結果を得た2つの実験の代表例である。エラーバーは平均とs.e.m.を示す。フローサイトメトリーのゲーティング戦略については、補足図1を参照。a,bの各時点での正確なマウス数については、Supplementary Table 1を参照のこと。
ソースデータ
フルサイズ画像
次に、ブースト間に60日以上の間隔が必要であるかどうかを検証した31。各免疫の間隔を28〜34日とした以外は、図1aと同様にワクチン接種、細胞選別及び移植を実施した。51回の刺激により、継続的な拡大性が実質的に失われることはなかった（図1b）。しかし、7日ごとのブーストでは、急激に増殖能が低下した（Fig. 1c）。これらのデータから、繰り返しの刺激はT細胞の老化や死滅につながるが、この運命は生物学的に必須ではないことがわかった。
細胞周期の完全性
細胞増殖はテロメアの短縮を伴い、それによって細胞の老化が引き起こされ、癌が予防され、寿命が制限されると提唱されてきた。このパラダイムに疑問を呈する人もいる19,32,33。活性化T細胞を含む多くの分裂細胞は、テロメラーゼを発現している34,35,36。我々は、種を越えたT細胞集団の中で、50回以上の実質的な増殖のバーストを観察したので、定量的PCR37によってテロメア長を調べた。その結果、テロメア長は維持されていた(Fig. 2a)。反復的な移入は、一見、未転移の細胞を追い出すがん細胞を選択するように見える。我々は、反復刺激したT細胞（ISTC）に細胞追跡用色素を負荷し、その後刺激を与えずにマウスに移植した。34日後、ISTCは増殖制御を失った形跡はなく、実際、一次記憶細胞よりも恒常的なターンオーバーが少なかった（Fig. 2b）。さらに、ISTC集団は耐久性があるものの、膨張性はなかった(Fig. 2c)。このように、メモリーT細胞は、悪性化したり耐久性を失うことなく、何年もかけて多くの分裂を蓄積することができる。
図2: 反復的にブーストされたT細胞は、テロメア長、細胞周期制御および耐久性を維持している。
図2
a, Naive、3°メモリー、33°メモリーCD8+T細胞を選別し、定量的PCRでテロメア長を調べ、Mus spretus参照DNAと比較した。 b, 3°および48°細胞を分裂追跡色素CellTrace Violetで標識し、さらなるブーストなしでレシピエントに移植した。比較のため、初代リンパ球性絨毛膜炎ウイルス（LCMV）特異的P14メモリーCD8+ T細胞も移植した。c, 45°および内因性3°メモリーCD8+T細胞は、感染後173日間、血液中で追跡した。エラーバーは平均値とs.e.m.を示す。フローサイトメトリーのゲーティング戦略については、補足図2を参照。
ソースデータ
フルサイズ画像
表現型の進化
未形質転換細胞の不滅の増殖という初期の主張は、後に若い細胞の連続的な播種に起因するとされた9。我々は、一次免疫マウスに固有の遺伝的にコードされたマーカーの組み合わせ(CD45.1+CD45.2-; Fig. 1a)で、すべての移植前にISTCを選別することによってこの可能性に対処した。さらに、ブースティングは遺伝子発現の漸進的な変化と関連しており、優勢な若いT細胞集団の混入は否定された（図3aおよび拡張データ図2）。変化はタンパク質レベルでも観察された。ISTCは、CD62Lを欠き、「老化マーカー」KLRG1を発現していたため、一次免疫応答を支配する中心記憶T細胞や幹記憶T細胞に関連する表現型には似ていなかった（図3b）。さらに、各世代は、PD1、TIM3（HAVCR2としても知られる）、TOXなど、T細胞の疲弊を規定すると考えられている分子を徐々に獲得していった（Fig.3c）。
図3: 反復ブースティングにより、遺伝子やタンパク質の発現が徐々に変化し、疲弊マーカーが獲得される。
図3
a、漸進的ブーストを経験したナイーブおよびN特異的メモリーCD8+ T細胞についてRNA-seqを実施した。b,c, 血液から分離したナイーブ細胞および様々な世代のH-2Kb/N52-59特異的メモリー細胞の表現型をフローサイトメトリーにより評価した。すべてのサンプルは、ずらしたコホートから同じ日に実行された。a, n = 3/群 b,c, n = 3 (7°), n = 4 (3°, 12°, 19° and 31°) または n = 9 (51° and naive) の代表値で、少なくとも2回の独立した実験で同様の結果を得ている。フローサイトメトリーのゲーティング戦略については、補足図3を参照。
フルサイズ画像
免疫機能の維持
PD1は、最近のT細胞受容体刺激に応答して発現し、慢性的な抗原刺激によって維持される38。このワクチン接種レジメンの後に抗原が持続することは知られていないため、反復的な急性ブースト後にPD1の発現がエピジェネティックに維持されるかどうかを検証した。ISTCが1回のブースト後300日以上レシピエントマウスで休息したとき、PD1は維持されていたが、同じマウス内の同じ抗原に特異的な内在性一次記憶CD8+T細胞はPD1を欠いていた（図4a）。また、Pdcd1遺伝子座のCpGジヌクレオチドが脱メチル化され、クロマチンにアクセス可能になっていることも確認された（図4b,c）。これらのデータは、ISTCが慢性抗原にさらされた疲弊したT細胞を模倣していることを示しているが、その根底にある制御は異なっている可能性がある。RNA配列解析およびフローサイトメトリー解析により、ISTCはマウスの慢性ウイルス感染で報告されている疲弊プログラムを部分的にしか獲得していないことが明らかになった（図4d,e）。ISTCは、抗原に応答して増殖する能力を維持していたため、疲弊したT細胞とは異なっていました（図1）。実際、CellTrace Violet標識の3°および48°ISTCを移植したところ、1回の追加ブーストで同程度の割合の細胞が≧8分裂を起こした（図4f）。さらに、ISTCは、ex vivoペプチド刺激後4-5時間以内にインターフェロンγ（IFNγ）および実質的な腫瘍壊死因子（TNF）エフェクターサイトカインを産生する能力を失わず（図4g）、微生物感染を制御する能力も低下していなかった（図4h）。
図4：転写、エピジェネティック、および機能的プロファイリングにより、ISTCと疲弊したT細胞は区別される。
図4
a, 18° CD45.1+ ISTCを、VSVindによる単回免疫の前にナイーブマウスに移植した。317日後、ISTCと内在性VSV/N52-59特異的一次メモリーCD8+T細胞およびナイーブCD8+T細胞を、血中PD1発現の維持について評価した。 b,c, ナイーブ、3°またはISTC細胞におけるPdcd1遺伝子座（PD1コード）のメチル化（b）またはクロマチン接近性（c）はそれぞれ、バイサルファイトシーケンスまたはシーケンサーによるトランスポゼアクセス性クロマチン測定（ATAC-sequ）により評価された。RNA-seqで測定したPdcd1 RNAも示している。Mb、メガベース。 d、疲弊したCD8+T細胞（Tex）42によって発現が増加または減少すると報告された遺伝子と共有または非共有である遺伝子発現モジュール。 f、3°または48°細胞をCellTrace Violet分裂追跡色素で標識し、次にVSVindに感染したレシピエントに移した。g, ペプチド刺激4時間後のIFNγとTNFの染色。代表的なフローサイトメトリー（左図）およびペプチド滴定に対する応答（右図）。 h、ISTCまたは内因性VSV／N52-59特異的3°メモリー細胞をナイーブマウスに移植し、これをVSV-N（LM-N）を発現するListeria monocytogenesに静脈内感染し、そして5日（5d）後に脾臓における細菌負荷について評価した。 c.f.u.., n = 3 (a,c,d,g), n = 4 (b,e), n = 4 (4°) または 5 (49°) (f), n = 9 (3°) または 10 (移植なしおよび 33°) (h). a,e-g は≧2類似実験の代表、 b-d は単一の実験からのデータ、 g は2実験からのデータの結合である。群間の有意性を検定するために、対数10変換したデータにダネットの多重比較検定を用いた通常の一元配置分散分析を行った；**P = 0.0086 (3°) または P = 0.0028 (33°). エラーバーは平均とs.e.m.を示す。フローサイトメトリーゲーティング戦略については、補足図4を参照。完全な統計テストの詳細については、補足情報3を参照。
ソースデータ
フルサイズ画像
考察
これらのデータは、T細胞が本来、無制限ともいえる集団の拡大能力を持ち、宿主生物よりも実質的に長生きすることを証明している。他の体細胞もこのような可能性を示すかどうかは不明である。予想外に、増殖制御を失ったISTCを検出できなかったことから、抗原経験のあるT細胞は、特に形質転換前の事象に反応して細胞死を引き起こす態勢にあるのではないかという疑問が湧いてきた。このような生物学的特徴は、長期間にわたる静止状態と、急激な増殖の繰り返しの後、増殖した集団の大部分がプログラム死するという、T細胞の特異な生活様式に対応しているのかもしれない。おそらくISTCは、時間や経験による制約をはるかに超えて細胞の体力を維持するだけでなく、癌から身を守るための生物学に情報を提供することができるだろう。
それにもかかわらず、ISTCは時間と刺激履歴によってエピジェネティックに、転写的に、そして表現型的に変化した。ISTCは、メモリーT細胞の「幹」27に関連する標準的なマーカーを失い、T細胞の疲弊と機能不全に関連するマーカーを獲得した6 (Fig. 3)。ISTCは、細胞単位ではナイーブT細胞やセントラルメモリーT細胞と同等に増殖しないようだが(図1a)、48回のブーストで増殖能力や持続的メモリー形成能力が累積的に低下するようなことはなかった(図2c)。この結果は、T細胞幹細胞の概念を否定するものではないが、自己複製能と、これまで長寿や増殖適性を維持する能力に関連するマーカーとを分離するものである。また、ISTCは、増殖能力、機能、抗原非依存性長寿によって定義される疲弊と、慢性感染症や癌で特徴付けられる疲弊細胞に共通する表現型とを分離している。ヒトでも機能的なPD1+ T細胞が観察されているが、これは異種再感染や病原体の再増殖によって繰り返し刺激を受けた細胞である可能性がある39,40。
T細胞の老化、疲弊、死は、慢性的な刺激、極端な年齢、休息を挟んで繰り返される刺激のあるモデルで頻繁に観察される4,6,28,29,30,41。我々の結果は、これらの運命が回避可能であることを示している。実際、ISTCは3回のブーストごとに希釈されていたため、控えめに見積もっても、未免疫マウス内に存在する約200個のH-2Kb/N52-59特異的ナイーブCD8+ T細胞のそれぞれが、1041個の51°静止メモリーCD8+ T細胞（拡張データ図3）、つまり地球上の3万倍の総細胞量を生み出す増殖能を持っていたことがわかる。ISTCは、T細胞の永続的な増殖能と長寿を可能にするパラメータを解明するモデルであり、また、体力維持のための広範な生物学的メカニズムを明らかにするものである。
研究方法
マウス
B6.SJL-PtprcaPepcb/BoyJ (CD45.1+ B6) とP14 CD8+ T細胞トランスジェニックマウスは、ミネソタ大学の動物施設で繁殖させた雌のドナーである。雌のC57BL/6J（CD45.2+ B6）マウスはJackson Laboratoriesから購入し、最初の感染時に8〜10週齢であったレシピエントマウスとして使用した。動物は、14時間の明期と10時間の暗期のサイクルで飼育された。環境は、温度68〜72°F、湿度30〜70%に維持された。動物は、Institutional Animal Care and Use Committeeのガイドラインに従って扱われ、プロトコルはミネソタ大学のInstitutional Animal Care and Use Committeeの承認を受けた。
ウイルス感染
CD45.1+三次記憶細胞は、106プラーク形成ユニット(p.f.u.)のVSVnj、実験特異的休息期間、2×106 p.f.u. VVn、実験特異的休息期間、107 p.f.u. VSVindの異種プライム・ブースト・ブースト感染で増殖させた。レシピエントCD45.2+マウスに移植後、106p.f.u.のVSVind、実験特異的休息期間、2×106p.f.u.のVVn、実験特異的休息期間、107p.f.u. VSVnjでヘテロプライムブーストブースト感染させて細胞を増殖させた。すべての異種プライムブーストブースト感染は、尾静脈から送達された。LCMVアームストロング感染については、2×105p.f.u.を腹腔内注射で投与した。LCMVクローン13については、BioXCell社製の抗マウスCD4（GK1.5）200μgを、2×106p.f.u.のウイルスによる尾静脈感染の前日および後日に腹腔内注射でマウスに投与した。
ISTCの追跡
感染後の様々な時点で、顎下静脈から血液を採取した。赤血球をACK溶解バッファーを用いて溶解し、血球をBD Biosciencesの抗マウスCD8a (53-6.7; 1:100), BioLegendの抗マウスCD44 (IM7; 1:200), 抗マウスCD45を含む種々の抗体で常に染色した。 1（A20；1：400）、Tonbo Biosciences社製Ghost Dye Red 780（1：1,000）、VSVind核タンパク質由来のH2Kb結合RGYVYQGLペプチドと主要組織適合性複合体Iテトラマー（N-テトラマー；1：200）である。主要組織適合性複合体4量体は、以前に記載したように調製した43。フローサイトメトリーデータは、BD LSR II、BD Fortessa、または Cytek Aurora で収集し、BD FlowJo を使用して解析した。細胞移植後、ISTCの値は、移植された細胞数および10％生存率に基づいて計算され、一方、内在性細胞の値は、B6マウスにおけるナイーブH2Kb/RGYVYQGL結合細胞の報告数に基づいて計算された44。
蛍光活性化セルソーティングと細胞移植
ドナーマウスの脾臓および巨視的リンパ節から単細胞懸濁液を調製した。いくつかのケースでは、サンプルを表面抗体で染色する前に、赤血球をACK溶解バッファーで溶解させた。また、CD8+ T細胞をネガティブセレクションにより濃縮してから表面抗体で染色した場合もある。CD8+ T細胞の濃縮は、Stem Cell EasySep Mouse CD8+ T Cell Isolation Kitを用い、製造元の説明書に従って、またはビオチン化抗体の調製したカクテルを用いて実施された。簡単に言うと、単細胞懸濁液を、2％熱不活性化ウシ胎児血清（Peak Serum）および1mM EDTA（Promega）を添加したリン酸緩衝食塩水（Gibco）中に1ミリリットル当たり108細胞で再懸濁し、5％ラット血清（Stem Cell）、および0. 0275 mg ml-1の抗マウスCD4（GK1.5）をInvitrogen社から、抗マウスCD19（1D3）、抗マウスCD11b（M1/70）、抗マウスNK1.1（PK136）、抗マウスF4/80（BM8.1）、抗マウスTER119、抗マウスCD45R（RA3-6B2）、抗マウスLY6G（GR1）と抗マウスCD16／32（2.4G2）をトンボ・バイオサイエンシズから入手した。すべての抗体はビオチンにコンジュゲートされていた。抗体インキュベーション後、Stem Cell EasySep Mouse Streptavidin RaphidSpheres Isolation kit を用いて、抗体結合細胞をメーカーの説明書に従って除去した。その後、BD Biosciences社製の抗マウスCD8a (53-6.7; 1:200), 抗マウスCD45.1 (A20; 1:200), 抗マウス CD45.2 (104; 1:200), N-tetramer (1:200), Tonbo Biosciences社製のGhost Dye Red 780 (1:1,000) で細胞染色をした。生CD8a+VSV-N-tetramer+CD45.1+CD45.2-細胞をBD FACS Aria IIでソーティングし、ソーティングした105個の細胞をレシピエントマウスに尾静脈から移植した。翌日から感染を再開した。
定量的PCRによるマウステロメア長の測定
テロメア長は、先に述べたプライマー（Integrated DNA Technologies社により合成）とコントロール遺伝子を含む定量的PCRを用いて測定した37。データは QuantStudio 5 システム (Applied Biosystems) を用いて収集した。単離した M. spretus の DNA は、Jackson Laboratories から購入し、比較的短いテロメアを持つマウスの DNA 源とした。
細胞へのCellTrace Violetのラベリング
脾臓および巨視的リンパ節から分離した細胞の単細胞懸濁液の細胞を、製造者の指示に従ってCellTrace Violet（Invitrogen）で標識した。CellTrace Violetで標識した細胞を尾静脈からマウスに移植した。
RNA-seq
Qiagen RNeasy Plus Micro kitを使用して、105個のソートされた細胞からバルクRNAを製造者の指示に従って単離した。ライブラリーは、Takara/Clontech Stranded Total RNA-seq pico input mammalian kitを使用して調製した。Naive、1°、3°、27°の細胞はキットバージョン1を、それ以外のサンプルはキットバージョン2を用いて調製した。キットバージョン1で調製したサンプルはIllumina HiSeqで、キットバージョン2で調製したサンプルはIllumina NovaSeq 6000で配列決定した。fastqファイルの品質は、FastQCで評価しました。アダプターおよび低品質セグメントは、Trimomaticでトリミングした。フィルタリングされたリードは、Hisat2を用いてマウスゲノムGRCm38にアライメントし、featureCountsを用いてカウントマトリックスを作成した。その後の遺伝子発現データ解析は、すべてRソフトウェアで行った。低レベルで発現した遺伝子は、filterByExpr関数を用いてフィルタリングし、edgeRでTMM-normalizeした。差次的発現遺伝子はlimmaを用いて決定した。RNA-seq サンプルは 2 バッチで配列決定した。log[fold change] > 1、false discovery rate < 0.05の場合、有意な差とみなした。ヒートマップは、ComplexHeatmapパッケージで作成した。RNA-seqサンプルの1回目と2回目の間でバッチ効果に気づいた。しかし、2つのナイーブグループ間の遺伝子発現差解析では、差次的に発現した遺伝子はわずかであり、そのほとんどが未定義遺伝子またはリボソーム遺伝子であることから、観察されたバッチ効果が我々の解析に影響を及ぼしていないことが示された。
フローサイトメトリーによる細胞表現型判定
ACK溶解バッファーで処理した血液細胞または脾臓細胞のいずれかを用いて、フェノタイピングを実施した。細胞は、以下の様々な組み合わせで細胞外に染色した：抗マウスCD8a (53-6.7; 1:100), 抗マウスCD4 (GK1.5; 1:1,000), 抗マウスCD45.1 (A20; 1:400), 抗マウスCD45.2 (GK1.3; 1:1,000). 1（A20；1：400）、抗マウスCD122（TM-β1；1：100）、抗マウスCD62L（MEL-14；1：800）、抗マウスKLRG1（2F1；1：200）BD Biosciences製、抗マウスCD44（IM7；1：200）、抗マウスCD38（90；1：100）、抗マウスCD45. 1（A20；1：400）、抗マウスCD28（E18；1：100）、抗マウスPD1（RMP1-30；1：100）、抗マウスCD200R（OX-110；1：50）、抗マウスTIM3（RMT3-23；1：100）BioLegend、抗マウスCD45. 1（A20；1:400）、抗マウスCD127（A7R34）（1:100）、抗マウスCD45. 2（104；1：200）、Tonbo Biosciences社製Ghost Dye Red 780（1：1，000）、リンパ球性絨毛膜炎ウイルス由来のN-テトラマーまたはH2Db結合KAVYNFATMペプチド（GP33-テトラマー）、Tonbo Foxp3/Transcription Factor Staining Kitを用いて固定・透過化、Tonbo Permeabilization bufferで細胞内染色し抗 マウスTOX（TXRX10；1: Invitrogen社製の抗マウスEOMES（Dan11mag；1：50）、eBioscience社製の抗マウスBCL-2（10C4；1：50）、Cell Signaling Technology社製の抗マウスTCF1/TCF7（C63D9；1：50）である。フローサイトメトリーデータは、BD FortessaまたはCytek Auroraのいずれかで収集し、BD FlowJoで解析した。
ATAC-seq
ATAC-seqは、以前に記載されたプロトコル45に従って実施された。トランスポーズドDNAのライブラリー調製は、Nextera DNAライブラリー調製キットを用いて、製造者の説明書に従って実施した。サンプルは、Illumina HiSeqで配列決定した。FastQCは、fastqファイルの品質を評価するために使用した。リードはbowtie2を用いてマウスゲノム（UCSCバージョンmm10）にアライメントし、リードごとに有効なアライメントを行い、許容ミスマッチ数を1に設定した。Samtoolsはマッピングされたリードのみを含むソート済みbamファイルの生成に使用し、重複のマークにはPicardが使用された。その後のデータ解析はすべてRソフトウェアで行った。ブラックリスト領域とミトコンドリアリードは、200塩基対のウィンドウ幅を使用してcsawでピーク領域を呼び出す前に除去された。また、アクセス可能なクロマチン内のリードのバックグラウンドに対する濃縮度が生物学的サンプルグループによって大きく異なるため、log[c.p.m.] TMMスケールピークカウントを既述のようにquantile-normalizationした46。アクセス性の差の解析はlimmaで行い、ピーク領域は隣接するウィンドウの最大距離を200塩基対にして結合した。ゲノム領域はGvizを使用してプロットした。
PD1メチル化解析
精製細胞からゲノムDNAを単離し、Zymo EZ DNA methylation kitを用い、製造元の指示に従い、重亜硫酸塩処理を施した。重亜硫酸塩処理したDNAは、PD1プロモーター特異的プライマーを用いてPCR増幅した47。このアンプリコンをTAベクターにクローニングし、細菌に形質転換した。個々のコロニーからのベクターは、以前に記述したように、BISMAソフトウェア（Bremen, Germany）を用いて配列決定し、分析した47。
In vitro サイトカイン刺激
顎下静脈から血球を採取し、ACK溶解バッファーを用いて赤血球を溶解し、5%熱不活性化牛胎児血清、2 mM L-グルタミン、100 U ml-1 ペニシリン-ストレプトマイシンおよび 0.05 mMβ-メルカプトエタノールで補充したRPMIに細胞を再懸濁させた。細胞を96ウェルプレートのウェルに加え、Tonbo BiosciencesからのブレフェルジンAとNew England Peptide Inc（現在Vivitideと命名）で合成された様々な濃度のRGYVYQGL VSV-Nペプチドを含む培地で最終濃度3μMのブレフェルジンAと標識濃度のペプチドを生成した。4〜5時間後、細胞を細胞外にBD Biosciences社製の抗マウスCD8a（53-6.7；1：100）、抗マウスCD45.1（A20；1：400）、抗マウスCD45. 2 (104; 1:400)、Tonbo Biosciences社製Ghost Dye Red 780 (1:1,000) およびN-tetramer (1:200) を用いて固定・透過化し、Tonbo Permeabilization buffer中でBD Biosciences社製TNF (MP6-XT22; 1:100) とBioLegend社製IFNγ (XMG1.2; 1:100) で細胞内染色を実施した。フローサイトメトリーデータは、BD Fortessaで収集し、BD FlowJoソフトウェアで分析した。
リステリア菌の保護
105個に選別したN特異的細胞を移植した1日後に、VSV-Nを発現するL. monocytogenesのコロニー形成ユニット7×103個（LM-N）を尾静脈からマウスに注射した。LM-N感染5日後に脾臓を摘出し、滅菌した0.5% Igepal CA-630 (Sigma Aldrich) でホモジナイズして細胞を溶解させた。細胞ホモジネートの様々な希釈液を、製造者の指示に従って調製したBBL Brain Heart Infusion Agar（BD Biosciences）を入れたペトリ皿にプレーティングし、37℃で一晩培養し、翌日にコロニーを数えた。
非リンパ組織解析
非リンパ性組織は、既述49のようにBD Biosciences社製の血管内抗CD8a抗体（53-6.7）3μgを使用して単細胞懸濁液を調製するなど、既述48と同様に処理した。各組織からの単細胞懸濁液を、BD Biosciencesからの抗マウスCD8a (53-6; 1:00), Tonbo Biosciencesからの抗マウスCD45.1 (A20; 1:200) およびGhost Dye Red 780 (1:1,000), Invitrogenからの抗マウスCD69 (H1.2F3; 1:50) および N-tetramer (1:200) によって細胞外染色した。フローサイトメトリーデータは、BD Fortessaで収集し、BD FlowJoソフトウェアで解析した。
データ測定
経時的に追跡した細胞は、異なる感染後に、異なるマウス内の細胞集団に対して行われた目立たない測定で繰り返し測定された。
統計手法
サンプルサイズを決定するための統計的検定は行わなかった。マウスは無作為に異なる実験群に割り当てられた。研究者は実験グループに対して盲検化されていない。有意性、グループサイズ（n）およびP値を決定するために使用された特定の統計的検定は、図の説明で提供されている。P値＜0.05、有意。すべての統計解析は、Prism（GraphPad）を用いて行った。
報告書の概要
研究デザインに関する詳細な情報は、この記事にリンクされているNature Portfolio Reporting Summaryに掲載されています。
データの入手方法
本研究の結果を裏付けるデータは、合理的な要求があれば、対応する著者から入手可能である。配列データはGEO（アクセッション番号GSE213230）で入手可能です。ソースデータは本論文に添付されています。
参考文献
Stanley, J. F., Pye, D. & MacGregor, A. 培養動物細胞が達成する倍加数と種の寿命の比較。Nature 255, 158-159 (1975).
論文
ADS
CAS
Google Scholar
Röhme, D. 哺乳類の長寿とin vitroの正常線維芽細胞およびin vivoの赤血球の寿命の間に関係があることの証拠。Proc. Natl Acad. Sci. USA 78, 5009-5013 (1981).
論文
ADS
Google Scholar
Bodnar, A. G. et al.正常ヒト細胞へのテロメラーゼ導入による寿命の延長。サイエンス 279, 349-352 (1998).
論文
ADS
CAS
Google Scholar
Masopust, D., Ha, S.-J., Vezys, V. & Ahmed, R. Stimulation history dictates memory CD8 T cell phenotype: implications for prime-boost vaccination.J.Immunol.誌によれば、CD8 T細胞の刺激履歴は、メモリーCD8 T細胞の表現型を決定する。J. Immunol. 177, 831-839 (2006).
論文
CAS
Google Scholar
C57BL/6Jマウスの老年学的データ。生存曲線における性差。J. Gerontol. 30, 157-162 (1975).
論文
CAS
Google Scholar
McLane, L. M., Abdel-Hakeem, M. S. & Wherry, E. J. CD8 T cell exhaustion during chronic viral infection and cancer（慢性ウイルス感染と癌によるCD8 T細胞の消耗）。Annu. Rev. Immunol. 37, 457-495 (2019).
論文
キャス
Google Scholar
Carrel, A. On the permanent life of tissues outside of the organism. J. Exp. Med. 15, 516-528 (1912).
論文
CAS
Google Scholar
エベリング、A.H. 10年前の線維芽細胞株。J. Exp. Med. 35, 755-759 (1922).
論文
CAS
Google Scholar
Witkowski, J. A. Dr. Carrelの不死細胞。Med. Hist. 24, 129-142 (1980).
論文
CAS
Google Scholar
ヘイフリック、L.＆ムーアヘッド、P.S.ヒト二倍体細胞株の連続培養。Exp. 細胞研究 25, 585-621 (1961).
論文
CAS
Google Scholar
テロメアの長さは、ヒト線維芽細胞の複製能力を予測する。Proc. Natl Acad. Sci. USA 89, 10114-10118 (1992).
論文
ADS
CAS
Google Scholar
Goldstein, S. Aging in vitro growth of cultured cells from the Galapagos tortoise（ガラパゴスゾウガメの培養細胞の老化）。Exp. Cell Res. 83, 297-302 (1974).
論文
Google Scholar
テロメアとテロメラーゼ：現代の若返りの泉か？Rejuv. Res. 7, 126-133 (2004).
論文
Google Scholar
Cagan, A. et al. 体細胞突然変異率は、哺乳類の寿命に比例する。Nature 604, 517-524 (2022)。
論文
ADS
CAS
Google Scholar
Boer, R. J. D., Homann, D. & Perelson, A. S. 急性リンパ球性絨毛膜炎ウイルス感染時および感染後のCD4+/CD8+ T細胞応答の異なる動態。J. Immunol. 171, 3928-3935 (2003).
論文
Google Scholar
Morgan, D. A., Ruscetti, F. W. & Gallo, R.正常ヒト骨髄からのTリンパ球の選択的in vitro増殖。サイエンス 193, 1007-1008 (1976).
論文
ADS
CAS
Google Scholar
Gillis, S. & Smith, K. A. 腫瘍特異的細胞傷害性T細胞の長期培養。Nature 268, 154-156 (1977).
論文
ADS
CAS
Google Scholar
Effros, R. B., Dagarag, M., Spaulding, C. & Man, J. The role of CD8+ T-cell replicative senescence in human aging.（ヒトの老化におけるCD8+ T細胞の複製老化の役割）。Immunol. Rev. 205, 147-157 (2005).
論文
CAS
Google Scholar
Rubin, H. ヒト細胞の試験管内での老化と生体内での寿命のある複製との間の不一致。Nat. Biotechnol. 20, 675-681 (2002).
論文
CAS
Google Scholar
老化と疲弊は絡み合っているのか、それとも免疫力を低下させる無関係なプロセスなのか？Nat. Rev. Immunol. 11, 289-295 (2011).
論文
CAS
Google Scholar
Rosenberg, S. A. et al.転移性黒色腫患者の免疫療法における腫瘍浸潤リンパ球およびインターロイキン-2の使用（Use of tumor-infiltrating lymphocytes and interleukin-2 in the immunotherapy of patients with metastatic melanoma. N. Engl. J. Med. 319, 1676-1680 (1988).
論文
CAS
Google Scholar
Rosenberg, S. A. et al. 自己腫瘍浸潤リンパ球およびインターロイキン2による転移性メラノーマ患者の治療。 J. Natl Cancer Inst. 86, 1159-1166 (1994).
論文
CAS
Google Scholar
Dudley, M. E. & Rosenberg, S. A. Adoptive-cell-transfer therapy for the treatment with cancer（がん患者に対する養子細胞移植療法）。Nat. Rev. Cancer 3, 666-675 (2003).
論文
CAS
Google Scholar
Zhang, Y., Joe, G., Hexner, E., Zhu, J. & Emerson, S. G. Host-reactive CD8+ memory stem cells in graft-versus-host disease（移植片対宿主病における宿主反応性CD8+メモリー幹細胞）. Nat. Med. 11, 1299-1305 (2005).
論文
CAS
Google Scholar
Gattinoni, L. et al. Wntシグナルは、エフェクターT細胞の分化を停止させ、CD8+メモリー幹細胞を生成する。Nat. Med. 15, 808-813 (2009).
論文
CAS
Google Scholar
Gattinoni, L. et al. 幹細胞様の性質を持つヒトメモリーT細胞サブセット。Nat. Med. 17, 1290-1297 (2011).
論文
CAS
Google Scholar
Graef, P. et al. Serial transfer of single-cell-derived immunocompetence reveals stemness of CD8+ central memory T cells.は、CD8+セントラルメモリーT細胞の幹細胞性を明らかにした。Immunity 41, 116-126 (2014).
論文
CAS
Google Scholar
Wirth, T. C. et al. 繰り返しの抗原刺激により、トランスクリプトームは段階的に多様化するが、メモリーCD8+ T細胞分化のコアシグネチャーは維持される。Immunity 33, 128-140 (2010).
論文
CAS
Google Scholar
Rai, D., Martin, M. D. & Badovinac, V. P. The longevity of memory CD8 T cell responses after repetitive antigen stimulations. J. Immunol. 192, 5652-5659 (2014).
論文
キャス
Google Scholar
Fraser, K. A., Schenkel, J. M., Jameson, S. C., Vezys, V. & Masopust, D. Prexisting high frequencies of memory CD8+ T cells favor rapid memory differentiation and preservation of proliferative potential upon boosting.（既存の高頻度のメモリーCD8+ T細胞は、ブースティング時に迅速なメモリー分化と増殖能の保存に有利である）。Immunity 39, 171-183 (2013).
論文
CAS
Google Scholar
異種ブースティングの間隔が短いと、メモリーCD8 T細胞の機能は維持されるが、寿命は短くなる。J. Immunol. 196, 3054-3063 (2016).
論文
キャス
Google Scholar
Rubin, H. Telomerase and cellular lifespan: ending the debate? Nat. Biotechnol. 16, 396-397 (1998).
論文
CAS
Google Scholar
Mondello, C. et al. 健康な百寿者の線維芽細胞および血液細胞におけるテロメア長。Exp. Cell Res. 248, 234-242 (1999).
論文
CAS
Google Scholar
Weng, N. P., Levine, B. L., June, C. H. & Hodes, R. J. ヒトTリンパ球の発生と活性化におけるテロメラーゼ活性の制御された発現。J. Exp. Med. 183, 2471-2479 (1996).
論文
CAS
Google Scholar
Weng, N., Hathcock, K. S. & Hodes, R. J. TおよびB細胞におけるテロメア長およびテロメラーゼの制御：複製能維持のための機構。Immunity 9, 151-157 (1998).
論文
CAS
Google Scholar
Hathcock, K. S., Kaech, S. M., Ahmed, R. & Hodes, R. J. Induction of telomerase activity and maintenance of telomere length in virus-specific effector and memory CD8+ T cells.ウイルス特異的エフェクターおよびメモリーCD8+ T細胞におけるテロメラーゼ活性の誘導と長さの維持。J. Immunol. 170, 147-152 (2003).
論文
CAS
Google Scholar
Callicott, R. J. & Womack, J. E. Real-time PCR assay for measurement of mouse telomeres（マウスのテロメア測定のためのリアルタイムPCRアッセイ）。Comp. Med. 56, 17-22 (2006).
CAS
Google Scholar
Bally, A. P. R., Austin, J. W. & Boss, J. M. PD-1発現の遺伝的およびエピジェネティックな制御。J. Immunol. 196, 2431-2437 (2016).
論文
CAS
Google Scholar
Duraiswamy, J. et al. 健康なヒト成人におけるプログラム死-1hi CD8 T細胞の表現型、機能、および遺伝子発現プロファイル。J. Immunol. 186, 4200-4212 (2011).
論文
CAS
Google Scholar
関根 哲也 他：TOXは、疲弊し多機能化したヒトエフェクターメモリーCD8+T細胞で発現している。Sci. Immunol. 5, eaba7918 (2020).
論文
CAS
Google Scholar
Lee, K. et al. Tim-3およびPD-1の発現増加によって定義される加齢に伴う疲弊したCD8+ T細胞の特徴. Aging Cell 15, 291-300 (2016).
論文
CAS
Google Scholar
Bengsch, B. et al. Epigenomic-guided mass cytometry profiling reveals disease-specific features of exhausted CD8 T cells.エピゲノム誘導型マスサイトメトリープロファイリングにより、疲弊したCD8T細胞の疾患特異的な特徴が明らかになった。Immunity 48, 1029-1045 (2018).
論文
キャス
Google Scholar
Altman, J. D. & Davis, M. M. MHC-peptide tetramers to visualize antigen-specific T cells. Curr. Protoc. Immunol. 115, 17.3.1-17.3.44 (2016).
論文
Google Scholar
Obar, J. J., Khanna, K. M. & Lefrançois, L. Endogenous naive CD8+ T cell precursor frequency regulates primary and memory response to infection.（内因性ナイーブCD8+ T細胞前駆体頻度が感染に対する一次および記憶応答を制御する）。Immunity 28, 859-869 (2008).
論文
CAS
Google Scholar
ATAC-seq：クロマチンアクセシビリティをゲノムワイドにアッセイするための手法。Curr. Protoc. Mol. Biol. 109, 21.29.1-21.29.9 (2015)に掲載されました。
論文
Google Scholar
Künzli, M. et al. 長寿命のT濾胞ヘルパー細胞は可塑性を保持し、体液性免疫の維持に貢献する. サイエンス・イムノア. 5, eaay5552 (2020).
論文
Google Scholar
Youngblood, B. et al.ウイルス慢性感染は、抗原特異的CD8+T細胞においてPD-1をコードする遺伝子座の脱メチル化を強制的に行う。Immunity 35, 400-412 (2011).
論文
CAS
Google Scholar
Steinert, E. M. et al. メモリーCD8 T細胞の定量化により、免疫監視の地域化が明らかになった。Cell 161, 737-749 (2015).
論文
キャス
Google Scholar
Anderson, K. G. et al. 血管内染色による血管白血球と組織白血球の識別。Nat. Protoc. 9, 209-222 (2014).
論文
キャス
グーグルスカラー
参考文献のダウンロード
謝辞
D.M.およびV.V.の研究室の皆様には、有益なご意見をいただきました。また、細胞選別を行ったミネソタ大学Flow Cytometry resourceに感謝する（J. Motl, T. Martin and R. Arora）。本研究は、National Institutes of HealthのR01 AI084913, R01 AI146032 (D.M.) and T32HL007741 (A.G.S.), and Swiss National Science Foundation grant P2BSP3_200187 (M.K.) から支援を受けている。
著者情報
著者および所属
免疫学センター、微生物学・免疫学部門、ミネソタ大学、ミネアポリス、米国
Andrew G. Soerens、Marco Künzli、Clare F. Quarnstrom、Milcah C. Scott、Lee Swanson、JJ. Locquiao, Vaiva Vezys & David Masopust
オハイオ州立大学医学部微生物感染症・免疫学科（米国オハイオ州コロンバス
Hazem E. Ghoneim
ミュンヘン工科大学ヴァイエンシュテファン生命科学部動物生理学・免疫学部門（ドイツ・フライジング
Dietmar Zehn
米国テネシー州メンフィス、セント・ジュード小児研究病院、免疫学部門
Benjamin Youngblood
寄稿
A.G.S., M.K., C.F.Q., M.C.S., L.S., J.L. and H.E.G. は実験を行い、データを分析し、可視化を準備した。B.Y.は、データの解析と可視化資料の作成を行った。D.Z.は試薬の作成と共有を行った。A.G.S.、M.K.、V.V.、D.M.は実験の設計と原稿執筆を行った。
共著者
David Masopustに連絡する。
倫理的宣言
利益相反
著者らは、競合する利害関係を宣言していない。
査読
査読情報
Natureは、この論文の査読に貢献したSusan Kaechと他の匿名の査読者に感謝します。
その他の情報
出版社からのコメント Springer Natureは、出版された地図や所属機関に関する管轄権の主張に関して中立的な立場を維持しています。
エクステンデッドデータ 図と表
Extended Data 図1 相互に刺激されたT細胞は、非リンパ系組織に移入する。
a) CD45.1+ 48° ISTCメモリーCD8 T細胞をナイーブマウスに移植し、その後、3回の異種プライムブーストブースト免疫を行っている。51°ブーストの48日後に非リンパ組織を分析した。フローサイトメトリープロットは、血管内in vivo抗体標識で染色されなかった生きたCD8a+リンパ球をゲートとしている。 b) 内生3°細胞（CD45.1-）と48°メモリーCD8 T細胞（CD45.1+）でのCD69発現。プロットは、4匹のマウスから連結して、実験は、同様の結果を持つ3つの同様の実験の代表となる。
Extended Data 図2 反復刺激されたCD8 T細胞の遺伝子セット濃縮解析。
Gene Ontologyデータベースの「Biological process」カテゴリーを用いて、45°ISTCと初代メモリー細胞の間で差次的に発現する遺伝子についてGene set enrichment analysisを行った。ISTCにおける発現上昇（活性化）および発現低下（抑制）の上位20パスウェイを示した。統計的な有意性は、Over-Representation分析を用いて判定した。
Extended Data 図3 1個のナイーブCD8 T細胞は、1040個以上のメモリー細胞子孫を産生する可能性を示している。
a) 51回のHPBB免疫後の細胞増殖能の推定を示す模式図。HPBB: Heterologous Prime, Boost, Boostの3回連続免疫。 b) 地球の体積と、ナイーブCD8 T細胞の増殖能の計算から推測されるメモリーT細胞の理論的体積を比較した模式図。
補足情報
補足情報1
このファイルには、Fig.1-4で用いたゲーティングスキームを示すSupplementary Fig.1-4と、Fig.1a,bの各時点での動物数を示すSupplementary Table 1が含まれている。
報告書の概要
補足情報2
45°細胞と3°細胞、1°細胞またはナイーブCD8+T細胞の間で差次的に発現する遺伝子を列挙したファイルである。Empirical Bayes moderationを用いて、有意性を検定した。
補足情報3
Fig.4gに対して行った統計の詳細を示す拡張統計結果。
ソースデータ
ソースデータ Fig.
ソースデータ Fig.
ソースデータ Fig.
権利と許可
Springer Natureまたはそのライセンサー（学会またはその他のパートナー）は、著者またはその他の権利者との出版契約に基づき、本論文の独占的権利を有する。本論文の受理済み原稿の著者によるセルフ・アーカイブは、かかる出版契約の条項および適用法のみによって管理される。
転載と許可
この記事について
クロスマークで通貨と真偽を確認する
この記事の引用
Soerens, A.G., Künzli, M., Quarnstrom, C.F. et al. Functional T cells are capable of supernumerary cell division and longevity（機能的なT細胞は、過剰な細胞分裂と長寿が可能である。ネイチャー (2023). https://doi.org/10.1038/s41586-022-05626-9
引用文献のダウンロード
受領日
2022年7月1日
受理済み
2022年12月05日
公開日
2023年1月18日発行
DOI
https://doi.org/10.1038/s41586-022-05626-9
この記事が気に入ったらサポートをしてみませんか？