腸内細菌叢由来のウルソデオキシコール酸は、M2マクロファージの極性を高めることで低出生体重児誘発性大腸炎を緩和させる
公開日：2023年1月31日
腸内細菌叢由来のウルソデオキシコール酸は、M2マクロファージの極性を高めることで低出生体重児誘発性大腸炎を緩和させる
https://microbiomejournal.biomedcentral.com/articles/10.1186/s40168-022-01458-x#article-info
Yu Pi, Yujun Wu, ...Junjun Wang 著者を表示する
マイクロバイオーム11巻、記事番号：19（2023）この記事を引用する
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指標詳細
概要
背景
低出生体重児（LBW）は、出生後の腸の炎症および腸内細菌の異常と関連している。しかし、そのメカニズムはほとんどわかっていない。
目的
本研究では、胆汁酸（BA）の代謝、治療効果、作用機序について、子豚モデルでLBW誘発性腸管炎を対象に検討することを目的とした。
研究方法
LBWと正常出生体重（NBW）の新生児ブタの糞便マイクロバイオームおよびBAプロファイルを比較した。糞便微生物叢移植（FMT）により、微生物のBA代謝と腸管炎症の関連性をさらに確認した。LBW子豚とNBW子豚でBA濃度が異なるウルソデオキシコール酸（UDCA）の大腸炎症改善効果をLBW子豚、LBW-FMTマウスモデル、DSS誘発大腸炎マウスモデルで評価し、治療可能なBA濃度がLBW子豚とNBW子豚で異なることを示した。また、DSS投与マウスおよびマクロファージ細胞株を用いて、UDCAが腸の炎症を抑制する背景にある細胞および分子メカニズムについても検討した。16S リボソーム RNA 配列決定法を用いてマイクロバイオーム解析が行われた。糞便および腸内のBAプロファイルは、ターゲットBAメタボロミクスによって測定された。J774A.1細胞において、ファルネソイドX受容体（FXR）のレベルを低分子干渉RNAでノックダウンした。
結果
子豚モデルにおいて、LBWと正常出生体重の動物との間で、糞便中のマイクロバイオームとBAプロファイルの両方に有意な差があることを示す。抗生物質投与マウスにLBW子豚のマイクロバイオータを移植すると、腸の炎症が引き起こされる。重要なことは、LBW子豚の腸管で減少した主要なBAであるUDCAを経口投与すると、M2マクロファージの極性を誘導することにより、LBW子豚、LBW-FMTマウスモデルおよび大腸炎マウスにおいて腸の炎症が顕著に緩和されることであった。UDCAは、マクロファージのNF-κB活性化を抑制しながら、BA受容体FXRに関与して炎症性サイトカイン産生を抑制するメカニズムが明らかになった。
結論
これらの知見は、LBWに伴う腸の異常とdysbiosisの因果関係を確立し、腸内細菌叢とBA代謝を標的とすることにより、LBW児の腸の健康と生後発育不全を回復させることができる可能性が示唆された。
ビデオ アブストラクト
はじめに
子宮内発育不全（IUGR）は、発展途上国で約30％、先進国で約8％の有病率で、世界中で公衆衛生上の重大な関心事となっています[1]。IUGRは、妊娠中の哺乳類の胚・胎児または胎児器官の成長と発達を損ない、ヒトだけでなく家畜種においても低出生体重（LBW）［2］、成長の遅れ、出生後の乳児の永久的な発達不全を引き起こします［3］。世界保健機関では2500g未満の乳児をLBWと定義しており[4]、壊死性腸炎などの消化器系障害を伴うことが多い[3]。家畜種の中でブタは最も多くのIUGR発生を示し、自然発生するIUGR子豚の成長遅延のパターンは、IUGRヒト新生児に自然に発生するものと非常に似ており [5,6] 、出生前および出生後のIUGR、すなわち胎児プログラミングおよび栄養介入に関する研究の動物モデルとして確立されています [7,8,9]. LBW子豚では、生後12時間の間に炎症反応が高まります[10]。さらに、LBWは、成長段階の豚における炎症性サイトカイン（例えば、IL-1βおよびTNF-α）の産生の増加および上皮バリア機能不全に関連する後腸の健康も損なう［11, 12］。
哺乳類の腸、特に大腸には、多数の細菌（消化物1g当たり約1010〜1012個）が高い多様性（400以上の細菌種）を持って生息している[13, 14]。腸内マイクロバイオームが担う多くの重要な機能の1つは、一次胆汁酸（BA）の脱共役とそれに続くデオキシコール酸（DCA）やリトコール酸（LCA）などの二次胆汁酸への生変換です [15, 16]。一部のLactobacillus属、Erysipelotrichaceae、Lachnospiraceae、Clostridium、Bacteroidesは胆汁酸塩ヒドロラーゼ（bsh）遺伝子を、他のLactobacillus属、Lachnospiraceae、Ruminococcaceae、Clostridiaceae、Eubacterium、Peptostreptococcusは7αデヒドロキシラーゼ活性のBA誘導型（bai）オペロンを搭載している[17,18,19]。潰瘍性大腸炎やクローン病などの炎症性腸疾患（IBD）における微生物によるBA代謝異常の関与については、広く研究されている[20]。IBD患者の糞便中の共役BA濃度は健常者よりも高く、二次BA濃度はIBD関連微生物群の脱共役および変換能力の障害により低くなっています[20]。
しかし、これらの微生物-BA-疾患との関連についてのメカニズム的な理解は不足しています。したがって、腸疾患におけるBAの役割と腸内細菌叢との関係を解明し、治療法の可能性を探る必要があります[21]。生後間もないLBW豚とNBW豚では、腸内細菌叢の構成や糞便中のメタボロームが異なることが知られている[22, 23]。また、LBW児ではBAsの総量や合成量が減少していることが多い[24, 25]。BAsは自然免疫の細胞を直接制御することがよく知られており、farnesoid X receptor (FXR) のリガンドとして作用する [26, 27]。FXRの活性化は、その後、LPSでプライミングされたマクロファージからのIL-1β、IL-6、TNF-αの放出を抑制する[28, 29]。しかし、LBWにおける微生物のBA代謝やLBWにおける腸管炎症の亢進へのBAの関与はほとんど不明である。
我々は、LBW子豚とNBW子豚の腸内細菌叢組成の違いが、腸管におけるBA代謝を変化させ、LBW子豚の腸管炎症亢進をもたらすと仮定した。この仮説を検証するために、ターゲットBAメタボロームプロファイリングとマイクロバイオーム解析を採用し、生後2日目のLBW子豚とNBW子豚の腸内のBAプロファイルとマイクロバイオータ組成の違いを調査した。さらに、DSS誘発大腸炎マウスモデルと細胞培養モデルを用いて、LBW子豚で過剰に減少する二次BAであるウルソデオキシコール酸（UDCA）が腸の炎症を制御する役割とその潜在的背景を探りました。これらの研究により、LBWにおける腸内細菌叢およびBA代謝の異常が明らかになり、LBWに伴う発育不全の原因が解明されるとともに、LBWによる腸内炎症および出生後の発育不全の予防・治療に対する新しいアプローチが提供されることが期待されます。
材料と方法
子豚と糞便サンプルの採取
14頭の多産婦（Landrace × Large White；2-4分割）から、妊娠113-114日後にDuroc ×（Landrace × Large White）の子豚を合計14産子として自然分娩させた。母豚には NRC の勧告に従ったトウモロコシ-大豆粕ベースの飼料を与え、自由に水を飲めるようにし た。新生子豚の体重は出生直後に記録し、各子豚からLBW子豚（0.75∼0.95 kg）とNBW子豚（1.35∼1.55 kg）を1頭ずつ選び、同じハウスで個別飼育を行った。本試験では交配は行わなかった。母豚および子豚は、実験期間中、抗生物質やその他の薬剤を投与されることはなかった。LBW子豚14頭およびNBW子豚14頭の新鮮な糞便サンプルを2日目に滅菌綿棒により末端直腸から採取し、2つに分け、一方は液体窒素で瞬間冷凍した後、マイクロバイオームおよびBAプロファイリング分析まで-80℃で保存し、もう一方は便中マイクロバイオータ移植（FMT）に使用した。
糞便微生物叢の移植
LBWおよびNBW子豚の新鮮な糞を、15％グリセロール（v/v）を含む滅菌PBSで個別に5倍に希釈し、ホモジナイズして分注し、将来のマウスへのFMTのために-80℃で保存した。合計16匹の4週齢の雄のC57BL/6 SPFマウス(Biotechnology Co., Ltd., Beijing, China)を、抗生物質(Meilun Bio., Dalian, China) (1 g/L streptomycin, 0.5 g/L ampicillin, 1 g/L gentamicin, and 0.5 g/L vancomycin) で処置して腸の微生物相を枯渇させて、記載されているようにした[30]。抗生物質は飲料水で希釈し、1日おきに補充した。2週間の投与後、血液寒天培地、McConkey寒天培地、Luria-Bertani（LB）ブロス（Beijing Land Bridge Technology Ltd., Beijing, China）を用いた従来の細菌培養により、マウスの細菌枯渇が確認された。さらに，QIAamp DNA Stool Mini Kit（Qiagen, Valencia, CA, USA）を用いて糞便から微生物DNAを抽出し，記載されているように真正細菌のユニバーサルプライマーを用いた定量PCR（qPCR）により総菌数を定量化した[31]．FMTについては、マイクロバイオータ枯渇マウスに、個々のLBWまたはNBWドナーからの糞便微生物懸濁液0.2 mLを隔日に1回、4週間経口接種し、1処理あたり8匹を投与した。マウスは2日ごとに個別に体重を測定し、試験終了時に大腸消化物および組織を採取し、さらなる分析を行った。
DSS誘発マウス大腸炎およびウルソデオキシコール酸（UDCA）処理
合計24匹の8週齢の雄C57BL/6 SPFマウスを、コントロール群、デキストラン硫酸ナトリウム（DSS）群、DSS＋UDCA（Sigma-Aldrich, St Louis, MO, USA）浣腸群（50 mg/kg BW）を含む3群にランダムに分割した（n = 8）。急性実験性大腸炎は、3% DSS (36-50 kDa; MP Biomedicals, Santa Ana, CA, USA) を飲料水中に入れて7日間自由摂取させることで誘発した。実験期間中、毎日体重を測定した。急性大腸炎は、疾患活動性指数（DAI）（補足表S1）、結腸長、および組織学的スコアリングシステムを用いて、以前に記載されたように評価した[32]。8日目にマウスを犠牲にし、長さ測定のために全大腸を摘出した。結腸下部の2cmセグメントを採取し、4％パラホルムアルデヒドで固定し、病理組織学的検査のために処理した。
LBW子豚へのUDCA投与
合計 10 頭の多産婦（Landrace × Large White; 2~4 parities）に、NRC 推奨のトウモロコシ-大豆粕ベースの飼料を与え、実験期間中、自由に水にアクセスできるようにした。妊娠113〜114日目の母豚から10頭のDuroc × (Landrace × Large White)の子豚が自然分娩で誕生した。分娩直後に新生子豚の体重を記録し、各子豚から2匹のLBW子豚（0.75〜0.95 kg）を得て、1 mLの生理食塩水を経口投与する対照群と1 mLのUDCA（50 mg/kg BW）を毎日投与するUDCA群にランダムに割り付けた（各群n = 10）。すべての子豚は同じ環境に収容された。本試験では、交配は行わなかった。母豚および子豚のいずれも、実験期間中、抗生物質やその他の薬剤を投与されなかった。8日目に、各群から6匹の子豚を無作為に選び、体重測定後に犠牲にして大腸組織を採取した。組織サンプルは、さらなる分析まで-80℃で保存した。
マウスのマクロファージの枯渇
マクロファージの枯渇は、3％DSS処理の2日前、およびDSS処理中の1日目と4日目に、0.2mLのクロドロネートリポソーム（Liposoma BV, Amsterdam, The Netherlands）をマウスに腹腔内注射することにより、記載されているように行った[33]。動物を、対照群、DSS群、DSS＋UDCA群、DSS＋マクロファージ枯渇群、およびDSS＋UDCA＋マクロファージ枯渇群を含む5群にランダムに分けた（各群n＝8）。8日目にマウスを犠牲にしてサンプル収集を行い、上記のようにさらに解析を行った。
糞便微生物叢移植およびウルソデオキシコール酸（UDCA）処理
4週齢の健康な雄のC57BL/6 SPFマウスを合計40匹選択した。1週間の適応期間の後、2週間の抗生物質による腸内細菌叢の枯渇、4週間のNBWまたはLBWの糞便微生物叢のFMTを行った。関連する実験方法は、上記の説明を参照。マウスを、NBW-FMT群、LBW-FMT群、LBW-FMT＋UDCA群、LBW-FMT＋マクロファージ枯渇群、LBW-FMT＋UDCA＋マクロファージ枯渇群（各群n＝8）の5群に分けた。UDCA処理については、マウスに毎日0.2mLのUDCA溶液（50mg/kg BW）を経口投与した。マクロファージの枯渇は、UDCA投与2日前、UDCA投与中の1日目と4日目に実施した。UDCA投与8日目に、すべてのマウスを犠牲にし、体重を測定した後、大腸組織を採取した。組織サンプルは、さらなる解析まで-80℃で保存した。
細胞培養と処理
マウスJ774A.1マクロファージは、10％牛胎児血清（Gibco, Carlsbad, CA, USA）および1％ペニシリン／ストレプトマイシン（Invitrogen, Carlsbad, CA, USA）添加DMEM中、37℃、5％CO2で培養された。細胞を6ウェルプレート（Corning, Corning, NY, USA）に2×105細胞/プレートで一晩播種し、その後1μg/mL LPSおよび1mM UDCAを個別にまたは組み合わせてさらに24時間処理し、RNAおよびタンパク質抽出、その後のRT-qPCR、RNA配列決定、ウェスタンブロットおよびフローサイトメトリ解析用に細胞を収集した。
RNA干渉
マクロファージは、Lipofectamine® 3000試薬（Thermo Fisher Scientific．San Jose, CA, USA）を用い，6ウェルプレートにスクランブルsiRNAを導入し，1 mM UDCA処理を24時間行った．上清中のIL-1β濃度はELISA法により測定した。細胞サンプルは、IL-1βの遺伝子発現、p65、p-p65、FXRのタンパク質発現のために採取された。
BAsの定量分析
糞便および大腸消化物中のBAsを、以前に記載されたようにプロファイリングした[34]。簡単に言えば、MassLynx 4.1 ソフトウェア (Waters, Milford, MA, US) によって制御される ESI ソースを備えた Waters XEVO TQ-S 質量分析計と結合した Waters ACQUITY UPLC をすべての分析に使用した。クロマトグラフィー分離は、Waters ACQUITY BEH C18 カラム (1.7 μm, 100 mm × 2.1 mm 内径) を用いて実施した。ネガティブモードで得られた生データは、Waters TargetLynx Application Manager（バージョン4.1）を用いて解析し、検量線と各サンプル中の異なるBAsの濃度を取得しました。
腸内細菌叢の解析
QIAamp Fast DNA Stool Mini Kit (Qiagen Ltd., Hilden, Germany) を用いて、糞便および大腸消化物中の全微生物ゲノムDNAを抽出した。16S rRNA遺伝子のV3-V4領域をユニバーサルプライマー341F（5′-ACTCCTACGGAGGCAGCAG-3′）および806R（5′-GGACTACHVGGTWTCTAAT-3′）を用いて増幅させた。生配列は、QIIME 2 (version 2020.2) [35]を用いて解析された。初期リードは、quality filtered、denoised、assembleを行い、Deblur [36]を用いてキメラ配列を除去し、ユニークなamplicon sequence variants (ASVs) [36]を生成させた。最低2本のリードを持ち、2つ以上のサンプルに存在するASVのみが保持された。系統樹は、Silva 138データベースに対してSEPPアルゴリズムを用いて、デフォルト設定の下で作成した[37]。腸内細菌叢の機能的可能性は、PICRUSt2[38]を用いて予測した。すべてのデータは、Majorbio I-Sanger Cloud Platform (https://cloud.majorbio.com/)で解析された。生シーケンスリードは、子豚の糞便についてはPRJNA646844、FMT後のマウスの大腸消化物についてはPRJNA714049のアクセッション番号でNCBI Sequence Read Archive (SRA) データベースに寄託された。
病理組織学的検査
大腸組織サンプルは4％パラホルムアルデヒドで24時間固定し、その後脱水、パラフィン包埋、切片化、ヘマトキシリン・エオジンまたは過ヨウ素酸シッフ（PAS）染色を行った。その後の顕微鏡評価は、経験豊富な病理医が盲目的に行った。組織損傷の程度は、以前に記載されたようにスコア化された[39]。腸表面の上皮欠損、クリプト破壊、および炎症性細胞の浸潤の程度を評価し、病理組織学的検査に含めた（補足表2）。
フローサイトメトリー解析
フローサイトメトリー解析は、既報の通り行った[40]。簡単に言うと、大腸組織をミンチにして、5mM EDTAと1mM DTTを含むハンクのバランス塩溶液（HBSS）中で37℃、30分間インキュベートして、上皮細胞を解離させた。100μmのセルストレーナーでろ過した後、残った断片を0.05%コラゲナーゼD（Roche, Shanghai, China）および0.05%DNase I（Roche, Shanghai, China）を含むRPMI培地で穏やかに振盪しながら30分間インキュベーションした。J774A.1細胞サンプルについては、実験処理後、1サンプルあたり約1×106個の細胞を回収した。細胞懸濁液は、70μmのセルストレーナーを通過させ、その後のフローサイトメトリー解析のために回収した。前庭単核細胞（LPMC）またはJ774A.1細胞は、以下の抗体で染色した。APC抗マウス/ヒトCD11b (Biolegend/M1/70), PE抗マウスCD11c (Biolegend/N418), PE抗マウスF4/80 (Biolegend/BM8), およびAPC抗マウスCD206 (MMR) (Biolegend/C068C2) を用いて染色した。CD11b+CD11c+細胞はM1マクロファージとし、F4/80+CD206+細胞はM2マクロファージとして扱った[40]。
RNA抽出とRT-qPCR
大腸組織または J774A.1 細胞から TRIzol（Takara Bio, Otsu, Japan）を用いて Total RNA を抽出し， PrimeScript® RT Reagent Kit with cDNA Eraser（Takara Bio, Otsu, Japan）を用いて 1 μg RNA を逆転写した．RT-qPCR は、ABI 7300 real-time PCR system (Applied Biosystems, Foster, CA, USA) で遺伝子特異的プライマー (補足表 3) と SYBR Green マスターミックスを用いて実施した。遺伝子発現の相対的な倍数変化は、先に述べたように、サイクル閾値（Ct）法および参照遺伝子としてのβ-アクチンまたはGAPDHを用いて計算された。
RNA配列決定
RNA配列決定のために、6ウェルプレート中のJ774A.1細胞を、LPS（1μg/mL）ありまたはなしで1mMのUDCAで24時間処理し、全RNAをTRIzolを用いて分離し、RNA品質を2100 Expert Bioanalyzer (Agilent, Palo Alto, CA, USA) で評価して、商業ライブラリ調製のために送り、Illumina HiSeq 2000でMajorbio Biotech（上海、中国）により配列決定を受けた。短いシーケンスリードは、Majorbio I-Sanger Cloud Platform (https://cloud.majorbio.com/)で解析された。GOアノテーション[41]に基づき、生物学的プロセス、細胞成分、および分子機能に関連する差次的発現遺伝子（fold change ≥ 2およびFDR < 0.05）を分析した。免疫反応関連遺伝子は、KEGGパスウェイ[42]に基づいて解析された。RNA 配列データは NCBI の Gene Expression Omnibus (GEO) にアクセッション番号 GSE174489 で寄託された。
酵素結合免疫吸着測定法(ELISA)
マウス大腸組織およびJ774A.1マクロファージ細胞培養物中のIL-1β、TNF-αおよびIL-6の濃度は、それぞれカタログ番号88-7013-88、88-7324-88および88-7064-88 (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA) の特定のELISAキットで製造者の説明書に従って測定された。
タンパク質抽出とウェスタンブロット解析
凍結マウス大腸組織およびJ774A.1細胞ペレットを液体窒素下で乳鉢と乳棒を用いて粉砕し、プロテアーゼ阻害剤のカクテルを含むRIPA緩衝液（150 mM NaCl, 1% Triton X-100, 0.5% deoxycholate sodium, 0.1% SDS, 50 mM Tris-HCl, pH 7.4) で溶解した (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA)。13,000×g, 4℃で10分間遠心分離した後、BCA Protein Assay Kit (Beyotime Biotechnology, Beijing, China) を用いて上清液中のタンパク質濃度を測定した。ウェスタンブロットでは、等量のタンパク質（30μg）をあらかじめ染色したタンパク質マーカーとともにSDS-PAGEにかけ、ポリビニリデン・ジフルオライド（PVDF）膜（Millipore, Billerica, MA, USA）に転写し、TTBS（20 mM Tris/150 mM NaCl, 0.1% Tween-20, pH 7.5）で室温、5％無脂乳にて1時間ブロッキングを行った。膜を、一次抗体、FXR（猫番号72105、1：1000）、p65（猫番号6956、1：1000）、p-p65（猫番号3033、1：1000）、p38（猫番号8690、1：1000）、p-p38（猫番号4511、1：1000）とともにインキュベートした。4511、1：1000）、ERK1/2（猫番号4695、1：1000）、p-ERK1/2（猫番号4370、1：2000）、JNK1/2（猫番号9252、1：1000）、およびp-JNK1/2（猫番号4668、1：1000）4℃で穏やかに揺らしながら一晩培養した。すべての一次抗体は、Cell Signaling Technology (Danvers, MA, USA)から購入した。TTBSで3回洗浄した後、膜を、西洋わさびペルオキシダーゼ標識二次抗体（Goat anti-Rabbit IgG, Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA）と1：5000希釈で1時間、室温でインキュベートした。Supersignal West Dura Extended Duration Substrate (Pierce, Rockford, IL, USA) を用いてシグナルを発現させた。Alpha Imager 2200 (Alpha Innotech, San Leandro, CA, USA) を用いて化学発光を検出・定量し、各サンプルのβ-アクチン発現量に対して正規化した。
統計解析
すべての統計的有意性は、一元配置分散分析（ANOVA）、その後の一対比較のためのポストホックテューキーテスト（SPSS 20ソフトウェア、IBM、Armonk、NY、USA）を使用して評価した。すべての結果は、平均値±SEMで表した。P < 0.05の場合、差は統計的に有意であるとみなされた。直交部分最小二乗法-判別分析（OPLS-DA）を、処置群間の腸内BAプロファイルを判別するために実施した。散布図はGraphPad Prism 6.0を用いて作成した。
結果
腸内BA代謝はNBW豚とLBW豚で異なっていた
LBW子豚でBA代謝がシフトしているかどうかを調べるために、UPLC-MSを用いてNBWおよびLBW子豚の2日目の糞便のBAsのターゲットプロファイリングを実施した。子豚の糞便中に同定された合計40種のBAsのうち、大半（75％）はLBW子豚よりもNBW子豚の方が高いレベルを示した（Supplemental Fig.1A）。OPLS-DA解析では、Q2Y値0.511、R2Y値0.819と満足のいく結果が得られ（補足図1B）、BAプロファイルはNBW豚とLBW豚で明確に分離した（Fig. 1A）。相対存在量の結果から観察される子豚の糞便中の主要なBAsは、HCA、HDCA、UDCAである（Fig. 1B）。全体として、一次BAs、二次BAs、および総BAsの濃度はLBW群で有意に減少していたが、総BAsに対する一次BAs、総BAsに対する二次BAs、および一次BAs/二次BAsの比率はNBW豚とLBW豚で有意差がなかった (Fig. 1C)．さらに、2群の子豚の間で、VIP値が1以上の13個の高分離能BAが同定された（補足図1C）。LBW子豚はNBW子豚と比較して、VIP値が最も高い6つのBA（UDCA、HDCA、HCA、CDCA、7-Keto LCA、βUDCA）が有意に減少した（P < 0.01）(Fig. 1D and Supplemental Fig. 1D)。これらの結果は、腸管におけるBA代謝がNBW子豚とLBW子豚で異なることを示唆している。
Fig.
figure 1
生後2日目の低出生体重児（LBW）および正常出生体重児（NBW）の糞便中胆汁酸（BA）プロファイル（n = 10）。A糞便中胆汁酸プロファイルのOPLS-DAスコアプロット。B NBWおよびLBW子豚の糞便中のBAsの相対的な存在量。C 一次BAs、二次BAs、総BAsの濃度、および一次BAsと総BAs、一次BAsと二次BAsの比率を示した。D最も差のある6種類の糞便中BAsのバイオリンプロット。データはパネルCおよびDにおける平均値±SEMで示される。
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FMTはLBWに特徴的な腸内細菌叢と大腸の炎症をマウスで再現する
LBW子豚の腸内細菌叢が腸管炎症を惹起するかどうかを調べるため、抗生物質投与マウスにLBWまたはNBW子豚から調製した糞便微生物叢を用いてFMTを行い、腸内細菌叢の枯渇を試みた（図2A）。予想通り、抗生物質のカクテルを2週間経口投与したマウスは、培養可能な細菌（補足図2A）および細菌のDNA量（補足図2B）が明らかに減少し、糞便中の総菌数が4log減少していた（補足図2C）。FMTは、実験全体を通して、LBW-FMTマウスとNBW-FMTマウスの間で飼料摂取量に差を生じなかった（P > 0.05）（補足図2D）。しかし、LBW-FMTマウスの体重は、FMT後24日目からNBW-FMTマウスの体重と比較して有意に減少した（P < 0.05）（図2B）。NBW-FMTマウスの大腸はほぼ健全であったが、LBW-FMTマウスは杯細胞が少なく、組織学的スコアが有意に高かった（図2C）。また、LBW-FMTマウスは、大腸において炎症性サイトカイン（IL-1β、TNF-α）の発現が有意に上昇し、ムチン2（MUC2）およびBA受容体（FXR）が低下した（P＜0.05）（Fig. 2D）.....。
図2
図2
NBWおよびLBW子豚の抗生物質投与マウスへの糞便微生物叢移植（FMT）が腸内細菌組成および腸の健康状態に及ぼす影響（n = 8）。A 実験デザインの概略。B FMT後のマウスの体重変化。C FMT後のマウスの代表的なH&E染色（50×倍率）、PAS染色（50×および100×倍率）、大腸切片の組織学的スコア、杯細胞数。D FMT後のマウスの大腸における炎症、バリア機能、胆汁酸受容体に関連する遺伝子のmRNA発現量。ドナー子豚とレシピエントマウス間のマイクロバイオーム（E）、LBW子豚とNBW子豚の糞便マイクロバイオーム（F）またはFMT後のマウスの大腸マイクロバイオーム（G）をBray-Curtis距離に基づいて主座標分析（PCoA）プロットしたもの。LBW群とNBW群間（H）またはLBW-FMT群とNBW-FMT群間（I）のWilcoxon rank-sum検定に基づく細菌属の濃縮度の差分。データは平均値±SEMで示した。*p < 0.05、**p < 0.01。LBW-FMT：LBW子豚の糞を移植したマウス、NBW-FMT：NBW子豚の糞を移植したマウス
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NBW子豚とLBW子豚、NBW-FMTマウスとLBW-FMTマウスの間の微生物叢組成の違いをさらに調べるため、糞便および大腸消化管細菌DNAを用いてそれぞれ16S rRNA遺伝子シーケンスを行ったところ、十分なシーケンス深度を示した（Supplemental Fig.3A）。LBW子豚の糞便微生物叢のACE、Chao1、Shannon indexなどのα-diversity指標はNBW子豚のそれよりも顕著に高かったが（P < 0.05）(Supplemental Fig. 3B)、LBW-FMTマウスとNBW-FMTマウスではα-diversityに大きな変化はなかった（Supplemental Fig. 3C)。全体として、NBW子豚とLBW子豚の間の糞便サンプルおよびNBW-FMTマウスとLBW-FMTマウスの間の結腸消化器サンプルの微生物叢構造には、ブレイ・カーティス、重み付きユニフラック距離および重みなしユニフラック距離（ANOSIM、P < 0.05）に基づいて明確な分離が見られた（図2Eおよび補足図3DとG）。特に、Bray-Curtis (ANOSIM, P < 0.05), weighted unifrac distance (ANOSIM, P < 0.05) and unweighted unifrac distance (ANOSIM, P = 0.10) に基づく微生物相構造の明確な分離がNBWとLBW豚の間で観察された (Fig. 2F and Supplemental Fig. 3D and G)。2F and Supplemental Fig. 3E and H）、また、LBW-FMT群とNBW-FMT群の間で、Bray-Curtis距離、weighted unifrac距離、unweighted unifrac距離における微生物相の明確な分離（ANOSIM、P < 0.05）が認められた（図2Gおよび補足図3Fおよび図4I）。微生物相は，LBWおよびNBW子豚ではFirmicutesとBacteroidotaの2系統（補足図4A）およびEscherichia-Shigella，Bacteroides，Streptococcusの3属で占められていたのに対し，LBW-FMTおよびNBW-FMTマウスではDubosiella，norank_f_MuribaculaceaeおよびLactobacillusを含む3属が占めた（補足図4B）．LBW子豚はNBW子豚に比べ、Bacteroidotaの相対量が有意に増加し、Proteobacteriaの相対量が減少した（q < 0.05）(Supplemental Fig. 4C)。しかし、LBW-FMTマウスはNBW-FMTマウスと比較して、Actinobacteriotaの相対量が有意に増加し、DesulfobacterotaとVerrucomicrobiotaが減少した（Supplemental Fig.4D）．属レベルでは、LBW子豚はNBW子豚と比較して、Bacteroides、Lactobacillus、Veillonellaの存在量が有意に高く、Escherichia-Shigella、Clostridium sensu stricto 2、Enterococcusは低かった（q < 0.05）(Fig. 2H)。しかし、LBW-FMTマウスはNBW-FMTマウスと比較して、LactobacillusとEnterorhabdusの存在量が多く、AkkermansiaとBacteroidesの存在量が少なかった(q < 0.05) (Fig. 2I)。これらの結果は、FMT後のマウスの腸内細菌叢のパターンがドナー子豚のそれとは異なることを示し、微生物の機能がLBW子豚の腸内炎症を引き起こす重要な要因である可能性を示唆している。
FMTはLBWに特徴的な腸内微生物のBA関連機能をマウスに再現する
PICRUSt2を用いた機能予測により、一次BA生合成と二次BA生合成の機能がLBWにより大きく変化していること（LDA > 2, P < 0.05）（Fig. 3A）、7α-ヒドロキシステロイドデヒドロゲナーゼ（7α-HSDH）遺伝子保有菌の相対量が有意に減少し、BA 7-デヒドロキシル化（baiJ）活性菌がNBW子豚と比較して有意に増加した（P < 0.05）(Fig. 3B)．また、7α-HSDH遺伝子を保有する細菌の相対量もLBW-FMTマウスで有意に減少した（P < 0.05）（Fig. 3C）。qPCRを用いて、さらに、7α-HSDHおよび7β-HSDH遺伝子のコピー数がLBW子豚およびLBW-FMTマウスの両方で著しく減少していることを確認した（P < 0.05）(Fig. 3D, E)．CDCAからのUDCAの生合成に関与するすべてのBAおよび微生物酵素（図3F）が、LBW子豚で著しく減少したことに注目されたい（P < 0.05）。7α-HSDHおよび7β-HSDHの遺伝子コピー数が糞便中のUDCAレベルと有意な正の相関を示し（P < 0.05）、一方baiJがUDCAと負の相関を示した（図3G）のは当然といえば当然であろう。これらの結果は、LBW子豚の微生物によるBA代謝に明らかな変化があることを示唆するものであった。
Fig.
図3
NBWおよびLBW子豚の糞便を移植したマウスにおける微生物機能解析（n = 8）。LBW群とNBW群の間でPICRUSt2に基づいて予測された微生物機能のLEfSe解析。PICRUSt2の機能予測に基づく、LBWおよびNBW子豚の糞便（B）またはLBW-FMTおよびNBW-FMTマウスの大腸消化液（C）における7α-ヒドロキシステロイド脱水素酵素（7α-HSDH）およびBA 7-脱水素化（baiJ）陽性の細菌が濃縮度の差をもって存在すること。qPCR解析に基づくLBWおよびNBW子豚の糞便（D）またはLBW-FMTおよびNBW-FMTマウスの大腸消化管（E）におけるbaiJ、BA hydrolase（bsh）、7α-HSDH、7β-HSDHおよび12α-HSDHの遺伝子コピー数（D）。F CAとCDCAからの微生物による生変換によるUDCAの合成経路。G 個々のBA代謝遺伝子の遺伝子コピー数とLBWおよびNBW子豚の糞便中のBAs濃度とのスピアマン相関。データはパネルB、C、D、Eにおける平均値±SEMで示した。LBW-FMT：LBW子豚の糞便を移植したマウス；NBW-FMT：NBW子豚の糞便を移植したマウス
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BAsのターゲットプロファイリングにより、LBW-FMTマウスの大腸ではほとんどのBAsが減少していた（Supplemental Fig.5A）。Q2YとR2Yの値から、OPLS-DAモデルが有効であることが示唆され（Supplemental Fig. 全体として、LBW-FMT群では、一次BAs、二次BAs、総BAsの濃度が有意に減少し、総BAsに対する一次BAs、総BAsに対する二次BAs、二次BAsに対する一次BAsの比率はNBW-FMT豚とLBW-FMT豚で有意差がなかった (Fig. 4C)。VIP値が1以上の高度に分化濃縮されたBAが合計19個同定された（補足図5C）。NBW-FMTマウスと比較して、LBW-FMTマウスは、UDCA、HCA、および12-DHCAの濃度が有意に減少していた（P < 0.05）（図4Dおよび補足の図5D）。さらに、7α-HSDHと7β-HSDHの両方の遺伝子コピー数は、結腸内のUDCA濃度と有意な相関があった（図4E）。さらに、2つの炎症性サイトカイン（IL-1βおよびTNF-α）の遺伝子発現量は、UDCAの大腸内濃度と有意な負の相関があった（図4F）。これらの結果は、種間FMTによりLBW表現型を再現できること、LBW子豚で観察されるBA代謝および腸内炎症には腸内全細菌が関与していることを示した。
図4
図4
LBWまたはNBW子豚の糞便を移植したマウスの大腸BAプロファイル（n = 8）。A 大腸BAプロファイルのOPLS-DAスコアプロット。B NBW-FMTマウスおよびLBW-FMTマウスの大腸消化管におけるBAsの相対的存在量。C 一次BA、二次BA、総BA、および一次BAと総BAの比率、一次BAと総BA、一次BAと二次BAとの比率の濃度。D 差異的な発現量を示す3つの大腸BAのバイオリンプロット。E 7α-HSDHおよび7β-HSDHの遺伝子コピー数と、大腸で異なる濃度を持つ3つのBAsの濃度との間のスピアマン相関。F 大腸におけるBAsの濃度と炎症性サイトカインの遺伝子発現との間のスピアマン相関。データはパネルCおよびDにおける平均値±SEMで示した。LBW-FMT：LBW子豚の糞便を移植したマウス、NBW-FMT：NBW子豚の糞便を移植したマウス
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UDCAはDSS誘発大腸炎モデルマウスおよびLBW子豚の両方で抗炎症作用およびバリア保護作用を発揮する
LBW子豚においてUDCAは最も差次的に存在するBAであり（VIP値が最も高く、P値が最も低い）、LBW-FMTマウスにおいて有意な減少を示し、この減少がLBW子豚およびLBW-FMTマウスにおける大腸炎症の増強に関連していることから、UDCAが腸の炎症およびバリア機能障害を直接予防できるかどうかを検討することを試みました。まず、DSS誘発大腸炎モデルマウスを用い、7日間のDSS投与開始時にUDCAを経口投与する場合としない場合を検討した（図5A）。UDCAは、体重減少（図5B）、疾患活動性指数スコア（図5C）、結腸長の短縮（図5D、E）、および結腸のミエロペルオキシダーゼ（MPO）濃度（図5F）が顕著に減少したことからわかるように、DSS誘発大腸炎を著しく改善させた。UDCA投与により、DSS投与マウスでは炎症細胞の浸潤および上皮層の破壊が有意に抑制された（図5G, H）。また、UDCA投与により、DSS投与群に比べ、杯細胞数が有意に増加した（図5I）。さらに、UDCAは、大腸における炎症性サイトカイン（IL-1β、IL-6、TNF-α）のmRNA（図5J）およびタンパク質発現レベル（図5K）の両方を抑制した。さらに、UDCAは、結腸においてBA受容体（FXR）のmRNAおよびタンパク質発現レベル、ならびに別のBA受容体（TGR5）のmRNA発現レベルの両方を上昇させた（P < 0.05）（図5L、M）。
図5
図5
UDCA経口投与によるDSS誘発マウス急性大腸炎の改善（n = 8）。A 実験デザインの概略。B FMT後のマウスの体重変化。C Disease activity indexスコア。D 大腸の代表画像。E 大腸の長さ。F 結腸のミエロペルオキシダーゼ（MPO）濃度。G 大腸切片の代表的なH&E染色（50倍率）およびPAS染色（50倍率および100倍率）。H 大腸の組織学的スコア。I ゴブレット細胞の数。J 大腸の炎症性サイトカインの mRNA 発現量。K 大腸の炎症性サイトカインのタンパク質レベル。L 大腸の BA 受容体の mRNA 発現量。M 大腸におけるFXRの蛋白質レベル。データは、平均値±SEMで示した。*P < 0.05, **P < 0.01, *** P < 0.001; # P < 0.05, DSS + UDCA グループに対して
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さらにLBW子豚を採用し、UDCA補給がマウスで観察されたように腸の炎症を抑え、腸の健康を改善できるかどうかを確認しました。新生児LBW子豚にUDCA（50 mg/kg）を毎日7日間経口投与した（Fig.6A）。8日目の体重は、対照群よりも増加する強い傾向が見られた（P = 0.097）（図6B）。UDCAはまた、明らかに粘膜上皮の完全性を改善し、コントロールと比較して、結腸の組織学的スコアが有意に低下して杯細胞の頻度を増加させた（Fig.6C）。さらに、DSS投与マウスで観察されたものと同様に、UDCAは、IL-1βおよびTNF-αのmRNA発現を有意に低下させた（図6D）。バリア機能遺伝子（ZO-1、OCLD、CLDN1、MUC1、MUC2）およびFXRの発現も、UDCA処理に反応してLBW子豚の結腸で有意に増加した（図6D）。これらの結果は、UDCA の補給が、LBW 乳児の腸の健康と出生後の発達を改善するために臨床的に有用であることを強く示唆するものであった。
図6
図6
LBW子豚（n = 10）におけるUDCA経口投与による大腸炎症の緩和。A 実験デザインの概略。B UDCA投与前および投与8日後の体重。C UDCAを投与したLBW子豚の代表的なH&E染色（50倍）、PAS染色（50倍および100倍）、大腸切片の組織学的スコア、および杯細胞数。D UDCAを投与したLBW子豚の結腸における炎症、バリア機能、および胆汁酸受容体に関連する遺伝子のmRNA発現量である。データは、平均値±SEMで示した。*p < 0.05, **p < 0.01
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UDCAによる抗炎症作用は、マクロファージのM2偏極を誘導することにより達成される
マクロファージは、大腸炎の進行に重要な役割を果たすことが知られています[43]。UDCAによる大腸炎の緩和におけるマクロファージの役割を評価するために、UDCAを介入させたまたはさせないDSS投与の2日前に、クロドロネートを含むリポソームを腹腔内に注入して、マウスのマクロファージを減少させた（図7A）。マクロファージの枯渇は、体重変化（図7B）、疾患スコア（図7C）、結腸長短縮（図7D、E）、結腸上皮組織学スコア（図7F）および炎症細胞浸潤（図7G）から明らかなように、UDCAによるDSS誘発大腸炎の軽減を有意に阻害した。さらに、マクロファージの枯渇は、DSS処理マウスの結腸において、UDCAによるIL-1β（図7H）およびTNF-α（図7I）の抑制を実質的に無効にした。
図7
図7
DSS投与マウス（n = 8）におけるUDCAによる腸管炎症の緩和に対するマクロファージ枯渇の影響。A 実験デザインの概略。B 日々の体重変化。C 疾患活動性指標スコア。D 大腸の代表的な画像。E 大腸の長さ。F 組織学的スコア。G 結腸切片の代表的なH&E染色（倍率50倍）。大腸における2つの炎症性サイトカイン、IL-1β（H）およびTNF-α（I）のmRNA発現レベル。データは平均値±SEMで示した。*P < 0.05, **P < 0.01, *** P < 0.001; #P < 0.05, DSS+UDCAのグループに対して; θP < 0.05, それぞれのクロドロネート処理グループに対して
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UDCAによるLBW誘発腸炎症の緩和におけるマクロファージの役割をさらに確認するために、LBW-FMTマウスモデルを使用し、UDCA介入中にクロドロネート含有リポソームの腹腔内注射によりマウス内のマクロファージを枯渇させた（図8A）。マクロファージの枯渇は、UDCAによるLBW誘発体重減少（図8B）および大腸上皮組織学的スコア（図8C、D）の緩和を有意に阻害した。さらに、マクロファージの枯渇は、LBW-FMTマウスの結腸におけるUDCAによるIL-1β、IL-6、およびTNF-αの抑制（図8E）を実質的に無効とした。さらに、FXRの発現は、UDCA介入により有意に活性化された（図8F）。これらの結果は、UDCAが主にマクロファージの関与によって大腸で抗炎症作用を発揮することを示していた。
図8
図8
LBW-FMTマウス（n = 8）におけるUDCAによる腸の炎症の緩和に対するマクロファージ枯渇の影響。A 実験デザインの概略。B 体重変化。C 大腸切片の代表的なH&E染色（×40倍率）。D 組織学的スコア。E 大腸における炎症性サイトカイン（IL-6、TNF-α、IL-1β）およびF胆汁酸受容体のmRNA発現レベル。データは平均値±SEMで示した。*p < 0.05、**p < 0.01。LBW-FMT：LBW子豚の糞便を移植したマウス、NBW-FMT：NBW子豚の糞便を移植したマウス
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マクロファージは、組織の微小環境に応答して、炎症性M1細胞または抗炎症性M2細胞に極性化する[44]。腸の炎症におけるマクロファージ極性化に対するUDCAの影響を調べるために、UDCAを投与したまたは投与しないDSS処理マウスの結腸から調製したLPMCを用いてフローサイトメトリーを行った。予想通り、DSS投与に反応してM1マクロファージ（CD11b+CD11c+）の割合が増加し、M2マクロファージ（F4/80+CD206+）が減少したが、UDCA投与によりその傾向が逆転した（図9A-C）。このことは、少なくとも一部はマクロファージ極性の調節を介してUDCAが抗炎症作用を発揮することを示唆する。
図9
図9
DSS処理マウス（n = 8）におけるマクロファージ極性化およびNF-κB阻害に対するUDCAの効果。UDCAに反応したDSS処置マウスの大腸ホモジネート中のM1マクロファージ（CD11b+CD11c+）（B）およびM2マクロファージ（F4/80+CD206+）（C）の優勢と同様にフローサイトメトリープロット（A）の代表例を示している。D UDCAに反応してDSS処置マウスの大腸でp65 NF-κBのリン酸化が減少した。E UDCAに反応したDSS処置マウスの結腸におけるp38、ERK1/2、およびJNK1/2のリン酸化。データは、平均値±SEMで示した。*P < 0.05
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UDCAの抗炎症作用は、FXRおよびNF-κBの抑制を一部介するものであること
NF-κBおよびMAPKシグナルは、炎症性サイトカイン産生に関与する重要な経路である。NF-κBおよびMAPK経路の活性化におけるUDCAの役割は、まず、DSS処理マウスの結腸で調べられた。DSSによって誘発されたp65 NF-κBのリン酸化は、UDCA投与によって有意に減少した（図9D）。しかし、MAPK（p38、JNK、ERK）シグナル伝達経路では、DSSまたはUDCAに反応して有意差は観察されなかった（図9E）。
UDCAが介在する抗炎症反応の基礎的なメカニズムを研究するために、マウスJ774A.1マクロファージ細胞をさらに採用した。未処理の細胞ではサイトカイン遺伝子の発現に影響を与えなかったが、UDCAは24時間の処理後にLPS誘発の炎症性サイトカイン（IL-1β、IL-6、TNF-α）の発現を用量依存的に抑制した（データは示されていない）。6時間および12時間ではLPS誘発炎症反応を増幅するように見えたが、UDCAは24時間では炎症性サイトカインの発現を著しく抑制し（補足図6A）、M2マクロファージの割合（F4/80+CD206+）を著しく増加した（補足図6BおよびC）。
LPS刺激J774A.1マクロファージのUDCAに対するトランスクリプトーム変化を理解するために、RNA-seqを実施したところ、トランスクリプトームプロファイルに明らかなシフトが見られた（Fig. 10A）。UDCAは、LPS刺激J774A.1細胞において、1948遺伝子の有意なアップレギュレーションと2099遺伝子の有意なダウンレギュレーションを引き起こしました（図10B）。例えば、UDCAは、IL-1β、TNF-α、CCL7、CCL2、CCL4、CCL9、CCL3、CXCL2、およびCSF3などの炎症性サイトカインおよびケモカインのパネルのLPSによる誘導を抑制した（Fig. 10C）。KEGGパスウェイ解析により、LPS処理したJ774A.1細胞では、UDCAに反応して複数のパスウェイのダウンレギュレーションが異なることがさらに明らかになった。その中には、TNFシグナル伝達経路、サイトカイン-サイトカイン受容体相互作用、Toll様受容体シグナル伝達経路、およびNF-κBシグナル伝達経路が含まれていました（図10D）。これらの結果から、UDCA の抗炎症機能がさらに確認されました。
図10.
図10
UDCA存在下または非存在下でLPS処理したJ774A.1細胞の転写プロファイリング（n = 4）。A 2群間の転写プロフィールのPCAプロット。B 2群間で有意に差のある発現遺伝子をVolcanoプロットしたもの。差次的発現遺伝子は、2倍以上の差とFDR < 0.05を示すもののみを含む。C UDCA存在下でのLPS誘発炎症性サイトカインおよびケモカイン遺伝子発現の抑制。D LPS刺激細胞におけるUDCA処理後のKEGGパスウェイの濃縮度合いの違い
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FXRとTGR5は、BAsの受容体として知られています[45]。UDCA による抗炎症反応における両受容体の関与を調べるために、まず FXR と TGR5 の mRNA 発現を調べた。TGR5 mRNA は J774A.1 マクロファージにおいて UDCA によって変化せず（データは示さず）、LPS 存在下で 24 時間ではなく 6 時間と 12 時間に適度な誘導が起こった（図 11A）。一方、FXRは、LPS存在下（図11A）または非存在下（データ示さず）で、J774A.1細胞においてUDCAにより6、12および24時間誘導された。さらに、UDCAは、LPSの有無にかかわらずJ774A.1マクロファージのFXRのタンパク質発現を増強させた（図11B）。UDCAによるNF-κB活性化および炎症性サイトカイン遺伝子発現を抑制するためにFXRが必要かどうかをさらに検討するために、RNA干渉を採用した。FXR siRNA干渉後、FXRの発現は有意にダウンレギュレートされた（図11C）。予想通り、LPSによるNF-κB p65のリン酸化はUDCAにより抑制されたが、FXR特異的siRNAを用いたFXRノックダウンにより、そのような抑制効果は一部消失した（Fig. 11D）。さらに、FXRノックダウンにより、UDACによるIL-1βの発現抑制が一部解除され、TNF-αの発現が完全に回復した（図11E）。これらの観察結果を総合すると、FXRは、UDCAによるLPS誘発のNF-κB活性化および炎症性サイトカイン産生の抑制に関与していることが示唆される。UDCAの抗炎症作用におけるTGR5の関与については、役割は小さいと思われるが、まだ調査中である。
図11
図11
LPS処理したJ774A.1細胞におけるUDCAによる抗炎症作用へのFXRの関与（n = 3）。1 μg/mL LPS と 1 mM UDCA の併用または併用しない場合の FXR および TGR5 mRNA (A) および FXR タンパク質 (B) の発現を示す。C FXR siRNA干渉後のFXR発現。D p65 NF-κBのリン酸化に対するFXRノックダウン。データは、平均±SEMとして示される。*P < 0.05、対コントロール群、#P < 0.05、対LPS、&P < 0.05、対LPS+UDCAのグループ。E 1μg/mLのLPS、1mM UDCAおよび/またはFXR siRNAに反応したIL-1βおよびTNF-αのmRNA発現を示す。データは、平均値±SEMとして示される。*p < 0.05, **p < 0.01, *** p < 0.001
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考察
IUGRの乳児は一般的に摂食不耐性を示し [7、46、47]、壊死性腸炎などの新生児腸疾患のリスクが高い [48]。子豚モデルでの以前の研究では、LBW動物の大腸で炎症性サイトカイン（IL-1βとTNF-α）のレベルが上昇することが示された[10,11,12]。しかし、その根本的なメカニズムはまだ解明されていない。LBW豚とNBW豚の腸内細菌とメタボロームには大きな違いがあり [22, 23]、微生物のBA代謝とIBDの関連性が知られていることから [20] 、我々はターゲットプロファイリングによりLBW豚とNBW豚の腸内BAプロファイルの違いを検討しました。さらに、FMTにより腸内細菌叢とBAプロファイルおよび腸管炎症の因果関係を確立しました。さらに、LBW子豚で高度に減少しているBAであるUDCAを投与すると、LBW子豚、LBW-FMTマウス、大腸炎モデルマウスのいずれにおいても腸の炎症が直接緩和されることを見いだしました。さらに、UDCAが炎症を抑制する分子および細胞メカニズムを明らかにし、UDCAによる腸の炎症抑制にはマクロファージが必要であることを実証しました。UDCAはFXRを介してマクロファージのM2極化を誘導し、NF-κBを阻害することにより、腸管において抗炎症作用を発揮することが明らかになりました。これらの知見は、LBWに伴う腸管異常へのBAsの関与に光を当て、微生物のBA代謝を標的としたLBW児の腸内健康および生後発育不全の改善の可能性を示唆するものである。
新生児腸管における微生物の早期コロニー形成は、腸管の健康状態を調節する上で重要な役割を果たす。NBW子豚と比較して、LBW子豚では微生物のα多様性が高く、LBW子豚はどの年齢でも糞便の微生物多様性に影響を与えないという我々の以前の研究結果と矛盾している[22]。これらの違いは、本研究における品種（ランドレース×ヨークシャー vs デュロック×（ランドレース×ラージホワイト））、サンプリング時点の違い（生後3日目 vs 生後2日目）、糞のサンプリング方法の違い（直腸サンプル採取の屠殺 vs 滅菌綿棒による新鮮糞の採取）により生じたと思われる。FMTは、腸内細菌関連疾患のメカニズムについて、新たな直感的証拠を提供することができる[49]。FMT後、レシピエントマウスはLBWおよびNBWドナー新生子豚と同等の微生物群集を保有していないにもかかわらず、我々の結果は、腸内BA代謝酵素（7α-HSDHおよび7β-HSDH）および腸内BAプロファイルの違いによって反映されるLBW-FMTマウスとNBW-FMTマウス間のBA代謝関連マイクロバイオームの異なるコロニー化を提示した。このようにドナーとレシピエントの類似性が低いという現象は、FMT実験を含む他の論文でよく見られた[50,51,52]。本研究では、微生物叢組成の変化はドナーとレシピエントの間で類似していないが、FMTによって微生物叢、特に微生物の機能が変化する可能性があると説明できるかもしれないが、確認するためにはさらなる研究が必要である。
BAsは、微生物叢および宿主の受容体の両方と相互作用することによって、炎症の制御に決定的に関与していることがますます評価されている[53]。UDCAは、二次的なBAであり、一次的なチェノデオキシコール酸（CDCA）の細菌性7β-OHエピマーである。CDCAからのUDCAの生合成に関与する2つの重要な酵素（7α-HSDHおよび7β-HSDH）は、Clostridium、Eubacterium、Bacteroides、大腸菌およびEggerthella lentaなどのいくつかの腸内細菌によってコード化されている［54, 55］. (1)UDCAは、LBW子豚において最もVIP値が高く、P値が低い差次減少BAであった。(2)LBW子豚のFMT後のマウスの大腸消化管において、UDCAは有意に減少していた。(3) 7α-HSDHおよび7β-HSDH遺伝子コピー数はいずれもLBW子豚およびLBW-FMTマウスの両方の腸管において有意に減少していた。(4）LBW子豚の糞便中のEscherichia-ShigellaおよびClostridium sensu stricto 2などの7α-HSDHおよび7β-HSDH産生菌、ならびにLBW-FMTマウスの結腸中のBacteroidesおよびEggerthellaの相対量が有意に減少していたこと。(5) LBW 子豚と LBW-FMT マウスの両方で、UDCA の濃度と 7α-HSDH/7β-HSDH 遺伝子コピー数の間に強い負の相関が観察された； (6) UDCA は、胆道閉鎖症などの様々な胆道疾患の治療に使用されてきた唯一の BA である [56]；および (7) UDCA には抗炎症性が認められている [57,58,59]；．我々は、UDCA生合成経路がLBWにおいて著しく損なわれていることを発見し、LBWへの介入に利用できる可能性があることを明らかにした。我々は、UDCA投与が、LBW子豚、LBW-FMTマウス、およびDSSによって誘発された大腸炎モデルマウスの両方において大腸の炎症を緩和することを実証し、UDCAによってDSS誘発大腸炎がマウスで減衰することを示すいくつかの最近の研究と一致した[57,58,59]。実際、UDCA の投与は、総非経口栄養に関連する胆汁うっ滞を有する超低出生体重児（VLBW）の肝機能を改善することも示されている [60、61]。さらに、UDCAは、新生児モデルマウスにおける敗血症および大腸炎における拡張スペクトルβ-ラクタマーゼ産生大腸菌感染時に、後腸ミクロフローラ構造および短鎖脂肪酸産生の改善により、細菌の増殖および侵入過程を阻害し、腸のホメオスタシスを媒介することが証明された[62]。
細胞レベルでは、UDCAによる腸管炎症の改善はマクロファージ依存的であり、炎症性M1表現型から抗炎症性M2表現型へのマクロファージの優先的な偏光を通じて達成されることを初めて明らかにした[63]。これは、大腸炎の緩和においてM1マクロファージからM2マクロファージへの移行を示した最近の研究とも一致する[43, 64]。UDCAによるM2マクロファージの極性化は、ob/obマウスの脂肪組織でも示された[65]。さらに、我々の研究と同様に、UDCAは、今回の研究で使用したものとは異なる腸の炎症モデルであるTNBSおよびDSS処理したラットまたはマウスの大腸炎を予防することが判明した[58, 66]。したがって、UDCAは、腸の炎症に関連するサイトカインレベルの上昇および上皮透過性の上昇の両方を防ぐことができ、IBD患者において治療上有益であることが示唆された。
FXRは粘膜のホメオスタシスに重要であり、慢性的な腸の炎症時には一般的に抑制されることを示唆する証拠が増えてきています[53]。BA依存性のFXR活性化は、TNF及びIL-1β遺伝子座のNF-κB結合部位からの核共受容体のクリアランスを防ぐことにより、NF-κB活性化を抑制することが報告されている［67、68］。分子レベルでは、FXRが、in vivo及びin vitroの両方で、UDCA媒介のNF-κB活性化及び炎症性サイトカイン産生の抑制に関与することが示された。一貫して、大腸炎を有するマウスにおけるFXR活性化は、腸の炎症の減少を示す[69,70,71]。逆に、FXRの欠損は、大腸炎モデルマウスにおいて粘膜の炎症の亢進をもたらす[69]。以上のことから、UDCAはFXRと相互作用することにより、NF-κBの活性化を抑制してマクロファージの炎症作用を抑制することが示唆されました。
FXRに加えて、BAsは、プレグナンX受容体（PXR）、グルココルチコイド受容体（GR）、ビタミンD受容体（VDR）、および細胞表面受容体（TGR5）など他のいくつかの核内受容体のリガンドであることは注目に値する[72]。FXRノックダウンでは、UDCAに応答したNF-κB活性化および炎症性サイトカイン産生を完全に抑制できないことから、これらの受容体の一部もUDCAによる抗炎症反応に関与していると考えられるが、不完全な抑制は、マクロファージにおける遺伝子ノックダウン効率が比較的低いことにも起因している可能性もある。しかしながら、他のBA受容体（例えば、PXR、GR、VDR）が関与している可能性があり、さらなる調査が必要である。
本研究ではUDCAを選択し、その後、LBW子豚への経口投与により腸の炎症を緩和することを確認したが、他の異なる量のBAも同様に役割を果たすと思われる。今後、他のBAsやBAsの組み合わせが、LBWに伴う代謝異常や免疫異常の軽減に有効であるかどうかを検証することが重要であろう。第二に、UDCAの生合成に関与する主要酵素である7α-HSDHおよび7β-HSDHがLBW子豚では著しく低下していることから、7α-HSDHおよび7β-HSDH陽性菌をLBW児の生後発育不全治療に移入する可能性を検討することは興味あることである。第三に、LBW子豚に関連する腸の健康問題の多くに腸内細菌叢が関与していることを示したので、正常者のFMTをLBW乳児に検討することで良い結果を得ることが可能である。第四に、in vitroマクロファージ細胞モデルを用いたマクロファージ極性化によるUDCAによるLBW誘発腸管炎症の改善機構を十分に説明できていないことである。今後、in vivoでのマクロファージ養子縁組が必要である。
まとめ
要約すると、我々は、LBW子豚が正常な子豚に比べて有意に低いUDCAを産生し、7α-HSDH-および7β-HSDH-陽性菌を保有していないことを初めて明らかにした。UDCAを経口投与することで、LBW子豚の腸内環境が著しく改善されます。さらに、UDCAがマクロファージの極性を調整し、FXRに関与し、NF-kBの活性化を抑制することによって、腸の炎症を緩和することを明らかにしました。本研究は、LBWに伴う腸の異常と微生物叢が介在するBA代謝の変化との直接的な関連性を示すものである。以上のことから、我々はLBW関連腸疾患のメカニズムを明らかにしただけでなく、LBW関連出生後異常の治療のために、独立した、しかし関連したいくつかの介入戦略を提案した。
データおよび資料の利用
すべてのシーケンスリードはNCBI Sequence Read Archive (SRA) データベースに、子豚の糞についてはPRJNA646844、FMT後のマウスの大腸消化物についてはPRJNA714049のアクセッション番号で寄託された。すべてのRNA配列データはNCBIのGene Expression Omnibus (GEO)にアクセッション番号GSE174489で寄託された。
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参考文献のダウンロード
謝辞
中国河北省の養豚場での実験にご協力いただいた乗組員の皆様に感謝いたします。
資金提供
本研究は、中国国家自然科学基金（32002189、31630074、31972596、31902170、31902189、32125036）、中国博士研究基金（2020M682102）、広東省重点研究開発計画（2019B020218001）、北京市自然科学基金（S170001）からの支援を受けて行われたものです。
著者情報
著者および所属
中国農業大学動物科学技術学院動物栄養学国家重点実験室、北京市、100193、中国
Yu Pi, Yujun Wu, Xiangyu Zhang, Dongdong Lu, Dandan Han, Shiyi Zhang, Hao Ye, Shuai Lian, Yu Bai, Zhenyu Wang, Shiyu Tao, Defa Li & Junjun Wang.
中国農業科学院飼料研究所，農業農村部飼料生物技術重点実験室，中国北京，〒100081
ユー・ピ
農業農村部生物飼料国家重点実験室、Boen Biotechnology Co. LTD, Ganzhou, 341000, China
Yu Pi, Dongjiao Ni & Xinhua Zou
アーカンソー大学農学部動物科学科、Fayetteville, AR, 72701, USA
Jiangchao Zhao
上海交通大学附属第六人民病院トランスレーショナルメディスンセンター、上海糖尿病重点実験室、上海睡眠呼吸障害重点実験室、中国上海市、200233
鄭小峥・賈賈賈
ワーヘニンゲン大学動物栄養学研究室、私書箱338、ワーヘニンゲン、6700 AH、オランダ
Shiyi Zhang & Hao Ye
ハワイ大学がんセンター、ホノルル、ハワイ州、96813、アメリカ
Wei Jia
香港バプティスト大学漢方医学部 〒999077 香港 九龍塘
Wei Jia
オクラホマ州立大学動物・食品科学学部、74078, OK, Stillwater, USA
張 國龍
寄稿
YP、YW、XZ、DL、ZW、YB：実験およびデータ解析、YP：原稿執筆、YP、SZ、HY、SL、DH、ST、DN、XZ、JZ、XZ、WJ、GZ、JW：原稿修正および議論に貢献した。全著者が原稿を読み、最終版を承認した。
著者名
Junjun Wangに連絡する。
倫理に関する宣言
倫理的承認と参加への同意
すべての実験プロトコルは、中国農業大学動物管理使用委員会（中国、北京）の承認を得た。
論文発表の同意
該当なし。
利害関係
著者らは、競合する利害関係がないことを宣言する。
追加情報
出版社からのコメント
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補足情報
追加ファイル1：補足表S1.
疾患活動性指標（DAI）の採点基準1,2。補足表S2. 組織学的損傷評価のパラメータと基準1,2. 補足表S3. 本実験で使用したプライマー対1. 補足図S1. 出生2日後の低出生体重（LBW）および正常出生体重（NBW）子豚の糞便胆汁酸（BAs）プロファイル（n = 10）。補足図S2. マウスにおける腸内細菌叢の枯渇の検証(n = 8)。補足図S3. NBWおよびLBWドナー子豚、NBW-FMTおよびLBW-FMTレシピエントマウスの微生物構造。補足図S4. NBWおよびLBWドナー子豚、ならびにNBW-FMTおよびLBW-FMTレシピエントマウスの微生物組成。補足図S5. LBWまたはNBW子豚の糞便を移植したマウスの大腸BAプロファイル（n = 8）。補足図S6. J774A.1細胞における炎症性サイトカイン遺伝子発現およびマクロファージ極性化に対するUDCAの影響。
権利と許可
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Pi, Y., Wu, Y., Zhang, X. et al. Gut microbiota-derived ursodeoxycholic acid alleviates low birth weight-induced colonic inflammation by enhancing M2 macrophage polarization. Microbiome 11, 19 (2023). https://doi.org/10.1186/s40168-022-01458-x
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受付終了
2022年11月04日
受理済
2022年12月28日
公開日
2023年1月31日発行
DOI
https://doi.org/10.1186/s40168-022-01458-x
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キーワード
低出生体重児
マイクロバイオーム
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マクロファージ
免疫力
マイクロバイオーム
ISSN: 2049-2618
お問い合わせ先
投稿に関するお問い合わせ: lyndie.manicani@springernature.com
一般的なお問い合わせ: info@biomedcentral.com
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