大腸菌愛好家の皆さん、あなたの菌株は野生型rpoS遺伝子を持っていますか？
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大腸菌愛好家の皆さん、あなたの菌株は野生型rpoS遺伝子を持っていますか？
by Roberto
大腸菌株のrpoS対立遺伝子は、多くの人にとっては重要ではないかもしれない。しかし、一般的なストレス応答や定常期への適応に興味があるのであれば、野生型のrpoS遺伝子を持っているかどうかを知りたいと思うかもしれない。結局のところ、rpoSはシグマ因子σSをコードしている。σSはRNAポリメラーゼに、飢餓状態など数多くのストレスに適応するのに不可欠な遺伝子を転写するよう指令するグローバル制御因子である。
アレクサンダー・ハームスが最近ツイッター（現在はᵔ）に投稿したスレッドが、この記事を書くきっかけとなった。要するに、彼は大腸菌株がLB培地で増殖した後、LB寒天培地に刺さった状態で出荷されることが多いことに懸念を表明し、この問題について詳細に検討したSpiraらの素晴らしい論文を引用したのである。2009年、二階堂堀史はSTCの読者に、おそらく最も閲覧数の多い投稿で、LBを使用する際のいくつかの問題点について警告した。しかし、Harmsが懸念している問題は、増殖中に生じるものではなく、むしろLB培養物を長期間定常期に保つことにある。これは、私の研究室でこの問題に取り組んでいた30年以上前にさかのぼるものだ。簡単に説明すると、LBでは細胞が増殖するためにアミノ酸を異化し、アンモニアを放出して培地をアルカリ化する。定常期培養の高いpHは細胞を死滅させる。数日後、個体群の〜99％が死滅する。驚くべきことに、生き残ったのは親型ではない。その短時間のうちに、集団は「GASP」表現型（定常期における成長優位性）を持つ突然変異体に乗っ取られてしまう。GASPは細菌の進化における一般的な現象であるように思われる。しかし、LBで培養された大腸菌の場合、野生型rpoSを持つ株から始めると、培養を引き継ぐ最初のGASP変異体は、ほとんど必ずと言っていいほど、RpoS制御系全体が制御されなくなるような部分的な機能喪失をもたらす、減弱型あるいは「低形質」rpoS対立遺伝子を持つ。これらの対立遺伝子の予期せぬ結果の一つは、この対立遺伝子を保有する大腸菌が死細胞の残骸（まず第一にアミノ酸）を食べてよく増殖し、GASP表現型を発現することである。数十年にわたり、世界中で多くの研究者が大腸菌株をLB上で長期保存してきたようであるが、それは多くの実験株が実際に減弱したrpoS対立遺伝子を保有しているからである。
図
図1. 大腸菌由来過酸化水素酵素II（カタラーゼ）のアッセイ。野生型（A）、rpoS819（B）、またはrpoS::Km（C）対立遺伝子を持つ株をLB寒天培地プレート上で増殖させ、細胞に直接H2O2を添加してカタラーゼ活性を測定した。出典 正面図： LB液体培地で培養した大腸菌の3日間培養で、ほとんどの細胞が死滅した。細胞をバイタルステインのアクリジンオレンジで処理した。死細胞は緑色、生細胞はオレンジ色。出典 コルター研究室の顕微鏡写真、1990年頃。
つまり、自分の菌株にどのようなrpoS対立遺伝子が存在するのかを知りたいということである。わざわざrpoS遺伝子の塩基配列を調べる必要があるのだろうか？少なくとも最初の一歩としては必要ない。シークエンシングが簡単になった分、もっと簡単な方法がある。これは、菌株を一晩予備培養しておけば、数秒でできるアッセイである。rpoSはカタラーゼ（過酸化水素II）の発現を制御しているので、この酵素の活性はrpoSの対立遺伝子状態の代理として役立つ。問題の菌株のパッチを一晩培養した後（そう、LBプレートでOK）、それぞれのパッチの上に過酸化水素水溶液を一滴垂らすだけでよい。過酸化水素の分解により、酸素ガスの泡が発生する。野生型対立遺伝子を持つ株からはしっかりとした気泡が発生し、多くの減弱対立遺伝子を持つ株からは気泡がかなり減少しているのがすぐにわかるだろう（rpoS欠損株からは実質的に気泡は発生しない）。これは実にシンプルで、シンプルで私は好きだ。(注：対照として野生型とヌルのrpoS対立遺伝子を持つ株があると便利です！）。
大腸菌株の出荷方法について何かアドバイスはありますか？試してみる価値があるかもしれない簡単な提案がある。寒天培地に0.05倍希釈LB培地（または他の濃厚培地でも同様に希釈したもの）を刺して送ってはどうでしょう。栄養分の濃度が低いので、pHはあまり変化せず、死滅も少なくなり、GASP変異体による乗っ取りも遅くなります。あなたの菌株は大丈夫でしょう。
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投稿日 9月 18, 2023 at 02:54 AM カテゴリー: その他, 生理学・遺伝学｜ パーマリンク
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