N-グリコシル化腸管タンパク質BCF-1は、フィンブリアンタンパク質を介して細菌と結合し、微生物のコロニー形成を形成する

論文|第42巻第1号111993頁、2023年1月31日発行
N-グリコシル化腸管タンパク質BCF-1は、フィンブリアンタンパク質を介して細菌と結合し、微生物のコロニー形成を形成する
何永娟 2
ファンルイ・ハオ 2
賀瑞甫
Yingyang Zhang
傅凱
Bin Qi 3
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脚注を表示するオープンアクセス公開日:2023年1月18日DOI:https://doi.org/10.1016/j.celrep.2023.111993
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ハイライト

C. elegansを用いた細菌のコロニー形成を制御する因子の同定

N-グリコシル化BCF-1は大腸菌に結合することで大腸菌のコロニー形成を促進する

N-グリコシル化BCF-1はオリゴサッカリートランスフェラーゼOSTB-1と相互作用する

宿主BCF-1は腸内細菌叢を形成する
まとめ
微生物のコロニー形成は、宿主の健康に重要な役割を果たす。しかし、微生物コロニー形成の成立を促進する宿主因子は未だ不明である。本研究では、線虫において大腸菌のコロニー形成を制御する宿主因子を同定するスクリーニング方法を確立した。その結果、N-グリコシル化を有するBCF-1が、フィンブリアータンパク質YdeRを介して大腸菌に直接結合し、大腸菌のコロニー形成を促進することを見出した。BCF-1は大腸菌によって活性化され、オリゴ糖転移酵素OSTB-1と相互作用し、大腸菌のコロニー形成を制御するために重要である。また、BCF-1のN-グリコシル化が大腸菌のコロニー形成に重要であることも明らかにした。さらに、微生物叢の構成がBCF-1によって形作られていることも明らかにした。本研究は、宿主の糖タンパク質と大腸菌の間の細菌コロニー形成の「足場モデル」を示すとともに、細菌コロニー形成の調節に関与する個々の宿主因子を特定する強力な研究アプローチを導入している。

図解要旨
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キーワード
大腸菌のコロニー形成
微生物叢
N-グリコシル化
BCF-1
フィンブリア
線虫
研究テーマ（複数可）
CP：微生物学
はじめに
腸内細菌叢は健康維持に重要であり、細菌叢のアンバランスはいくつかの疾患と相関している。近年、主にゲノムワイド関連解析のアプローチにより、宿主のマイクロバイオータ組成が宿主遺伝学と環境選択圧の両方によって形成されることが強調されている1、2、3、4、5、6。これらのゲノムワイド関連解析では、宿主遺伝学の腸内マイクロバイオータへの影響に関する示唆的な関連性だけが強調されているが7、宿主要因によって影響を受ける腸内マイクロバイオータの定着と安定化を促す機構はまだ十分に解明されていない。
科学者が腸内細菌のコロニー形成を制御する宿主因子を系統的に同定するためには、優れた動物モデルを確立することが極めて重要である。線虫C. elegansは、細菌と宿主の相互作用を系統的に解析するための強力な実験モデルであることが示されています8,9,10,11,12,13,14,15 C. elegansは、その本来のマイクロバイオームのコロニー形成を系統的に解析することによってもマイクロバイオーム研究モデルとして確立されてきました16,17。しかし、寿命が延長した異常咽頭切断変異体（phm-2、eat-2）では、腸内細菌の蓄積により自然免疫反応の活性化が見られることから21、細菌のコロニー形成レベルが動物の老化表現型と関連していることが示唆されています。
最近の研究では、線虫はその種としての特性によって定義される特徴的なマイクロバイオームを保有しており、その結果、環境や地理的な変動に関係なく、基礎となるゲノムを保有していることが明らかになりました12,17,22,23。そのため、線虫と細菌の両面から遺伝子を解析することで、腸内細菌のコロニー形成を制御する個々の宿主因子を系統的にスクリーニングし、その分子機構を明らかにすることが可能である。
糖タンパク質の主要なクラスとして、N-結合型糖鎖とO-結合型糖鎖がある。上皮型糖鎖は、腸管粘膜の主要な構成要素である。腸内細菌と腸管上皮の相互作用を促進し、病原性細菌による感染や炎症性腸疾患（IDB）などの疾患において変化する。24 腸管上皮のO-グリコシレーションは腸内細菌叢を空間的に制御し、グリコシレーションの変化はIBDにおけるディスバイオシスの空間パターンに寄与する24,25。宿主粘液のN型糖鎖修飾は、腸内常在菌の特定の集団を維持するのに重要な役割を果たしており、潰瘍性大腸炎（UC）患者ではN型糖鎖修飾関連遺伝子の発現が損なわれていた26。したがって、遺伝子スクリーニングを用いてC. elegansの腸内細菌バランスに影響を与える特定の宿主上皮糖タンパク質を特定すれば、ホスト-微生物相互作用における糖タンパク質の機構が明らかになるであろう。
本研究では、大腸菌を用いた簡単な宿主モデルとスクリーニング手法により、線虫の腸内細菌コロニー形成を制御する宿主分泌因子を探索した。その結果、腸内大腸菌によって活性化される宿主のN-グリコシル化タンパク質BCF-1が、細菌と直接結合することで大腸菌のコロニー形成を促進することを見いだした。さらに、糖転移酵素OSTB-1がBCF-1と相互作用し、そのN-グリコシル化を制御していることを明らかにし、N-グリコシル化が大腸菌の結合とコロニー形成に重要であることを強調した。我々は、腸内細菌叢の安定性を維持する線虫の他の個体因子の同定に有用な研究モデルを提示し、宿主のN-グリコシル化がどのように細菌を選択するのかを明らかにすることができた。
研究成果
大腸菌のコロニー形成を制御する宿主タンパク質の同定
腸内細菌叢の構成は、宿主や環境因子によって形成される1,27。しかし、宿主特異的な因子がどのように細菌叢を制御しているかは、未だ不明である。我々は、腸管内腔で細菌と空間的に相互作用する腸管分泌タンパク質が、細菌のコロニー形成や組成を制御する重要な因子であると推測した（図1A ）。
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図1大腸菌のコロニー形成を制御する宿主因子の同定
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次に、2つの簡単な基準を指定して、宿主タンパク質候補を同定するシステムを構築した。(1) 内腔分泌タンパク質がバクテリアによって誘導されること、(2) これらのタンパク質がバクテリアとも直接結合すること (図1A)。まず、大腸菌によって誘導されるルーミナルタンパク質を同定するために、L1動物を大腸菌とともに液体培養し、または大腸菌なしで培養し、上清を採取した（図1Bおよび1C）。この方法では、質量分析（MS）により71個のタンパク質が同定されました（図1C、図1F）。次に、大腸菌結合タンパク質を同定するために、大腸菌を用いてワームの全タンパク質をプルダウンし（図1D）、MSによって204個のタンパク質を同定した（図1Eおよび図1F）。両方のアッセイで同定されたタンパク質はわずか8種類であった（図1F; 表S1）。次に、これらの候補タンパク質が大腸菌のコロニー形成に影響を与えるかどうかを調べるため、RNAiスクリーニング法を確立し、大腸菌のコロニー形成を活性化する遺伝子を探した。各RNAi候補プレートでL1ワームをL4まで培養した後、それらの動物を大腸菌OP50-GFPプレートに66時間移した（OP50-GFPのコロニー形成をモニターするため）（図S1A）。その結果、F57F4.4/4.3、enol-1、tct-1のRNAiで処理した動物ではOP50-GFPのコロニー形成が減少したことから、これらの遺伝子は大腸菌のコロニー形成に良い影響を与えていると考えられる（図S1B）。
BCF-1は大腸菌のコロニー形成を制御する
候補のうち、F57F4.4はN-グリコシル化タンパク質であり28,29 、膜ラフトに存在することから30 、F57F4.4が細菌のコロニー形成に関与している可能性が示唆された。大腸菌のコロニー形成を制御する F57F4.4 の役割をさらに確認するために、F57F4.4 の機能喪失（lf）欠失アレルで大腸菌 OP50-GFP レベルと細菌のコロニー形成単位（CFU）を測定した。 4 (ok2599) 変異体、およびCRISPR-Cas9により構築した、第2エキソンの途中に27bpの挿入がありフレームシフトと早期停止コドンを生じた独立した変異アリル（図S2A）、bcf-1(ylf1) と命名（図2Aおよび2B ）、この遺伝子をRNAiした動物（図S2BおよびS2C）でも同様に測定した。すべての変異体において、大腸菌のコロニー形成が減少していることがわかった。同様に、bcf-1(ylf1)変異体では、大腸菌K12-GFPレベルも減少していた（図2C）。これらのデータは、F57F4.4が成虫における大腸菌のコロニー形成を正に制御していることを示唆している。この表現型に基づき、我々はF57F4.4をbacterial colonization factor-1（bcf-1）と命名した。
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図2BCF-1が大腸菌のコロニー形成を仲介している様子
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BCF-1が大腸菌のコロニー形成を制御する役割を排除するために、大腸菌のコロニー形成に影響を与えることを明らかにした。BCF-1が内腔の形態形成や摂食に影響を与えることで大腸菌のコロニー形成を制御していることを除外するために、(1) ERM-1:GFP31 および VHA-6: mCherry32レポーター動物を用いて内腔の形態形成を観察したところ、bcf-1をノックダウンした動物では頂膜極性が破壊されていないことがわかった（図2D）、（2）咽頭ポンプによる摂食能を測定したところ、bcf-1変異体ではポンプ作用に変化がないことがわかった（図2E）、（3）またbcf-1変異体は野生型（N2）よりも蛍光ビーズの腸への取り込み量が多いことが判明した（図2F）。これらのデータは、BCF-1がC. elegansにおいて実際にコロニー形成因子であり、内腔の形態形成や摂食に影響を与えないことを示す。
我々のデータは、BCF-1が成体動物において大腸菌のコロニー形成を制御していることを示している。そこで、腸内に大腸菌を蓄積する咽頭研磨機変異体を用いて、発育初期における大腸菌のコロニー形成にもBCF-1が影響するかどうかを検討した21。その結果、eat-2変異体ではL4期に大腸菌が蓄積していたが、eat-2, bcf-1二重変異体では大腸菌蓄積レベルが減少しており（図2G）、BCF-1は早い時期（L4期）の大腸菌の定着も制御していると考えられる。
次に成体生存率を解析したところ、bcf-1(ylf1)変異体は野生型(WT)と比較して平均寿命が有意に減少（38.9%）したが、最大寿命は変わらなかった（図S2D；表S2）。長寿命を有するphm-2（-）やeat-2（-）は腸内の細菌蓄積により自然免疫応答を活性化していることがわかった21。次に、bcf-1(ylf1)変異体では自然免疫応答が活性化されないのかどうかを調べた。成体動物のRNAシーケンス（RNA-seq）データから、bcf-1（ylf1）変異体では自然免疫応答遺伝子の発現が低下していることがわかった（図S2E；表S3）。これは、bcf-1(ylf1)変異体では腸内の大腸菌のコロニー形成が低下し、自然免疫を活性化できず、寿命が短くなった可能性が考えられる。
bcf-1の発現パターンを調べるために、bcf-1遺伝子のC末端にgfpとflagを融合し、CRISPR-Cas9技術を用いてbcf-1p::bcf-1::gfp::flagと名付けたシングルコピー組み込み株を作った（図S2F-S2H)。また、タグ付きBCF-1タンパク質（BCF-1-GFP-FLAG）がまだ機能しているかどうかを確認するために、N2およびノックイントランスジェニック動物に大腸菌OP50-mCherryを与えて大腸菌コロニー形成状況を解析した。その結果、N2およびトランスジェニック動物において大腸菌のコロニー形成は変化しておらず（図S2I）、タグ付きBCF-1が正常な機能を有していることが示された。強いBCF-1の発現は、腸（図2H）および腸の頂膜（図S2J）において検出された。また、BCF-1が大腸菌OP50（生菌または加熱死菌）により誘導されることを見出した（図2I）。BCF-1は、主に細胞壁成分を含む熱殺大腸菌によって誘導されることから、細菌の細胞壁成分がBCF-1の発現を誘導している可能性が示唆された。これらのデータを総合すると、BCF-1は大腸菌によって誘導され、それが腸内の大腸菌のコロニー形成に重要であることが示唆された。
BCF-1はフィンブリアを介して大腸菌に結合する
BCF-1が免疫遺伝子の活性化を通じて大腸菌のコロニー形成に影響を与えるかどうかを調べるため、RNA-seqを行い、bcf-1変異が宿主の免疫応答遺伝子を活性化するかどうかを検証した。RNA-seqのデータから、自然免疫反応に関わる遺伝子はbcf-1(ylf1)変異体では発現が低下しており（図S2E）、bcf-1 lfは宿主免疫反応を活性化しないことが示された。これらのデータは、BCF-1が制御する大腸菌のコロニー形成は、宿主の免疫応答の活性化を介していない可能性を示唆している。
そこで、BCF-1と大腸菌の相互作用そのものが、菌のコロニー形成に重要であるかどうかを考えてみた。まず、トランスジェニックワーム (bcf-1p::bcf-1::gfp::flag) あるいは Anxa2::flag あるいは SerpinA3n::flag をトランスフェクトした293T細胞株をネガティブコントロールとして抽出した総蛋白を大腸菌でプルダウンしたところ、 BCF-1は直接大腸菌に結合することが分かった (Figure 3A ) 。次に、真核細胞への細菌の接着を媒介するフィンブリアタンパク質と鞭毛タンパク質の生合成に関与する大腸菌変異体をスクリーニングした（図S3A）。その結果、大腸菌変異体(ΔydeR)のコロニー形成が低下していることから（図3B）、推定されるフィンブリアタンパク質であるYdeRは大腸菌のコロニー形成因子であることが示唆された。最後に、BCF-1とΔydeR変異体の間で、菌体へのBCF-1の結合が減少していることを見出した（図3C）。ΔydeR変異体の相対増殖速度は指数関数期でWTよりわずかに遅いが、定常期（48時間）に到達したときの総菌数は同じであった（図S3B）。また、一晩培養した菌体を線虫増殖培地（NGM）プレートに播種し、摂食の3日前に増殖させたので、NGMプレート上の総菌体量は同じはずであり、動物は同じ量の菌体を食べている（N2 と bcf-1 変異体ではポンプ速度も同じ）ので虫腸内のコロニー形成には影響しない可能性がある。これらのデータから、BCF-1が大腸菌に直接結合することが大腸菌のコロニー形成に重要であり、BCF-1の大腸菌への結合は細菌のYdeRに依存することが示された。
図 サムネイル gr3
図3BCF-1が細菌のフィンブリアル・タンパク質を介して大腸菌と直接相互作用している様子
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BCF-1は大腸菌によって誘導される（図2I）。この誘導は、大腸菌のYdeRを介して大腸菌と結合するために重要である（図3）。そこで、大腸菌によるBCF-1の誘導もYdeRに依存しているかどうかを調べた。ΔydeR変異体を与えた動物では、BCF-1-GFPレベルが低下しており（図3D、3E）、BCF-1の誘導が実際に大腸菌YdeRに依存していることが示唆された。さらに、YdeRタンパク質は腸内細菌科で保存されていることから（図S3C）、YdeRは宿主のBCF-1を誘導することで細菌の結合を高め、コロニー形成を行う腸内細菌科共通の因子である可能性が示唆された。
BCF-1は大腸菌のコロニー形成を制御するために重要なOSTB-1と相互作用している
BCF-1がC. elegans腸管の大腸菌コロニー形成を制御する機構をさらに調べるために、単離したワームの全タンパク質に対してBCF-1:GFP:FLAGタンパク質を用いた免疫沈降（図4A ）とMSを用いて、BCF-1と潜在的に相互作用するタンパク質の同定を行った。MS解析の結果、オリゴ糖転移酵素であるOSTB-1がBCF-1と相互作用することが判明した（図4B）。このcoIPの結果を確認するために、bcf-1::gfp::flag動物にostb-1p::ostb-1::mCherryを発現させたトランスジェニック動物を作製してみた。まず、BCF-1とOSTB-1が腸で共局在していることがわかった（図4C）。次に、BCF-1:GFP:FLAGプルダウンにより、OSTB-1:mCherryもその相互作用相手として同定された（図4D）。これらのデータは、BCF-1がOSTB-1と相互作用することを示している。もしOSTB-1-BCF-1相互作用が大腸菌のコロニー形成を制御する機能を持っているならば、ostb-1をノックダウンするとbcf-1(ylf1)変異体で見られたのと同じように大腸菌のコロニー形成が減少するはずである（図2A）。予想通り、ostb-1 RNAiを処理した動物では、標識大腸菌からのGFPレベルも減少しており（図4E）、OSTB-1-BCF-1相互作用が腸内の大腸菌定着に重要であることが示唆された。
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図4BCF-1はOSTB-1と直接相互作用し、大腸菌のコロニー形成を制御するのに重要な役割を果たしている。
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BCF-1のN-グリコシル化は大腸菌との結合に重要である。
BCF-1 (F57F4.4) は、レクチンアフィニティーキャプチャー、同位体コードタギング、MSによってN-結合型糖タンパク質であることが同定されている33。OSTB-1はオリゴ糖転移酵素である34。小胞体膜では、オリゴサッカリルトランスフェラーゼ（OST）複合体が、糖鎖前駆体からペプチド中のアスパラギン残基に糖鎖を転移することによってN-結合型グリコシル化を仲介している35, 36。次に、BCF-1のN-グリコシル化がOSTB-1で制御されているか、このタンパク質修飾が大腸菌との結合に重要かについて検討した。まず、BCF-1が本当にN-結合型糖鎖で修飾されているのかどうかを調べた。ウェスタンブロット上のBCF-1タンパク質のサイズが、N-結合型糖鎖を除去するN-グリカナーゼ（PNGase）処理によって減少することがわかった37 (Figure 5A )。次に、ostb-1 RNAiを導入した動物では、BCF-1のN-結合型糖鎖のレベルも低下していることから（図5B）、OSTであるostb-1がBCF-1のN-グリコシル化を制御していることが示唆された。最後に、PNGase（図5C）またはostb-1 RNAi処理によってBCF-1のN-グリコシル化が低下すると、BCF-1と大腸菌の結合が減少する（図5D）。これらのデータから、大腸菌はBCF-1上のN-糖鎖部位に結合し、これらの糖鎖の存在が大腸菌の定着に重要であることが示された。
図5 gr5のサムネイル
図5 BCF-1のN-グリコシル化は大腸菌の結合に重要である。
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ゲノムワイドRNAiスクリーニングによるBCF-1の制御因子の同定
通常の摂食条件下（大腸菌OP50または大腸菌HT115）では、bcf-1p::bcf-1::gfp::flag動物は腸内に強いGFPシグナルを発現する（図2H）。この事実により、bcf-1活性化因子を同定することができた。そこで、ORFeomeベースのRNAiライブラリ38を用いて、bcf-1活性化因子を同定するためにゲノムスケールのRNAiスクリーニングを行った（図6A ）。その結果、GFPの発現を低下させる32のRNAiクローンが得られ（表S4；図S4）、それらの遺伝子がbcf-1の活性化因子であることが示唆された。
図 サムネイル gr6
図6BCF-1発現制御因子の逆遺伝学的スクリーニング
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候補のうち、DBL-1はTGFβ/BMP様ファミリーのメンバーであり、線虫の腸内常在菌の存在量に影響を与えることが示されている39ことから、BCF-1の発現を活性化することで大腸菌のコロニー形成を制御する役割を持つ可能性が示唆された。まず、dbl-1をノックダウンする（dbl-1 RNAi）ことで、BCF-1の発現が低下することを確認した（図6B）。次に、DBL-1が大腸菌のコロニー形成にも影響を与えるかどうかを調べるため、L1ワームをdbl-1 RNAiプレートで2世代培養した後、L4ワームを大腸菌OP50-GFPプレートに移して3日間培養を行った。その結果、dbl-1 RNAiを持つ動物では大腸菌のコロニー形成が減少し（図6C）39、合成微生物群集を与えたdbl-1変異動物では腸内細菌の存在量が増加したことから、TGFβ/BMP免疫シグナルが線虫の通性動物の存在量に影響を与えていることが示唆された。ここでは、大腸菌の単回給餌のみで動物のコロニー形成を試験したため、コロニー形成の制御における細菌の相互作用や、宿主のコロニー形成因子に影響を与える他の常在菌との可能性を排除することができなかった。しかし、我々のデータは、DBL-1が腸内における大腸菌のコロニー形成のためにBCF-1の発現を活性化することを示すものであった。
BCF-1は腸内細菌叢を形成する
我々は、Caenorhabditis elegans-E. coli（GFP）を単純なモデルとして用いることで、宿主因子BCF-1が腸での大腸菌のコロニー形成を制御していることを明らかにしました。しかし、自然環境では、C. elegansは特に微生物の多様性に富む環境に多く生息している13。そこで、BCF-1が腸内細菌叢組成の形成に寄与しているかどうかを検討した。まず、腐ったリンゴ、バナナ、ヨーグルトを混ぜて、多様な微生物が豊富な栄養源を確立した（図S5A）。L4 WTおよびbcf-1（ylf1）変異体（以前は大腸菌OP50で培養）の10個の独立した集団を、この食物源（細菌群）で3日間培養した。その後、細菌16S rDNAのディープシークエンスにより、ワームの微生物相の細菌組成を特徴付けた。主座標分析（PCoA）により、WT と bcf-1(ylf1) 変異体の微生物叢は顕著に分離し（図 7A ）、宿主因子 BCF-1 が微生物相に大きな影響を与えていることが示唆された。16S rDNA遺伝子配列解析の結果、bcf-1(ylf1)変異体では、Gammaproteobacteriaが減少し、ほとんどの種（Actinobacteria、Alphaproteobacteria、Bacilli、Bacteroidia、Oxyphotobacteriaなど）が増加した (Fig. 7B, 7C, and S5B; Table S5)。さらに、好気性細菌、グラム陰性細菌、グラム陽性細菌、潜在的病原性細菌の存在量は、WTとbcf-1(ylf1)変異体動物で異なっており、好気性細菌とグラム陰性細菌族は変異体で減少し、グラム陽性細菌と潜在的病原性細菌は増加した (Figures 7D-7G; Table S5)。これらのデータを総合すると、BCF-1がミミズ腸内の細菌群集の組成を形成していることが示された。
図7.
図7BCF-1による腸内細菌叢の形成
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考察
共生する腸内細菌は、動物の健康、特に疾病の軽減に重要な役割を担っている。共進化と共種分化は、腸内細菌群間および腸内細菌群内の恒常性を維持するための極めて重要なイベントである。このように、宿主と腸内細菌の深い関わりを理解するためには、宿主がどのように細菌群集を形成しているかが非常に重要である。本研究では、C. elegans-E. coliの相互作用モデルを用いて、細菌のコロニー形成を形成する宿主因子を同定するスクリーニング方法を確立した。その結果、N-グリコシル化タンパク質（BCF-1）が、大腸菌のフィンバリアタンパク質YdeRを介して直接大腸菌と結合し、腸内細菌叢のコロニー形成や存在量を制御する役割を持つことを突き止めた。宿主のBCF-1の発現は大腸菌によって刺激され、BMP/DBL-1シグナルによって正に制御されている（図7H）。したがって、我々の研究は、特定の糖タンパク質の役割とそのメカニズムが細菌のコロニー形成を制御していることを明らかにした。また、N型糖鎖修飾が腸内細菌の量を調節する重要なハブであるという証拠を追加するだけでなく、細菌のコロニー形成を調節する個々の宿主因子を特定するための貴重な研究アプローチを提供するものである。
これまでの研究で、ヒトのゲノムワイド関連解析により、宿主の遺伝子が微生物叢を形成していることが明らかにされている1,2,3,4,5,6。これらの因子には、抗菌ペプチド41、パターン認識受容体42、免疫グロブリンA（IgA）抗体産生に影響を与える遺伝子43、バリアムチンのグリコシル化に必要な酵素などが含まれる26,44。
しかし、動物の腸内には複雑な微生物コンソーシアムが存在し、無菌マウスや個々の細菌の相互作用系を用いた高価な動物モデルもあるため、バランスのとれた細菌集団を維持するメカニズムの解明は困難である45。線虫と細菌を用いた2サイド遺伝子解析の利点により、ホスト-微生物相互作用に関わる分子メカニズムの一部が明らかにされてきた。最近の研究では、線虫は環境や地理的な変化に関係なく、種としての特性、つまり基礎となるゲノムによって定義されるコアマイクロバイオームを保有していることが判明しています。したがって、線虫は、腸が微生物群集によってどのようにコロニー形成され、同時に、宿主がこの微生物群集によってどのように影響を受けるかを分子および生化学的レベルで理解するために、宿主および細菌因子を系統的にスクリーニングするための優れた動物モデルであると言える。本研究では、（1）内腔分泌タンパク質が細菌（大腸菌）によって誘導されること、（2）それらのタンパク質も細菌（大腸菌）に直接結合すること、という2つの単純な性質を持つ宿主因子をスクリーニングすることにより、細菌のコロニー形成の制御に関わるN-糖タンパク質を同定することに成功した。また、腸内pHの調節に関与する宿主因子や抗菌ペプチドも微生物叢の構成に影響を与える可能性がある。このように、線虫を用いた簡便なスクリーニング法を開発することは、細菌のコロニー形成を形成する個々の宿主因子を同定するための強力なアプローチとなり得る。
腸管上皮の糖鎖形成は、バリアー形成、宿主-微生物共生、免疫に寄与している。ムチン型O-グリカンは、腸の主要な糖鎖のクラスである。ムチン型O-グリカンは腸内細菌の主要な糖鎖であり、その存在によって粘液細菌組成に影響を与え、特定の細菌を選択したり、逆に細菌を排除することができる。ムチン型O-グリカンが宿主微生物とのホメオスタシスを促進することは明らかである。24 O-グリカンが微生物の選択を媒介する分子的根拠はまだ明らかではないが、おそらくこのプロセスには、ムチン型O-グリカンの特定の構造への細菌レクチン様接着剤の結合が関与している47。分泌型ムチンに存在するO-グリカンは、栄養学的な選択根拠を生み出し、大腸菌のコロニー形成能力に影響を与える可能性もある48。哺乳類において、大腸菌は消化管内の優勢な通性嫌気性菌である。本研究では、BCF-1が腸管内腔膜ラフトに局在するN-グリコシル化タンパク質であり、腸で高発現し、線虫の大腸菌結合と微生物叢形成に重要であることを見出した。この結合は、腸内細菌科に保存されている大腸菌のフィンブリアル・タンパク質YdeRに依存しており、YdeRがBCF-1と宿主との細菌バランス維持の鍵である可能性が示唆された。脱糖したBCF-1は、in vitroでは大腸菌と結合できない。また、ostb-1 RNAiを与えたワムシでは、BCF-1タンパク質のN-グリコシル化が低下しており、大腸菌のコロニー形成効率が低下していることが明らかになった。これらのデータは、BCF-1 N-型糖鎖が大腸菌を内腔に位置づけるための足場として機能している可能性を示唆しており、特定の細菌の宿主選択のモデルとなっていると考えられる。
以上のことから、本研究は、大腸菌が活性化したN-糖タンパク質が、選択的な細菌（大腸菌）との直接結合を介して、腸管内の細菌コロニー形成を形成するという原理を明らかにした。したがって、動物モデルを用いて、腸管上皮のN-グリコシル化の程度が哺乳類の細菌構成にどのように影響するかをさらに検討することは、非常に重要である。また、今回報告された宿主のN-glycoproteinが大腸菌と直接相互作用する足場モデルは、他の細菌が腸に定着するメカニズムの理解に大きな影響を与える可能性がある。
研究の限界
本研究では、宿主タンパク質の糖鎖修飾（BCF-1）が細菌の結合とコロニー形成に極めて重要な役割を果たしていることが示された。しかし、動物が糖化BCF-1の誘導によってどのように大腸菌を感知しているのかは、まだ不明である。この問題は、今後、BCF-1:GFPレポーター動物を用いた大腸菌刺激によるフォワードジェネティックススクリーンで解決できる可能性がある。
STAR★Methods
主要リソース一覧
試薬またはリソースソース IDENTIFIER
抗体
anti-flag M2, モノクローナル抗体 Sigma Cat #F3165

RRID:AB_259529
抗α-チューブリン モノクローナル抗体 Sigma Cat #T5168

RID:AB_477579
抗 mCherry-tag マウスモノクローナル抗体 Sungene Biotech Cat #KM8017
ペルオキシダーゼ標識Affinipure Goat Anti-Rabbit IgG(H + L) Jackson Cat #111 -035-003

RID: AB_2313567
ペルオキシダーゼ標識アフィニピュアゴート抗マウスIgG(H + L) Jackson Cat #115 -035-003

RID:AB_10015289
抗フラグ ® M2 アフィニティ ゲル Sigma Cat #A2220

RID:AB_10063035
細菌・ウイルス株
大腸菌 慶應ノックアウト親株 BW25113 Dharmacon Cat #OEC5042
E. coli Keio Knockout Collection Dharmacon Cat #OEC4988
大腸菌 OP50 ケノラブディティス・ジェネティクスセンター（CGC） RRID:WB-STRAIN:OP50
大腸菌 OP50-GFP CGC N/A
Escherichia coli OP50-mCherry この試験 N/A
RNAi給餌細菌株 HT115(DE3) GE Dharmacon (ORF RNAi library) N/A
RNAi給餌細菌株 ostb-1 GE Dharmacon (ORF RNAi library) N/A
RNAi 供給細菌株 dbl-1 GE Dharmacon (ORF RNAi ライブラリー) N/A
RNAi 供給菌 HT115(DE3) Source BioScience (Ahringer) N/A
ORFeome RNAi ライブラリー GE Dharmacon (ORF RNAi ライブラリー) N/A
大腸菌 K12-gfp この試験 N/A
大腸菌 ΔydeR-gfp 本試験 N/A
大腸菌 K12 Dharmacon N/A
Escherichia coli ΔydeR Dharmacon N/A
化学物質、ペプチド、リコンビナントタンパク質
レバミソール塩酸塩 サンゴン・バイオテック社 Cat# MFCD00012675
ゲンタマイシン溶液 Solarbio Cat #L1312
アンピシリンナトリウム Sangon Biotech Cat #A610028 -0025
Kanamycin sulfate Sangon Biotech Cat #A506636 -0025
ラテックスビーズ、アミン修飾ポリスチレン、蛍光性黄緑色 Sigma Cat #L1030
BIOHUB 78PEI MAX 40K 78bio Cat #78pei40000
重要な市販アッセイ
PNGase F、リコンビナント NEB Cat #P0708S
カクテル MCE Cat #HY -K0011
ECL Select ウェスタンブロッティングキット GE Healthcare Cat #RPN2235
SuperSignal™ ウェスタンブロッティングキット Thermofisher Cat #A45915
2×Rapid Taq マスターミックス Vazyme Cat #P222 -01
Phanta HS スーパーフィデリティ DNA ポリメラーゼ Vazyme Cat #P502 -d1
KOD FX 東洋紡績株式会社 Cat #KFX -101
ClonExpress MultiS ワンステップクローニングキット Vazyme Cat #C113 -01
オメガプラスミドミニキット I Omeg社製 猫型番：D6932-02
The Omega Gel Extraction Kit Omega Cat #D2500 -02
Pierce BCA Protein Assay Kit Thermo Fisher Cat# 23225
Fast Silver Stain Kit Beyotime Cat# P0017S
寄託データ
N2とbcf-1(ylf1)のRNA-seqデータ 本紙GSE221568
実験モデル 生物／系統
C. elegans N2 線虫遺伝学センター(CGC) N/A
C. elegans: RB1971 F57F4.4(ok2599) V CGC N/A
C. elegans: YNU30: bcf-1(ylf1) V この研究 N/A
C. elegans: YJ402: erm-1::gfp Gobel et al.31 N/A
C. elegans: KWN117: rnyEx60 [pELA2 (vha-6p::vha-6::mCherry) + myo-3p::GFP + pCL1 (pha-1+)] CGC N/A
C. elegans PHX4067: syb4067 [bcf-1p::bcf-1::gfp::3xflag] V SunyBiotech N/A
C. elegans: YNU43: syb4067 [bcf-1p::bcf-1::gfp::3xflag] V; ylfEx139[ostb-1p::HA::ostb-1::mCherry + odr-1p::gfp] この研究結果についてN/A
C. elegans YNU196: rnyEx60 [pELA2 (vha-6p::vha-6::mCherry) + myo-3p::GFP + pCL1 (pha-1+)]; syb4067 [bcf-1p::bcf-1::gfp::3xflag] V この研究N/A
C. elegans DA1116: eat-2(ad1116) II CGC N/A
C. elegans: YNU197: eat-2(ad1116);bcf-1(ylf1) この研究 N/A
オリゴヌクレオチド
プライマー（表 S6 参照） 本試験 N/A
リコンビナントDNA
プラスミド：pPD49.26 Miedel et al.49 Addgene Plasmid #37830
プラスミド: pPD162 Dickinson et al.50 Addgene Plasmid #47549
プラスミド Postb-1 HA::ostb-1::mCherry この論文 N/A
プラスミド Anxa2::flag この論文 N/A
プラスミド SerpinA3n::フラグ 本紙 N/A
プラスミド: pFPV25.1 Valdivia and Falkow51 Addgen #20668
プラスミド: pFPV-mCherry Drecktrah et al.52 Addgen #20956
プラスミド：pLVX-CMV100 Dean et al.53 Addgen #110718
ソフトウェアおよびアルゴリズム
Fiji (ImageJ) http://fiji.sc Ver 1.50i; RRID:SCR_002285
Prism Version 8.0.1 GraphPad https://www.graphpad.com/scientific-software/prism/
新しいタブで表を開く
リソースの有無
リード連絡先
詳細な情報や試薬のリクエストは、Lead contact Bin Qi (qb@yun.edu.cn)にお願いします。
材料の入手方法
本研究で作製したすべての試薬と菌株は、研究資材譲渡契約書とともに、主担当者に請求することで入手可能である。
実験モデルおよび被験者の詳細
C. elegansの株と維持
線虫株は、細菌（E. coli OP50）を播種した線虫増殖培地（NGM）プレート上で20℃に維持した。
以下の株/アレルがCaenorhabditis Genetics Center (CGC)から入手された、または指示されたものである。N2 Bristol（野生型対照株）；RB1971［f57f4.4（ok2599）］；YJ402：［Perm-1：：erm-1：：GFP］；KWN117 ［pha-1(e2123) III；hum-5(e1490) V；rnyEx60 ［pELA2 (vha-6p::vha-6:mCherry) + myo-3p:GFP + pha-1(+)]. DA116：eat-2(ad116)
本研究により、以下の系統が作製された。
YNU30: bcf-1(ylf1);
PHX4067 F57F4.4 {syb4067[bcf-1p::bcf-1::3xflag::gfp(knock-in)]};
YNU43: {(syb4067 [bcf-1p::bcf-1::3xflag::gfp], ylfEx139[ostb-1p::HA::ostb-1::mCherry, odr-1p::GFP])})
YNU196: rnyEx60 [pELA2 (vha-6p::vha-6::mCherry) + myo-3p::GFP + pha-1(+)]};syb4067 [bcf-1p::bcf-1::gfp::3xflag];
YNU197：eat-2（ad1116）；bcf-1（ylf1）。
細菌株
大腸菌OP50、大腸菌K12（BW25113）、大腸菌K12変異体、大腸菌OP50-mCherry、大腸菌OP50-GFP、大腸菌HT115をLB培地で37℃にて培養した。
その後、標準的な一晩培養した菌を各線虫増殖培地（NGM）プレートに撒いた。
方法の詳細
トランスジェニック系統の作製
1)
CRISPR/Cas9によるYNU30: bcf-1(ylf1)の作製
オンラインCRISPRデザインツール（http://crispor.tefor.net/）を用いてシングルガイドRNA（sgRNA）標的配列を設計し、pPD162ベクター50にクローニングしてsgRNA発現ベクターを作成した。共打ちマーカーとしてpCFJ90 (Pmyo-2:mCherry; Addgene #19327 ) を使用した。標的遺伝子のsgRNAベクター（20ng/μL）と共打ちマーカーpCFJ90（2.5ng/μL）を若齢成獣の生殖腺に共打ちした。共射出マーカーpCFJ90のF1子孫を単一化してF2子孫を作り、PCR増幅とT7 Endonuclease I消化でスクリーニングした。F1突然変異体の単一子孫をさらに個々のプレート上で単離し、ホモ接合型突然変異について分析した。すべての変異は配列決定によって確認された。この株の作成に使用したプライマーは
bcf-1(ylf1) sgRNA。Atcgaagttattaatgcccc
2)
CRISPR/Cas9によるPHX4067の作製
サニーバイオテック社（http://www.sunybiotech.com）において、CRISPR-Cas9の手法により株（PHX4067, syb4067 [bcf-1p::bcf-1::3xflag::gfp]) を作出した。
以下のsgRNAを使用した。
Sg1-CCACAAAGGGCTCATCTTCCATC.
Sg2-TATCGCTCTGACTAGACATTAGg.
3)
YNU43の作製
線虫のosb-1過剰発現プラスミドを構築するために、まずosb-1の2X HAタグとゲノムDNAをpPD49.26:mCherryに挿入し、PstIで消化し、得られたベクターをosb-1と命名した。2kbのostb-1プロモーターはSphIで消化された結果ベクターに挿入された。このコンストラクトはシークエンスにより確認された。
YNU43 {syb4067[bcf-1p::bcf-1::gfp::3xflag (knock-in)], ylfEx139[ostb-1p::HA::ostb-1::mCherry, odr-1p::gfp]} を作成するために、 ostb-1p.P を含む DNA プラスミド混合物を用意した。 :HA::ostb-1::mCherry (25ng/ul) と odr-1p:GFP(25ng/ul) を含む DNA プラスミドを標準的な方法で syb4067 [bcf-1p::bcf-1::3xflag::gfp] 二卵性成虫の性腺に注射した。 54
顕微鏡および画像解析
タンパク質（GFPおよびmCherry）局在化の観察／定量化のために、幼虫または成虫を2.5mMレバミソールを含むM9緩衝液中の3%寒天パッドにマウントし、DP80カメラを備えた倒立Leica STELLARIS 8 FALCONまたはOlympus BX53顕微鏡を用いて写真を撮った。
OP50-GFPコロニー形成アッセイでは、OP50-GFPをコロニー形成したワームをOlympus MVX10解剖顕微鏡とDP80カメラを使用して撮影した。
OP50-GFPのコロニー形成アッセイ
大腸菌OP50/E. coli HT115で増殖したL4ワームをピッキングにより大腸菌OP50-GFP播種プレートに移し、その後20℃で3日間インキュベートした。OP50-GFPをコロニー形成した動物を25mMレバミソールを含むM9塩溶液を用いて麻酔した後、100mg/mlアンピシリンを含むLBプレートに移し、40℃で一晩培養した。この培養条件では、腸内にコロニー化した大腸菌OP50-GFPはその場で増殖し、それによってOP50-GFPシグナルを増幅することができたが、ワームは加熱により死滅してしまった。OP50-GFPでコロニー形成された死んだワームは、ピッキングにより新しいNGMプレートに移し、顕微鏡でGFP蛍光チャンネルを使用して撮影された。GFPの強度はImageJで算出した。
腸管コロニー形成単位の定量化
腸内のコロニー形成単位（CFU）の測定は、記載されているように行った17。簡単に言えば、50匹のワームを25mMレバミソールを含む500μL M9バッファにピッキングし、5回洗浄した。動物表面の細菌を除去するために、次に動物を25mMレバミゾール、100μg/mLゲンタマイシンおよび1mg/mlアンピシリンを含むM9緩衝液で室温で1時間処理した。その後、M9バッファーで3回洗浄した。最後に、虫を滅菌乳棒で溶解し、溶解液をLB寒天培地プレートにプレーティングして一晩培養を行った。翌日、細菌のコロニー数を数え、動物1匹あたりのコロニー形成単位（CFU）を算出した。
OP50-mCherryコロニー形成アッセイ
大腸菌OP50で増殖したL4ワームを大腸菌OP50-mCherry播種プレートに移し、その後20℃で3日間インキュベーションを行った。動物を25mMレバミソールを含むM9バッファーを用いて麻酔した後、ワームをスライドに摘出し、DP80カメラを備えたOlympus BX53顕微鏡を用いてmCherry蛍光チャネルで顕微鏡観察した。
蛍光ビーズ摂取量の測定
この方法は Kiyama らから改変したものである55 。簡単に言うと、15ul のラテックスビーズ（アミン修飾ポリスチレン、蛍光黄緑、Sigma #L1030 ）を M9 緩衝液で洗浄し、NGM プレートに適用した。成虫をM9バッファーで3-5回洗浄し、細菌を除去した後、ビーズの付いたNGMプレートに塗布した。プレートは、20℃で30分間インキュベートした。その後、25 mMレバミゾールを含むM9バッファーを用いて動物を麻酔し、Olympus BX53顕微鏡とDP80カメラを用いて蛍光画像を撮影するために虫をスライドガラスに摘出した。
細菌の増殖速度の検出
標準的な一晩培養した細菌（LBブロス中37℃）を新鮮なLBブロスに希釈した（1：100の割合）。希釈した細菌を37℃で200rpm振とうしながら培養した。定常期まで1時間ごとにOD600を測定した。
寿命の解析
寿命の研究は、以前に記載されたように、20℃のNGMプレート上で行った56。簡単に言えば、寿命は、健康なL4段階の雌雄同体をOP50播種NGMプレート上に置くことによって0日目に開始された。繁殖期（およそ最初の10日間）には、自己繁殖を排除するために動物を新しいOP50播種プレートに移し、その後は2日ごとに移した。虫は毎日採点した。統計解析にはPrism8ソフトウェアを使用した。すべての生存データは表S2で入手可能である。
咽頭ポンピング率
L4+3日齢の動物を用いて咽頭ポンピング速度を測定した。咽頭ポンプは、DP80カメラを備えたOlympus MVX10解剖顕微鏡を用いて、10秒間のインターバルの間にカウントされた。その後、1秒あたりに換算した。
RNAi処理
すべての摂食 RNAi 実験では、MRC RNAi ライブラリー57 または ORF-RNAi ライブラリー38 からの細菌クローンを用いた。RNAi プレートは、NGM 寒天に最終濃度 1 mM となるように IPTG を加えることで調製した。特定の RNAi 株と対照株（空の L4440 ベクターを持つ HT115 株）の一晩大腸菌培養物（100μg/ml アンピシリン含有 LB ブロス）を RNAi 供給プレートに播種し、使用前に室温で 2 日間培養を行った。
RNAiスクリーニング
RNAiスクリーニングは、1mM IPTGおよび100ug/ml Ampicillinを含むNGM寒天を用いた96ウェルプレートで行った[ C. elegans open reading frame (ORF)-RNAi feeding library (Source Bioscience) ]。大腸菌HT115 RNAi培養液を100μg/mlアンピシリンを含むLBで対数期まで96ウェルディッシュで培養した。個々のRNAiクローンを含む培養菌体50ulをスクリーニングプレートに添加した。同調したL1ワーム（bcf-1p::bcf-1::gfp::flag）をプレートに加え、L4ステージまで成長させた。その後、L4ステージの動物をOP50-GFPプレートに移し、コロニー形成の後、コロニー形成アッセイを行った。
GFP標識大腸菌またはmCherry標識大腸菌の構築
コンピテント大腸菌の調製
大腸菌K12-mutant-GFPの構築には、大腸菌慶應コレクションからの変異株のシングルコロニーを50ug/mL Kanamycinを含むLB液体培地に37℃で一晩植菌した。大腸菌OP50-mCherryの構築のために、大腸菌OP50のシングルコロニーを37℃で一晩、LB培地中に接種した。この菌液200-300μlを1.5mLチューブに入れ、30分間氷上に置いた。4000rpm、4℃で2分間遠心分離した後、上清を捨て、あらかじめ冷却した0.1M CaCl2を1mL加えてペレットを再懸濁させた。以上のステップを3回繰り返した。最後に、ペレットを60ul 0.1M CaCl2に懸濁し、コンピテント大腸菌を作製した。
ヒートショック形質転換
Plasmid MiniKitⅡ(OMEGA、D6945-02)で抽出した pFPV-25.1 plasmid (Addgen #20668 ) と Pfpv-mCherry (Addgen #20956 ) を 60ul のコンピテント E. coli細胞に加え、30分間氷上に置き、42℃で45秒間熱ショックを行い、すぐに 氷上に戻した。その後、900ulのLB培地を加え、チューブを37℃の振盪インキュベーターに1時間入れた。その後、アンピシリン（100μg/mL）を含むLBプレート上に菌体を広げ、37℃で培養した。翌日、個々の緑色または赤色のコロニーを蛍光顕微鏡で観察した。
大腸菌刺激動物からの分泌タンパク質の単離
同調したL1ワームを500ulのM9に入れ、5ulの大腸菌（OD600 = 1）を添加するかしないかで1.5mLチューブに入れて4時間穏やかに振盪し、50g、1分間の遠心分離でワームをペレット化して上清を採取した。
上清を0.22μmのフィルターユニットでろ過し、Orbitrap hybrid mass spectrometer (Orbitrap exploris 480, Thermo Scientific)を用いて質量分析用の分泌タンパク質を取得した。
ミミズの全タンパク質抽出
ミミズは、液体窒素中、PMSF（1mg/ml）を含むタンパク質溶解バッファ（50mM Tris-HCL, 50mM NaCl, 0.5% deoxycholate, 10% glycerinum, 1%NP40) で3回凍結融解して溶解された。その後、虫を組織粉砕チューブで粉砕した。次に、得られた液体を12000rpm、4℃で20分間遠心分離し、上清をミミズの総タンパク質とした。タンパク質濃度は、Pierce BCA protein assay kit（ThermoFisher社製、23,227）を用いて測定した。
タンパク質-細菌結合アッセイ
タンパク質-細菌結合アッセイは、記載されているように行った58。簡単に言うと、大腸菌K12野生型とΔydeR変異体を50mg/mLカナマイシンを含むLBで37℃、同じOD600値まで培養した。2mLの菌体を遠心分離（8,000rpm, 1min）し、上清を捨て、ペレットをMESバッファ（25mM MES, 25mM NaCl, pH = 6.0) で3回洗浄し、最後に500ul MESバッファに再懸濁させた。この500ulの菌体懸濁液に同量のタンパク質（300μg-1mg）を加え、4℃で2時間、回転させながらインキュベートした。インキュベーション終了後、細菌をペレット化し、インキュベートした上清を除去し、ペレットをMESバッファーで3回洗浄した。洗浄したペレットと培養した上清に含まれるタンパク質をウェスタンブロットで検出した。
トランスフェクションおよびトランスダクション
一過性のトランスフェクションのために、293T細胞を6ウェルプレートに播種した（タンパク質-大腸菌結合アッセイ用）。細胞が70〜80％のコンフルエンスに達したとき、トランスフェクション試薬（BIOHUB 78PEI MAX 40K）の説明書に従ってプラスミドを細胞にトランスフェクションした。48時間後、細胞を回収し、溶解して全タンパク質を抽出し、これをタンパク質-大腸菌結合アッセイに使用した。タンパク質（Anxa2およびSerpinA3n）の発現効率は、ウェスタンブロットにより確認した。
大腸菌結合タンパク質アッセイ
大腸菌（一晩培養、OD600 = 1）を遠心分離し、ペレットをMESバッファーで3回洗浄し（上図）、最後に500ul MESバッファーに再懸濁させた。この500μlの大腸菌懸濁液を、ワーム全タンパク質（上記に示す）と共に、またはワーム全タンパク質なしで、2時間インキュベートした。インキュベーションの最後に、細菌をペレット化し、インキュベーションした上清を除去し、ペレットをMESバッファーで3回洗浄した。
大腸菌ペレットに付着しているタンパク質をSDS-loading bufferで煮沸して溶出した（100℃、15分）。上清を13,000 g、10分間の遠心分離で回収し、SDS-PAGEゲルで分離した。SDS-PAGEゲルからバンドを切り出し、Orbitrap hybrid mass spectrometer (Orbitrap exploris 480, Thermo Scientific) を用いたLC-MS分析に回した。
タンパク質の脱グリコシル化アッセイ
ワムシの全タンパク質を市販の酵素PNGase F (NEB #P0708S ) で製造者のプロトコルにしたがって処理し、N-グリコシル化修飾を除去した。
IP-MSと共沈反応
IP-MSでは、PHX4067 [bcf-1p::bcf-1::gfp::3xflag] worm lysateの総蛋白5mgをANTI-FLAG beads (Sigma, #A2220 ) (30μl) と4℃で一晩混合し、洗浄バッファ (50mM Tris, 150mM NaCl, pH = 7.4) で5回洗浄を行った。タンパク質は1% SDSを用いて煮沸溶出し、銀染色とウェスタンブロットで検出した後、質量分析に供した。
共免疫沈降については、トランスジェニックワームYNU-43（ostb-1p::HA::ostb-1::mCherryおよびbcf-1p::gfp::3xflag搭載）の溶解液を上記のように処理し、サンプルを抗FLAGマウスmAb（Sigma）および抗mCherryマウスmAb（Sungene Biotech）でプローブしたウェスタンブロット分析に供した。
ウェスタンブロット
標的タンパク質を標準的なウェスタンブロット法により分析し、以下の抗体でプローブした：抗フラグM2、モノクローナル抗体（希釈＝1：5000、Sigma、F3165）、モノクローナル抗α-チューブリン抗体（希釈＝1: 5000, Sigma, T5168), Anti mCherry-tag mouse monoclonal antibody (Sungene Biotech, KM8017), Peroxidase-conjugated Affinipure Goat Anti-Rabbit IgG(H + L) (Jackson, 111-035-003), Peroxidase-conjugated Affinipure Goat Anti-Mouse IgG(H + L) (Jackson, 115-035-003)の5種類の抗体がある。
RNA-seq
1)
RNA-seq用動物サンプルの調製
RNA-seqは、独立に生成、収集、処理された3つの生物学的複製で行われた。大腸菌OP50で生育した成体動物[野生型N2およびbcf-1(ylf1)変異体]を採取した。
2)
RNA シークエンスとデータ処理
RNAサンプル調製のための入力材料として、サンプルあたり合計1μgのRNAを使用した。NEBNext UltraTM RNA Library Prep Kit for Illumina (NEB, USA)を用いて、製造元の推奨に従ってシーケンスライブラリを作成し、各サンプルにシーケンスを帰属させるためにインデックスコードを付加した。ライブラリー調製物はIlluminaプラットフォームで配列決定され、ペアエンドリードが生成された。生リードをさらにバイオインフォマティックパイプラインツール、BMKCloud（www.biocloud.net）オンラインプラットフォームで処理した。
DESeq2を用いて、2つの条件/グループの発現差分析を行った。微量発現遺伝子（DEGs）の遺伝子オントロジー（GO）濃縮分析は、DEGsにおける遺伝子長バイアスを調整できるWallenius非中心超幾何分布59に基づくGOseq Rパッケージによって実施された。RNA-seq データは、表 S3 に掲載されている。
線虫の腸内細菌叢組成の測定
サンプル調製
腐敗果実（リンゴ、バナナ）およびヨーグルトから細菌群集を分離した。腐敗果実（リンゴ、バナナ）およびヨーグルトをLB培地で培養（37℃で一晩）し、細菌群集を採取した。ティッシュペーパーを敷いたバールマン漏斗を用い、菌群（培地上清）を採取した。6cm NGMプレートに、10倍濃縮した菌群（培地上清）200ulを播種し、バクテリアローンを作製した。独立したL4ワーム10個体（約200匹、以前はOP50給餌）に細菌群集を3日間与え、微生物相を確立させた。ワムシを M9 で洗浄（6 回）し、滅菌（100 μg mL-1 ゲンタマイシンを含む線虫増殖培地プレート上で 1 時間）22 し、M9 でもう一度洗浄後、16S rDNA のディープシーケンス用に-80℃で冷凍保存した。
DNA抽出
DNAはTGuide S96 Magnetic Soil/Stool DNA Kit (TiangenBiotech (Beijing) Co., Ltd.)を用いて、メーカーの説明書にしたがって抽出した。Qubit dsDNA HS Assay Kit と Qubit 4.0 Fluorometer (Invitrogen, Thermo Fisher Scientific, Oregon, USA) を用いて、サンプルの DNA 濃度を測定した。
アンプリコンシークエンス
338F: 5′- ACTCCTACGGGAGGCAGCA-3′ and 806R: 5′- GGACTACHVGGTWTCTAAT-3′ universal primer setを使用して、各サンプルから抽出したゲノムDNAから16S rRNA遺伝子のV3-V4領域を増幅させた。フォワードおよびリバース16Sプライマーの両方には、ディープシーケンスを可能にするためにサンプル固有のIlluminaインデックス配列がテールされていた。PCRは総反応量10μLで行った：DNAテンプレート5-50 ng、＊Vn F (10μM) 0.3 μL、＊Vn R (10μM) 0.3 μL、KOD FX Neo Buffer 5 μL、dNTP (2mM each) 2 μL、KOD FX Neo 0.2 μL、ddH2O 最大10 μL. Vn FとVn Rは、増幅領域に応じて選択した。PCR反応は、95℃で5分間の初期変性後、95℃で30秒間の変性、50℃で30秒間のアニーリング、72℃で40秒間の伸長を25サイクル行い、72℃で7分間の最終伸長ステップを実行した。全PCRアンプリコンをAgencourt AMPure XP Beads (Beckman Coulter, Indianapolis, IN) で精製し、Qubit dsDNA HS Assay KitおよびQubit 4.0 Fluorometer (Invitrogen, Thermo Fisher Scientific, Oregon, USA) を使用して定量した。個々の定量ステップの後、アンプリコンを等量でプールした。構築されたライブラリについては、Illumina novaseq 6000 (Illumina, Santiago CA, USA) を使用して配列決定が行われた。
バイオインフォマティクス解析
本研究のバイオインフォマティクス解析は、BMK Cloud (Biomarker Technologies Co., Ltd., Beijing, China) の助けを借りて行った。一塩基の品質に従って、生データは主にTrimomatic60（バージョン0.33）によってフィルタリングされた。プライマー配列の同定と削除はCutadapt61 (version 1.9.1)で処理した。PEリードはUSEARCH62 (version 10)でアセンブルし、UCHIME63 (version 8.1) でキメラ除去を行った。以上の手順で得られた高品質リードを以下の解析に使用した。USEARCH60 (v10.0)で類似度97%以上の配列を同一のOTUにクラスタリングし、存在量<0.005%のOTUをフィルターにかけた。SILVAデータベース63 (release 132)を用いて、QIIME264のNaiveBayes分類法に基づいてOTUの分類注釈を行い、信頼度閾値は70%とした。Alpha多様性はQIIME2およびRソフトウェアでそれぞれ計算し、表示した。ベータ多様性は、QIIMEを用いて異なるサンプルの微生物群集の類似性の程度を評価するために決定された。β多様性の解析には、主座標分析（PCoA）、ヒートマップ、UPGMA、非計量多次元尺度法（NMDS）を用いた。さらに、線形判別分析（LDA）効果量（LEfSe62）を用いて、グループ間の有意な分類学的差異を検定した。識別特徴の閾値として、対数LDAスコアが4.0と設定された。異なる要因間のマイクロバイオームの非類似性を探るため、Rでパッケージ「vegan」を用いて冗長性分析（RDA）を実施した。図 7F および 7G の「好気性」グループと「潜在的病原性」グループは、マイクロビオームサンプルに存在する高レベルの表現型を決定するマイクロビオーム解析ツールである BugBase prediction40 を使用して分類された。
定量化・統計解析
定量化
BCF-1::GFPレポーターまたは大腸菌GFPの相対蛍光強度の定量化にはImageJソフトウェアを使用し、体積で正規化した。
統計解析
すべての統計解析はStudentのt-testを用いて行った。2つのサンプルグループの統計解析には、両側不対t検定を使用した。データはMean ± SDで表示し、p < 0.05は有意差とみなした。寿命の統計解析には Log rank (Mantel-Cox) test を用いた。
データおよびコードの入手方法

本論文のRNA-seqデータはNCBIのGene Expression Omnibusに寄託されており、GEOからアクセス可能である。GSE221568.

本論文では、オリジナルのコードは報告していません。

本論文で報告されたデータの再解析に必要な追加情報は、リクエストに応じて主担当者から入手可能である(qb@ynu.edu.cn)。
謝辞
Huanhu Zhu博士とC. elegans Knockout ConsortiumおよびCGC（NIH P40OD010440による資金提供）に菌株を、Zhao Shan博士に議論を、Leonard Krall博士に編集サービスを、雲南大学The Mass Spectrometry FacilityのXuna WuにMSで感謝します。本研究は、中華人民共和国科学技術部（2019YFA0803100および2019YFA0802100）、中国国家自然科学基金（32170794）、雲南応用基礎研究プロジェクト（2019FY003022、202001AV070011、202001AW070006、202201AT070196）および雲南大学スタートアッププログラムにより支援されたものです。
著者による寄稿
Y.H.とF.H.はほとんどの実験を行い、データを分析した。H.F.とG.T.はRNAiスクリーニングを行った。Y.Z.は、大腸菌コロニー形成法アッセイを行った。K.F.は293T細胞で実験を行った。B.Q.は、Y.H.とF.H.の意見を取り入れながら、研究の設計、本研究の監督、論文執筆を行った。
利害関係の宣言
著者らは、競合する利害関係を宣言していない。
補足情報
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資料S1. 図 S1-S5
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表S1. 図1B、1D、1Fに関連する大腸菌結合タンパク質と動物分泌タンパク質のリスト
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表S2. N2およびbcf-1(ylf1)変異体の生存データ、図S2Dに関連する。
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表S3. bcf-1(ylf1)変異体で発現低下した遺伝子のGO濃縮、図S2Eに関連する。
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表S4. RNAiスクリーニング後のBCF-1の制御因子のリスト、図6関連
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表S5. 10匹の独立したN2動物およびbcf-1（ylf1）変異体における微生物叢組成、図7B〜7GおよびS5Bに関連したもの
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表S6. オリゴヌクレオチド配列のリスト、主要なリソースの表と関連する
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記事情報
出版年譜
オンライン公開 2023年1月18日
受理されました。2023年1月4日
改訂版受理：2023年1月4日 2022年12月6日
受理：2022年12月6日 2022年8月29日
身分証明書
DOI: https://doi.org/10.1016/j.celrep.2023.111993

著作権について
© 2023 The Author(s).
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図版の概要
図 サムネイル gr1
図1大腸菌のコロニー形成を制御する宿主因子の同定
図2.
図2BCF-1による大腸菌のコロニー形成の仲介
サムネイルgr3
図3BCF-1と大腸菌はフィンバリアタンパク質を介して直接相互作用する
サムネイルgr4
図4BCF-1は大腸菌のコロニー形成を制御するのに重要なOSTB-1と直接相互作用している
図1.
図5 BCF-1のN-グリコシル化は大腸菌との結合に重要である
図5 BCF-1の大腸菌との結合に重要なN型糖鎖構造
図6BCF-1発現制御因子の逆遺伝学的スクリーニング
図1GR7
図7BCF-1が腸内細菌叢を形成している様子
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