マウス乳腺組織とヒト乳汁に存在する乳汁分泌関連マクロファージ

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発行：2023年6月19日
マウス乳腺組織とヒト乳汁に存在する乳汁分泌関連マクロファージ

https://www.nature.com/articles/s41590-023-01530-0

ディレイ・カンセバー
エカテリーナ・ペトロワ
...
メラニー・グレター
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Nature Immunology (2023)この記事を引用する
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メトリクス詳細
要旨
マクロファージは、免疫防御、器官形成、組織のホメオスタシスに関与している。マクロファージは、発生、妊娠、泌乳後の退行期における乳腺のリモデリングの様々な局面に寄与している。泌乳期における乳腺マクロファージの動態については、あまり知られていない。ここでは、マウスの授乳期に存在するマクロファージ集団について説明する。多項目フローサイトメトリーおよびシングルセルRNAシークエンシングにより、授乳期に誘導されるCD11c+CX3CR1+Dectin-1+マクロファージ集団（liMac）を同定し、妊娠前に存在する2つの常在F4/80hiおよびF4/80loマクロファージサブセットとは異なることが判明した。LiMacは主に単球由来で、哺育と同時にin situで増殖して拡大した。LiMacはIL-34とは無関係に発達したが、CSF-1シグナルを必要とし、一部は微生物相に依存していた。局所的には肺胞の基底細胞に隣接して存在し、乳汁中に滲出した。また、ヒトの乳汁中にliMacsに類似したマクロファージサブセットをいくつか発見した。これらの知見を総合すると、授乳期には乳腺と乳汁中にユニークなマクロファージが出現することが明らかになった。
主な内容
異なる組織のマクロファージは、起源も表現型も異質であり、環境シグナルに支配された臓器特異的な機能を担っている1。多くの組織常在マクロファージ（TRM）集団は胚前駆体に由来し、局所的に自己再生する一方、単球から継続的に補充されるものもある1,2。マウスの乳腺の場合、マクロファージは思春期の乳管形成、発情期の上皮細胞リモデリング、妊娠中の肺胞拡大、泌乳後の退縮をサポートする3,4,5,6,7。乳腺のマクロファージも哺乳に寄与するかどうかは十分に解明されていません。
出生時、乳児の免疫系は未熟であると考えられ、新生児の保護と免疫調節のために母親の受動免疫の伝達に一部依存している8。歴史的に、母乳は主に免疫グロブリンを含むことで発達中の乳児に免疫を伝達すると考えられてきました9。しかし、ヒトの母乳には母親の白血球10,11,12,13も含まれており、感染症の際にはその数が増加します14,15。
母乳中の母体リンパ球に関する知見は広がりつつあるが、母体骨髄系細胞の起源、性質、輸送、および哺乳中の子への移動の意義については、理解が不十分である。ここでは、マウスの乳腺マクロファージの解析とプロファイリングを行い、授乳期に発生する特定のマクロファージ集団を特定した。その起源、位置、サイトカイン依存性を明らかにし、ヒト母乳に存在すると考えられるマクロファージ集団を同定した。
結果
LiMacは授乳期にマウス乳腺に蓄積する
まず、授乳期における乳腺の組織リモデリングが骨髄コンパートメントにどのような影響を与えるかを調べた。フローサイトメトリーを用いて、C57BL/6（野生型）マウスの授乳期乳腺から採取した骨髄細胞を、処女・妊娠中の野生型コントロールの非授乳期乳腺と比較し、その特徴を調べた。樹状細胞（DC）、Ly6ChiおよびLy6Clo単球、好中球、好酸球を両群のマウスで検出したが、これらは授乳期にわずかに数が増加した（図1aおよびExtended Data図1a-c）。非泌乳乳腺で既に報告されている2つの主要な常在マクロファージ集団（F4/80hiおよびF4/80lo）は、処女および泌乳マウスの両方で検出され、それらの細胞数は泌乳期間中（産後1、4、6、8、12、15および21日目（pp））比較的一貫していた（図1a-c）。さらに、CD11c+F4/80+CD64+MHCII+CX3CR1+マクロファージの集団が泌乳期に存在し、CD11b、Lyve1、CD169、CD206、CD38は陰性であった（図1a-cおよび拡張データ図1a、c）。これらの「授乳期誘導マクロファージ」（liMacs）は、先行研究4,17では管状マクロファージと呼ばれていたが、1日目から12日目の間に約10倍に著しく増加し、4日目以降には全ミエロイド細胞の大部分を構成した（図1b、c、Extended Data 図1c). LiMacの数は泌乳後（21日目pp）に再び減少し、処女マウスの乳腺にはほとんど存在せず、妊娠後期（E18.5）にはまれであった（図1a-cと拡張データ図1a-d）。
図1：授乳期のマウス乳腺にはCD11chiマクロファージが存在する。
a,b、処女または授乳期（10日目pp）（a）または処女（-20日目pp）、授乳期（1-15日目pp）または授乳期後（21日目pp）（b）野生型マウスの乳腺における骨髄区画（CD45+CD11b+細胞および/またはCD11c+細胞にプレゲート）のUMAPプロットと対応ヒートマップ（a）およびフローサイトメトリによる代表プロットと頻度と全細胞数（b）の分析。ヒートマップはマーカー発現量の平均値を示す。データは変換され、パーセンタイル正規化された、グループあたりn = 3（a）。データ（タイムポイントごとにn = 5-6）は、6つの独立した実験からプールされた（b）。クラスカル・ワリス検定はダンの多重比較検定で補正した、*P < 0.05; **P < 0.01; ****P < 0.0001. Mac、マクロファージ、Mo、単球。 c、野生型マウスの非泌乳乳腺と比較した泌乳前期（1〜6日目pp）、泌乳後期（8〜15日目pp）、泌乳後（21日目pp）の授乳乳腺における（aのように）異なるミエロイド細胞集団の総細胞数の変化率のヒートマップを表示した。d, Cx3cr1GFP/+マウスの処女乳腺と泌乳（8pp日目）乳腺の免疫組織化学的解析。SMA（青）、Cx3cr1-GFP（緑）、CD11c（マゼンタ）。挿入図は、SMA、CD11cまたはCx3cr1-GFPを示す輪郭領域の拡大図である。画像はn = 2マウスの代表的なものである。スケールバー：75μm。
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LiMacsの空間分布を評価するために、Cx3cr1GFP/+レポーターマウスの組織切片をCD11c抗体で免疫組織化学的に染色し、Cx3cr1-GFPhiCD11chi liMacsを識別することができた。処女乳腺にはまばらな管網があり、妊娠中に拡張して密に詰まった肺胞を生成し、泌乳期に乳汁を生産する18。乳管と肺胞は、SMA+（平滑筋アクチン）基底細胞の外層と管腔細胞の内層からなる。Cx3cr1GFP/+処女乳腺では、Cx3cr1-GFPhiCD11chi liMacは稀であったが、近傍の管には時折細胞が検出された（図1d）。一方、Cx3Cr1-GFPhiCD11chi細胞は泌乳乳腺に多く存在し、ほとんどが肺胞の内部または隣接し、基底細胞層の内面を包んで存在していた（図1d）。これは、以前の観察結果と一致する4,17,19。Cx3cr1-GFPhiCD11chi liMacsはMHCIIhiでもあり（拡張データ図2a）、フローサイトメトリーデータ（図1a）と一致した。MHCIIhiCx3cr1-GFPdim/-CD11c+/-細胞は、F4/80hiおよびF4/80loマクロファージとLyve1+Cx3cr1-GFPdim/-CD11cdim F4/80hi マクロファージと思われるが、肺胞外に限局した（Extended Data Fig.2a-b）cDC もCD11chiMHCIIhiでCX3CR1（文献20）を発現するかもしれません。Cx3cr1-GFPhiCD11chi/MHCIIhi細胞がcDCであることを除外するために、泌乳中のCx3cr1GFP/+乳腺を共通のマクロファージマーカーIba1およびCD64で染色した。Cx3cr1-GFPhi細胞は、満場一致でIba1+とCD64+であった（Extended Data Fig.2c-d）。このように、liMacsは泌乳乳腺の1日目ppから検出され、12日目ppまで泌乳中に増加し、乳腺組織内の乳汁分泌部位に局在していることが明らかになった。
マウスliMacsは異なるトランスクリプトームシグネチャーを示す
マウスLiMacsの特徴をさらに明らかにするために、野生型の処女乳腺と泌乳乳腺から7日目のppで選別したCD11b+および/またはCD11c+ミエロイド細胞のシングルセルRNA-seqを実施した。その結果、授乳期乳腺では9つ、処女乳腺では8つの異なるミエロイド細胞集団を同定した（図2aおよび拡張データ図3a）。授乳期乳腺で最も多い集団であるliMac (Itgax+Cx3cr1+) 集団に加え、cDC1s (Xcr1, Clec9a) を検出した、 cDC2s (Cd209a), pDC (Ccr7), Ly6Chi (Lys2, Ly6c2, Ms4a4c) and Ly6Clo (Itgal, Nr4a1) monocytes, neutrophil (S100A8, S100A9, Clec4d), F4/80hi and F4/80lo macrophage (Figure. 2aおよびExtended Data Fig.3a）。F4/80hiマクロファージは、Mrc1+Cd163+Lyve1+Folr2+Mgl2+Pf4+に分類され、血管に関連するTRMで発現することが報告されている遺伝子（Extended Data Fig.3b）4,16,21,22,23. F4/80loマクロファージはCcr2+Ccl9+Fcrls+Lyz1+として同定された（拡張データ図3a）。LiMacはCD11c+とMHCIIhiであり、cDCと同様であった。しかし、cDC1sやcDC2sとは対照的に、Flt3やZbtb46といったDC系を規定する遺伝子は発現せず、C1qa、C1qb、Csf1r、Aif1、Fcgr1といったマクロファージのコア遺伝子を高発現した（Extended Data Fig.3c）。
図2：マウスliMacsはユニークな転写シグネチャーを示す。
a,b, UMAPによるSeuratガイド付きクラスタリングと次元削減により、8つと9つの異なる骨髄細胞集団（a）と、野生型マウスの処女乳腺（n = 1）と授乳期（7日目pp、n = 2）から選別したCD11b+とCD11c+骨髄細胞で発現する遺伝子（b）のSCRNA-SQにおけるF4/80loマクロファージ、F4/80hiマクロファージおよびliMacsにおけるベン図。c, 他の免疫集団と比較してliMacで有意に高い発現を示す上位100個のliMacシグネチャー遺伝子を、F4/80hiおよびF4/80loマクロファージ（aと同様）に対してプロットしたドット図である。d,e, UMAPによるSeuratガイド付きクラスタリングと次元削減により、選別された（CD45+Ly6G-Siglec-F-NK1.1）CD11b+および/またはF4/80loマクロファージに対して行ったscRNA seqにおけるliMacおよび増殖liMacs（liMacprolif）を示す。 1-）CD11b+および／またはCD11c+細胞（d）と、野生型マウスの8日目（n = 3）、11日目（n = 3）、14日目pp（n = 3）の授乳期乳腺におけるliMacおよびliMacprolif（e）に関連する遺伝子を示したヒートマップ。
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授乳期乳腺では、liMacs、F4/80hi、F4/80loマクロファージ間で、それぞれ131、155、103遺伝子が有意に異なる発現を示した（図2b）。liMacsで高発現した遺伝子には、TGF-βシグナル伝達経路に関連する遺伝子（Tgfbr1、Itgb5、Skil、Ntpcr、Lair1）が含まれていた（図2cおよび拡張データ図3a）。liMacsで発現する上位100遺伝子のうち、Tmem119やHexbなど、ミクログリアシグネチャー遺伝子24,25として記載されている遺伝子を確認した（図2c）。乳腺の腫瘍関連TREM2+マクロファージでは、Cadm1やOlfml3の高発現が報告されている22。liMacはCadm1とOlfm3を発現していたが（拡張データ図3d）、これらのマクロファージが記述する他のシグネチャー遺伝子を特異的に濃縮することはなかった。Cxcl16、Glycam1、Itgav、Vcam1などのケモカインや細胞接着分子をコードする遺伝子も、F4/80hiやF4/80loマクロファージと比較してliMacsで高発現していた（図2c）。また、Gene Ontology解析により、細胞移動の制御に関連する遺伝子の発現が豊富であることが確認された（Extended Data Fig.3e）。
また、liMacsで高発現していた遺伝子は、Clec7a（Dectin-1をコードする）であった（Fig. 2c）。Cx3cr1GFP/+マウスの授乳期乳腺の免疫蛍光染色では、ほとんどのGFP+細胞がDectin-1+であった（拡張データ図3f）ことから、Dectin-1はliMacsのマーカーとして有用であることが示唆された。また、リポ多糖（LPS）に対する細胞応答、炎症反応、食作用など、F4/80hiやF4/80loマクロファージと比較してliMacsで発現が増加する経路に従って、liMacsはIl1b（図2c）を発現した（Extended Data 図3e.） 一方、F4/80hiマクロファージは、エンドサイトーシス経路との関連が強かった。LiMacは、組織リモデリングの制御に関与するマトリックスメタロプロテアーゼMmp12とMmp13の発現量が高く（図2c）、Csn2（ベータカゼイン）、Csn3（カッパカゼイン）、Wap（乳清酸性タンパク質）といった牛乳の主要タンパク質成分をコードする転写物も発現した（図2cおよびExtended Data 図3a）。
また、活発に増殖しているliMacの小さなサブセットも確認された（Extended Data Fig.4a）。liMacsの発現プロファイルが経時的に変化するかどうかをさらに評価するため、8、11、14日目の泌乳野生型マウスに由来するソートliMacsのscRNA-seqを実施した。7日目のliMacs（拡張データ図4a）と同様に、Mki67やTop2aなどの遺伝子を発現する循環型liMacsの小さなクラスターが、これら3つのタイムポイントで検出された（図2d-e）17。liMacsと増殖liMacsの頻度は時間の経過とともに変化せず、さらなる時間的不均一性（図2d）や3つのタイムポイントを比較した多くの異なる発現遺伝子も検出されなかった（Extended Data図4b）。これらのデータから、健康な乳腺では、泌乳期間中にliMac集団が可塑性を示すことはないことがわかった。
LiMacは単球に由来し、授乳期に拡大する。
LiMacは妊娠後期から授乳期にかけて特異的に発生するようなので、単球由来であるかどうかを検証した。単球と顆粒球の運命マッピングが可能なMs4a3CreR26Ai14マウスでは、10日目の乳汁分泌乳腺で古典的単球がtdTomatoで効率よく標識された（図3a）。F4/80hiおよびF4/80loマクロファージは胚由来であるが、思春期以降は骨髄（BM）由来の単球にゆっくりと置換される4,16。10日目のppでは、授乳中の乳腺のF4/80loおよびF4/80hiマクロファージの約35%および50%が、liMac集団の75%とともにそれぞれtdTomatoで標識されており（図3a）、liMacの大部分が単球から生じることが示唆された。Dectin-1+細胞のほとんどがtdTomato+であることも、免疫蛍光法を用いて示された（図3b）。
図3：マウスliMacは主に単球に由来し、泌乳期に拡大する。
a, 代表的なフローサイトメトリーヒストグラムとグラフ（±s.d. は、泌乳中（10日目pp）のMs4a3CreR26Ai14マウスからの乳腺におけるF4/80loマクロファージ（F4/80lo Mac）、F4/80hiマクロファージ（F4/80hi Mac）、liMacs（CD45+SiglecF-Ly6C-Ly6G-の前駆）およびLy6Chi単球（Mo）（CD45+SiglecF-Ly6G-の前駆）でのtdTomatoラベル付けのパーセントを示した。3つの独立した実験からのプールされたデータ、n＝9。 b、Ms4a3CreR26Ai14マウスからの授乳中の乳腺の免疫組織化学（10pp日目）。DAPI（青）、SMA（緑）、Dectin-1（マゼンタ）、tdTomato（赤）。右のパネルは、左の概要画像で輪郭を描いた領域のDAPIとDectin-1およびtdTomatoの単一染色をそれぞれ示す。c, 1日目と3日目にタモキシフェンで処理した泌乳中（8-15日目pp）のCcr2CreERR26Ai14マウスの乳腺において、aと同様にF4/80lo Macs, F4/80hi Macs, liMacs, Ly6Chi MoにおけるtdTomatoラベルの割合を示す代表フローサイトメトリヒストグラムとグラフ（±s.d.）. 3回の実験のプールデータ、n＝6（8日ppからn＝4、15日ppからn＝2）。 d、1日目と3日ppにタモキシフェンを投与したCcr2CreERR26Ai14のダムの授乳中の乳腺（15日pp）の代表免疫蛍光画像。DAPI（青）、SMA（緑）、Iba1（黄）、tdTomato（赤）。中央のパネル（1）および右下のパネル（2）は、それぞれ左の概要画像（1）または上の画像（2）の輪郭領域のDAPIおよびIba1およびtdTomatoの単一染色を示す。e, 代表的なフローサイトメトリープロットとバイオリンプロットは、授乳期（13-15日目pp）のCcr2-/-および野生型ダムの乳腺における単球、F480hi Mac、F4/80lo MacおよびliMacの頻度と総細胞数をaのように示した。5回の独立した実験からのプールデータ；n = 8（WT）および7（Ccr2-/-）。両側マン・ホイットニー検定を実施、**P < 0.01; ***P < 0.001; NS, not significant. f, 授乳中の（7日目pp）野生型マウスからの乳腺におけるEdU+ F4/80lo マクロファージ、 F4/80hi マクロファージおよび liMacsの割合を示す代表フローサイトメトリプロットとグラフ（±s.e.m）、 EdU注入20時間後。3回の独立した実験から得られたデータをプールしたもので、n = 4. Kruskal-WallisテストとDunnʼs多重比較テストに続く。*P < 0.05.
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授乳期1週目のリマック数の急激な増加が、増殖によるものか、単球からの追加分化によるものかを理解するために、タモキシフェン投与により単球とその子孫を含むCCR2+細胞の標識化が起こるCcr2CreERR26Ai14マウスを用いた27、28．Ccr2CreERR26Ai14マウスを1日目と3日目にタモキシフェンで処理し、8日目と15日目の間に授乳中の乳腺を分析した。これらの時点で、tdTomato+であったのはliMacsおよびF4/80hiマクロファージの10%のみであったが、ほぼすべての単球がtdTomatoで標識されていた（図3c）。さらに、F4/80loマクロファージの85％がtdTomato+であった（図3c）。これは、Ccr2の発現によりタモキシフェン投与時に直接標識された結果と考えられる（拡張データ図3a）。免疫蛍光法を用いると、肺胞に並ぶIba1+細胞は、Ccr2CreERR26Ai14マウスのtdTomatoに対してほとんど陰性であった（図3d）。これらのデータから、泌乳期におけるliMacの拡大は、循環単球とは無関係であることが示唆された。これを確認するため、BMからの単球の排出が阻害されるCcr2-/-ダムを使用した29。予想通り、泌乳中のCcr2-/-乳腺では、13-15日目のppでLy6Chi単球が野生型乳腺と比較して激減した（図3e）。また、F4/80loマクロファージの数は、Ccr2-/-乳腺では著しく減少しており、CCR2依存性を示していた。一方、これらのマウスでは、liMacsとF4/80hiマクロファージの数は正常であり（図3e）、単球とは独立して蓄積することが示された。
さらに、liMacsが局所増殖によって拡大したことを検証するために、7日目のppでEdU（5-ethynyl-2′-deoxyuridine）を投与してliMacsの増殖率を分析した。EdU投与20時間後、liMacsの約10％、F4/80hiまたはF4/80loマクロファージの約2％だけがEdU+となった（図3f）。これと一致して、Cx3cr1GFP/+マウスの授乳中の乳腺の免疫組織化学では、Cx3cr1-GFP+細胞の13%がKi67+であることが示された（Extended Data Fig.4c）。これらのデータは、単球由来のliMacsが泌乳期間中にその場で拡大することを示した。
CSF-1と腸内細菌叢はliMacの発生を調節する
チロシンキナーゼ細胞表面受容体CSF-1Rは、ほとんどのマクロファージ集団の発生と維持に重要である30,31。CSF-1RシグナルがLiMacのホメオスタシスも制御しているかどうかを調べるために、CD11c+細胞でCsf1rを特異的に欠損させたCd11cCreCsf1rfl/flマウスを作成した。Cd11creCsf1rfl/flマウスでは、Csf1rfl/flマウスと比較して、授乳中の乳腺にLiMacがほとんど見られなかった（図4a）ことから、LiMacの発生にCSF-1Rが関与していることが示された。F4/80hiおよびF4/80loマクロファージは、Cd11cCreCsf1rfl/flマウスでは影響を受けず（図4a）、CD11cの低発現と一致した。Ly6Chi単球、好中球、好酸球の数は、Csf1rfl/flマウスとCd11cCreCsf1rfl/flマウスの授乳中の乳腺で同等であった（Extended Data Fig. 4d）。
図4：CSF-1と微生物叢は、授乳期乳腺におけるマウスliMacsの発達を制御する。
a、コントロール（WTまたはCsf1rfl/fl）およびCd11cCreCsf1rfl/flのダムの授乳期乳腺（8-14日pp）におけるF4/80hiマクロファージ（Mac）、F4/80blo MacおよびliMacの頻度と総細胞数を示す代表フローサイトメトリプロットとバイオリンプロット。4つの独立した実験で分析した5～6匹のマウスのデータをプールした。両側マン・ホイットニー検定を実施した。**b, Il34LacZ/LacZおよびコントロール（Il34+/+またはIl34LacZ/+）ダムの授乳中の乳腺（9日目pp）におけるF4/80hi Macs, F4/80lo MacsおよびliMacsの頻度と総細胞数（総細胞106あたり）を示す代表フローサイトメトリプロットおよびバイオリンプロットである。4つの独立した実験で分析した5匹のマウスのプールデータ。両側マン・ホイットニー検定を行った。 c、CSF-1抗体（Ab）（2〜3回）で処理したダムまたはコントロールダム（アイソタイプ抗体で処理または未処理のまま）からの授乳中の乳腺（7〜14日pp）におけるF4/80hi Macs、F4/80lo MacsおよびliMacsの頻度と総細胞数を示す代表フローサイトメトリプロットとバイオリンプロットである。5つの独立した実験で分析した11匹のマウスのデータをプールした。両側マン・ホイットニー検定を実施した。*d、従来型（CV）、クアトロ（Cu）、無菌（GF）ダムの授乳期乳腺（7日目pp）におけるF4/80hi Macs、F4/80lo Macs、liMacsの頻度と総細胞数を示す代表フローサイトメトリプロットとバイオリンプロットである。3つの独立した実験から得られたプールのデータを示す；n = 4-7. Kruskal-Wallisテストに続くDunnの多重比較テスト。**P < 0.01.
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次に、2つの既知のCSF-1RリガンドであるサイトカインCSF-1とインターロイキン-34（IL-34）32のliMac発生における役割について調査した。IL34欠損マウス（Il34LacZ/LacZ）33の授乳中の乳腺では、7日ppでIL34+/+またはIl34LacZ/+マウスと比較して、リマック、F4/80hiおよびF4/80loマクロファージの数は同等であり（図4b）、その生成にIL-34は必要ないことが示された。Csf1-/-マウスが発達障害を持ち、若くして死亡することを考慮し30、野生型ダムをCSF-1中和抗体で処理した。その結果、授乳中の乳腺ではliMacsが消失し、F4/80hiおよびF4/80loマクロファージはそれぞれ約25%および50%減少した（図4c）が、Ly6Chi単球など他の細胞には影響がなかった（Extended Data図4e.） したがって、liMacsはIL-34とは無関係に生成されたが、その発生および／または維持には、CSF-1を介したCSF-1Rシグナルが必要であった。
母親の微生物叢は、免疫系の成熟に重要な新生児の微生物コロニー化を促進し34、また脳や腸のマクロファージの発達と機能に影響を与える35,36,37。授乳期の乳腺マクロファージへの影響を調べるため、無菌マウス、4種類の既知の細菌（Escherichia coli MG1655、Bacteroides thetaiotaomicron ATCC29148、Lactobacillus reuteri I49、Lachnoclostridium sp. YL32、「Cuatro」マウスと呼ぶ）でコロニゼーションしたマウス、従来飼育の野生型マウスの比較を行いました。LiMacは、野生型マウスやCuatroマウスと比較して、無菌マウスの授乳中の乳腺に著しく少なく、F4/80hiおよびF4/80loマクロファージはほとんど影響を受けなかった（図4d）。これらのデータから、LiMacsの生成にはCSF-1が必要であり、その一部はマイクロバイオームの影響を受けていることが示された。
LiMacsは乳汁中に検出され、免疫機能を発揮する。
肺胞の内腔にIba1+細胞が時折検出されることから（図5a）、liMacsが乳汁中に滲出するかどうかを検討した。授乳中の野生型マウスから乳汁を採取し（7-11日目、12-15日目）、フローサイトメトリーで解析した。好中球（Ly6G+）、好酸球（Siglec-F+）、Ly6Chi単球、CD64+細胞など、CD45+免疫細胞は乳汁中の総細胞数の1%未満であった（図5b、c）。CD64+細胞の中に、CD11b-F4/80+MHCII+CX3CR1+Dectin-1+マクロファージの集団が検出され（図5b）、これはliMacの表現型と相関し、授乳期12-15pp日目にわずかに頻度が増加した（図5c）。なお、F4/80hiおよびF4/80loに相当する乳腺マクロファージは、乳汁中に検出されなかった（図5b）。
図5：LiMacはマウス乳汁中に存在し、乳房炎における好中球のリクルートに寄与している。
a, 授乳中の乳腺の代表的な免疫蛍光画像（15日目pp）。DAPI（青）、SMA（緑）、Iba1（黄）。矢印は、肺胞内のIba1+細胞を示す。b,c, 代表的なフローサイトメトリープロットとゲーティング戦略（b）、および野生型マウスの泌乳乳腺（7-11日目および12-15日目）におけるCD45+細胞内の好酸球、好中球、Ly6Chi単球、limacの頻度（c）を示すバイオリンプロット；n = 3 for days 7-11 pp, n = 6 for days 12-15 pp, data pooled from 2 independent experiments. d、E18.5および1日おきにCSF-1抗体またはアイソタイプコントロールで処理したWTのダムによって看護されたWTの仔の生存曲線および体重；n＝15、3つの独立した実験からのプールされたデータである。e、CD11creCreCsf1rfl/flまたはCsf1rfl/flマウスによって保育された仔（Cd11creCsf1rfl/+またはCsf1rfl/+）の生存曲線および体重；n＝30、4つの実験からのプールデータ。 f、未挑戦（対照）WTマウスまたは乳腺にLPSが注射されたWTマウス（LPS挑戦後18時間）の乳腺切片のH&E染色。スケールバー、100μm；n＝2〜3匹／群。 g、好酸球、F4／80hiマクロファージ（Mac）、F4／80loマクロファージ、liMacs、Ly6Chi単球（Mo）、Ly6Clo単球、好中球およびCD11bintMHCII＋細胞（CD45＋CD3-CD19-NK1にpregated）の頻度を示すUMAPプロットとバーグラフ。 1-およびCD11b+および／またはCD11c+および／またはF4/80+細胞）を、18時間前に第4乳腺にLPSを注射した、または未処置（コントロール）のままにしておいたWTマウスの授乳中の乳腺（11-14日目pp）において測定した。対応するヒートマップは、マーカー発現量の中央値を示す。データは変換し、分位正規化した、グループあたりn＝2〜3。 h、liMacs（上）の全細胞数を示す代表的なフローサイトメトリープロットおよびバイオリンプロット（CD45＋CD19-NK1上でpregated. 1-CD3-SiglecF-Ly6G-）および好中球（下）（CD45＋LiMacs-にpregated）を、未処置または7-11日目にCSF-1抗体で前処理し、18時間前に第4乳腺にLPSを注射するか未注入としたWTマウスにおける授乳乳腺（10-14日pp）において示した。データ（1群あたりn = 5-6）は、2つの独立した実験からプールされた。一元配置分散分析を適用し、*P < 0.05, **P < 0.01, ***P < 0.001, ****P < 0.0001.
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liMacが乳汁分泌のための乳腺のリモデリングに関与しているかどうかを調べるために、CSF-1抗体（腹腔内投与、2日ごと）で処理した野生型母親由来の新生児の生存をモニターした。CSF-1抗体による処理は、仔馬の生存や成長に影響を与えなかった（図5d）。同様に、Cd11cCreCsf1rfl/flのダムの仔も、規則正しい体重増加と一般的な健康状態を示し（図5e）、授乳中の乳腺における肺胞のサイズと数は、Cd11cCreCsf1rfl/flとCsf1rfl/flダムで同等だった（エクステンドデータ図5a）。これらの観察から、liMacsは乳汁分泌のための組織変換において重要な役割を担っていないことが示唆された。
liMacsが乳タンパク質をコードする遺伝子（例えば、Csn3）を発現していることを踏まえ、乳の組成を直接または間接的に調節しているかどうかを検討した。Cd11cCreCsf1rfl/flマウスまたはCsf1rfl/flマウスの7日目の乳のプロテオミクス解析では、βカゼイン（CASB）、カッパカゼイン（CASK）、ラクトアルブミン（LALBA）、ラクトトランスフェリン（TRFL）などの最も豊富に発現する50種類のタンパク質には、両群間で大きな変化はなかった（拡張データ図5B）。免疫グロブリンの濃度も、Cd11cCreCsf1rfl/flマウスまたはCsf1rfl/flマウス由来の乳の間で有意な変化はなかった（Extended Data Fig.5c）。また、CSF-1抗体処理マウスとアイソタイプコントロールマウスまたは無処理マウスの授乳中の乳腺には、同数のIgA産生プラズマ細胞が存在していた（Extended Data Fig.） したがって、liMacsは、免疫グロブリンを含む乳タンパク質の含有量に顕著な影響を与えなかった。
scRNA-seqデータのパスウェイ解析から、liMacsは貪食、炎症反応、LPSへの反応に関連する遺伝子を高発現しており、殺微生物機能を示唆することが示された。授乳中の乳腺から分離した細胞を、ザイモサン（TLR2のリガンド）およびLPS（TLR4）を含む異なるTLRリガンドに曝露することにより、in vitroでToll様受容体（TLR）刺激に応答するliMacsの能力を調べた。LiMacは、F4/80hiおよびF4/80loマクロファージと比較して、すべての条件でpro-IL1βの発現量が最も高かった。ザイモサンおよびLPSで処理したLiMacは、未処理のLiMacと比較して腫瘍壊死因子（TNF）の産生が増加したが、これはF4/80hiマクロファージよりも常に低かった（拡張データ図6a、b）。
liMacsの貪食能力を評価するために、授乳中の乳腺マクロファージを、pH感受性の高いpHrodo Red zymosan、大腸菌またはS. aureusバイオパーティクルにin vitroで曝露した。黄色ブドウ球菌と大腸菌は、乳房炎に頻繁に関連しています。LiMacsによる大腸菌粒子の貪食は、F4/80hiおよびF4/80loマクロファージよりも高かったが、F4/80loマクロファージはザイモサン粒子の内在化の増加を示した（拡張データ図6c）。一方、F4/80loマクロファージは、ザイモサン粒子の取り込みが増加した（Extended Data Fig.6c）。これらのデータは、liMacsが貪食性で、微生物の刺激に反応することを示した。
インビボで炎症を起こした乳腺におけるliMacsの潜在的な役割をさらに調べるために、LPSによって誘発される急性実験的乳腺炎のモデルを使用した。授乳中の乳腺にLPSを注入すると、ヘマトキシリン・エオシン（H&E）染色で示されるように、LPSチャレンジから18時間後に肺胞空間への免疫細胞の浸潤が見られた（図5f）。LPSチャレンジ乳腺のフローサイトメトリーにより、骨髄系細胞の中で、特にLy6G+好中球の頻度と総細胞数が増加していることがわかった（図5g、h）。これは大腸菌による乳腺炎の特徴である38、39。逆に、liMacはCD11bを上昇させ、その頻度と数は著しく減少した（図5g-h）。これは、炎症時のTRMで頻繁に報告されている現象である40。他の単核食細胞（CD11b+および/またはMHCII+）もLPSチャレンジにより減少した（Extended Data Fig.6d）。LPS注射前にCSF-1抗体を投与してliMacsを枯渇させると、無処置のLPS注射マウスと比較して好中球の浸潤が著しく減少した（図5h）ことから、以前提案したように、初期炎症反応におけるliMacsの役割を示唆している41。総じて、liMacは乳汁分泌のための組織リモデリングには不要であるが、乳汁中に輸送され、微生物刺激に応答する能力を備え、細菌チャレンジ時の自然免疫細胞のリクルートに関与していることが示唆された。
ヒト乳汁にはリマク様マクロファージが含まれる
ヒト乳汁中の単核食細胞はフローサイトメトリーで、ヒト母乳中のマクロファージなどの細胞はscRNA-seqでプロファイリングされている12,13。我々は、これらの細胞がマウスliMacsのカウンターパートであるかどうかを調べ、出産後4～63日以内に採取した健康なドナーのサンプルを用いて、ヒトミルクの細胞性免疫コンパートメントを表現型的および転写的に評価した。マウスミルクと同様に、ヒトミルク中の母親の白血球は、主に乳腺細胞からなるミルク細胞全体の1％から10％を占めていた。リンパ球はCD45+免疫細胞の60%までを占めた（図6a,b）。残りの細胞は骨髄系細胞で、CD11b+CD66b+CD16+好中球、CD11b+Siglec8+好酸球、CD11b+CD11c+CD64+HLA-DR+CD163+CD14+CD16+マクロファージからなる（図6aおよび拡張データ図7a）。
図6：ヒト乳汁には、いくつかのサブセットのマクロファージが含まれている。
a,b、ヒト乳汁中の免疫細胞（4〜63日目のppに採取し、CD45+細胞で予行演習）を示すUMAPおよび平均マーカー発現の対応ヒートマップ（a）、およびフローサイトメトリーで解析したヒト乳汁中のCD45+細胞中の免疫細胞集団のパーセント（b）（n＝13）を示すグラフ。代表的なUMAPは、4つの独立した実験のうちの1つ、n = 4から示されている。両側無対称のStudent's t testを実施した。***c, ヒト乳汁サンプル（n = 6）から選別された免疫細胞（CD45+）のscRNA-seq解析において、B細胞、T細胞、マクロファージ（Mac 1-3）、単球（Mo）、DC2/DC3の3集団および「休憩」と呼ばれる未同定のクラスタなど7つの免疫細胞集団を示すUMAPによるSeuratガイドクラスタイジングおよび次元削減。d、cと同様に3つのヒトマクロファージサブセット、単球、DC2/DC3における選択された遺伝子の発現を示すドットプロット。ドットのサイズは、各遺伝子を発現するクラスター内の細胞の割合を示し、ドットの色は発現レベルを示す。 e、cと同様にヒト乳汁マクロファージ（Mac 1、Mac 2、Mac 3）およびT細胞によるliMac署名遺伝子（図2cの通り）についての発現を示すヒートマップ。f, マウス乳腺マクロファージの予測類似度スコアをcのヒト乳腺マクロファージサブセットに適用したもの。 g, 注釈付きクラスター42（左）とMac 1, Mac 2, Mac 3, 単球（Mo）およびDC2/DC3（cと同じ）をMoMac-Verse（右）に投影したUMAPです。i、cのヒトマクロファージクラスターMac 1、Mac 2、Mac 3における選択された「TREM2シグネチャー」遺伝子22、42、45の発現を示すドットプロット。ドットサイズは、各遺伝子を発現するクラスター内の細胞の割合を示し、ドット色は発現レベル（凡例に示すとおり）を示す。
フルサイズ画像
ヒト乳汁中の白血球のscRNA-seqでは、すべてのサンプルでT細胞（CD3d、CD3e、CD247、TRAC）、B細胞（CD19、CD79b、BANK1）、DC2/DC3（CD1C、CD1E、CLEC10A）、単球（FCN1、VCAN、S100A8、S100A9）、マクロファージ（MARCO、CD68、CD163、SIGLEC1、AIF1）であった（図. 6c,dおよびExtended Data Fig.7b）。マクロファージでは、3つのクラスターが検出された。クラスター1（Mac 1）はAPOE、SPI1、CD9の発現が豊富であったが、クラスター2（Mac 2）とクラスター3（Mac 3）はそれぞれITGAX、CLEC7A、CD163を高濃度に発現した（図6d）。Mac 3とMac 1は、健康なヒト乳腺と乳がんで報告されているFOLR2+マクロファージと部分的に関連しているかもしれない（Extended Data Fig.7c）22。LiMacのトランスクリプトームをヒト乳腺マクロファージと比較すると、HEXB、CXCL16、CLEC7A、LPCAT2、MS4A7などのLiMacシグネチャー遺伝子の多くが、ヒトマクロファージの3つのサブセットのいずれか、あるいはすべてで発現しており（図6e）、種を超えて乳汁分泌に関連するマクロファージのプロファイルが一部保存されていると考えられた。マウス乳腺マクロファージと3つのヒト乳腺マクロファージサブセットとの間の類似性スコア分析により、liMacsとマウスF4/80loマクロファージは主にヒト乳腺マクロファージのMac 2サブセットに類似し、マウスF4/80hiマクロファージはMac 1とMac 2両方に一致することがわかった（図6f）。これは、3つのマウス乳腺と3つのヒト乳腺マクロファージの主成分（PC）分析（PCA）によって確認された（Extended Data図7d）。
次に、健康な状態と病的な状態の13のヒト組織にわたるヒトscRNA-seq大要に、ヒトミルクマクロファージをマッピングした42。この解析により、ほとんどのヒトミルクマクロファージは、ヒトscRNA-seq大要42の「TREM2_Mac」（No.3）と呼ばれるマクロファージクラスターに相関することが示された（図6g、h）これは、TREM2、APOE、APOC1、SPP1、CD9、LIPA、CD63、LGALS3（図6i）の発現で特徴付けられ、乳がん22、42など異なる腫瘍からのマクロファージに特に豊富に含まれていた。免疫抑制特性を持つTREM2+マクロファージは、前臨床腫瘍モデルでも報告されている43,44。同様のTREM2シグネチャーは、脂質代謝と食作用に関連している45-この特徴は、「脂質代謝過程」と「食作用、巻き込み」に富んでいた経路を持つヒト乳マクロファージにも相関しているかもしれない（拡張データ図7e）。ヒト乳Mac 3集団は、ヒトscRNA-seq大要42の「マクロファージ集団」（No.11）に一部対応しており、免疫制御特性を有すると報告されているメタロチオネイン遺伝子が発現していた46。これらのデータから、ヒト乳汁中のマクロファージは、表現型とトランスクリプトームにおいてマウスliMacに部分的に似ており、脂質やがん関連マクロファージを思わせるプロファイルを示すことが示された。
考察
我々は、マウス乳腺のマクロファージコンパートメントを解析し、妊娠前の乳腺に常在するF4/80hiおよびF4/80loマクロファージ集団に加えて、CD11b-CD11chiCX3CR1hiDectin-1+MHCII+ liMacsの集団が泌乳乳腺に出現し蓄積することを発見した4、16および17。LiMacは泌乳期の乳腺マクロファージのほとんどを占め、CSF-1シグナルに依存し、乳管上皮の近くに局在していた。
乳腺のF4/80hiマクロファージは、血管に関連するマクロファージの集団に似ていたが21,22、F4/80lo集団は、表現型、プロファイル、局在、系統の点でより曖昧で、異種混合である可能性があった。妊娠中の単球が、乳腺で産後早期に観察されるF4/80hiマクロファージの増加プールに寄与しているかどうかは、まだ明らかにされていない。LiMacは主にBM由来の単球に由来し、CCR2とは無関係に、授乳期にその場で急速に拡大した。泌乳期間中の数的な増加とは別に、組織内のリマックと乳汁で満たされた肺胞の内腔を含むリマック集団は、転写や表現型の面で時間的なダイナミクスを示さず、ほぼ均質な集団を表していた。
我々は、マウスとヒトの両方の乳汁中にマクロファージを発見し、乳汁中への移動は、通常移動しない典型的な組織常在マクロファージの行動とは対照的であることを明らかにした。乳汁中のマクロファージの役割と乳児への移行については、まだ調査が必要である。ヒトの乳汁マクロファージの3つのサブセットは、liMacsだけでなく、マウス乳腺のF4/80hiおよびF4/80loマクロファージにも類似していた。ヒトの母乳中の細胞、特に乳腺細胞は、ホルモンの調節や健康・生活習慣の変化により、授乳期には非常にダイナミックに変化します。ヒト母乳マクロファージの3つのサブセットが授乳期を通じてどのように変化するのか、また、感染においてさらなる多様性があるのかについては、まだ解明されていない。母子感染時には、ヒト乳白血球の総数が増加する14,47。乳汁中のマクロファージ数も母子手帳の健康状態と相関している可能性がある。我々は、マウス乳腺のliMacsが微生物曝露に迅速に反応し、LPSチャレンジ時には、大腸菌による乳房炎を解決するのに不可欠な好中球の早期リクルートに関与することを発見した38,39。これらの観察から、liMacは乳腺を侵入してくる病原体や感染から守るための免疫監視に参加している可能性があることが示されました。
乳腺のマクロファージは、妊娠中の乳腺の発達7と退行期の乳腺のリモデリングに関与している4。我々は、liMacが泌乳のための組織変換をサポートするかどうかを調査した。liMacには主要な乳タンパク質をコードする転写産物が検出されたが、liMacが乳タンパク質を発現しているのか、あるいは以前に示唆されたように、死んだ上皮細胞の貪食によるものかどうかは不明であった4,17。しかし、liMac欠損乳腺では、乳汁のタンパク質含量の変化や乳腺の構造変化は見られなかったことから、liMacは泌乳期の組織完全性の調節には関与していないことが提唱された。乳汁または乳腺のマクロファージは、脂質関連マクロファージで以前に同定されたTREM2シグネチャーによって示唆されるように、脂質代謝に関与している可能性がある45。同様のTREM2マクロファージプロファイルは、さらに癌における免疫抑制特性と関連しており22,42,43,44、ミルクにおける同様の役割の可能性を示唆する。
以上のことから、我々は、授乳期に乳腺で発生し、乳汁中に溢出するマウスマクロファージ集団を表現型的および転写的に記述し、さらにヒト乳汁中のマクロファージの異なるサブセットを特定した。これらのデータは、授乳期における母親と乳児の健康や病気におけるマクロファージの機能を調べるための新しい道を開くものである。
研究方法
マウス
C57BL/6JRj (CD45.2) マウスはJanvier Laboratoriesから購入した。Csf1rfl/flマウスはJ. Pollard48の好意により提供された。Ms4a3Creマウスは、F. Ginhoux26の好意により提供された。Ccr2CreER-mKate（Ccr2CreER）マウスは、Taconic Artemis27により作製した。ItgaxCre（参考文献49）、Il34LacZ／LacZ（参考文献33）、Ccr2-／-（参考文献50）、Cx3cr1GFP（参考文献51）およびR26Ai14（参考文献52）はインハウスで繁殖させた。すべての「Cre」及び「CreER」系統をヘテロ接合体として使用した。すべてのマウスは、温度（21〜24℃）および湿度（35〜70％）を制御した状態で、12時間の明暗サイクルを有する特異的病原体のない条件下で、個別に換気したケージで飼育した。
無菌およびCuatro-colonized C57BL/6Jマウスは、スイスのベルン大学のClean Mouse Facilityで飼育され、フレキシブルフィルムのアイソレーターで維持された。衛生状態は、Cuatroマウスの16S rRNA配列決定を含む、培養依存および非依存的な方法によって日常的に監視された。すべてのマウスは病原体を持たないことが確認された。
雌マウスを使用し、通常7～12週齢であった。授乳中の雌マウスの乳腺は、図の説明文に示すように、1日目から21ppの間に分析した；処女コントロール雌は、可能な限り年齢を合わせた。サンプルサイズを事前に決定するための統計的手法は用いなかったが、我々のサンプルサイズは過去の論文で報告されたものと同様である28。データ分布は正規分布と仮定したが、正式には検証していない。無作為化の特別な方法は使用しなかった。分析から除外された動物はいない。チューリッヒ大学でのすべての実験手順は、スイス連邦規則に従って行われ、チューリッヒ州獣医局の承認を得ている。
細胞懸濁液の調製
マウスをCO2吸入により犠牲にして、PBS（Gibco）で心内灌流した。灌流後、左右の腹部乳腺を剥離し、鼠径部リンパ節を摘出した。全てのサンプルをエッペンドルフチューブで小片に切断し、続いて10%FCSを補充したCa2+/Mg2+ HBSS中、0.4 mg ml-1 collagenase type IV (Worthington) および0.04 mg ml-1 DNase Iで37℃、40分間振とうしながら消化した。サンプルを18G針とシリンジでホモジナイズし、100μmのセルストレーナーで濾過して均質な細胞懸濁液を得た。細胞をPBSで1回洗浄し、赤血球溶解バッファー（ddH2O中0.16M NH4Cl, 0.11M KHCO3, 0.001M EDTA）に再懸濁し、氷上で5分間インキュベートし、100μmのセルストレーナーでろ過しPBSで洗浄しました。
フローサイトメトリー
細胞をPBS中の抗マウスCD16/32（クローン93）と15分間インキュベートしてFc受容体をブロックした後、PBSで希釈した以下に詳述する抗体混合物で4℃にて20分間標識した。データはBD LSRII Fortessa、BD FACSymphonyまたはCytek Auroraで取得し、FlowJoソフトウェア（Tree Star）およびR studioで解析した。セルソーティングは、100μmノズルを装備したBD FACS Aria IIIおよびBD S6で実施した。
マウスI-A/I-E（クローンM5/114.15.2 1：400）、CD11b（クローンM1/70 1：200）、CD11c（クローンN418 1：200）、CD45（クローン30-F11 1：400）、Ly6C（クローンHK1.4およびAL-21 1：400）に特異的に結合したフルオロクロムを有するモノクロナル抗体（mAbs）である。 4およびAL-21 1:400）、Ly6G（クローン1A8 1:200）、Siglec-F（クローンE50-2440 1:200）、CD3（クローン17A2 1:400），NK1.1（Clone PK136 1:200），CD19（Clone 1D3 1:400），CD64（Clone X54-5／7． 1 1:100）、F4/80（クローンCl:A3-1およびBM8 1:400）、CD169（クローンSER-4 1：200）、MerTK（クローンDS5MMER 1：200）、CD206（クローン C068C2 1:200）， Lyve1（Clone ALY7 1:100），CD38（clone 90 1： 400）、CX3CR1（クローンSA011F11 1：200）、Dectin-1（クローンRH1および2A11 1：400）およびXCR1（クローンZET 1：200）は、BD、eBioscience、バイオラッド、R＆Dまたはバイオレンドから購入。詳細な解析の前に、単一細胞および生細胞にゲーティングを行った。死細胞は、Fixable Viability Kit (Near-IR staining, Biolegend)で除外した。 ヒトCD11b (clone ICRF44 1:400), CD11c (clone BU15 1:100), CD14 (clone M5E2 1:100), CD16 (clone 3G8 1:100), CD64 (clone 10. 1:50) に特異的なmAbを用いた。 1 1：50）、CD66b（クローンG10F5 1：50）、CD3（クローンUCHT1 1：100）、CD4（クローンRPAT4 1：150）、CD8（クローン3B5 1：100）、Siglec8（クローン7C9 1：50）MerTK（clone 590H11G1E3 1： 50）、FceR1（クローンCRA1 1：50）、CD163（クローンGHI/61 1：50）、CX3CR1（クローン2A91 1：50）、HLA-DR（クローンG46-6 1：200）およびCD56（クローンNCAM16． 2 1:100）は、BDまたはBiolegendのいずれかから購入した。細胞増殖アッセイには、Click-iT EdU Cell Proliferation Kit (ThermoFisher)を使用した。
マウス乳汁中の免疫グロブリン濃度は、LEGENDplex Mouse Immunoglobulin Isotyping Panel (6-plex, Biolegend) により測定し、FlowJo software (v.10.6) (BD Bioscience) および LEGENDplex software (v.8.0) (Biolegend) で解析した。
フローサイトメトリー高次元解析のために、生データをFlowJoで前処理し、その後、R studioのuniform manifold approximation and projection（UMAP）53で変換、パーセント正規化、次元削減、可視化した。FlowSOMアルゴリズムは、マーカー発現値および中央値または平均発現値のヒートマップを重ね合わせたUMAPを用いた自動クラスタリング54に使用された55,56,57.
乳汁採取と白血球の単離
ダムは、6.5 mg kg-1 体重のキシラジン（Xylasol, Graeub）と 65 mg kg-1 体重のケタミン（Ketasol-100, Graeub）を i.p. 注入して麻酔した後、4 IU のオキシトシン（Sigma-Aldrich）で i.p. 刺激し、乳腺から手動でミルクを発現させてインシュリンシリンジを用いて採取した。
ヒト乳汁サンプルは、チューリッヒ大学病院で、出産後4～63日以内に、20～40歳（平均（S.D.）32.0（5.0））の健康な女性から採取した。両乳房からの搾乳は、病院または自宅で電動ポンプ（Symphony、Medela）を用いて、実験室に移送する最大12時間前にドナーによって行われた。採取された母乳は病院でホモジナイズされ、1-3mlが本分析に使用され、残りは乳児への授乳に使用された。研究プロトコルは、チューリッヒ州のスイス倫理委員会（BASEC-Nr. 2020-00542）の承認を受け、研究に参加するすべての被験者が登録前にインフォームドコンセントにサインした。
乳細胞の分離には、牛乳をPBSで1：1の割合で希釈し、800gで20分間、15℃で遠心分離を行った。脂質層とスキムミルクを除去し、400g、5分間の遠心分離とPBSへの再懸濁により、細胞ペレットをPBSで2回洗浄した。
抗体処理
CSF-1中和抗体（クローン5A1）およびアイソタイプコントロール抗体（ラットIgG1、クローンHPRN）はBio X Cellから購入し、0.2-0.3 mgの用量でi.p.を投与した。
タモキシフェン処理
タモキシフェンは、最終濃度が25 mg ml-1となるように、コーン油中の100%エタノールで再構成された。合計5 mgのタモキシフェンを妊娠マウスに経口ガベージで投与した。
LPS誘発乳腺炎
CSF-1中和抗体（クローン5A1）をLPS注射の1日前および2日前にi.p.投与した。マウスをイソフルランで麻酔し、第4乳腺に5〜10μgのLPS（Sigma）を注射した；18時間後にマウスを犠牲にして乳腺を分析した。
ファゴサイトーシスアッセイ
乳腺細胞は上記のように単離した。単離後、細胞を上記のように染色し、2%FBSを含むRPMIに再懸濁し、pHrodo Red E. coli、ZymosanおよびS. aureus BioParticles (Invitrogen) (0.01 mg ml-1, 0.05 mg ml-1 and 0.01 mg ml-1, respectively) とともに、37℃および5% CO2で1時間半インキュベートした。インキュベーション後、直ちに細胞を取得した。
TLRリガンドによるインビトロ刺激
鼠径部、腹部および胸部乳腺から上記のように細胞を単離した。単離後、細胞を完全培地（RPMI（Seraglob）、10％FBS（Gibco）、0.01M HEPES（Gibco）、1mMピルビン酸ナトリウム（Gibco）、2mM Glutamax（Gibco）、1％ Penicillin-Streptomycin（Gibco）、1％ nonessential amino acids （Gibco）、57． 2 μM β-メルカプトエタノール（AppliChem））をGolgiPlugとGolgiStop 1:1,000（BD） で処理し、Zymosan 50 μg ml-1（InvivoGen） またはLPS 300 ng ml-1（Sigma） に曝露するか、刺激しないまま（ネガティブコントロール）。細胞を37℃で6時間インキュベートし、洗浄し、上記のように表面マーカーを染色した後、Cytofix/Cytoperm（BD Biosciences）で4℃で20分間固定し、Perm bufferで洗浄した（2% BSA, 0.5% Saponin, 0. 0002%アジ化ナトリウム in PBS）、Perm緩衝液中の細胞内抗体ミックスで25分間染色（TNF（clone MP6-XT22 1:400） and proIL-1β（clone NJTEN3 1:200）, eBioscience または Biolegendから購入）、Perm緩衝液で洗浄してPBSに再懸濁して取得。
組織学
マウスをCO2窒息で安楽死させ、PBSで灌流した。乳腺脂肪パッドを除去し、4％PFA（Morphisto）で4℃で6〜24時間固定し、PBSで洗浄した後、PBS中の30％スクロースで4℃、1〜5日間インキュベートした。その後、組織をCryo Embedding Medium (Medite)に埋め込み、ドライアイス上で凍結した。
Hyrax C60 cryostat (Zeiss)を用いて、切片（20 µm）をスライドグラスに切り出した。切片を37℃で20分間乾燥させ、PBSで2回洗浄し、PBS中の10％正常ヤギ血清（ThermoFisher Scientific）と0.5％Triton X-100（Sigma-Aldrich） で室温で2時間ブロッキングした。一部の染色では、M.O.M kit Mouse Ig Blocking Reagent (90 μl in 2.5 ml PBS; Vector Laboratories)を用いて、さらに室温で45分間ブロッキングを行った。一次抗体は、以下の抗体：マウス抗平滑筋アクチン（Dako、1：25）、AlexaFluor 594に結合したアルメニアハムスター抗CD11c（BioLegend、1：200）、eFluor 660に結合したラット抗Lyve1（eBioscience、1：100）およびPE-Cy7に結合したラット抗Ki67（eBioscience、1：500）を用いて5％の正常ヤギ血清およびPBS中の0.5％のトリトンX-100で4℃、一晩かけて行った。次に、二次抗体（AlexaFluor 405に結合したヤギ抗マウスIgG、ThermoFisher Scientific、1：200）を、PBS中の5％正常ヤギ血清および0.5％Triton X-100中で室温で2時間適用しました。標識後、切片は、DAPI（Dianova）を含むか含まないマウントメディウムで、ガラスカバースリップの下にマウントした。画像は、SP8共焦点顕微鏡（Leica）で、20倍の多焦点対物レンズまたは63倍の油彩対物レンズを使用して取得した。解析には、LAS X（Leica）およびImaris（Bitplane）ソフトウェアを使用した。
60μMの切片（浮遊切片）をHyrax C60 cryostat（Zeiss）を用いて切り出し、その後、ブロッキング緩衝液（PBS＋2％正常ヤギ血清＋0.1％Triton X-100）で1時間インキュベートして透明にした（室温）。次いで、自由浮遊切片を、4℃で2〜3日間、一次抗体で、抗Iba1（1：500、Wako）、抗GFP（1：200 Nacalai Tesque）、抗SMA（1． 100、Sigma）、抗CD64（1：100、Bio-Rad）、抗Dectin-1（1：100、Bio-Rad）、抗CD138（1：100、BioLegend）、抗IgA（1：100、Southern Biotech）または抗MHCII（1：100、BioLegend）。PBSで5分ずつ3回洗浄した後、切片をDAPI（1：1,000 ThermoFisher）および1：500に希釈した二次抗体とともにRTで2時間インキュベートした。その後、洗浄ステップを繰り返し、切片を数滴のマウントメディウム（Dianova）でマウントした。高解像度画像は、SP5 uprightまたはSP8 Falcon共焦点顕微鏡（Leica）で、×20と×40の対物レンズを使用して取得した。画像はImarisソフトウェア（Bitplane）を用いて処理した。
H&E染色は、凍結切片またはパラフィン包埋切片をキシレンで脱パラフィンし、100％、95％、70％のエタノール勾配で再水和した。その後、切片を水で洗い、ヘマトキシリン（Sigma）で5分間染色し、水で洗い、エオシン（Morphisto）で1分間カウンターステインし、95％、100％のエタノール勾配で脱水し、キシレンでクリアしてEukitt mounting medium（Sigma）でマウントしました。その後、切片を明視野顕微鏡（Olympus）で撮像し、ilastikソフトウェア58でピクセル分類ワークフローを用いて画像を分割し、その後Fiji（National Institutes of Health（NIH））へエクスポートした。肺胞の数と大きさは、Analyze Particlesコマンドを使用して計算した。小さな非特異的な斑点や、適切に分割されていない肺胞の大きな集合体を除外するため、1,000ピクセル（458μm2）から50,000ピクセル（22,888μm2）の間の領域を持つ肺胞のみが要約統計に含まれました。
単一細胞RNA配列決定とデータ解析
マウス細胞は、TotalSeq抗マウスHashtag抗体B0304、B0305およびB0306（クローンM1/42；30-F11）（8、11および14日目のpp用）を用いてバーコード化した。ヒト乳房細胞は、TotalSeq抗ヒトHashtag抗体B0251、B0252、B0253、B0254およびB0255（クローンLNH-94および2M2）でバーコーディングした。マウス細胞については10,000個（7日目pp、処女乳腺はn＝1、泌乳乳腺はn＝2）、18,000個（8、11、14日目pp、各タイムポイントはn＝3）、ヒト細胞については10,000個（8〜63日目pp、n＝6）を10x Genomics Chromiumにロードし、メーカーの指示に従いライブラリ作成を行った（Single Cell 3′ v. 3 protocol）。
ライブラリーはNovaSeq6000プラットフォームで、細胞あたり約50,000リードの深さで配列決定した。10x Genomics社のCellRanger（v.3.1.0）を使用して、デマルチプレックス、GENCODE reference build GRCm38.p6 Release M23（マウス細胞）へのリードのアライメント、および固有の分子識別子の崩壊が行われました。ヒトのミルクサンプルはGRCh38.p13にアライメントされました。
CellRangerの内蔵セルコールアルゴリズムによって生成されたフィルター付き遺伝子-細胞数マトリックスから、Seurat v.3ワークフローを使用してサンプルを分析しました。簡単に言うと、検出された遺伝子、カウントされたユニークな分子識別子、ミトコンドリア含有量に応じて、低品質の細胞をフィルターにかけた。追加のフィルタリングステップとして、scDblFinderパッケージ59を使用して、ダブレットを除去した。細胞周期の状態は、サイクロンアルゴリズム60を使用して決定した。タイムポイントp7の3つのサンプルは、2,000の可変特徴量を持つfastMNN法によって統合された。細胞はUMAP次元削減を用いて可視化した。クラスターの同一性は、SeuratのFindMarkers関数によって計算されたマーカー遺伝子に基づいて手動で決定された。選択された一次クラスターは、個別に再クラスタリングされた。サブクラスタ識別後、サブクラスタラベルを統合し、最終的な細胞アノテーションを行った。遺伝子オントロジーアノテーションはEnsemblデータベースからダウンロードし、遺伝子セットのGO濃縮度はclusterprofilerパッケージを使って計算した。8日目、11日目、14日目のpp間の差分発現遺伝子は、volcano3Dパッケージにvoom polar関数で実装されているlimma voom法を用いて計算した。ボルケーノプロットは、volcano3D関数を用いて、カットオフを0.01に設定し、ペアワイズフィルタをfalseに設定して作成しました。マルチモーダルMoMac-VERSE参照マッピングには、Seuratのマルチモーダル参照マッピングパイプライン61を使用し、PC数は原著論文42と同じ50台とした。
ヒトのミルクサンプルとマウスのデータを比較するために、ヒトの遺伝子をオルソログのマウス遺伝子にマッピングし、その後Seuratの統合データ機能（PCA）を使って統合しました。マウスとヒトのマクロファージ集団を類似性スコアで比較するために、ヒトのデータを参照とするSeurat V3 Integration and Label Transferパイプラインを使用しました。両データセットのカウントマトリックスとメタデータをSCT変換し、統合アンカーをデフォルトパラメータで抽出した62。ヒトマクロファージのアノテーションは、TransferData関数を用いて30k-nearest neighbor dimensions（Similarity Score）22,63でマウス細胞に転送されました。
プロテオミクス解析
サンプル調製：1サンプルあたり80 µlを100 µlのSDSバッファ（4% SDS, 100 mM Tris-HCl pH 8.2, 0.1 M dithiothreitol）と混合し、95 ℃で5分間煮沸し、90秒間高強度焦点式超音波で処理しました。その後、タンパク質を800μlのUTバッファー（100mM Tris-HCl pH8.2中の尿素8M）で希釈し、Ultracel 30,000 molecular weight cut off centrifugal unit (Amicon Ultra, Merck) にロードして14000gで遠心分離をした。SDS バッファーは、200 µl の UT バッファーの遠心分離1ラウンドで交換した。還元タンパク質のアルキル化は、UTバッファー中の100 µl iodoacetamide 0.05 Mと5分間インキュベートし、UTで100 µlの洗浄ステップを3回、NaCl 0.5 Mで100 µlの洗浄ステップを3回行った。最後に、フィルター補助サンプル準備（FASP）プロトコル64から適応して、1：50（w/w）でトリプシン（プロメガ）を含む120 μl 0.05 Triethylammonium Bicarbonate buffer (pH8) でフィルターを介してタンパク質消化された。消化は、湿式チャンバー内で室温で一晩行った。溶出後、ペプチドを含む溶液を最終濃度0.1%トリフルオロ酢酸、3%アセトニトリルまで酸性化した。ペプチドを社内のC18ステージチップで脱塩し、乾燥させ、質量分析（MS）分析用に20μlの3%アセトニトリル、0.1%ギ酸で再沈殿させました。ペプチド濃度はnanodropを使用して推定し、容量は0.6 µg µl-1のペプチド濃度に正規化しました。
液体クロマトグラフィー-MS分析
質量分析（MS）分析は、Digital PicoViewソース（New Objective）を装備し、M-Class UPLC（Waters）に結合したOrbitrap Fusion Lumos（ThermoFisher Scientific）で実施した。2つのチャンネルの溶媒組成は、チャンネルAが0.1%ギ酸、チャンネルBが0.1%ギ酸、99.9%アセトニトリル、カラム温度は50℃であった。各サンプルについて、2μlのペプチドを市販のACQUITY UPLC M-Class Symmetry C18 Trap Column (100 Å, 5 µm, 180 µm × 20 mm, Waters) に、続いてACQUITY UPLC M-Class HSS T3 Column (100 Å, 1.8µm, 75µm × 250 mm, Waters)にロードしました。ペプチドは300nl min-1の流速で溶出した。5%のBで3分間の初期保持を行った後、83分間で5%から22%のBへのグラジエントを行い、さらに10分間で22%から32%のBへのグラジエントが適用された。カラムは、95%Bまで上昇させ、95%Bを10分間保持した後、負荷条件を再確立することで洗浄された。サンプルはランダムな順序で取得された。質量分析計をデータ依存モードで操作し、フルスキャンMSスペクトル（300～1,500m/z）を200m/zで120,000の分解能で、500,000の目標値まで蓄積した後に取得しました。データ依存MS/MSは、リニアイオントラップにおいて、0.8Daのウィンドウを持つ四重極分離と35%のフラグメントエネルギーを持つ高エネルギーC-trap解離フラグメンテーションを使用して記録した。イオントラップはラピッドスキャンモードで、ターゲット値10,000、最大注入時間50msで操作した。5,000以上の強度を持つプリカーサーのみがMS/MSに選択され、最大サイクルタイムは3秒に設定された。電荷状態スクリーニングが有効である。Singly、unassigned、および7より高い電荷状態は拒絶された。MS/MS測定用に以前に選択されたプリカーサーの質量は、20秒間さらなる選択から除外され、除外ウィンドウは10 ppmに設定された。サンプルは、m/z 371.1012と445.1200の内部ロックマス校正を使用して取得されました。MSプロテオミクスデータは、ローカルのラボラトリー情報管理システム65を使用して取り扱われた。データはProteomeXchangeで識別子PXD041711で入手可能である（参考文献66）。
取得した生のMSデータは、MaxQuant（v.1.6.2.3）で処理し、その後、統合されたAndromeda検索エンジンを使用してタンパク質を同定した。スペクトルは、Uniprotのマウス参照プロテオーム（タクソノミーID 10090、プロテオームID UP000000589）、その逆デコイされたFastaデータベースおよび共通タンパク質コンタミに連結して検索されました。システインのカルバミドメチル化は固定、メチオニン酸化とN末端タンパク質のアセチル化は可変の修飾として設定された。酵素特異性はトリプシン/Pに設定し、最小ペプチド長7アミノ酸、最大2回のミスカッティングを許容した。MaxQuant Orbitrapのデフォルトの検索設定を使用した。最大偽発見率は、ペプチドで0.01、タンパク質で0.05に設定された。ラベルフリー定量を有効にし、ラン間のマッチングのために2分間のウィンドウを適用した。MaxQuantの実験デザインテンプレートでは、個々の定量値を得るために、各ファイルは実験デザインで独立させた。MaxQuantで生成され、proteinGroups.txtファイルに報告されているタンパク質強度値を使用しました。タンパク質強度の前処理は以下のように行った：ゼロに等しい強度は除去し、非ゼロの強度はlog2変換し、サンプル間の系統的な違いを除去するためにロバストzスコア変換を用いて修正した。log2倍変化とP値を推定するために、Bioconductorパッケージのlimmaを使用した。多重検定のP値は、Benjamini and Hochberg手順を用いて調整し、偽発見率を求めた。
統計解析
P値および平均±s.d.または±s.e.m.（該当する場合）を含む統計解析は、GraphPad Prism v.7 および v.9（GraphPad Software）を用いて行った；nは生物学的反復の数を表す。各実験の統計的な詳細は、対応する図の説明文に記載されています。
報告書の概要
研究デザインに関する詳しい情報は、この記事にリンクされているNature Portfolio Reporting Summaryでご覧いただけます。
データの入手方法
マウス乳腺およびヒト乳汁のscRNA-seqデータセットは、Genome Expression Omnibusに、それぞれGSE230697およびGSE230749のアクセッション番号で寄託された。MSプロテオミクスデータは、ProteomeXchange ConsortiumのPRIDEパートナーリポジトリに、データセット識別子PXD041711で寄託した。
コードの利用可能性
この研究では、新しいコードは生成されませんでした。これらの知見を裏付けるコードは、すでに記述されている42,56,57。MoMac-VERSE解析の解析コードはGithub（https://github.com/gustaveroussy/FG-Lab）にアップロードされています。
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謝辞
フローサイトメトリー施設（チューリッヒ大学）および顕微鏡・画像解析センター（チューリッヒ大学）の技術サポート、E. Yángüez, D. Popovic, D. Ehrsamによる単細胞RNAシーケンスの実施、D. González Rodríguezによるバイオインフォーマティクスサポート、FGCZ（機能的ゲノムセンター）におけるプロテオミクス解析P. Nanni、M. Lutz (Institute of Experimental Immunology, University of Zurich) による技術サポートに感謝します。ベルン大学のClean Mouse Facilityのスタッフの技術サポートに感謝する。Family Larsson-Rosenquist財団の支援に感謝する。また、原稿のレビューに協力してくれたInsight Editing LondonのL. Robinsonに感謝する。本研究は、スイス国立科学財団からの助成金（310030_184915, PP00P3_170626 and BSSGI0_155832 to M.G., 310030_146130, 316030_150768, 310030_170320 to B.B. and CRSII5_177164 to A.J.M.) により支援されています。このプロジェクトは、欧州連合（EU）の研究・イノベーションプログラム「Horizon 2020」の下、欧州研究会議（ERC）から資金提供を受けています（M.G.への助成契約番号819229）。
著者情報
著者情報
ディレイ・カンセバー
現在の住所 ロシュ、バーゼル、スイス
これらの著者は同等に貢献した： Dilay Cansever, Ekaterina Petrova.
著者と所属
チューリッヒ大学実験免疫学研究所、チューリッヒ、スイス
Dilay Cansever, Ekaterina Petrova, Sinduya Krishnarajah, Caroline Mussak, Christina A. Welsh, Wiebke Mildenberger, Victor Kreiner, Elsa Roussel, Sebastian A. Stifter, Myrto Andreadou, Pascale Zwicky, Nicole Puertas Jurado, Burkhard Becher 及び Melanie Greter
ギュスターヴ・ルシーがんキャンパス（フランス、ヴィルジュイフ
Kevin Mulder、Camille Blériot、Florent Ginhoux
フランス国立衛生研究所（INSERM）U1015、フランス国立がん対策機構（Equipe Labellisée-Ligue Nationale contre le Cancer）、フランス、Villejuif
ケビン・マルダー＆フローラン・ジンホウクス
パリ・サクレー大学、イル・ド・フランス、フランス
ケビン・マルダー（Kevin Mulder
チューリッヒ機能ゲノミクスセンター、チューリッヒ工科大学、チューリッヒ、スイス
ユベール・レーラウアー＆ゲー・タン
上海交通大学医学部免疫学研究所（中国・上海市
リュウ・ザオユアン＆ジンホウ・フロラン
フランス・パリ、CNRS、ネッケル悪性腫瘍研究所
カミーユ・ブレリオ
ベルン大学病院内臓外科・内科クリニック（スイス・ベルン市
フランチェスカ・ロンキ、アンドリュー・J・マクファーソン
シンガポール免疫学ネットワーク（SIgN）、科学技術研究庁（ASTAR）、シンガポール、シンガポール
フローラン・ギンホウ
チューリッヒ大学病院新生児科、新生児の神経発達・成長・栄養のためのラーション・ローゼンクイストセンター、スイス、チューリッヒ
ジャンカルロ・ナタルッチ（Giancarlo Natalucci
スイス、チューリッヒ、チューリッヒ大学病院、新生児科、新生児研究室
ジャンカルロ・ナタルッチ
貢献度
D.C.とE.P.は、実験、データ解析、研究計画、原稿執筆を行った。G.T.、H.R.、V.K.は、バイオインフォマティクス解析を行った。W.M.とC.A.W.は組織学的解析を行った。S.K.、C.M.、E.R.、S.A.S.、M.A.、P.Z.、N.P.J.は実験を行った。F.G.、Z.L.、C.B.、K.M.はヒトマクロファージの運命マッピング株を共有し、データ解析を行った。F.R.とA.J.M.は、無菌マウスを用いた実験を行った。M.G.は原稿の執筆と編集、研究の構想、監督、資金提供を行った。G.N.は参加者のデータ収集を担当した。B.B.、F.G.、G.N.、A.J.M.は原稿の編集と査読を行った。S.K.とC.M.は同等に貢献した。すべての著者が原稿を読み、承認した。
対応する著者
Melanie Greterに対応する。
倫理的宣言
競合する利益
著者は、競合する利益を宣言していない。
査読
査読情報
Nature Immunologyは、本著作の査読に貢献した匿名査読者に感謝します。査読者の報告書はこちらからご覧いただけます。Ioana Visanは本論文の主編集者であり、他の編集チームと協力して編集過程と査読を管理した。
その他の情報
出版社からのコメント Springer Natureは、出版された地図や機関所属の管轄権の主張に関して中立を保っています。
エクステンデッドデータ
Extended Data 図1 授乳期のマウス乳腺におけるミエロイド細胞のゲーティング戦略と集団動態。
a-c、好酸球、好中球、Ly6Chi単球、F4/80loマクロファージ（Mac）、F4/80hiマクロファージ、liMacsおよび樹状細胞（DC）のゲート戦略の代表フローサイトメトリプロット（ライブでプレゲートされた、 a）、総細胞数のバイオリンプロット（b）、および総ミエロイド細胞のパーセンテージを示す棒グラフ（c）を、処女、授乳期（10日目pp）および授乳後（21日目pp）の野生型マウスの乳腺で示した。データ（各タイムポイントにつきn = 5-6）は、6つの独立した実験からプールされたものである。d, 妊娠後期（E18.5）の乳腺の骨髄コンパートメントをフローサイトメトリーで解析したUMAPプロット（CD45+CD11b+および/またはCD11c+にプレゲートをかけた）。ヒートマップは、平均マーカー発現を示す。データは変換され、パーセンタイル正規化された。Fig. 1に関連する。
Extended Data Fig. 2 LiMacsはマウスの乳汁分泌部位に局在している。
a-b, Cx3cr1GFP/+ダム（8日目pp）の授乳中の乳腺の免疫蛍光画像で、SMA（青）、CD11c（マゼンタ）、Cx3cr1-GFP（緑）、MHCII（黄色）（a）またはLyve1（b）（黄色）を示す。挿入図は、Cx3cr1-GFP、CD11c、MHCII（a）またはCx3cr1-GFP、CD11c、Lyve1（b）の単独染色を示す輪郭領域の拡大図である。画像はn = 2マウスの代表的なものである。スケールバー： c-d、Cx3cr1GFP/+ダム（9-12日目pp）の授乳中の乳腺の免疫蛍光画像で、DAPI（青）、SMA（赤）、Cx3cr1-GFP（緑）、CD64（シアン）（c）またはIba1（シアン）（d）。挿入図は、Cx3cr1-GFPとCD64（c）およびIba1（d）の単一染色を示す輪郭領域の拡大図である。スケールバー： 低倍率は100μm、挿入図は50μm。画像はn = 4マウスの代表的なものである。Fig. 1に関連する。
Extended Data Fig. 3 liMacsで高発現している遺伝子。
a-e、7dppのWTマウス由来の授乳期乳腺のミエロイド細胞（CD11b+および/またはCD11c+）のscRNA-seq解析。a、クラスター定義遺伝子のヒートマップ。b, liMacs、F4/80hiマクロファージ（Mac）、F4/80loマクロファージにおける選択した「Folr2シグネチャー」遺伝子22の発現を示す点描画。ドットの大きさは、各遺伝子を発現しているクラスター内の細胞の割合を示し、ドットの色は発現レベルを反映する（凡例に示す）。 c, liMacs、F4/80loマクロファージ、F4/80hiマクロファージ、cDC2sおよびcDC1sにおけるマクロファージおよびDCシグネチャー遺伝子67、68の発現を示すヒートマップ。 d, liMacs、F4/80hiマクロファージ、F4/80loマクロファージにおける選択した「Cadm1／トレミー2シグナル」遺伝子22の発現を示すドットのプロット。ドットの大きさは、各遺伝子を発現しているクラスター内の細胞の割合を示し、ドットの色は発現レベルを反映する（凡例に示す）。 e, 授乳中の乳腺のliMacs、F4/80hiマクロファージ、F4/80loマクロファージにおける遺伝子発現パターンに応じたGO用語のエンリッチメント。f, DAPI（青）、SMA（白）、Cx3cr1-GFP（緑）、Dectin-1（赤）（左）およびCx3cr1-GFPとDectin-1の単一染色（右）を示すCx3cr1GFP/+ダム（8日pp）からの哺乳類乳腺の免疫蛍光画像。画像はn = 2マウスの代表的なものである。スケールバー： 100 µm。
Extended Data Fig. 4 マウスの泌乳期に増殖するLiMacs。
a, 野生型マウスの授乳期乳腺（7日目pp）におけるミエロイド細胞（CD11b+および/またはCD11c+）のscRNA-seqデータの増殖細胞（赤）を示すUMAPと増殖関連遺伝子発現を示す点描画。ドットの大きさは、その遺伝子を発現している細胞の割合を示し、色は、細胞あたりの平均遺伝子発現量を示す。図2に関連する。 b, 8日目、11日目、14日目のliMac間で発現量の異なる遺伝子を示すポーラーボルケーノプロット（limma voom法で解析）。座標は、グループごとの相対的な平均発現値に対応する。8052個のうち86個の遺伝子が差次的に発現し、そのうち46個は8日目のppで特に発現が増加した（調整p値＜0.01）。p値が高い30個の遺伝子にラベルを付けた。c、Cx3cr1GFP/+のダムからの授乳中の乳腺におけるKi67+ liMacsの割合を示す代表的な免疫蛍光画像および棒グラフ（±SEM）（8-10日目のpp）。Ki67（マゼンタ）、SMA（黄色）、Cx3cr1-GFP（緑色）、DAPI（青色）。挿入図は、輪郭のある領域の単一染色を示す拡大図である。N = 4マウス。スケールバー： d, Csf1rfl/flおよびCd11cCreCsf1rfl/flダムの授乳期乳腺（8-14日目pp）におけるLy6Chi単球、好中球および好酸球の総細胞数を示すバイオリンプロットである。4つの独立した実験で分析した5-6匹のマウスのデータをプールした。両側Mann-Whitney検定実施、ns =有意ではない。図4に関連する。 e、野生型ダムからのコントロール（アイソタイプコントロール抗体処理または未処理）またはCSF-1抗体（Ab）処理（2〜3回）の授乳中の乳腺（7〜14日目のpp）におけるLy6Chi単球、好中球、好酸球、B細胞およびDCの総細胞数を示すバイオリンプロットである。5つの独立した実験で分析した11匹のマウスのプールデータ。両側マン・ホイットニー検定を実施、ns＝有意でない。Fig.4と関連する。
Extended Data Fig. 5 liMacsの欠失はマウス乳汁のタンパク質組成を変化させない。
a, Csf1rfl/flおよびCd11cCreCsf1rfl/flダムの授乳期乳腺（8日目pp）の乳腺切片のヘマトキシリンおよびエオシン染色を示す。肺胞の数および肺胞面積はilastikソフトウェアを用いて定量化した。画像はそれぞれn = 4および5匹のマウスの代表的なものである。スケールバー：200 µm。両側無対称のStudent's t testを実施、ns = not significant。図5に関連する。 b、7日目ppのCsf1rfl/flおよびCd11cCreCsf1rfl/flダム由来の乳汁中の最も豊富なタンパク質50を示すヒートマップ。Csf1rfl/flおよびCd11cCreCsf1rfl/flの泌乳中のIgA、IgM、IgG1、IgG2a、IgG2b、IgG3濃度を示すバイオリンプロットであり、N=13-14、3つの個別実験からのプールデータ、灰色の線で示されている。それぞれ、N = 9および7匹のマウス。d, コントロール（未処理）またはCSF-1抗体処理（8-11日目pp）のダムの授乳中の乳腺（11-14日目pp）の代表的な免疫蛍光画像は、DAPI（青）、IgA（緑）およびCD138（赤）を示す。挿入図は、輪郭のある領域の単一染色を示す拡大図である。スケールバー： スケールバー：概要画像では50μm、挿入画像では37.5μm。e、アイソタイプ処理またはCSF-1抗体処理（1、3、5pp日）したダムの授乳中の乳腺（7pp日目）におけるIgA+細胞の総細胞数を示す代表的なフローサイトメトリープロットおよびバイオリンプロットである。データは3つの独立した実験からプールされたもので、n = 5-6。両側Mann-Whitney検定を実施、ns = 無意義。
Extended Data Fig. 6 3つの乳腺マクロファージは、微生物刺激に対して異なる反応を示す。
a-b. in vitroでLPSまたはザイモサンに6時間曝露した後の野生型マウスの泌乳乳腺（day 11-14 pp）由来のproIL-1β+またはTNF+ liMacs（a,b）およびF4/80loマクロファージ（Mac）およびF4/80hiマクロファージ（b）の割合を示す代表フローサイトメトリプロット（a）とバイオリンプロット（b）。データは2つの独立実験からプールされ、n = 7。各値は3複製の平均である。ダンの多重比較検定によるクラスカル・ワリス検定を実施、*p < 0.05; **p < 0.01; ***p < 0.001. c、大腸菌、ザイモサンおよび黄色ブドウ球菌のpHrodo Redバイオ粒子にin vitroで90分間曝露した後の野生型マウスの泌乳乳腺（10-15日目pp）からのpHrodo Red+ F4/80loマクロファージ、F4/80hiマクロファージおよびliMacの割合を示す代表フローサイトメトリプロットとバイオリンプロットである。大腸菌およびザイモサンpHrodo Redバイオ粒子については、3つの独立した実験（10-15日目pp）からプールしたN = 10、黄色ブドウ球菌pHrodo Redバイオ粒子については、2つの独立した実験（12-15日目pp）からプールしたn = 7。すべてのサンプルは3連で実行し、平均値を算出した。ダンの多重比較検定によるクラスカル・ワリス検定を実施した、*p < 0.05; **p < 0.01; ***p < 0.001, ns = not significant. d, 他の単核食細胞（MNP）の総細胞数を示すバイオリンプロット（CD45+CD19-NK1。 1-CD3-SiglecF-Ly6G-「LiMac-」）、好酸球、NK細胞、B細胞およびT細胞を、分析の18時間前にLPSでチャレンジしたコントロール（未処理）およびCSF-1抗体処理（7-11日目pp）マウスの授乳中の乳腺（10-14日目）または未処理で残した状態で、示した。データ（1群あたりn = 5-6）は、2つの独立した実験からプールされた。一元配置分散分析試験を適用、*p<0.05, **p<0.01, ****p<0.0001, ns = not significant. Fig.5と関連する。
Extended Data Fig. 7 3つのマクロファージサブセットがヒト乳汁中に存在する。
a, ヒト母乳のT細胞、好酸球、好中球、マクロファージ（CD45+細胞でプレゲート）の代表的なフローサイトメトリープロットと各集団の異なるマーカーに関する代表的なヒストグラム。c、Mac 1、Mac 2およびMac 328におけるFOLR2+マクロファージシグネチャー遺伝子発現を示すドットプロット。 d、マウス乳腺（7日目pp）およびヒト乳汁のMac 1、Mac 2およびMac 3集団（8〜63日目pp）のF4/80loマクロファージ、F4/80hiマクロファージおよびliMacの主成分分析。e、T細胞と比較してヒト乳汁Mac1、Mac2およびMac3の遺伝子発現パターンによるGO用語の濃縮表示。図6に関連。
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Cansever, D., Petrova, E., Krishnarajah, S. et al. Lactation-associated macrophage exist in murine mammary tissue and human milk. Nat Immunol (2023). https://doi.org/10.1038/s41590-023-01530-0
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受理2021年5月11日
2023年5月08日受理
2023年6月19日発行
DOIhttps://doi.org/10.1038/s41590-023-01530-0
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サイトカイン
単球・マクロファージ
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ネイチャー免疫学（Nat Immunol） ISSN 1529-2916（オンライン） ISSN 1529-2908（印刷物）
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