絶滅危惧種であるカーカーポーの腸内細菌叢の種全体の多様性とゲノム変異との関連性を把握する

2023年5月25日 11:23

https://onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1111/mec.16999

アニー・G・ウェスト、アンドリュー・ディグビー、アンナ・W・サンチュア、ジョセフ・G・グリン、ピーター・ディアデン、カーカポー・リカバリーチーム、マイケル・W・テイラー、ララ・アーバン
初出：2023年5月24日
https://doi.org/10.1111/mec.16999
ハンドリングエディターエリン・ヴィデヴァル
について
セクション

要旨
腸内細菌叢は宿主の健康に不可欠な役割を果たし、絶滅の危機に瀕した野生動物の保護管理にも重要な影響を与える。食事、薬物、生息地などの要因が腸内細菌叢を形成することが知られているが、宿主ゲノム背景の複雑な役割を含む要因全体についての理解はまだ不完全である。私たちは、ニュージーランド固有種の飛べないオウムである絶滅危惧種カーカーポ（Strigops habroptilus）の宿主ゲノムと腸内細菌叢の相互作用に関する研究を行っていますが、これは私たちの知る限り、ほぼ全ての絶滅危惧種について消化管細菌の多様性と宿主ゲノム多様性の関係を最も包括的に研究したものの1つと言えます。我々は、84％のカーカポーの腸内細菌叢を表す糞便サンプルの16S rRNA遺伝子ベースの分析を実施した。この調査を優れたメタデータで活用し、宿主のゲノム多様性と、性別、年齢、食事、抗生物質、病気、生息地、サンプリング日などの要因が、カーカーポーの腸内細菌叢に与える影響を明らかにしました。また、腸内細菌の多様性と、腸のホメオスタシス、炎症、免疫、代謝に関連する機能的経路との間に推定される関連性を明らかにしました。このようにカーカーポーの腸内細菌叢と宿主のゲノムとの関係を理解することで、カーカーポーの健康や病気の軽減における腸内細菌叢の役割について新しい知見が得られ、カーカーポーの保護に直接役立つと考えられます。全体として、保全研究と管理におけるマイクロバイオーム研究の統合は、ワンヘルスコンセプトの理解と実現を向上させると予想される。
1 はじめに
マイクロバイオータは、動物の健康、フィットネス、発達に本質的であり（Cho & Blaser, 2012）、消化、恒常性、免疫系調節、生殖、神経プロセスにおいて必須の役割を果たす（Gilbert et al., 2018; Spor et al.）絶滅の危機に瀕した野生動物の健康と体力に腸内細菌叢が及ぼす潜在的な影響は、保全管理プログラム、特に飼育下または高度に管理された集団に関しては適切である（San Juan et al., 2021; Trevelline et al., 2019; West et al., 2019; West, Delaunay, et al., 2022; West, Digby, et al.、2022）。例えば、絶滅の危機に瀕しているイーストクロサイと絶滅危惧種のミナミシロサイの両方における生殖能力は、微生物叢を介したホルモン産生と代謝に直接関連しており（Antwis et al., 2019; Williams et al., 2019）、種の保全を支援する生殖健康の潜在的バイオマーカーの特定が可能となった。
微生物叢は、食事、投薬、生息地または社会的ネットワークなどの環境要因によって形成され得るが（David et al., 2014; Rodrigues Hoffmann, 2017; Rothschild et al., 2018; San Juan et al., 2021; West, Delaunay, et al., 2022; West, Digby, et al., 2022）、微生物叢を形作る要因全体に対する理解はまだ不完全なものである。例えば、微生物叢の組成は系統と有意に関連し（Rojas et al., 2021; Waite & Taylor, 2014）、種の生態におけるかなりの分岐を覆すことができる（例えば、草食性のジャイアントパンダの腸内細菌叢は、肉食性の姉妹種のものと似ている [Xue et al., 2015] ）。この観察に対する顕著な例外は、コウモリや鳥類の間で、腸内細菌叢が系統上の変化と強く関連していることである（Song et al.、2020）。宿主の遺伝的背景も微生物叢の構成に大きな影響を与えるが（Zhernakova et al.、2016）、ゲノムと微生物叢の両方のデータを入手できる大規模コホートが必要なため、ほとんどの種でその役割は未解明である。このようなデータセットは、最近、ヒト（Awany et al., 2019; Goodrich et al., 2016; Hall et al., 2017; Ishida et al., 2020）および一部の動物種（齧歯類［Doms et al., 2022; Suzuki et al., 2019; Wang et al、 2015, 2022]、反芻動物や家禽[Ryu & Davenport, 2022参照]、さらには野生のヒヒ[Grieneisen et al., 2021]など)がありますが、我々の知る限り、微生物叢とホストゲノムの関係に関する研究は、絶滅危惧種の野生動物についてまだ実施されていません。このような情報は、宿主の遺伝的影響と、より操作しやすい環境要因の影響を区別することで、絶滅危惧種のマイクロバイオーム工学に関する今後の取り組み（West et al.など、2019）に役立つはずです。
ここでは、事実上絶滅の危機に瀕している種であるカーカーポ（Strigops habroptilus）全体の腸内細菌叢カタログを作成しました。そして、この微生物叢カタログを、全個体の広範な環境データおよびゲノムデータ（Guhlin et al.、2022）と組み合わせて、絶滅危惧種全体の微生物叢の多様性に影響を与える要因の全体像を明らかにしました。カーカーポは、アオテアロアニュージーランド固有の飛べない夜行性のオウムで、生息地の分断や哺乳類の捕食者の侵入により、20世紀半ばには機能的に絶滅したと考えられていました。現存するカーカーポーの集団は、主にニュージーランド・アオテアロアのラキウラ島／スチュワート島で発見された1つの集団と、「本土」のカーカーポーの中で唯一子孫を残すことに成功したリチャード・ヘンリーという1頭の雄個体の子孫である。深刻な個体群ボトルネックを経た現在、カーカポーは高度に近親交配され、低い繁殖成功率に苦しんでいる。この状況は、ポッドカーブの大量収穫期（およそ2～4年ごと）にのみ起こる散発的な繁殖によってさらに深刻になっている（Eason et al.）しかし、最近の知見では、長期的に小さな個体数であるにもかかわらず、カーカーポーは有害な突然変異が予想よりも少ないことが示唆されています（Dussex et al., 2021）。種として、カーカーポーはさらに病気への感受性が高まり、特に滲出性肛門炎は、カーカーポーの健康に大きな影響を与える、病因がはっきりしない炎症性の肛門疾患です（Jakob-Hoff & Gartrell, 2011; White et al., 2015）。現在、生き残った約250頭のカーカポーは、捕食者のいない沖合の5つの島で野生個体群として暮らし、ニュージーランド自然保護局（Te Papa Atawhai）のカーカポー・リカバリープログラムによって管理されています。カーカーポは、世界で最も大きく、唯一飛べず、唯一レック繁殖をするオウムというユニークな鳥であり（Merton et al. したがって、カーカポーの腸内細菌叢は、他の草食動物種と同様に、消化において重要な役割を果たしていると考えられます（Amato et al., 2013, 2016; Mackie, 2002）。先行研究では、カーカポーの腸内には、草食動物としては非常に珍しい、単一種のEscherichia-Shigellaに頻繁に支配される低多様性の細菌群集が存在することが示されています（Perry et al., 2017; Waite et al., 2012, 2014, 2018; West, Digby, et al., 2022）。先行研究はまた、この微生物相が、補助給餌や手作業による飼育などの人為的影響、生物地理的変動、性別や年齢などの個体特性に頑健であるようであることを示している（Perry et al., 2017; Waite et al.）
我々はまず、現存する成人カーカーポーのほぼ全個体（2019年の繁殖期に孵化したヒナを除く、2020年12月31日時点の個体数n=141）に加え、死亡した数個（n=14）の糞便サンプル（合計n=133）から細菌16S rRNA遺伝子データを作成・照合し、その後、同じ個体の全ゲノム配列データ（Kākāpō125+ゲノムプロジェクトで作成）（Guhlin et al.、2022）と結合しました。次に、細菌の多様性と宿主の特徴（カーカーポーの性別、年齢、抗生物質治療、補助飼料、病気の状態（滲出性肛門炎）、手での飼育など）、さらに島の位置やサンプル採取の年や季節などの環境因子との関連性を調査しました。これらの情報とゲノムデータセットを活用し、腸内細菌多様性、Escherichia-Shigella優勢、コア細菌分類群存在量の遺伝率、遺伝的構造、ゲノムワイド関連性を評価しました。カーカーポーの腸内細菌叢と宿主のゲノム背景との関係の理解を深めることで、カーカーポーの健康と体力における微生物叢の役割について新たな知見が得られ、すべての生命システムとその健康の相互接続を確認するワンヘルスの概念に則り、カーカーポーの管理と保全に直接役立つことを期待しています。
2 材料と方法
サンプル収集
本研究は、（a）新鮮な糞便を採取した（n = 74）、（b）以前のサンプリング作業から糞便をすでに-20℃で保存していた（n = 29）、または（c）16S rRNA遺伝子アンプリコン配列データが入手できた（n = 30）133人のkākāpō個人の糞便微生物相に基づいている（ペリーら（2017）から）。このデータセットには、現存する成人カーカーポーの84％（2020年12月31日時点で生存する成人カーカーポーの141人中119人）、および歴史上の人物と死亡した14人の微生物相データがすべて含まれています。
糞便サンプルは、6つの沖合の島から採取されました（図1）： Whenua Hou (Codfish Island, 46° 47′ S, 167° 38′ E), Pukenui (Anchor Island, 45° 45′ S, 166° 31′ E), Te Hauturu-o-Toi (Little Barrier Island, 36° 11′ S, 175° 04′ E)、 Te Kākahu-o-Tamatea（カルキー島、南緯46度03分、東経166度31分）、Pearl Island（南緯47度11分、東経167度42分）、Te Pākeka（モード島、南緯41度02分、東経173度53分）です。パール島とテ・パケカのサンプルは1998年と1999年に採取された（履歴サンプル）。サンプルは定期的なモニタリングの際に臨機応変に収集されたため、新鮮な糞便が常に入手できるとは限らない。新鮮な糞便が得られない場合、当初は襟足スワブを採取したが、スワブの細菌プロファイルは糞便のものと十分に異なっており、代理として使用することはできなかった（図S1）。新鮮な糞便が入手できた場合、その一部をRNAlater溶液2.5mLを含む滅菌ポリプロピレンチューブに直接入れ、4℃で一晩保存し、その後、サンプルを島外に輸送して処理できるようになるまで-20℃で保存した。新鮮な糞便を採取できず、kākāpō個体がPerryら（2017）の研究にまだ含まれていない場合、我々は、-20℃で保存され、以前の島への遠征中にできるだけ無菌的に採取された糞便サンプルを確認しました。これらの以前に収集されたサンプルは、RNAlaterですぐに保存されるか、または排便後1時間から4時間の範囲で、収集後できるだけ早く島で凍結されました（サンプル保存が微生物群集の推論に与える影響の統計比較は、データS1の表S1に示されています）。RNAlaterに保存された糞便材料は氷上で、凍結サンプルはドライアイスで、DNA抽出のためにWaipapa Taumata Rau The University of Aucklandに発送された。すべてのサンプルに付随するメタデータ（データS2）には、サンプル収集の場所と日付、サンプル収集の季節、抗生物質歴、滲出性肛門炎歴、カーカポ個体の性別と年齢、サンプル収集前の3ヶ月間に補助飼料が与えられていたかどうか、カーカポがヒナとして手で育てられていたかどうかが含まれています。1970年代から1980年代にかけてラキウラ／スチュワート島で発見された年齢不明の鳥を補うため、カーカポーの年齢は10年のカテゴリーに分類された。年齢不明のカーカーポは本研究で採取された個体の26％を占め、カーカーポが通常繁殖を開始する年齢である発見日の最低年齢を10歳とした（Digby et al.、2023）。
図1
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キャプション
DNAの抽出
DNAは、豊富なPCR阻害剤の存在と過剰な塩の共沈殿の両方を低減するためにわずかに変更された、Perryら（2017）によって以前に記載されたセチルトリメチルアンモニウムブロミド（CTAB）ベースのビーズビーティング法の修正版を用いて解凍した糞便サンプルから抽出された。各サンプルについて、100mgの糞便を、RNAlaterで保存する場合はリン酸緩衝生理食塩水で、直接凍結する場合は70％エタノールで、最初に洗浄した。その後、30mgのポリビニルポリピロリドン（PVPP）を含む高塩分CTAB抽出バッファーに懸濁する前に、サンプルを70％エタノールで2回目の洗浄を行った。2019年半ば以前に処理されたサンプルは、FastPrep FP120ビーズビーターを用いて5.5 ms-1で30秒間撹拌された。試験中に機械が故障して修理できなかったため、残りのサンプルはTissueLyser II機械の対応する設定を用いて溶解した（30Hz、80秒）。溶解または保存（冷凍対RNAlater）の異なるサンプル間で、微生物叢組成に系統的な違いがないことを確認した（データはData S1の表S1に記載）。溶解したサンプルを、10分ごとに反転攪拌しながら65℃で30分間インキュベートし、その後、24：1のクロロホルム／イソアミルアルコール抽出（13000rpmで10分間遠心分離）した。上清を0.6volのイソプロパノールを含む新しいチューブに移し、室温で15分間インキュベートした後、11,500rpmで4℃、30分間遠心分離を行った。その後、イソプロパノールを除去し、ペレット化したDNAを含むチューブに1mLの70%エタノールを加え、室温で1時間放置して過剰な共沈塩を吸収させた。その後、サンプルを13,000rpmで10分間遠心分離し、上清を捨て、ペレットを70%エタノールで再度洗浄し、13,000rpmで再度10分間遠心分離した。ペレットは、20μLのTEバッファー、30mgのPVPP、800μLの高塩TEバッファー（1.5M NaCl）を加える前に、できるだけ多くのエタノールを取り除くために短時間風乾された。200μLのあらかじめ温めた0.7M NaCl-10% CTAB溶液を加える前に、サンプルを短くボルテックスした（1400rpm）。サンプルを再び65℃で30分間インキュベートし、10分ごとに反転させて混合し、その後、クロロホルム/イソアミルアルコール抽出を2ラウンド行った。最終上清を13,000rpmで2分間遠心分離して残存するPVPP粒子を除去し、0.1volの3M酢酸ナトリウム（pH5.2）および2volの70%エタノールとともに-20℃で一晩インキュベートした。70%エタノール洗浄を2回行った後、最終ペレットを20μLの10mM Tris-HCl (pH 8)に再懸濁した。
16S rRNA遺伝子の増幅と配列決定
DNA抽出物は、V3-V4のPCR増幅に供された。 341F（TCG TCG GCA GCG TCA GAT GTG TAT AAG AGA CAG｜CCT ACG GGN GGC WGC AG）および785Rプライマーペア（GTC TCG TGG GCT CGG AGA TGT GTA TAA GAG ACA G｜GGアクト ACH VGG GTA TCT AAT CC）とイルミナ互換Nexteraアダプター（下線部シーケンス）を用いてV4 16SrRNA遺伝子アンプリコン領域の増幅を行った。KAPA 3G Plant PCRキットを用いて、Perryら（2017）に記載されたPCR条件で増幅を行った。アンプリコンサイズおよびネガティブコントロール（抽出およびPCRコントロール）のバンドがないことを、SYBR Safe DNA Gel Stain（Invitrogen）を用いて1％アガロースゲルで確認した。PCR産物はAMPure XPビーズまたはZymo ZR-96 DNA Clean-Up Kitを用いて精製し、DNA濃度はQubit High Sensitivity dsDNA kit（Invitrogen）を用いてEnSpire Multimode Plate Readerで定量化した。サンプルは5 ng/μLに正規化し、Auckland Genomics LtdがIllumina MiSeqで2 × 300 bpケミストリーを用いてライブラリー調製およびシーケンスした（サンプルはAuckland Genomicsがデマルチプレックスした）。
バクテリアのデータ解析
16S rRNA遺伝子アンプリコン配列は、著者の推奨に従って、DADA2ソフトウェアパッケージ（バージョン1.16；Callahanら、2016）を使用してR（バージョン4.0.1；R Core Team、2019）で処理した。フォワードリードおよびリバースリードは、最初のプライマー除去後、それぞれ280 bpおよび240 bpにトリミングされた。切り捨てられた値よりも短いシーケンスリードは、truncQ <2または予想エラー数がフォワードリードとリバースリードで3を超えるリード（-maxEEパラメータ）と同様に破棄された。DADA2エラー学習アルゴリズムは、順方向および逆方向のリードに適用され、その後、ユニークな配列に脱複製されました。その後、DADA2コアサンプル推論アルゴリズムが複製解除された配列に適用され、その後マージされ、ノイズ除去された固有のアンプリコン配列バリアント（ASV）が得られました。配列キメラは除外し、SILVA 138リボソームRNAデータベース（Quast et al.、2013）を用いて分類学を割り当てた。DECIPHER (version 2.16.1; Wright, 2016) と phangorn (version 2.5.5; Schliep, 2011) パッケージを使用して系統樹を構築した。
ASVテーブル、分類学的割り当て、系統樹を対応するメタデータと統合し、R (version 4.1.0, R Core Team, 2021) package phyloseq (version 1.34.0; McMurdie & Holmes, 2013) を使用してphyloseqオブジェクトを作成しました。葉緑体やミトコンドリアを含む非標的配列は、phyloseqのprune_taxa関数を用いてデータセットから除去しました。また、低存在のASV（総相対存在量<0.0001%）も除去しました。続いて、サンプル間のシーケンス出力の有意差に対応するために、データをサンプル間の最小リード数（n = 3480; Table S1）に希釈化した（Weiss et al., 2017）；希釈化を5回行い、得られたすべてのブレイ・カーティス距離行列は、9999回の順列によるMantel検定（vegan package version 2.5-7; Oksanen et al., 2020）を用いて高い相関（スペアマン係数 = 0.999, p-value <.001）性を示した。
ObservedおよびInverse Simpson alpha-diversity指数は、希薄化したASVデータにphyloseqのestimate_richness関数を適用して算出した。Observedリッチネスとは、与えられたサンプルに含まれる微生物群の種数の直接的な指標であり、一方、Inverse Simpson多様性指数は、微生物群の種リッチネスに加え、コミュニティ全体の構造をよりよく表現するための均等性も測定する。これらのα-多様性指数とサンプルの共変量（サンプル採取日と季節、性別、年齢、島の位置、抗生物質処理、補助飼料、病気、手飼育）との関連を、Kruskal-Wallis検定（Shapiro-Wilk検定でα-多様性指数の非正規性を確認後）［Vgan package］を用いて検証した（表1）。共変量因子間のポストホック一対比較は、有意なクラスカル・ワリスモデルに対してBenjamini-Hochberg p値補正を伴うDunnの検定（dunn. test package version 1.3.5; Dinno, 2017）で実施した。
TABLE 1. 潜在的な共変量とα-多様性指数およびβ-多様性指数との関連についてのクラスカル・ワリスおよびPERMANOVAの検定結果をそれぞれ示す。
共分散変数ObservedInverse SimpsonBrayCurtis PCoAgUniFrac PCoAKruskal-Wallis p-valueH statisticKruskal-Wallis p-valueH statisticPERMANOVA p-valueR2F statisticPERMANOVA p-valueR2F statisticSex.01 a6.25.211.56.009b0.033.54.005b0.033.50Island.138.51.03a12.76.180.051.30.420.040.97Year.389 .71.3410.16.610.0050.67.330.0081.02Hand rearing.271.24.082.99.130.011.60.450.0070.90Supplemental feeding.390.76.450.57.500.0060.82.110.011.69Season.254 .12.086.83.03a0.041.95.180.031.30Antibiotic history.301.08.880.03.900.0030.44.110.011.85Exudative cloacitis.930.15.161.97.510.0060.81.080.021.95Age.137.15.533.16.370.0080.97.330.0081.07
注）BrayCurtis PCoAとgUniFrac PCoAはそれぞれ、各変数に関連する距離非類似度行列のPERMANOVA結果を示す。
a 限界的有意性（p < .05）を示す。
b 有意であることを示す（p < .01）。
β多様性を探索するために、phyloseqおよびGUniFrac（バージョン1.1; Chen, 2018）パッケージを用いて、希薄なデータに対するBray-Curtisおよび一般化UniFrac非類似度行列をそれぞれ算出し、主座標分析（PCoA; veganパッケージ）に供した。次に、距離行列を9999回の順列でPERMANOVA（vegan）にかけることで、β多様性指標とすべての共変量との関連を検証した（表1）。さらに、veganの関数betadisperとpermutestを使用して、均質なグループの分散をテストした。metagenomeSeq（version 1.40.0; Paulson et al、 2013）、ZicoSeq（GUniFracパッケージの機能バージョン1.7; Yang & Chen, 2022）およびANCOM-BC（バージョン2.0. 3; Lin & Peddada, 2020）パッケージを使用し、各ソフトウェア間で同等の設定：例えば、与えられたASVの最小有病率10％（p値はプールされ、Rstats p.adjust() 関数でボンフェローニ誤差補正を使用して調整されました）、非稀釈、フィルタリングデータを用いて主要バイナリ共変数（性別、病気、手飼育、補食、島（Whenua Ho vs Pukenui、最大の2つの集団））によるASVの存在量の差についてテストしました。
次に、phyloseqオブジェクトを分類学上の種レベルで凝集させ、plyrパッケージ（バージョン1.3.5; Wickham, 2011）を使用して、種あたりの平均相対存在率が0.3%未満であることに基づいて、あまり多くないASVを「その他」のカテゴリーに分類しました。コア種は、全サンプルにわたって有病率が85％以上、平均相対存在量が1％以上の種と定義した。そして、これらのコア種の相対存在量を分類群特異的表現型として使用した（「材料と方法：遺伝子型-表現型解析」を参照）。
すべてのデータは、Rパッケージggplot2（バージョン3.3.3; Wickham, 2016）、cowplot（バージョン1.1.1; Wilke, 2020）、およびManu（「kākāpō」カラーパレット）（バージョン 0.0.1; Ram et al., 2018; Thomson, 2020）で可視化しました。
遺伝子型-表現型解析
169人のkākāpōのゲノムデータは、現存するkākāpō集団全体と過去に死亡した個体を代表するように、Kākāpō125+プロジェクト内で作成されました。高信頼性の一塩基多型（SNP）コールセットを同定するために、高品質のkākāpō参照ゲノム（NCBI分類ID：2489341）と169個体のショートリード全ゲノムシーケンスデータ（2×125bpまたは2×150bp Illuminaペアエンド配列；平均ゲノム幅カバー24.4、個人間の範囲は13.1～53.4）をDeepVariant（Guhlinら、2022参照）で合成しました。PLINK（バージョン1.9; Purcell et al., 2007）を用いて、微生物叢のデータも得られた133人の個体について、遺伝子型の欠損（20%以上）、マイナーアレル頻度（5%未満）、ハーディーワインバーグ平衡からの極度のずれ（P < 10-7）、バイアレルシティについてこのSNPコールセットにフィルターをかけ、下流の分析に使用する1,202,717SNPを得ました。次に、強い連鎖不平衡のSNPを刈り込み（PLINKのindep-pairwise機能を使用、ウィンドウサイズ50、ステップサイズ10、ペアワイズr2閾値0.8）、このSNPセットを使用して、分散標準化関係行列とこの関係行列の主要成分分析（PCA）の最初の10主成分を算出しました。
微生物に関連する表現型としては、観察値および逆シンプソンα多様性指数、Escherichia-Shigella coliの優性（以下、ES. coli dominance: Escherichia-Shigella coliが与えられたサンプルの希薄な配列リードの少なくとも50％を構成するかどうかを記述するバイナリ変数）、Bray-CurtisおよびgUniFrac ordinationsのそれぞれの第1主座標（PCo）軸、3種のコア種Escherichia-Shigella coli, Escherichia-Shigella fergusonii, Tyzzerella spの相対配列存在度（結果：微生物相の多様性を参照）。すべての定量的表現型は、R（バージョン4.1.0）でパッケージxavamess（バージョン0.6; Robin, 2018）を用いてランク標準化された。以前のKruskal-WallisおよびPERMANOVA試験（材料および方法：細菌データ解析参照）の下で表現型と有意に関連した共変量は、交絡因子として特定され、したがって、その後の表現型解析の間に制御した。
以下のパイプラインを使用して、微生物叢とゲノム変異の関係を評価した。BayesR（バージョン2；Moserら、2015）を使用して、デフォルトの総反復（n＝50,000）およびバーンイン（n＝20,000）設定によるベイズ混合モデリング（マルコフ連鎖モンテカルロ［MCMC］順列に基づいて）によりすべての表現型について遺伝率の推定および染色体による遺伝率の分割を行った。しかし、反復回数を200,000回（n = 50,000のバーンイン）に増やしても、遺伝率がゼロでないことを示す証拠は見つかりませんでした。そこで、観察されたリッチネス表現型を下流のすべての解析から除外した。染色体分割とMCMC連鎖プロット（図S2）は、Rパッケージのggplot2とcowplotを使用してプロットされました。
次に、遺伝性の表現型がゲノム全体の近親交配に直接関係しているかどうかを調べるために、Rパッケージstats（バージョン4.1.0、R Core Team、2021）を用いてピアソン相関とスピアマン相関を用いて近親交配係数と順位標準化表現型の相関をとった。近交係数は、vcftools --het を用いて性染色体を除去した後のSNPコールセットに基づいて、デフォルト設定（バージョン0.1.15；Danecek et al.、2011）で算出した。
次に、遺伝性形質をゲノムワイド関連研究（GWAS）に供した。RepeatABEL（バージョン1.1；Rönnegårdら、2016）を用いて、カーカーポーの性別および関係行列PCAの最初の3つのPC（PCAスクリープロットは図S3参照）を制御しながらSNPと微生物関連表現型の間の関連試験を実行した。その後、RepeatABEL出力ファイルをR（バージョン4.1.0）で処理し、性染色体を除去した。マンハッタンおよび関連するQQプロット（図S4）はqqmanパッケージ（バージョン0.1.8; Turner, 2018）を用いて作成し、Manuパッケージ「kākāpō」パレットに基づき色付けした。また、細菌組成が大幅に異なる外れ値個体（n = 3）は、データセットからこれらを削除して解析を再実行することで、GWASによって検出された関連性に有意な影響を与えないことを確認した。したがって、これらの外れ値は、以降のすべての解析に保持された。さらに、GenABEL Rパッケージ（バージョン1.8-0; Aulchenko et al., 2007）を用いて、p値のゲノムインフレーションを計算した。有意差閾値αを0.001に設定し、有意なSNPのピークが存在する領域を分離することで、注目すべきゲノム領域を特定した。次に、bedtools (version 2.29.2; Quinlan & Hall, 2010)を用いてSNP-wiseとwindow-wiseのp-valueを平均化し、スライディングウィンドウ法（ウィンドウサイズ10kbp、スライドステップ1kbp；Urban et al.で最適化）でこれらの有意領域の下にある遺伝子を特定しました。
Magmaソフトウェアを用いて、デフォルト設定（バージョン1.08; de Leeuw et al., 2015）でSNPワイズGWAS結果に対して遺伝子セット解析を行い、微生物関連表現型と有意に関連する遺伝子パスウェイを同定した。鶏特有のGene Ontology (GO) パスウェイセットを使用し、ge-lab.org (Gallus_gallus_5.0) からダウンロードし、我々の知る限り、利用可能な最も完全なキュレーション済み鳥類遺伝子パスウェイデータベースである。Magmaの出力ファイルはRにエクスポートされた（ここでp値はBonferroni補正（stats version 4.0.3; R Core Team, 2021; Hochberg, 1988）を用いて多重検定用に調整された）。Bonferroni補正後の閾値α=0.05で有意だったパスウェイのみを報告する。
3 結果
バクテリアの多様性
入手可能なシーケンスデータと新規シーケンスデータから、合計26,649,116本の生の16S rRNA遺伝子アンプリコン配列リード（フォワードおよびリバース）を結合し、品質およびキメラフィルタリング後に8,648,731本の結合リードが残った（材料と方法）。非標的および低存在のASVを除去した後、データセット全体で4138個のユニークなASVが同定されました。サンプルあたり3480リードに希釈した後、3478のユニークなASVが残りました。サンプルあたりの平均ASV数は73個で、サンプルあたりのASV数は9～602個でした。全体として、98.99%のASVが既知の門に分類学的に割り当てられ、77.9%は種レベルに割り当てられました。
プロテオバクテリアが圧倒的に多く（配列リードの80％）、次いでファーミキューテス（リードの18.5％）であった。カーカポについて以前に報告したように、Escherichia-Shigella coliは最も豊富な種であり、ほとんどのカーカポの糞便サンプルの微生物相を支配し、全配列リードの70％を占めた（図2a）。Tyzzerella sp.は2番目に多い種でリードの14.5%を占め、Escherichia-Shigella fergusoniiが2.3%でそれに続きました。これらの3つの分類群は、カーカーポーの糞便サンプルの85%以上で1%以上の平均相対配列量で存在する唯一の種であったため、カーカーポーの腸のコア細菌叢と定義した（図2b）。Escherichia-Shigellaが優勢でないサンプルでは、Tyzzerella種の相対存在度が高く、一般的により多様な腸内細菌叢を示した（図2a）。kākāpō Richard Henryの糞便サンプルは異常で、Pantoea種が優勢であり、他の糞便サンプルでは有意な数（サンプルあたり2リード以上）で表現されていなかった。
図2
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すべてのサンプルにおいて、平均観察リッチネス多様性推定値73.1（SD±107）、平均逆シンプソン多様性推定値2.2（SD±4.3）が得られました。また、逆シンプソン多様性指標は島の位置とわずかに有意に関連していた（p = .03、図2d、表1）が、観察された細菌の豊かさはカーカーポーの性別と有意に関連していた（p = .01、表1）。一対比較のためのポストホックダン検定は、逆シンプソン多様性指数の島嶼間の有意差は、Te Kākahu-o-Tamatea (TK) とPukenui (PU) サンプル (p-value = .03) および TK と Whenua Hou (WH) サンプル (p-value = .02) 間の差によることを明らかにしました。
Bray-CurtisおよびgUniFrac非類似度行列で測定した細菌のβ多様性は、カーカポーの性別と有意に関連していた（p < 0.01; Table 1; Materials and Methods）。季節は、細菌群集の変動にわずかに有意な影響を及ぼしたが（p = .03、表1）、不均一なグループ分散を示し（p = .01、材料と方法）、PERMANOVAで観察された変動の多くを説明することができる。Bray-Curtis指標とgUniFrac指標の両方で、最初のPCoA序列軸に沿った細菌群集の分離は、Escherichia-Shigella coliの優位性によるところが大きかった（図2e；図S5）。サンプル採取の年や季節、年齢、補食、抗生物質投与、滲出性下腔炎がβ多様性指標に及ぼす潜在的な影響を検証し可視化することで、他の変数が細菌のβ多様性に影響を与えないことを確認した（表1；図S6）。
性別は、細菌多様性の複数の指標と有意に関連する唯一の変数であった（表1）。島の位置と季節はわずかに有意な関連を示したが（表1）、これらの関連は、島の位置の場合は、それぞれ小規模なTKグループ（n = 7）と我々の2つの最大サンプリンググループ（WH = 65、PU = 48）との違い、季節の場合は、異種グループの分散によってもたらされた。また、3つのソフトウエアにおいて、カーカーポーの性別、滲出性肛門炎、手での飼育、補食、島の位置（Whenua Hou島とPukenui島）には、ASVの量に差があり、一貫した関連性は見られませんでした（データS1の表S2参照）。特に、性別、滲出性肛門炎、手による飼育という3つの変数は、3つの方法すべてにおいてASVとの関連性を示さなかった。したがって、その後のGWAS解析には、コアでない分類群を含めなかった。GWAS解析のための微生物関連表現型としての腸内細菌叢の指標には、観察値および逆シンプソンα多様性指数、大腸菌優勢（バイナリ）、Bray-CurtisおよびgUniFrac順序のそれぞれの最初のPCo軸、および3つのコア種である大腸菌、ES. fergusoniiおよびTyzzerella spの相対配列存在量が含まれていた（方法と材料参照）。
細菌とゲノムの多様性の関連性
BayesRに実装されているベイズ階層モデルを用いると、ほとんどの微生物関連表現型は、95％信頼区間（CI）が非常に広いものの、約30％の事後モード遺伝率推定値を持つことがわかった（表2；材料および方法）。MCMCチェーンとバーンインステップの数を増やしても、観察されたリッチネスだけは遺伝性の証拠を示さなかった（点推定値0％）（資料と方法）。そこで、観察されたリッチネス表現型をすべての下流解析から除外した。さらに、本研究で対象とした表現型のうち、ゲノムワイド近親交配と有意に関連するものはなかった（表3）。
表2. BayesRで実装されたベイズ階層モデルから得られた各表現型の事後モードと中央遺伝率、およびそれぞれの95％信頼区間（CI）。
PhenotypeHeritabilityPosterior modeMedianCIES. coli dominance30.60%0.02%2e−69–0.90Inverse Simpson29.80%0.05%1e−40–0.90BrayCurtis PCoA27.04%0.001%2e−50–0. 84gUniFrac PCoA26.30%0.002%1e−83–0.86Escherichia-Shigella coli20.60%0.003%4e−66–0.82Escherichia-Shigella fergusonii33.00%0.10%7e−97–0.92Tyzzerella sp.37 .30%0.27%2e-34-0.91
注：事後密度プロットは図S7に記載されています。BrayCurtis PCoAとgUniFrac PCoAはそれぞれ第1PCo軸を表し、分類群固有の表現型は相対存在量として分析される。
TABLE 3. kākāpōゲノムワイド近親交配係数と微生物叢の表現型との関連を検証するためのピアソンおよびスピアマン相関とp値。
表現型近親交配相関Pearson係数p値Spearman係数p値E.coli優勢0.096.270.110.20Inverse Simpson-0.080.36-0.060.49BrayCurtis PCoA0. 031.730.026.08gUniFrac PCoA−0.009.92−0.028.75Escherichia-Shigella coli−0.018.83−0.004.96Escherichia-Shigella fergusonii−0.022.800.022.80Tyzzerella sp.0 .009.920.009.92
注：BrayCurtis PCoAとgUniFrac PCoAはそれぞれ第1PCo軸を表し、分類群特異的表現型は相対量として分析されている。
性別は腸内細菌叢の多様性に有意に関連する唯一の因子であったため、最初の3つのゲノムベースのPCとともに、遺伝子型-表現型解析の共変量として組み入れた。微生物に関連する表現型の遺伝はすべて多遺伝子形質であり、染色体が長いほど遺伝率が高いことがわかった（図3、4、上段）。GWASによると、4×10-8という厳しいゲノムワイド有意性閾値α（すべてのSNPでボンフェローニ多重検定補正を仮定）において、微生物関連表現型と有意に関連したSNPはなかった。しかし、すべての表現型について、0.001の厳しい公称有意性閾値αで多くの有意な関連を見出した（図3、4、下段；公称有意なSNPは赤で着色されている）。次に、p値をスライディングウィンドウ方式で集約し（図S8; 材料と方法）、空間的に集約されたシグナルを活用して、名目上有意なゲノム領域の基礎となる候補遺伝子を突き止めた（表4）。
図3
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図4
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表4. 微生物関連表現型と名目上有意に関連するゲノム領域に位置する候補遺伝子（材料と方法；名目上有意なSNPsが広がる領域と重複する遺伝子領域については図S8を参照ください）。
表現型クロモソームゲノム領域（bp）GeneES. coli dominance553,355–99,452CTNND152,103,070–2,104,021OSBP/tRNA-Lys10249,924–314,795PPIP5K1Inverse Simpson52,590,997–2,846,875CAT8605,460–796,168DYSF17617,639–622,380NTN1Bray–Curtis PCoA592, 124–94,317CTNND152,065,643–2,846,875OSBP/tRNA-Lys1512,770,170–14,889,060Many genes215,368,145–6,116,544IPO9gUniFrac PCoA1152,532,261–152,651,141BMPER2121,600,570–122,061, 239 遺伝子ヒットなし22394,437-515,150MAP3K14 & MYO1DE Scherichia-Shigella coli52,285,267-2,890,904OSBP/tRNA-Lys & CAT/acyl-CoA (8-3) -desaturase-like1514,887,992-15,275,496DNAJC5Escherichia-Shigella fergusonii211、 877,073-12,131,049STXBP5L & GTF2E1 & RABL3217,470,588-20,860,982Many genes67,407,293-8,474,671COL3A1 & COL5A2 & WDR75 & PMS1169,332,512-10,110,412Many genesTyzzerella sp. 21,692,942 –1,742,046ROBO14248,453–891,436SFB1
注：BrayCurtis PCoAとgUniFrac PcoAはそれぞれ第1PCo軸を表し、分類群特異的表現型は相対量として解析している。多くの遺伝子」は、データS1の表S3に記載されている。
我々の遺伝子セット解析は、パスウェイ間のボンフェローニ多重検定補正後に、腸内細菌関連表現型と有意に関連するいくつかのGOパスウェイを特定した。これらのパスウェイは、いくつかの代謝および細胞機能、ならびに酸素検出、ビタミンB12および成長因子活性に関連するプロセスを記述していた（表5）。
表5. 微生物叢の表現型と有意に関連するGene Ontology（GO）パスウェイ。
表現型GO参照有意な遺伝子パスウェイ調整済みp値パスウェイ大腸菌優勢GO:0016282eukaryotic_43S_preinitiation_complex.007GO:0007129Synapsis.007 逆シンプソンGO:0098559細胞質_サイド_初期_エンドソーム_膜.015GO:0097284肝細胞_アポトーシス_プロセス.016Bray-Curtis PCoAGO:0014820tonic_smooth_muscle_contraction.004GO:0014824artery_smooth_muscle_contraction.004 GO:0060584プロスタグランジンエンドペルオキシド合成活性.004GO:0003100エンドセリンによる全身動脈血圧の調節.004GO:0031705ボンベシンレセプター結合.004GO:0031708エンドセリン_B_レセプター結合.004 GO:0014826静脈平滑筋収縮.013GO:0016282一酸化窒素合成酵素生合成過程.018GO:0051767サルコメア組織化の正調節.015GO:0016282真核生物43S_前始動複合体.011 Escherichia–Shigella coliGO:0043091L-arginine_import3.2e−06GO:1902023L-arginine_transport3.2e−06GO:0043092L-amino_acid_import.002 Escherichia-Shigella fergusoniiGO:0070483detection_of_hypoxia5.6e-07GO:0043932ossification_involved_in_bone_remodeling7.1e-06GO:0003032detection_of_oxygen1. 5e-05GO:0009235コバラミン代謝過程2.2e-05GO:0034714タイプ_III_トランスフォーミング_成長因子_β_受容体結合1.8e-04GO:0061133エンドペプチダーゼ_活性化因子_活動.003 Tyzzerella属GO:0033290真核生物_48S_前始動_複合体.003GO:0070993翻訳_前始動_複合体.003GO:0004924オンコスタチンM媒介_シグナリング_パスウェイ.026 GO:0048861白血病抑制因子シグナル伝達経路.026GO:0004923白血病抑制因子受容体活性.026GO:0004897毛様体神経栄養因子受容体活性.026GO:0038165オンコスタチンM-受容体活性.026
注：P値は、テストパスウェイ間のボンフェローニ多重検定補正を用いて調整したものです。BrayCurtis PCoAとgUniFrac PcoAはそれぞれ第1PCo軸を表し、分類群特異的表現型は相対量として分析されている。
4 結論
カーカポーの腸内細菌叢に関する我々の研究は、我々の知る限り、事実上全種類の細菌多様性を記述し、さらに絶滅の危機に瀕している集団における微生物叢と宿主ゲノム多様性の関係を評価する初めての試みである。私たちは、種全体の細菌多様性の真の範囲と個体間の一貫性を理解するために、できるだけ多くの現存するカーカポーの微生物叢カタログを作成しました。実際、全個体についてカタログを作成したところ、一部の個体でユニークで著しく異質な微生物相が確認されました。我々はこれらのデータを用いて、広範な環境データと個体固有の特徴を考慮しながら、微生物叢とゲノム全体の多様性との種的な関係を研究した。遺伝的構造解析と関連解析により、カーカーポーの微生物叢の多様性は高度に多因子的な形質であることが確認されましたが、関連するヒトの研究（例えば、石田ら、2020年）から予想されるように、サンプリングアプローチにより、単一種でこの複雑な関係の全体を把握したことを確認することができました。
生存している全カーカポーの84%の微生物相をサンプリングし、さらに死亡した鳥のデータも含めることで、腸内細菌の多様性の全体像を描くことができたのです。2年間のサンプリング期間中に現存する全カーカポーの糞便サンプルを入手するために最大限の努力をしたが、22羽のカーカポーの糞便サンプルを入手することはできなかった。すべてのカーカーポーは、人為的な影響を最小限に抑えて野生で生活しています。また、糞便サンプリングは日常的なモニタリングの一環として行われていたため、サンプリング回数を増やすことはできませんでした。しかし、世界的なセンサス人口が248人（2023年2月現在）という絶滅危惧種であるため、他の定量的ゲノム解析（Hong & Park, 2012など）と比較すると、本研究のサンプルサイズは依然として小さい。そのため、ゲノムワイドに有意なゲノム領域がなかったのは、本研究の検出力が低下したためと考えられる。しかし、厳しい公称有意閾値で、ゲノム背景とは一線を画すゲノム領域を特定することができた。さらに、これらの領域には、他の生物種で腸の恒常性維持や関連経路に関与しているとされる遺伝子が含まれていた。ヒトの微生物叢に関する大規模な宿主ゲノム研究が、細菌多様性の多遺伝子性に関して同様の結果を示していることから（石田ら、2020）、種全体の細菌多様性と宿主ゲノムとの関係に関するこの研究が、絶滅危惧種における微生物叢の役割について新しい洞察をもたらすと確信しています。
カーカーポーの腸内細菌叢
我々は、カーカポーの腸内細菌叢におけるEscherichia-Shigella属の優勢に関する以前の知見（Waite et al.、2018）を裏付け、Escherichia-Shigella coliが最も優勢な種として確認された。Escherichia-Shigella fergusoniiを含むEscherichia-Shigella属の追加種も、データセット全体を通じて優勢で豊富であった。このように、草食動物の腸内で1つの細菌属が優勢であることは、生物学的な特異性であることが確認されました。さらに、分類されていないTyzzerella種とStreptococcus gallolyticusをカーカーポーの腸内細菌叢の顕著なメンバーとして特定したが、これらはいずれも鳥類の消化管や他の草食性種のルーメンに頻繁に生息している（Curtisら、2018；Hussoら、2020；Liu、Zhu、ら、2020；Pasquereau-Kotulaら、2018；Yanら、2019）。一般に、Escherichia-Shigella coliの優位性が低下するにつれてTyzzerella sp.の相対存在量が増加することが観察されたが（図2）、これは一部、我々の希薄なデータの組成的性質を反映している可能性がある（Glor et al., 2017; McMurdie & Holmes, 2014; Weiss et al., 2017）。クロストリジア（タイゼレラ菌が属するクラス）のいくつかの種は、ヒトや他の哺乳類の腸内で正の常在菌と考えられているが（Guo et al., 2020）、これが鳥類に当てはまるかどうかはまだわかっていない。さらに、リチャード・ヘンリーは、複数のPantoea種に支配された腸内細菌叢を持つ唯一のkākāpō個体であることを確認しました。リチャード・ヘンリーは、アオテアロアニュージーランド本土から最後に生存したカーカポであり、他のすべてのカーカポは沖合の島（ラキウラ／スチュワート島）のみを起源としていることから、このパターンは腸内細菌組成の歴史的地理的変異を反映していると考えられ、将来の再導入に重要な影響を与える可能性がある。また、我々はリチャード・ヘンリーの子孫の微生物相も評価したため、リチャード・ヘンリーの独特なゲノム背景が彼の独特な微生物相の原因であることを否定することができる。
カーカーポーの腸内細菌叢に関するこれまでの研究とは対照的に、本研究では、カーカーポーの性別が細菌のαおよびβ多様性と有意に関連していることを発見しました。この関連性は、他の鳥類種でこれまでに報告されています（Borda-Molina et al.）この新しい発見は、これまでの分析に比べてサンプルサイズが大幅に増加したことを表していると考えられ、可能な限りサンプリング作業を増やすことの利点を強調している。しかし、性別と腸内細菌叢の関係は、食事や生息地などの他の影響力のある要因が存在する場合、解釈が難しいことが多い（Eldermanら、2018年；Kimら、2020年）。年齢、補食、抗生物質投与などの変数を含め、他のすべての環境要因および個々のカーカーポーの特性は、腸内細菌叢との有意な関連を示さなかった。島の居住地とサンプル採取の季節は、細菌多様性とわずかながら有意な関連を示したが、これらのシグナルはそれぞれ、サンプルサイズと異質な集団の分散に大きな相違があるためとした。また、成人のカーカーポーの最も一般的な疾患である滲出性肛門炎（肛門と下部生殖管の炎症を引き起こす）は、腸内細菌叢の多様性と関連しているという証拠は見つかりませんでした。この病気の原因菌はまだ不明であるため、この結果は細菌性病原体ではなく、ウイルスや真菌の存在を示唆している可能性があり、メタゲノムやメタトランスクリプトームアプローチの適用が必要となる。しかし、kākāpōの個体はサンプリング時に必ずしも肛門炎の炎症に苦しんでいなかったので、この無効な結果の別の説明は、病気の発生に関する腸内細菌叢の時間的変動を反映している可能性が考えられる。
細菌とゲノムの多様性の関連性
我々は、カーカーポーのゲノム変異と腸内細菌叢との関連性を示す証拠を報告する。ベイズ混合モデリングを用いて、α多様性、β多様性、分類群特異的存在量など、腸内細菌の多様性を表すほぼすべての形質について、ゼロではない遺伝率の証拠を見つけ、これらの形質の基礎となる複雑な多遺伝子アーキテクチャを説明した（図3および図4）。以前に説明した、宿主のゲノム多様性とその微生物叢の間の複雑な関係を考えると、カーカーポーの腸内細菌関連表現型の多遺伝子性は予想通りの結果でした（Awany et al., 2019; Goodrich et al.）この多遺伝子アーキテクチャにより、カーカーポーの腸内細菌叢の遺伝的基盤を完全に理解することはできませんが、ニワトリ特有の遺伝子経路に基づくGWASおよび遺伝子セット濃縮解析を用いて、関連遺伝子および経路を特定し、細菌の多様性とその関係を評価しました。
その結果、カーカーポーの腸内細菌叢と宿主の腸管粘膜上皮のホメオスタシスとの間に、示唆的な関係があることがわかった。一酸化窒素合成、L-アルギニン輸送、トランスフォーミング成長因子β（TGF-ǽ）受容体結合、プロスタグランジンエンドオキシド合成酵素などのGO経路が、腸内細菌の多様性を表す様々な形質と有意に関連していた（表5）。これらの遺伝子経路は、多くの生理系で作用する一方で、消化管では重要な役割を担っている。L-アルギニンは、粘膜上皮防御（Cinelli et al., 2020; Kubes & Wallace, 1995; Lundberg et al., 2008; Rosselli et al., 1998）および常在腸内細菌叢恒常性（Inserra et al., 2019）に必須の成分、一酸化窒素（Coleman, 2001; Moncada & Higgs, 1995）の合成に必要です。強力な血管拡張剤およびシグナル伝達分子として、一酸化窒素はまた、傷害または刺激部位への血流を増加させ、粘液産生を増加させ、粘膜の刺激物および微生物に対する免疫応答を調節することによって、粘膜を保護し、創傷治癒を刺激する（Björne et al., 2004; Jädert et al., 2012; Kubes & Wallace, 1995; Wink et al., 2011）。これに対応して、エンドセリンB受容体活性を介した平滑筋収縮、血圧調節、肺血管収縮に関連する微生物関連表現型と有意に関連する遺伝子経路を特定した（Kowalczyk et al., 2015; Ladenheim, 2013; Nguyen & Gerstein, 2019）（表5）。TGF-ǖは腸管上皮の恒常性に重要な役割を果たすサイトカイン/成長因子であり（Lichtman et al., 2016）、プロスタグランジンエンドオキシド合成酵素経路は胃や腸の粘膜の完全性を維持する（Peskar, 2001）。腸内細菌叢と腸粘膜上皮の恒常性の間のこの関係は、さらに、CTNND1、COL3A1、COL5A2、PPIP5K1など、細菌多様性と最も有意に関連するものの中にあり、他の機能の中で、腸の恒常性に重要な役割を果たすことが知られている個々の遺伝子によって裏付けられる（表4；図 S8）。CTNND1は、アドヘレンスジャンクションの中核成分として上皮の恒常性に寄与し（Daulagala et al., 2019; Smalley-Freed et al., 2010）、COL3A1およびCOL5A2は、腸管上皮の創傷治癒に機能を有する（Kuivaniemi & Tromp, 2019）。PPIP5K1キナーゼは、胃平滑筋腫粘膜下腫瘍の形成に関与しています（Gu et al.、2017）。粘膜上皮の慢性炎症はまた、以前に、ヒトにおけるEnterobacteriaceaeおよびVerrucomicrobiaceae細菌の過剰発現と関連しており（Ahmed et al., 2018）、その両方がkākāpō腸内細菌叢で観察されている（データS3）。
さらに、腸内細菌の多様性と宿主の炎症および免疫応答との間の相互作用の示唆的な証拠を発見した。TGF-ǽ、オンコスタチンM、白血病抑制因子（表5）は、腸を含む複数の宿主臓器の炎症反応に重要な役割を果たすサイトカインである。TGF-ǖは腸の炎症を調節し、T細胞活性および分化の重要な調節因子である（Hou et al., 2018; Li & Flavell, 2008; Wahl et al., 2004）。オンコスタチンMは、慢性潰瘍性大腸炎および炎症性腸疾患を有するヒトの炎症上皮で発現が上昇し（Li et al., 2020）、白血病抑制因子は腸上皮細胞の増殖を促進し、炎症大腸組織で発現が上昇する（Guimbaud et al., 1998; Nicola & Babon, 2015）。さらに、一酸化窒素（表5）は、粘膜の微生物に対する免疫反応を調節し（Björne et al., 2004; Jädert et al., 2012; Kubes & Wallace, 1995; Wink et al., 2011）、例えば、T細胞活性の仲介（García-Ortiz & Serrador, 2018）および活性酸素種の抑制（Coleman, 2001）などを通じて免疫反応の重要部分を構成しています。活性酸素種は腸内膜の炎症時に過剰に生成され（Kowalczyk et al., 2015）、我々の上位候補遺伝子の一つであるCAT遺伝子が直接コードする必須抗酸化酵素によって制御されることも知られている（表4；図 S8）。
最後に、カーカーポーの腸内細菌叢と宿主の代謝との関連性を示すいくつかの証拠を発見しました。例えば、OSBP遺伝子（表4、図S8）は、コレステロールの恒常性に関与することが知られており（Kentala et al., 2016; Mesmin et al., 2013）、腸内細菌叢によるコレステロールの恒常性の間接的な制御を示す証拠が積み上げられています（Le Roy et al., 2019）。コバラミン（ビタミンB12）代謝経路は、Escherichia-Shigella fergusoniiの存在量とさらに有意に関連していた（表5）；ビタミンB12欠乏は、欠乏がShigellaなどの分類群の増殖を可能にしたマウスで示されたように、腸内細菌叢の構成を大幅に変えることができる（Lurz et al., 2020）。
5 結論
本研究は、事実上現存する種全体の細菌多様性を評価し、絶滅の危機に瀕している種のゲノムとその腸内細菌叢との関連性を示す最初の証拠を提示した。カーカーポーの腸内細菌叢とその宿主ゲノムとの関係の理解が深まれば、カーカーポーの健康や病気の軽減における腸内細菌叢の役割について新たな知見が得られ、カーカーポーの管理や保全に直接役立つと考えられる。我々は、腸内細菌叢と、腸の恒常性、炎症、免疫反応、代謝に関連する機能的経路との間に推定される関連性を特定することができた。私たちは、微生物とゲノムの多様性の間に観察された関係に対する病気や補助的な餌などの要因の特定の効果を解明するために、今後の研究を提案します。腸内細菌叢と免疫、炎症、疾患感受性に関連する宿主機能との複雑な関連性を完全に理解するために、ウイルス、古細菌、真核生物の多様性を網羅する詳細な機能メタオミックアプローチを適用し、細菌のみに焦点を当てた現在の解析と比較することを目指しています。全体として、我々は、人間、動物、環境の福祉に影響を与えるワンヘルスの概念をどのように達成できるかをよりよく理解するために、保全研究と管理におけるマイクロバイオーム研究の統合を提案します。
著者貢献
AW、AD、MT、LUは本研究の構想を練った。AWとADはサンプルを整理した。Kākāpō Recovery Programmeの全員、特にDaryl Eason、Lydia Uddstrom、Deidre Vercoe、Jodie Cranがサンプル採取を手伝ってくれた。AWはすべての実験作業を行った。AWとLUは、ASとMTの重要な助言を得て、すべての計算機解析を行った。JG、PD、LUはゲノムデータセットを作成した。AW、MT、LUは、すべての共著者の意見を取り入れながら原稿を執筆した。
謝辞
著者らは、現在進行中のマイクロバイオーム研究に継続的な支援、援助、関心を寄せてくれたKākāpō Recovery Teamと、ゲノミクス領域での共同研究の枠組みを提供してくれたGenomics Aotearoaに感謝したい。また、Kākāpō125+コンソーシアムとNgāi Tahuからkākāpōゲノムデータセットへのアクセスを提供していただいたことに感謝するとともに、kākāpōゲノムデータセットの生成に際して以下の関係者のご貢献に感謝します：ニュージーランド自然保護局、Te Rūnanga o Ngāi Tahu、The Genetic Rescue Foundation、Genomics Aotearoa、The University of Otago, New Zealand、New Zealand Genomics Ltd、Duke University, USA、Science Exchange, Experiment.com. また、本研究の一環として、New Zealand eScience Infrastructure (NeSI)のハイパフォーマンスコンピューティング施設、コンサルティングサポート、トレーニングサービスを利用させていただいたことに感謝いたします。アオテアロアニュージーランドの国立施設はNeSIによって提供され、NeSIの共同研究機関およびビジネス・イノベーション・雇用省の研究インフラプログラム（https://www.nesi.org.nz）を通じて共同で資金提供されています。また、Neil Gemmell教授とオタゴ大学解剖学教室の継続的な支援に感謝したい。オープンアクセス出版は、オーストラリア大学図書館協議会（Council of Australian University Librarians）を通じたWiley - The University of Auckland協定の一環として、オークランド大学によって促進されています。
資金提供情報
AWは、オークランド大学生物科学部（Waipapa Taumata Rau）、ニュージーランド自然保護局（Te Papa Atawhai）、Graduate Women New Zealand、トッド財団、Kate Edger Educational Charitable Trustから支援を受けた。LUは、Alexander von Humboldt Foundation、Revive & Restore Wild Genomesの助成を受け、オタゴ大学解剖学教室の支援を受けた。
利益相反声明
著者らは、競合する利害関係がないことを宣言する。
倫理声明
この研究のために収集されたサンプルは、ニュージーランド自然保護局（Te Papa Atawhai）の承認を得ており、ニュージーランド動物福祉法に基づく同局の動物倫理委員会による倫理承認は必要ない。
ベネフィットシェアリングステートメント
カーカポ回復プログラムは、自然保護省カーカポ回復チームがンガイ・タフと協力して行う、研究に基づいた集中的な管理チームである。ンガイタフは、アオテアロアニュージーランドの南の島々、テ・ワイポウナムの先住民族マオリ族で、南島の80％以上を占めるランガティラタンガ（部族権限）を持っています。ンガイタフは、カーカポと文化的、精神的、伝統的に強い結びつきがあり、カーカポの保護、管理、保全に関する政策決定を行う際には、ンガイタフの意見を聞くことになっています。また、ンガイ・タフの和解協定により、ンガイ・タフはカーカポーの回復プログラムの代表を務めています。
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