人工飼育にとって心強いニュース： サンショウウオ幼生の移動が皮膚微生物叢に与える影響は限定的である

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ワイリーオンラインライブラリー
分子生態学32巻12号3276-3289頁
原著論文
オープンアクセス
人工飼育にとって心強いニュース： サンショウウオ幼生の移動が皮膚微生物叢に与える影響は限定的である

https://onlinelibrary.wiley.com/doi/full/10.1111/mec.16914

レア・フィエスキ＝メリック、ポーリーヌ・ヴァン・ルーウェン、マチュー・ドゥノエル、ダヴィッド・レスバレス
初出：2023年3月5日
https://doi.org/10.1111/mec.16914
Mathieu DenoëlとDavid Lesbarrèresが分担執筆。
ハンドリング・エディター ニック・ファウンテン・ジョーンズ
本誌について
セクション

要旨
両生類の新興病原体に対する抵抗力において、共生皮膚細菌群集が重要な役割を果たすことはよく知られてい るが、その異常繁殖につながる要因は十分に理解されていない。特に、個体群の移動が宿主の皮膚微生物叢の組成や多様性に及ぼす潜在的な影響についてはあまり注目されてきませんでした。このような急激な環境変化に伴う微生物叢の再編成の可能性を明らかにするため、3つの湖をまたぐキイロサンショウウオ幼生の相互移動をシミュレートするコモンガーデン実験を行った。移動前と移動15日後に採取した皮膚微生物叢サンプルの塩基配列を決定した。分離された抗真菌剤のデータベースを用いて、両生類減少の主な原因であるBatrachochytrium dendrobatidis病原体に対する機能が知られている共生細菌を同定した。その結果、15日間のモニタリング期間中、対照個体と移動個体の両方で皮膚微生物叢の組成や多様性、構造が大きく変化し、個体発生を通じて細菌群集が重要な再編成を行っていることがわかった。予期せぬことに、微生物叢の多様性と群集構造は、転移してきた個体には大きな影響を受けなかった。このことは、少なくとも今回調査した期間を通して、環境変化に対する皮膚細菌群集の強い回復力を示唆している。転移してきた幼虫の微生物叢では、いくつかの系統型がより豊富であったが、病原体を抑制する共生細菌に違いは見られなかった。これらの結果を総合すると、両生類の移 動はこの絶滅危惧種の動物にとって有望な戦略であり、皮膚微生物叢への影響は限定的であるこ とが裏付けられた。

1 はじめに
両生類は現在地球上で最も絶滅が危惧されている動物で、現存する種の3分の1以上が絶滅の脅威にさら されています（Stuart et al.） そのほかにも多くの脅威がありますが、グローバル化や動物取引、気候変動によって新興の病気が 急速に広がっていることは非常に大きな問題です（Cardiel et al.、2008；Wake & Vredenburg、2008）。例えば、致命的な「ツボカビ症」は世界中で両生類の大量死 を引き起こし、過去50年間で90種の絶滅が推定されるなど、500種以上の両生類が減少しています（Scheele et al.） この病気は2つの真菌、Batrachochytrium dendrobatidis（Bd）とBatrachochytrium salamandrivorans（Bsal）によって引き起こされ、両生類の皮膚を破壊し、その本質的な恒常性機能を損ない、重感染個体の死につながります（Fisher & Garner, 2020; Longcore et al.） 興味深いことに、どちらの病原体も宿主の免疫反応を抑制することができ（Fites et al., 2013; Rollins-Smith & Le Sage, 2021）、一部の両生類で観察される抵抗性は皮膚に存在する細菌共生体に由来することが示唆されています（Rebollar et al.）

常在微生物が宿主の健康や感染症に対する抵抗性に果たす役割はますます認識されるようになっている（Libertucci & Young, 2019; Stecher & Hardt, 2008）。その中で、両生類の病原性真菌の増殖を阻害する代謝産物を産生する細菌が数種同定されています（Bruckerら、2008；Lauerら、2008；Woodhamsら、2018）。しかし、これらの共生生物はすべての両生類に存在するわけではありません。「皮膚微生物叢」と呼ばれる両生類 の皮膚細菌群集の組成や多様性は、種や個体、さらにはライフステージによっても異なります（Jiménez & Sommer, 2017; Kueneman et al.） その結果、同じ種の集団間の微生物叢構造のわずかな違いが、疾患の転帰の違いに関連する可能性がある（Bates et al.） 細菌の16S rRNA遺伝子などのマーカー遺伝子のハイスループットシークエンシングが普及したことで、近年、両生類の微生物叢とその自然な可塑性の広範な特徴付けが可能になりました（Shendure & Ji, 2008）。実際、両生類の皮膚微生物叢は動的で、外在的な要因や環境に存在する細菌の影響を受けています（Harrison et al.） しかし、生息地の変化や汚染などの強い環境変化は、微生物叢の崩壊につながる可能性がある。これらの変化は「ディスバイオシス」と呼ばれ、日和見病原体による感染を促進する可能性があるため、宿主に悪影響を及ぼす可能性がある（Croswell et al., 2009; Jiménez & Sommer, 2017）。

両生類の世界的な急速な減少を考慮すると、両生類を保全するための最も推奨される戦略の1つは個体群の移 動で、国際自然保護連合（IUCN）では「保全上の利益を第一の目的とした、ある場所から別の場所への人為的な生 物の移動」と定義しています（IUCN/SSC, 2013）。移動の取り組みのほとんどは、絶滅のおそれのある生息地から個体を移動させること（「緩和移動」）、およ び／または個体群が消滅したり減少したりしている場所に個体群を再導入すること（「個体群回復」； Linhoff et al.） 両生類の保全によく使われるにもかかわらず、移入の成功率は限定的で、放流後数年間に繁殖が確認 されたのはわずか20％でした（Scheele et al.） 移入の失敗の多くはツボカビ症が原因であるとされています（Scheele et al. そのため、移 動に伴う両生類の皮膚微生物叢の再編成のダイナミクスを明らかにすることは、この保全方法の成 功を高めるために不可欠であると考えられます。

多様な分類群における最近のいくつかの研究から、移動に伴う腸内細菌叢や皮膚微生物叢の重要な可塑性が示されている。細菌群集は、移 動先の環境にいた個体と類似した微生物相へと急速に組成を変化させながら、時には数ヶ月にわたって区別可能な状 態を維持する（Uren Webster et al.） 両生類では、転座が細菌群集の構造の変化を引き起こす可能性を示唆する証拠は乏しい（Bletz et al., 2016; Kueneman et al., 2022; Nolan, 2020）；しかし、菌類を抑制する系統型への影響はまだ調査されていない。

ここでは、両生類の皮膚微生物相に対するこの保全手法の影響を調べるため、原位置でのコモンガーデン実験計画を用い てキイロサンショウウオ（Ambystoma maculatum, Shaw, 1802）の幼生を移動させました。実際、両生類の保全移動は、飼育コストやインフラコストを削減するために若いライフステージを用いて行われるこ とが多い（Linhoff et al.） 特に、Bdを抑制することが知られているすべての細菌配列をまとめたAntifungal Isolates Database（Bdを抑制することが知られているすべての細菌配列をまとめたデータベース；Woodhams et al. 実際、A. maculatumの幼虫はおそらくBdに抵抗性であるが、この病原体に対する抵抗性が皮膚分泌物から生じるのか、共生皮膚細菌から生じるのかは不明である（Crawshaw et al. 感染状況は細菌群集構造に影響することが知られているため、両生類の主要な病原体（ラナウイ ルスやサイトロイド）の存在についてもサンプルをスクリーニングしました。BdとBsalにはおそらく耐性があるが、A. maculatumの幼虫はこれらの菌のリザーバーとして働く可能性があり（Crawshaw他、2022；Martel他、2014）、ラナウイルスは他のAmbystomaで致死的であることから、キイロサン ショウウオもこれらの病原体に感染しやすい可能性がある（Brunner他、2011；Picco他、2007；Rojas他、2005）。

我々は、移動した個体の微生物叢は移動先の湖で対照個体の微生物叢に急速に収束するという仮説を立てた。過去の記録（Brunner et al., 2021; Crawshaw et al., 2022）に基づき、対象湖での病原菌の有病率は低いと予想した。その結果、保護細菌に対する淘汰圧が弱くなり、サンプリングした個体群ではBd阻害性の系統型の割合が低くなると予測した。微生物群の再編成が宿主のフィットネスに及ぼす可能性のある影響と、保全戦略としての集団移転の成功について考察する。

2 材料と方法
2.1 実験デザイン
カナダ、アルゴンキン州立公園にある3つの湖の間で相互移植が行われた： バット・レイク（BL、北緯45°35′10″、西経78°31′07″、標高400m）、ロスト・レイ・レイク（LL、北緯45°35′25″、西経78°32′13″、標高416m）、スペックルド・トラウト・レイク（SP、北緯45°31′59″、西経78°25′28″、標高420m）である。これらの地点は、地点間の制御不能な気候変動を抑えるため、半径6km以内に選ばれた。ミノウトラップの内側に広げたナイロン袋を縫い付けた特注のメソコスム（60×20cm）を合計63個、3つの湖に均等に配置した。各メソコズムは、ナイロン袋の体積の3分の2が水没するように岸辺の杭に取り付けられ、各袋の底には湖から採取した一握りの基質が加えられた。ナイロンの網目（直径2mm）はクラドセランやカイアシ類の通過を可能にし、サンショウウオの幼生の餌となった（Freda, 1983；図1a）。

詳細は画像に続くキャプションを参照。
図1
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パワーポイント
キャプション
2019年7月28日（D0）に、3つの湖（n = 63）のそれぞれで、発育段階45（すなわち、幼生の頭部の両側に棒状の「バランサー」がまだ存在し、前肢につき3本の明瞭な指がある；Harrison, 1969）の斑入りサンショウウオ幼生21匹を、岸に沿って浸漬網で捕獲した。幼虫の3分の1はコントロールとして元の湖に残し、残りは他の2つの湖に均等に移した（図1b）。15日後（D15）、生き残った幼虫をすべて再度綿棒で拭き取り、元の湖に戻して放した（n = 48）。実験期間中に変態に達した幼虫はいなかった。

すべての器具は、使用後にVirkon®S（デュポン社製）の3％溶液で消毒した。本実験プロトコルは、オンタリオ州天然資源省（ライセンス番号1093589）およびローレンシャン大学動物飼育委員会（プロトコル番号2019-02-01）の承認を得て実施した。

2.2 サンプル収集
データ収集は非侵襲的な皮膚スワビングで構成された。各幼虫を新しい手袋で保持し、滅菌綿棒（MW100レーヨンチップドライ綿棒、MWE）で脇腹の両側を前後に5回ずつ優しくこすった（n = 63 + 48 = 合計111サンプル）。水中で綿棒を20回かき混ぜて、1湖につき3つの環境対照サンプルを採取した（n = 合計9サンプル）。すべてのスワブは、フィールドでのサンプリング中は氷上で、アルゴンキン野生生物研究ステー ションに到着した時点では-25℃で、研究ラボに運ばれた後は-80℃で、さらに処理するま で乾燥保存した。

2.3 DNA抽出
DNA は DNeasy PowerSoil Pro キット（Qiagen）を使用し、製造元の指示に従い、非テンプレート・コントロー ル（NTC）を含めて綿棒から抽出した。各 DNA 抽出物の濃度と純度は、Synergy H1 分光光度計（BioTek）を用いた A260 吸光度アッセイで測定した。

2.4 病原体のスクリーニング
各スワブから抽出したDNAの一部を用いて、ラナウイルスとツボカビの存在を検査した。ラナウイルスは主に組織サンプルから同定されますが、綿棒の使用も両生類でラナウ イルスを検出するための信頼できる非侵襲的サンプリング方法です（Fordら、2022；Grayら、2012；Standishら、 2018）。病原体負荷量が大きく異なる場合の試薬の競合を避けるため（Thomas et al., 2018）、ラナウイルスのMCP遺伝子（Leung et al., 2017）、BdのITS1 rRNA遺伝子（Kriger et al., 2006）、Bsalの5.8S rRNA遺伝子（Blooi et al., 2013）を検出するプロトコールに従って、各病原体のシンプレクスアッセイを実施した。ツボカビの有病率は低いと予想されたため、サンプルはBd検出用とBsal検出用に5つずつプールした（Sabino-Pinto et al.）

すべての反応は96ウェルプレートで行い、5つの濃度（1、10、103、105、1010ゲノム当量/マイクロリットル）のNTCと標準物質を3倍量用いた。陽性対照は、Standishら（2018）のデザインに従い、gBlock（IDT）として注文した。サンプルは二重に試験し、ランダムに異なるプレートに割り当てた-二重の結果が一致しない場合、3回目の反応を行い、そこから結論を出した。

2.5 微生物の配列決定とバイオインフォマティクス
ライブラリー調製（プライマー515Fおよび806Rを使用）および16S rRNA遺伝子の超可変V4領域（～254 bp）のコミュニティアンプリコンシーケンスは、Metagenom Bio社によりMiSeqシステム（Illumina）で30,000リードの深さで実施された。dada2バージョン1.8 (Callahan et al., 2016)を使用し、qiime 2バージョン2019.7 (Caporaso et al., 2010)で管理して、多重化解除した配列を処理した。フォワードリードとリバースリードは、品質が低下する（それぞれ225bpと175bp）で切り捨てられ、キメラアンプリコン配列バリアント（ASV）は、より豊富な親ASVに対する再構成によって除去された。分類は、SILVAバージョン134に対して学習させたqiime 2に実装されたナイーブベイズ分類器を用いて、99%の同一性でクラスタリングされた代表的な配列に割り当てられた(Pruesse et al., 2007)。信頼性閾値0.7以上で分類された。Bdに対する阻害活性（Bd-inhibitoryと呼ぶ）が知られている共生菌の系統型を同定するために、代表的な配列をqiime 2のAntifungal Isolates Database (Woodhams et al., 2015)にアライメントした。

配列の前処理はRパッケージphyloseq (McMurdie & Holmes, 2013)を用いて行った。細菌配列のみを残し、NTCから同定された汚染ASVはRパッケージdecontam (Davis et al., 2018)を用いて除去した。サンプル間で不均一なカバレッジ深度（異なるライブラリーサイズ）に対処するため、データセットを低存在データセット（サンプルあたり20,000リード未満）に分割し、サンプルは正規化されなかったが、200未満のASVを含む場合は削除され、高存在データセット（サンプルあたり20,000リード以上）は、置換なしの希釈化（Cameron et al.） 全リードの0.001%未満を占める偽のASVはデータから除外した(Bokulich et al., 2013)。11のサンショウウオサンプルが希釈化処理で削除され、最終データセットは合計100のサンショウウオサンプルの7942のASVと、合計9の水サンプルの1643のASVで構成された。

2.6 統計分析
統計分析は R 環境バージョン 4.1.0（R Core Team, 2022）で行った。以下の検定はすべて、細菌群集全体とBd阻害性系統型のみに限定したサブセットの両方で実施した。すべてのモデルにおける共変量に関連する推定値は、.05の閾値以下のp値に関連する場合に有意とみなされた。

アルファ多様性（標本内の多様性）は、Chao1（推定ASV豊かさ）とShannon（推定群集多様性）指数を用いて定量化し、線形モデルを用いて調査した。簡単に説明すると、幼虫の場所と体長を固定効果として含むモデルを用いて、これらの要因が移入前（D0）に採取した微生物相サンプルのα多様性に影響を与えるかどうかを調べた。このモデルでは、体長（平均±SE＝41.58±1.19mm）は微生物叢のα多様性に影響を及ぼさないことが示されたため、パーシモン（parsimony）の目的のために、この変数は以降のモデルから除外された。個体発生と環境変化のどちらが皮膚微生物叢の構造に強い影響を与えるかを調べるため、α多様性指標を応答変数として、サンプリング時期（D0、D15）と転座状況（転座した、転座してない）を二項固定効果として、最初の場所（D0）と幼虫のアイデンティティをランダム効果として含む混合モデルに用いた。最後に、宿主の移動に対する微生物叢の回復力を調べるため、実験終了時（D15）に測定したα多様性指標を、同一個体の初期α多様性指標（D0）と移動状況を固定効果として、初期場所（D0）をランダム効果として含む混合モデルの応答変数として用いた。これらのモデルにおける各共変量の効果に関連する推定値をANOVAを用いて検定した。モデルの残差がANOVAに関連する正規性とホモ分散性の仮定を満たさない場合は、対数変換またはノンパラメトリック検定（Kruskal-Wallis[KW]およびWilcoxon-rank検定、必要に応じてDunn post hoc検定）をボンフェローニ補正とともに用いて、対応する共変量の効果を個別に調査した。

β多様性は重み付けUnifrac距離（Lozupone et al., 2011）として計算し、Rパッケージvegan（Oksanen et al., 2017）を用いて構築した主座標分析（PCoA）を用いて可視化した。アルファ多様性と同様のモデルを検定するために、adonis関数（n = 9999の並べ替え）を用いて実装した並べ替え多変量分散分析（PERMANOVA）を用いた。これにより、細菌群集の類似性に対する場所の影響を初期サンプル（D0）間で検定し、初期場所（D0）をブロックとして含むモデルで、すべての微生物相サンプルの群集構造に対する時間と転座状況の影響を検定し、転座状況を固定効果とし初期場所をブロックとして含むモデルで、転座に対する微生物相の回復力を最終サンプル（D15）間で調べた。適切な場合には、PERMANOVAに含まれる共変量の水準間の一対差を、一対アドニス検定を用いて検定した。グループ内変動の差はbetadisper検定を用いて調査した。初期標本（D0）と対照標本（D15）間、および移入幼虫と対照幼虫（D15）間で存在量が異なる特徴は、未精製データに対してdeseq2を用いて同定した（Love 2014）。集団間の共有ASVは、Rパッケージggvenndiagram（Gaoら、2021）で作成したベン図を用いて可視化した。その他のグラフ表示は、Rパッケージggplot2（Wickham, 2016）とggpubr（Kassambara, 2019）を用いてプロットした。

最後に、幼虫の死亡率の潜在的要因を調査した。生存率を二値応答とし、体長、初期アルファ多様性、および初期（D0）と最終（D15）の場所の相互作用を共変量としてロジスティック回帰（一般化線形モデル［GLM］）を実施した。最終的に死亡した幼虫の微生物相と実験終了時（D15）に生存していた個体の微生物相との間の群集構造（D0）における潜在的な初期差異を調べるために、一対アドニス検定を用いた。これらの後者の2つのグループ間で存在量の異なる特徴を、サンショウウオ幼生の3つの集団それぞれについて別々に、未精製のデータに対してdeseq2を用いて同定した。NCBIデータベース(www.ncbi.nlm.nih.gov)に対してblast検索を行い、これらの存在量の異なる特徴についてより詳細な情報を得た。

3 結果
3.1 オオサンショウウオ幼生の皮膚微生物叢における空間的変動の自然範囲
3つの湖とそのサンショウウオ幼生の集団はそれぞれ、初期（D0）には異なる微生物叢を保有していた。水サンプル中のASVの総数は湖によって異なり、LLの微生物叢のASV総数はBLの3倍であった（付録S1-S10A）。系統型の総数もオオサンショウウオ幼生の個体群間で差があったが、BL産の個体では他の湖よりも総ASV数が多く、Bd阻害性ASV数が多かった（付録S2）。水サンプルはプロテオバクテリア（Proteobacteria）、アクチノバクテリア（Actinobacteria）、アシドバクテリア（Acidobacteria）で占められていた（Appendix S1-S10B）。同様に、すべての幼虫の皮膚微生物相はプロテオバクテリア属（89.5％）で占められていたが、2番目に多い門は個体群によって異なり、BL産の幼虫ではバクテロイデーテス属（5.8％）、LL産の幼虫ではファーミキューテス属（3.5％）、SP産の幼虫では疣贅菌属（13.5％）であった（図2）。さらに、Bdに対する阻害活性が知られている系統型の相対存在量は、BL（12.5%）やLL（10.8%）よりもSP（18%）の幼虫の微生物叢の方が高かった。実験開始時の幼虫の微生物叢では、プロテオバクテリア（Proteobacteria）とバクテロイデーテス（Bacteroidetes）を合わせると、Bd阻害活性を持つ系統型の99.5%以上を占めていた（図3）。

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図2
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図3
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水中の微生物叢のα多様性は3つの湖の間で有意な差はなかったが（Chao1, ANOVA: F = 1.29, df = 2, p = 0.343; Shannon, ANOVA: F = 3.29, df = 2, p = 0.108）、サンショウウオ幼生の皮膚微生物叢の細菌群集の豊かさは当初、集団間で差があった（KW: χ2 = 13.07, df = 2, p = 0.001;図4a）。LL個体はBL個体（Dunn: z = -2.62、p = 0.013）およびSP個体（Dunn: z = -3.44、p = 0.001）よりも有意に貧弱な群集であったが、後者は同程度の豊かさであった（Dunn: z = 1.02、p = 0.465）。しかし、豊度（シャノン指数で測定）を含むアルファ多様性は、3つの個体群間で差がなかった（ANOVA：F = 1.41, df = 2, p = 0.252；図4b）。より具体的には、幼虫の微生物叢内に存在するBd阻害性細菌群集のα多様性は、サイト間で差がなかった（Chao1, KW: χ2 = 5.68, df = 2, p = 0.058; Shannon, ANOVA: F = 2.19, df = 2, p = 0.122; Appendix S3）。これらの初期微生物相サンプルの中で、アルファ多様性は幼虫の体格に影響されなかった（Chao1, Pearson: t = -0.85, df = 55, p = 0.399; Shannon, ANOVA: F = 1.79, df = 1, p = 0.187）。

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図4
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3地点の水の微生物相は、いくつかのASV（付録S1-S10C）の存在量に有意差があったため、ベータ多様性（PERMANOVA：F = 3.03, R2 = 0.50, df = 2, p = 0.046）では強く差があったが、組成分散（Betadisper：F = 0.51, df = 2, p = 0.570）では差がなかった。初期皮膚細菌群集のベータ多様性はすべてのサンショウウオ幼生の集団間で異なり、個体の位置は初期微生物叢サンプル間の組成変動の17％以上を説明した（PERMANOVA：F = 5.68, df = 2, p < 0.001）。それにもかかわらず、微生物叢の組成分散は3つの集団間で均一であった（Betadisper: F = 0.56, df = 2, p = 0.578）。同様に、Bd阻害性細菌群集の組成は個体群間で有意に異なっており、場所によってサンプル間のベータ多様性の変動の20%が説明された（PERMANOVA: F = 6.86, df = 2, p < 0.001）。Bd阻害細菌群集の組成分散は、LLの個体内よりもBLの幼生の方が有意に高かった（Betadisper: F = 6.32, df = 2, p = 0.002; Appendix S4）。

3.2 オオサンショウウオ幼生の皮膚微生物叢に対する経時変化と生息地移動の相対的影響
幼生の皮膚微生物叢の組成は、個体発生と移動の両方が影響していた。実際、D0とD15の両方でプロテオバクテリア（Proteobacteria）が一貫して大多数を占めていた一方で、2番目に多いフィラはこれらの時点によって異なっていた。さらに、移動した幼虫は、同じ場所に維持されていた対照幼虫とは異なる微生物相を持っていた（図2；補遺S5）。幼虫の微生物叢におけるBd阻害性系統型の相対的存在量は、転座によって異なる影響を受け、時間経過とともに減少したが、BL（7%）またはSP（6%）の個体に比べてLL（2%）の個体では低いままであった。

幼虫の微生物叢は、生息場所にかかわらず、15日間のモニタリングの間に多様性を増した（図4）。個体発生は微生物叢のα多様性に強く有意な影響を及ぼしたが（Chao1 ANOVA: F = 33.33, df = 1, p < 0.001; Shannon ANOVA: F = 45.95, df = 1, p < 0.001）、生息地の移動は影響を及ぼさなかった（Chao1 ANOVA: F = 0.72, df = 1, p = 0.398; Shannon ANOVA: F = 2.76, df = 1, p = 0.100）。実際、D15で幼虫から採集したサンプルのアルファ多様性は、対照個体と移入個体で差がなかった（ANOVA: Chao1, F = 0.33, df = 1, p = . 570; Shannon, F = 2.00, df = 1, p = 0.167）、アルファ多様性の初期（D0）測定値には影響されなかった（ANOVA: Chao1, F = 2.31, df = 1, p = 0.138; Shannon, F = 0.89, df = 1, p = 0.353）。同様に、Bd抑制性系統型のアルファ多様性は時間経過とともに有意に増加したが（Chao1 ANOVA: F = 4.32, df = 1, p = 0.041; Shannon ANOVA: F = 18.81, df = 1, p < 0.001）、トランスロケーションの影響は受けなかった（Chao1 ANOVA: F = 1.58, df = 1, p = 0.211; Shannon ANOVA: F = 2.96, df = 1, p = 088; Appendix S3）。D15のデータに限定したモデルでは、Bd阻害群集のアルファ多様性は、対照個体と移入個体で差がないことが確認された（ANOVA: Chao1, F = 0.78, df = 1, p = . 384; Shannon, F = 1.88, df = 1, p = 0.179）、またアルファ多様性の初期（D0）測定値にも影響されなかった（ANOVA: Chao1, F = 0.06, df = 1, p = 0.810; Shannon, F = 0.01, df = 1, p = 0.908）。

2つのサンプリングイベント（D0とD15）の時間差は、全微生物サンプル間のβ多様性の変動の13％以上を説明した（PERMANOVA: F = 15.34, df = 1, p < 0.001）のに対し、転座状況は0.9％未満しか説明できなかった（PERMANOVA: F = 1.02, df = 1, p = 0.388;付録S6）。より具体的には、D15において、対照個体と転座個体は類似した微生物叢構造（PERMANOVA, F = 1.11, R2 = 0.03, df = 1, p = 0.318；図5）と組成分散（Betadisper: F = 1.90, df = 1, p = 0.174）を有していた。全データセットの解析でも、微生物叢の組成分散は個体発生の影響を受けないことが示された（Betadisper: F = 1.24, df = 1, p = 0.263）。同様のパターンが保護系統型間でも観察された：全微生物試料中のBd抑制性細菌群集のベータ多様性のばらつきの17％以上を先天性が説明したのに対し（PERMANOVA：F = 21.43, df = 1, p < 0.001）、転座状況は2％未満しか説明しなかった（PERMANOVA：F = 2.10, df = 1, p = 0.099）。D15サンプルに限定して解析した結果、Bd抑制性コミュニティのベータ多様性は転流の影響を受けていないことが確認された（PERMANOVA, F = 2.17, R2 = 0.05, df = 1, p = 0.104）。さらに、保護微生物叢の組成分散は、時間（Betadisper: F = 0.10, df = 1, p = 0.761）にもトランスロケーション（Betadisper: F = 0.05, df = 1, p = 0.837）にも影響されなかった。

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図5
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差分解析の結果、コントロールサンプルのD0とD15の間の群集構造の変化は、51の系統型の存在量の変化によって引き起こされていることが明らかになったが、その大部分はプロテオバクテリア（Proteobacteria）に属し、バクテロイデーテス（Bacteroidetes）と疣贅菌（Verrucomicrobia）にも属していた。より古いサンプル（D15）とは対照的に、幼虫の初期皮膚微生物叢（D0）では、Verrucomicrobia門の細菌とProteobacteriaの11属で有意に高い存在量を示した（付録S7）。Bd阻害性の系統型のうち、10種のASV（すべてProteobacteriaに属する）が、初期サンプル（D0；付録S8）において有意に豊富であった。D15で対照個体と移動した幼虫の微生物相を比較したところ、差分分析により13の系統型の存在量に有意差があることがわかった。対照個体とは対照的に、移動した幼虫はこれらの分類群に富む微生物相を有していた（図6）。しかし、対照個体と移動幼虫の間で存在量に有意差のあるBd阻害性の系統型は見つからなかった。

詳細は画像に続くキャプションを参照。
図6
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3.3 カナダ、アルゴンキン州立公園における幼虫の死亡率と病気のスクリーニング
定量的ポリメラーゼ連鎖反応（PCR）の結果、すべてのサンプルからラナウイルスとツボカビは検出されなかった。それにもかかわらず、実験中に24％の幼虫が死亡した（D15時：nBL＝3；nLL＝2；nSP＝10個体死亡）。生存率は幼虫の体長（GLM: β = 0.07, df = 1, p = 0.354）、移動（GLM: β = -0.63, df = 1, p = 0.496）、初期アルファ多様性（GLM: β = -0.48, df = 1, p = . 273）であったが、生息地の影響を受けた。SPで採集された幼虫の生存確率は有意に低く（GLM：β = -2.68, df = 2, p = 0.013）、他の湖で採集された幼虫の生存確率は15.9倍高かった（表1）。最終的に死亡した幼生とD15で生存した幼生の間で、初期群集構造（D0）に違いは見られなかった（PERMANOVA：F = 0.12, df = 1, p = 0.147）。

表1. D15における幼虫の生存の決定因子を調べたロジスティック回帰の要約。
推定値 SE z値 p値
(切片） 2.11 3.15 0.67 .5030
初期体長 0.07 0.08 0.93 .3538
初期アルファ多様性 -0.47 0.43 -1.10 .2730
地位（TR） -0.63 0.92 -0.68 .4957
原産地（LL） -1.63 1.29 -1.26 .2073
原産地（SP） -2.68 1.08 -2.48 .0133
最終地点（LL） -1.32 1.07 -1.23 .2179
最終サイト（SP） -1.99 1.03 -1.93 .0531
注：推定値は標準誤差（SE）とともに示した。各カテゴリカル予測変数に用いられた対照は括弧内にある。初期体長と初期アルファ多様性（シャノン指数で測定）はD0で測定した。移入（TR）の効果はD15で対照幼虫と対比した。原産地（D0）と最終採集地（D15）の影響はBL（BLはバット湖、LLはロスト・レイ湖、SPは斑点鱒湖）に対して対比した。有意なp値は太字で示した。
しかし、差分解析の結果、BL産の幼生のうち、実験終了前に死亡した個体の微生物相は、初期（D0）には15種類のASVで、すべてProteobacteriaに属し、生存した幼生の微生物相よりも少ないことが明らかになった（Appendix S9）。より具体的には、BL由来の幼虫の初期Bd阻害微生物相の中で、2つのバイオマーカー（Pseudogulbenkiania sp.とDeefgea sp.）は、最終的に死亡した幼虫では、生存した幼虫に比べて有意に存在量が少なかった（Appendix S10）。LLの幼生のうち、死亡した個体では、同じくプロテオバクテリア門に属する2つのASVの初期値が低かった。SILVAを用いた系統分類は科レベル（Enterobacteriaceae）に限定されたが、ブラスト検索の結果、これら2つのASVはKlebsiella pneumoniaeとSalmonella entericaである可能性が示唆された。SPの幼虫のうち、死亡した個体の微生物叢は、当初は2つのASVに富んでいたが、ブラスト検索の結果、これらのバイオマーカーの1つはAcidovorax属に属する可能性が示唆された（Appendix S9）。

4 結論
この研究により、両生類の皮膚に存在する細菌群集の構成に関する理解が深まり、自然保護活動な ど人為的な環境撹乱が動物の微生物相に及ぼす影響に関する知見が広がりました。両生類は致命的な皮膚病に対する抵抗力において皮膚共生細菌が重要な役割を担っていることを考えると、このことは両生類にとって特に重要です（Rebollar et al.） これらの結果を総合すると、早いライフステージで行われた集団移動が両生類の皮膚微生物相に与える影響は 限定的であることが示唆されます。さらに、サンショウウオの幼生の微生物叢は環境よりも個体発生によってより強く形成されるようである。これらの観察結果は他の両生類モデルで確認する必要がありますが、今回の発見は両生類保全の有望な戦 略として集団移入を支持するものです。

4.1 自然に動的な微生物叢における空間的・時間的変動のパターン
キイロサンショウウオ幼生の皮膚微生物叢は、他の多くの両生類種で報告されているように、プロテオバクテ リア（Proteobacteria）が支配的で、バクテロイデーテス（Bacteroidetes）、ファーミキューテス（Firmicutes）、ベ ルコミクロビア（Verrucomicrobia）が重要な割合を占めていました（Harrison et al. 水中のものとは異なっていたことから、両生類の皮膚の選択性が確認され（Walke et al., 2014）、場所によって組成や豊富さ、ベータの多様性が異なっていた。これは、両生類の皮膚微生物叢が環境要因に対して高い感受性を持ち、同じ種の個体間でも大きな差異が生じる可能性があることを考慮すると予想された（Birdら、2018；Varelaら、2018）。実際、α多様性は同程度であったにもかかわらず、本研究の3つの湖の水は、β多様性の強い変動によって示唆されるように、区別可能な微生物叢構造を有していた。

このような空間的多様性に加えて、サンショウウオ幼生の皮膚微生物叢の構成が、その発生を通じて急速に変化していることが報告された。群集の豊かさと多様性は、第45段階（D0）から変態前の最終段階（D15）にかけて急速に増加した。カエル幼生の腸内・口内微生物叢の構造や多様性には、個体発生が影響することが知られているが、このような狭い時間枠での変化を報告したのは今回が初めてである（Griffithsら、2018；Warneら、2017）。D0からD15の間に存在量が有意に増加した多くの系統型を同定したが、その中にはいくつかのAcinetobacter属やPseudomonas属が含まれていた。 これらの属の多くの種はin vitroでツボカビの増殖を阻害することが報告されている（Muletz-Wolz et al.

興味深いことに、我々の結果は、個々の微生物群の初期α多様性は15日後のα多様性に影響しないことを示している。この短期間での細菌群集の重要な再編成は、発育段階45における幼虫の皮膚の選択性が低いためか、あるいは幼虫が成長するにつれて生態学的ニッチの利用可能性が高まるためと考えられるが、幼虫の体長と皮膚微生物叢のα多様性との間に関連性は見られなかった。この直感に反する結果は、最初のサンプリングで細菌群集が枯渇したためである可能性もある。つまり、スワビングによって他の種が微生物叢にコロニー形成されなくなったか、あるいはD15でも微生物叢に残っていたはずの系統型が除去された可能性がある（Fukami, 2015）。個々の皮膚微生物叢の経時的変動に関する研究では、多くの場合、短期間のサンプリングが繰り返されていることを考慮すると、これらの研究が細菌群集の自然変動を正確に表しているかどうかを判断することは、特に興味深い可能性がある。

4.2 移住が皮膚微生物叢の組成と多様性に及ぼす影響
今回の結果から、移設はサンショウウオ幼生の皮膚細菌群集の構成に影響を与えたが、α多様性や群集構造（β多様性）には影響を与えなかったことが示唆された。移設された個体の微生物叢は、おそらく移設元の環境由来の細菌を保持しつつ、移設先の種によってコロニー化されている。興味深いことに、これらの分類群のいくつかは、Akkermansia属（Belzer & De Vos, 2012）、Odoribacter属、Parabacteroides属（Wan et al.） 移入が皮膚細菌群集に及ぼす構造的な影響については、移入元の環境の微生物を維持しつつ、新しい環境の微生物叢へとグローバルにシフトすることが、タスマニアデビル（Chongら、2019年）からアトランティックサーモンの稚魚（Uren Websterら、2020年）、ヘルベンダーサンショウウオ（Nolan、2020年）に至るまで、長期的な研究や多くの宿主で報告されている。しかし、いくつかの移殖実験では、微生物叢のアルファ多様性と群集構造は、移殖された個体の移殖先環境によって完全に決定されることが報告されている（Bletz et al.） キイロサンショウウオの幼生では、転移してきた個体が原産地の湖にとどまった対照幼生と同様のαおよびβ多様性の微生物叢を維持していたことから、皮膚微生物叢は環境変化に対して非常に強いことがわかった。このことは、幼生期の微生物コロニー形成が後期の微生物群集に影響を与える可能性があることを裏付けており（Robinson et al., 2010; Sanchez et al., 2017; Uren Webster et al., 2020）、特に両生類の保全という文脈では重要なことである。しかし、変態前の幼生をサンプリングするために私たちの研究は15日間しか行わなかったが、これは陸生になる際に微生物叢が大きく変化すると考えられるためである（Kueneman et al.

4.3 保護的な系統型、病気に対する感受性、死亡率
実験幼生の微生物叢におけるBd阻害性系統型の割合は、他の両生類分類群と比較して比較的低かった（Walke et al.） 本研究のすべての個体がツボカビからクリアであったことを考慮すると、これは病原体の有病率が低い個体群では抑制性系統型の選択が減少する可能性があることを示唆するWalkeら（2017）の研究と一致する。我々の結果と比較すると、ラナウイルスやツボカビの有病率が高い場所では、個体発生や移動を通じて微生物相が再構築されるパターンが異なることが予想される。いずれにせよ、私たちのサンプル内で同定された系統型のほとんどがBdに対して未検証のままであり（D0では74％、D15では対照サンプルで70％）、両生類を脅かし（Pessier, 2014）、その皮膚微生物群集に変化を引き起こす（Federici et al.） さらに、微生物の二次代謝産物の産生や機能は病原体分離株によって異なることがあるため（Antwis & Harrison, 2018）、同定された系統型の抗真菌特性を確認するには16S配列決定だけでは不十分である。そのため、研究者や保全関係者により網羅的なデータベースを提供するためには、より広範な新興疾患に対する細菌の阻害活性を調査することが急務である。とはいえ、Bd阻害細菌の定量化は、保護活性を持つ共生細菌がたどる潜在的な傾向に関する重要な洞察を提供し、後者の真菌に対する活性が知られている稀な系統型がBdに対しても阻害性を持つことから、Bsal阻害細菌にも外挿できるかもしれない（Woodhams et al.）

ラナウイルスやツボカビがいなかったにもかかわらず、実験終了時の幼虫は変態に非常に近かったため、両生類では一般的に死亡率の増加と関連する生活期間であった（Careyら、1999；Rollins-Smith、1998；Werner、1986）。微生物相の多様性や構造と宿主の死亡率との間に関連は見られなかったが、SPサイトを起源とする幼虫（D0）はBLやLLを起源とする個体よりも死亡率が有意に高かった。この属は他の両生類の常在細菌叢にも見られるが（Lauer et al., 2008）、Bdに感染した個体（Federici et al, 2015）や皮膚創傷内（Hernández-Gómez et al. したがって、Acidovorax sp.の存在量が高い幼虫では、初期（D0）にもろい表皮をぬぐったことで、この細菌によって悪化した皮膚病変が引き起こされ、その結果、これらの個体が死亡した可能性が考えられる。いずれにせよ、移動自体が死亡の原因ではなかったことは、この保護戦略にとって心強いことである。他の2地点の個体群では、生存した幼生と比較して死亡した幼生にあまり見られなかった系統型のいくつ かは、両生類で一般的に見られる分類群（Salmonella enterica；Srikantiah他、2004年）や淡水湖の堆積物（Pseudogulbenkiania sp.；Weber他、2009年）であった、 しかし、驚くべきことにこれらの分類群の1つ（Klebsiella pneumoniae）はアヌラ ンモデルで致命的な感染を引き起こすことが知られています（Hallinger et al.

5 まとめ：顕微鏡レンズを通して両生類の保全を見る
保全研究に宿主に付随する細菌群集を取り入れることは、宿主個体群の将来の生存性を確保するための有望 な手段として認識されつつあります（Trevelline et al.） 宿主の健康にとって不可欠な機能に対する常在細菌叢の貢献と、それらの高い相互依存性から、宿主とその関連微生物を1つの機能単位として認識する「ホロビオント」概念（Carthey et al.、2020）が登場した（Esser et al.、2019；Morar & Bohannan、2019；Zilber-Rosenberg & Rosenberg、2008）。この文脈から、微生物群集の確立のための重要な窓を破壊しないように、宿主単独ではなくホロビオントを考慮した包括的なアプローチを用いて、集団移動のための最適なライフステージを選択すべきであることが示唆される。今回の結果は、移動のようなその場での保全アプローチが微生物相の構造やサンショウウオの幼生の生存に 影響を与えないことを示唆しており、勇気づけられるものですが、今後の研究ではさまざまなライフステージやビ オトープを用いて、このような管理戦略が両生類の微生物相に与える長期的な影響をさらに調査する必要がありま す。結局のところ、現在の保全活動をホロビオントの管理にシフトさせるには、動物の微生物叢の組織化 のダイナミクスをより深く理解する必要がありますが、第6の大量絶滅の危機に直面している絶滅危惧種の宿主 の保全の成功率を高める可能性があります（Carthey et al.）

著者の貢献
L.F.M.は研究を計画し、その場で実験を行い、実験室での作業を行い、データを分析し、原稿の初稿を執筆した。P.V.L.はデータを分析し、原稿を編集した。M.D.は本研究の監督・設計を行い、原稿を編集した。P.V.L.は本研究の監督・企画、資金提供、原稿編集を行った。最終原稿は著者全員が承認した。

謝辞
Noah Loiselleにはフィールドでの協力を、Algonquin Wildlife Research Stationの研究者にはメソコスムの構築とサンショウウオの捕獲を手伝ってもらった。Patrick MoldowanとPeter Millsには幼生のAmbystoma判別に関する専門知識を教えてもらい、捕獲場所を推薦してもらった。Nadia Mykytczukには微生物相分析に関する指導を、Jake KerbyにはqPCRに関する専門知識を教えてもらった。また、2名の匿名査読者の建設的なコメントにより原稿が大幅に改善されたことに感謝する。L.F.M.はNSERC Create GrantによるReNewZooプログラムの資金提供を受けた博士課程の学生であり、旅費はMITACS Globalink Research Award (SUB/2021/516154)の支援を受けた。M.D.はFonds de la Recherche Scientifique-FNRS（ベルギー）の研究ディレクターである。

資金援助情報
フィールドワークおよびシークエンシングの資金は、カナダ自然科学・工学研究評議会（NSERC）のDiscovery grant 6877-2018により提供された。

利益相反声明
著者らは利益相反がないことを宣言する。

利益配分に関する声明
私たちの研究は優先的な関心事に取り組んでおり、この場合は両生類（地球上で最も絶滅の危機に瀕している脊椎動物の一種）の評価である。L.F.M.はフィールドにいる間、数名の学部生の教育とトレーニングに貢献した。この研究から得られる利益は、上記のように公開データベースでデータを共有することで得られます。

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