GMP基準に準拠した凍結乾燥糞便微生物群カプセル製剤の設計と製造

哉百名

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ジャーナル・オブ・コントロール・リリース
350巻、2022年10月、324-331ページ
GMP基準に準拠した凍結乾燥糞便微生物群カプセル製剤の設計と製造

https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0168365922005168

著者リンク オーバーレイパネルNur Masirah M. Zain a, Daniëlle ter Linden a, Andrew K. Lilley a, Paul G. Royall a, Sophia Tsoka b, Kenneth D. Bruce a, A. James Mason a, Grace B. Hatton c, Elizabeth Allen d, Simon D. Goldenberg e, Ben Forbes a
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https://doi.org/10.1016/j.jconrel.2022.08.012
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キーワード
糞便微生物移植FMT品質管理安定性製造凍結乾燥カプセルマイクロバイオーム
略語
CDIClostridioides difficile infectionCFUcolony-forming unitFMTFaecal Microbiota TransplantGMPG Good Manufacturing PracticeIMPinvestigational medicinal productPCRpolymerase chain reactionPMApropidium monoazide

  1. はじめに
    糞便微生物叢移植（FMT）は、少なくとも1人の健康なドナーの便をレシピエントの腸管に移植する治療的介入である[1,2]。FMTには重要な臨床応用の可能性が数多くあり、最も確立されているのは、英国国立医療技術評価機構（NICE）が推奨するクロストリジウム・ディフィシル（Clostridioides difficile）感染症（CDI）の再発治療である［3,4］。腸内細菌叢の異常と関連する疾患の数は増加しており、FMTがこれらの疾患の潜在的治療法として提案されることが多くなっている［5,6］。再発性CDIの治療におけるFMTの有効性は、臨床医を勇気づけ、幅広い、そして増えつつある疾患におけるFMTの有効性を評価するようになった。ヨーロッパでは現在、潰瘍性大腸炎、クローン病、過敏性腸症候群、袋炎、肝硬変、非アルコール性脂肪性肝疾患、抗菌薬耐性、移植片対宿主病、肥満、パーキンソン病、慢性疲労症候群、脊椎関節炎を対象とした臨床試験において、FMTが標準治療として、あるいは治験薬として実施されている[7]。

英国では、FMTは未承認医薬品に分類され、臨床試験で使用される場合は治験薬（IMP）に指定されている［8］。IMPとして、FMTは医薬品の製造管理及び品質管理に関する基準（GMP）に準拠して製造され、所轄官庁（英国では医薬品医療製品規制庁；MHRA）の承認を受ける必要がある。数多くのベストプラクティスガイドラインがあるにもかかわらず、FMT製品やその送達の標準化はほとんど行われておらず、欧州諸国間でFMTの提供や実施に大きなばらつきがある[7]。

FMTの製造、送達、規制の多くの側面が未解決であり、これらの最適化は、CDI治療と新たな適応症におけるFMTの効果に関する研究の双方にとって焦点となっている。FMTドナーの病原性微生物やその他のリスクに関するスクリーニングについては、英国および欧州のコンセンサスガイドラインがあり [9,10] 、重大な副作用はまれである。上記で引用したものも含め、FMT療法を試験・開発している研究者の報告では、研究者は、最適な糞便微生物製剤、薬効、投与方法、安全性などをより明確にする必要性を強調している。これらの報告は、このエキサイティングな時期に採用され、評価されている方法とアプローチの多様性を強調している。最もバリエーションに富んでいるのは、ドナーの便微生物群、製造のための便の処理、そして患者の消化管にドナーの糞便材料を送達する方法と部位である。

FMT製造への合理的なアプローチを模索する上で、FMT製品は健康な人の新鮮な便からできるだけ多くの微生物叢を取り込むべきであるというのが共通の前提である。そのため、ほとんどの報告は、細菌の生存率や多様性の低下を最小限に抑えるFMT製造法の設計に焦点を当てている。FMTとその作用機序はまだ十分に理解されておらず、複雑な治療用微生物群集を合理的に設計できるようになるには、まだ時間がかかる[8]。専門家のコンセンサスでは、FMTの治療的有望性をさまざまな疾患で評価できるようになるには、最適化が必要であると結論付けられている［11］。

したがって、サンプルの採取から、処理、検査、保存、そして移植に至るまで、FMTの方法を最適化することに多くの関心が寄せられている［[12], [13], [14]。FMTは、経鼻胃管（または経鼻十二指腸管）または大腸内視鏡を介して投与される糞便懸濁液の形で製造されるのが最も一般的である[15]。このような形態での糞便移植の方法は、手技の安全性リスク、追加コストに関連しており、比較的侵襲的であるため、患者の受け入れの障壁となりうる。再発性CDIを治療するために、経口カプセルから糞便を投与する方法が研究されており、多くの場合、カプセル内の液体懸濁液を濃縮・凍結して、ブルーミング（吸水、膨潤、変形）やカプセル殻の崩壊を抑制している。Louie, Cannon [16]は、関連ドナーの新鮮な便懸濁液を二重の過密封経口カプセルに濃縮することにより、100％の治療成功率（27/27人のレシピエントが1回の投与でそれ以上再発することなく臨床的に治癒した）を達成した。Youngster, Russell [17] も、血縁関係のないドナーからの凍結懸濁液をカプセル化して利用し、1～2回の治療で90％以上の成功率を達成している [17] 。

凍結乾燥された糞便を含むカプセルは、さらに魅力的な薬学的アプローチを提供する。凍結乾燥によって水分が除去され、少量の粉末になるため、水分が充填されることによるカプセル殻の膨潤や崩壊の問題がなくなり、飲み込むカプセルの数が減るため、患者に受け入れられやすくなり、治療費も安くなる [18]。さらなる研究で確認されれば、凍結乾燥によってFMTを冷凍保存する必要もなくなるかもしれない。このような利点は、加工によって治療薬の活性成分が除去されたり不活性化されたりする懸念と背中合わせである。したがって、糞便微生物叢の減少や変化を避けるようにFMTカプセルの製造工程を設計することが重要である。

最近の系統的レビューでは、凍結乾燥カプセル製剤を利用した適格な研究（少なくとも10人の患者を対象に、再発性CDIの治療における経口FMTカプセルの役割を調査したものと定義）は5件しか見つかっていない［19］。これらの研究のうち、カプセルの調製に使用された方法と最終製品の仕様の詳細は驚くほどまばらであった。データが提供された場合、そのばらつきが強調された：2件の研究ではカプセルの材料はヒプロメロースであり、1回の摂取量あたりのカプセル数は6、8～32、4～5、2～27カプセルであり、便量は100～200gと50～218gであり、対数総菌量は11.8、11.3～11.8、11.3～12.3 log CFUであった［[19]、[20]、[21]、[22]、[23]、[24]］。このように、調製方法、その管理、再現性、治験薬の品質について報告がなかったり、不注意であったりすることが、治療法としてのFMTの評価や開発を制限している。

われわれの知る限り、われわれは、患者の治療のために定義された大量の便から凍結乾燥した微生物叢を含む経口カプセルのFMTを製造するための、詳細な工程パラメーター、製品の特性および仕様を含む、GMPに準拠した工程の完全な記述を初めて提供する。我々の目的は、糞便提供から生存微生物叢を抽出し、それを1回量5カプセルの形で提供するための、よく制御されたプロセスを設計することであり、これは今後予定されている臨床試験で治験薬として使用することができる。さらに、この製品の生菌量に基づく予備的な安定性データと、再発性CDI患者を治療するための未承認薬として使用した場合に得られた臨床成績についても報告する。

  1. 材料と方法
    Guy's and St Thomas' NHS Foundation Trustは、MHRA（Medicines & Healthcare Products Regulatory Agency：医薬品・ヘルスケア製品規制庁）から英国における治験薬製造・輸入承認（MIA(IMP)）を取得しており、すべての製造活動は適格者によって監督、認証、バッチリリースされている。

2.1. 材料
健康なヒト糞便サンプルは、国際的なガイダンス[9,10]に従い、事前にスクリーニングされたドナ ーから入手した。ドナーは、検体採取後2時間以内に検査室に検体を搬送することが求められた。ドナーは、カンピロバクター、サルモネラ、赤痢菌、大腸菌O:157、卵巣、シストおよび寄生虫、C. difficile、ゲンタマイシンおよびカルバペネム耐性グラム陰性菌、メチシリン耐性黄色ブドウ球菌（MRSA）、ヘリコバクター・ピロリおよびノロウイルスの存在について検査された。その後、SARS-Cov-2の検査もレパートリーに加わった。各バッチは1人のドナーから得られたもので、提供されたものをプールすることは許可されていない（n = 5；女性2人、男性3人）。

凍結保護剤トレハロース（D-(+)-trehalose、GMPグレード無水粉末、Alfa Aesar社、英国）は、凍結中の細菌細胞膜への損傷を最小限に抑えるために使用した[26]。トレハロースは非還元糖であり、一般にバイオ医薬品における凍結保護剤として安全であるとみなされている。細胞構造の変化や凝集を防ぐため、凍結サイクル中の適合性と安定化特性を示す [27,28]。Staley, Hamilton [29]は、トレハロースを凍結保護剤として使用す ることで、生存微生物の回収率が向上することを実証した。

2.2. 糞便のカプセルへの加工
希釈とホモジナイズ、繊維質除去のためのろ過、遠心分離による微生物群の濃縮、濃縮ペレットの凍結乾燥といういくつかの工程を経て、凍結乾燥品を調製した（図1）。生存している微生物が治療活性の鍵であるという仮説に従って、このプロセスは、効率的で、よく制御され、再現性のあるプロセスを用いて、生存していない便物質から微生物を分離し、生存能力を維持し、少数の単位用量で送達できる形態に濃縮するように設計された。

図1
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図1. 液体糞便微生物叢移植に使用された方法[25]を応用し、5カプセルで同等の移植を行うための処理方法。このプロセスには、凍結乾燥と凍結乾燥粉末をカプセルに移す前に、サンプルを均質化し、余分な有機物を除去し、糞便微生物叢を凍結保護剤とプレミックスする重要なステップが含まれる[25]。画像はBioRender.comで作成。

2.2.1. 便懸濁液と濃縮
150mLの滅菌0.9% w/v 塩化ナトリウムと80gの便サンプルを、ワイヤーボールを入れた食品用シェーカーで混合し、懸濁液を調製した。手で激しく振って均一な混合物を得、目視検査で確認した。大きな繊維状物質を除去するため、懸濁液を滅菌した単回使用のポリプロピレン製粗いふるい（Unisurge International Ltd., UK）を用いてろ過した。不要な懸濁物質をさらに分離するため、濾液を50mLのファルコンチューブ4本に分け、400xgで10分間遠心分離した。ペレットを捨て、残った上清を3000 xgで25分間2回目の遠心分離を行い、細菌を濃縮した。凍結保護剤トレハロースを最終濃度5% w/vになるようにペレットに加え、混合し、滅菌した90mm×15mmのプラスチックシャーレに移し、-80℃で最低2時間凍結させた。すべての工程は不必要な遅延なく行われ、サンプル提供者から最大6時間以内に完了した（研究室への輸送も含む）。

2.2.2. 凍結乾燥
濃縮懸濁液を入れたペトリ皿を、-50℃で最低12時間、0.05ミリバールの圧力で凍結乾燥した（Mini Lyotrap freeze dryer, LTE Scientific, UK）。サイクルの終わりに、真空は周囲条件下で解放された。熱重量分析（TA Instruments TGA Q500 V20.13 Build 39）を実施し、カプセル化した凍結乾燥FMTカプセル中の水分含有量を測定した。7～30mgの凍結乾燥FMT試料を、マイクロスパチュラを用いて白金皿に載せ、20～200℃の温度範囲で10℃/分の加熱速度で加熱した。含水率は、3回繰り返して測定し、20 °Cから100 °Cの間の試料重量減少率の平均値から求めた。

2.2.3. カプセル化と保存
粉末の流動とカプセルへの充填を可能にするため、高多孔性モノリスまたは凍結乾燥FMTケーキをスパチュラで軽く砕き、緩い粉末とした。薄茶色の粉末を耐酸性の不透明なスウェーデンオレンジ色のサイズ0カプセルに充填し（1バッチにつき5カプセル、200～250mg/カプセル）、密封容器に入れ-80℃で保存した。DRcaps®（Capsugel、Lonza社製）は、胃の中で遭遇するような低pH条件に耐性があり、ほとんどの植物性細菌に悪影響を与えることから選ばれた。このことは、放射性同位元素で標識した99 mm Tc-DTPAカプセルを用いたガンマシンチグラフィによるヒト試験で実証されている [30]。これにより、カプセルの遅延放出特性が確認され、一般的な即時放出カプセル（5分）よりも約45分遅れて崩壊が始まった。放出は平均52分（カプセルが胃から出ようとするとき）に始まり、完全な放出は放出開始から20分後に起こった。このようなアプローチにより、凍結乾燥FMTは胃を通過した時点でカプセルから放出され、腸内でのカバー率が高まる。

製造工程全体の詳細な説明は図1と表1に、得られたFMTカプセルは図2に示す。最終的な製造工程に至るパイロット研究の詳細については、補足（表S1）に示す。

表1. 製造工程の各ステップと凍結乾燥により製造された糞便微生物移植カプセルの仕様。

ステップ 処理ステップ パラメーター 仕様
1 バッチあたり80 gの便を秤量する。
2 ワイヤーボール付きの清潔なシェーカーに、便と150mLの0.9%滅菌塩化ナトリウムを加える 150mLの0.9%滅菌塩化ナトリウム
3 シェーカーの蓋を固定し、激しくシェイクする。
4 均質な混合物が得られることを確認する 懸濁液は目視で均質に見える。
5 滅菌ふるい（孔径2 mm×2 mm）を用いて大きな繊維状物質をろ過する。
6 混合液を 50 mL のファルコンチューブ 4 本に移す。
7
a)
懸濁液を入れたファルコンチューブを400 x gで10分間遠心する。

繊維状物質からペレットが形成される
b)
上清を回収し、新しい滅菌済み50mLファルコンチューブに移し、4本のチューブに等分する。

目視で確認する。細菌細胞を含む上清は不透明で褐色の外観をしている。
c)
上清を入れたファルコンチューブを3000 x gで25分間遠心する。

細菌細胞からペレットが形成される。
d)
上清を捨て、ペレットを残す。

ペレット量は3～5mL
8 トレハロース1mL（トレハロース0.5gを水8mLに溶かしたもの）を各ファルコンチューブに加え、ボルテックスで5秒間混合する。
9 すべてのファルコンチューブの内容物を滅菌プラスチックシャーレ（90 × 15 mm）に移し、-80 °C で最低 2 時間凍結する。
11 凍結した懸濁液を最低12時間凍結乾燥する（-50℃、0.05ミリバール）。
12 生成した凍結乾燥品を、滅菌プラスチックプレートスプレッダーを用いてホモジナイズし、粉末にする。 微粒子と粗粒子が混在した褐色の粉末が得られる。
13 最終製品をカプセル化する。同じバッチからほぼ等量の粉末を5つのカプセルに分注し、スウェーデン製オレンジDRキャップに手で充填する。 ほぼ等量のタンピングされたパウダーが充填されたカプセル
14 カプセルをHDPE デュマ® ボトルに移し、試験専用ラベルを貼る。直ちに-80℃の冷凍庫で保管する。 カプセルは試験の必要性に応じてラベル付けされ（EU GMP Annex 13に準拠）、-80℃で保管される。
図2
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図2. FMT凍結乾燥カプセルの写真。1回の治療に対応する1バッチは、21.7mm×7.64mmの0号カプセル5個からなる。カプセルはスウェーデンオレンジ色に着色され、プラセボが必要な試験で被験者に中身が見えないようになっている。比較のため、英国の1ペニー硬貨とユーロの2セント硬貨が示されている。

2.3. 微生物学的分析
2.3.1. サンプリング
細菌計数のための微生物学的サンプリングは、製造の主要段階と製造後のさまざまな時点で実施された。これらには、未処理便、糞便ペレット（凍結乾燥直前）、および最終凍結乾燥製品が含まれ、保存後ベースライン、6、12、36 週間で検査された。サンプルは、バイオセーフティキャビネット（BSC）の下で、記録された重量の物質を滅菌チューブに移し替えて採取した。

2.3.2. 生死細胞の分離とDNA抽出
サンプリング後すぐに、サンプルの希釈とプロピジウムモノアジド（PMA）処理を行った[31]。PMAは死滅／損なわれた細菌の細胞壁／膜を貫通し、DNAと恒常的に結合する能力を示しており、熱処理したサンプルではコントロールと比較してqPCRシグナルが低いことが示された[32]。サンプルは滅菌水で100倍に希釈し、十分に混合した。凍結乾燥したサンプルの場合は、凍結乾燥細胞を復活させるため、室温で30分間インキュベートした。90μLのアリコートを透明なRNaseフリー1.5mLチューブ（Thermo Fisher Scientific、米国）に移し、PMAの最終濃度が100μMになるように水中20μM PMA（Biotium Inc. 非PMA処理コントロールでは、10μLの滅菌水を加えた。サンプルをホイルで覆い、室温で30分間回転シェーカーでインキュベートした。その後、LED青色光（IB-Applied Science社、スペイン）に15分間暴露することにより、PMA分子をDNAに固定した。DNA 抽出は、DNeasy PowerLyzer PowerSoil Kit（Qiagen、USA）を用い、製造元の指示に従い全サンプルについて行った。DNA抽出物は、さらに分析を行うまで-20℃で保存した。

2.3.3. 細菌量の定量
DNA抽出後、PMA処理サンプルと非PMA処理サンプルの細菌量を定量し、総生存細菌数と非生存細菌数の両方を調査した。総細菌負荷量qPCRは、前述のように実施した[33]。このアッセイの定量下限（LLOQ）は1000 CFU/gサンプルであった。定量値は Rotor Gene Q-series ソフトウェア（Qiagen, Crawley, UK）で作成し、糞便中の CFU/g で表した。

2.4. データ解析
総細菌負荷量は、1を加えてlog10値に変換した（0 CFU/g + 1 = 0 log10 CFU/g）。データ分布の正規性は、Shapiro-Wilk 検定を用いて評価した。正規分布データ（未処理便および凍結乾燥前）およびPMA処理サンプルと非処理サンプルの細菌量を比較するために、一対のt検定を実施した（図3）。非正規分布データ（凍結乾燥後）については、Wilcoxon検定を実施した（図3）。一元配置分散分析（One-way ANOVA）を用いて、製造後の異なるタイムポイントにおける荷重の違いを調査した（Fig.4）。すべての統計分析は、IBM SPSS Statistics version 25（IBM Inc.）

図3
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図3. (a)未処理便、(b)凍結乾燥前懸濁液（遠心分離工程とトレハロース添加の最終製品）、(c)凍結乾燥FMT製品。総細菌負荷量（生菌および非生存菌）は、元の便で9.9～10.6 log CFU/g、凍結乾燥前懸濁液で9.9～10.6 log CFU/g、凍結乾燥FMTで10.7～11.2 log CFU/gであった。

図4
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図4. 超低温（-80℃）で36週間保存した場合の生菌数における凍結乾燥FMT製品の安定性。5つの独立したバッチについて、4つのサンプリング日（一元配置分散分析、p = 0.24、n = 5、F = 1.54、df = 3）において、36週間にわたる生菌数の有意な減少は観察されなかった。凍結乾燥FMT製品の平均生菌数は以下の通りであった： ベースライン時（0週目）9.5 log CFU/g、6週目9.9 log CFU/g、12週目9.3 log CFU/g、36週目8.9 log CFU/gであった。

2.5. 臨床試験
2021年6月から11月にかけて、7人の患者がカプセル化FMTによる治療を受けた。患者はまず、嚥下障害／口腔咽頭障害の評価を受けた。患者には最低4時間絶食してもらい、カプセル摂取の約30分前にオメプラゾール40mgを服用した。これは試験当時の臨床慣行であったが、腸溶カプセルの溶解によりカプセルからFMTが早期に放出されるリスクを回避するために中止された。患者はカプセルを好きな水分と一緒に飲み込むことが許可され、カプセル摂取後20分間モニターされた。患者の年齢範囲は40〜85歳で、CDIの既往は平均3.4回であった。

  1. 結果と考察
    安全性スクリーニングのガイドラインを除けば、FMTには確立された品質基準がない。これは、有効成分が定義されておらず、バッチごとに出発材料が異なる製品を規制することの難しさを反映している。このシナリオで品質を管理するための合理的かつ実際的なアプローチは、加工の一貫性と管理を保証するための適正製造規範に焦点を当てることである。生菌が治療活性の鍵であるという前提に基づき、加工・保存中の生菌の保持を製品の品質の重要な指標とした。製造方法は、一連のパイロット研究を通じて発見的に開発され、その後最終的に、先験的な製品仕様を満たす5つの「規制」バッチを製造するために使用された。

健康なドナーから採取した便を図1に示した方法で処理すると、各工程で品質規格（表1）に適合したカプセルが製造された。便からは、最終製品で108～109 CFU/gの総生菌量が得られた（図3）。生死細胞分離qPCRアッセイを用いて測定された生菌量は、元の糞便サンプル1gあたりで正規化すると、製造工程を通じて10倍未満のCFU/g減少（1010から109 CFU/80gの便へ）を示した。この減少は、初回から凍結乾燥前の段階で見られ、凍結乾燥前後では減少は見られなかった）。これらの減少は統計的に有意ではなかった（一元配置分散分析、p = 0.396, n = 5, F = 1.002, df = 2）。生菌の対数カウントは、すべてのサンプルで、非生存細胞を含む総細菌量より平均21.83％（範囲9.33～36.39％）少なかった（未処理便、凍結乾燥前懸濁液、paired t-test, p = 0.006,0.001; 凍結乾燥後粉末、Wilcoxon test, p = 0.043, n = 5）。

固形便は液化され、繊維状物質の懸濁液となり、そこから2回の遠心分離によって粗い懸濁物質が除去された。使用した遠心分離機は、速度、時間、温度を制御し、サイクル終了時にペレットが破壊されないようにゆっくりと減速するスピンサイクルを備えている。各段階での収量と外観に応じた仕様が設定されており、未処理の便サンプルと凍結乾燥用の懸濁液の間で、全微生物の損失や生存率の低下は見られなかった（図3aおよびb）。トレハロース添加後、凍結前に懸濁液をペトリ皿に移し、凍結乾燥を容易にするために表面積を大きくした。凍結乾燥後、粉末ケーキは簡単に粗粉末に分解され、スパチュラを使ってカプセルに移され、各カプセルにほぼ等しい体積が入るようにタンピングされた。

このプロセスを用いて、80gの生便出発物質を、通常1.6gの凍結乾燥FMTを含む5カプセルの単一バッチに加工し、FMTの単一「用量」を構成した。80gの便から生成された凍結乾燥物の重量にはばらつきがあり、将来の規格設定を可能にするために、バッチ間ばらつきの指標としてモニターされている。製造されたばかりのカプセルの残留水分を測定したところ、6.46 ± 0.24%（n = 7）であり、これは凍結乾燥生物学的医薬品の典型的な限度内であった [34,35]。

凍結乾燥前と凍結乾燥後の細菌含量を比較した結果、凍結乾燥後も微生物数や生菌数の減少は見られなかった（図 3b、c）。凍結乾燥したカプセル入りFMT製品を-80℃で36週間保存しても、生菌数の有意な減少は見られなかった（図4、一元配置分散分析、p = 0.24, n = 5, F = 1.54, df = 3）。このデータは、これらの保存条件下での製品の安定性を裏付けている。分散した場所での臨床試験用サンプルの輸送のような実用的な目的のためには、標準的な冷凍庫（-20℃）または冷蔵庫温度（2～8℃）のような、通常のコールドチェーン輸送および保管で達成可能な温度で、より長い期間、安定性を評価する必要がある。異なる保存温度におけるカプセルの安定性に関する研究は現在進行中である。予備的な観察によると、-80℃で保存する必要はないようである（データは示していない）。

カプセル製剤の安定性を、FMTにより一般的に使用される液体製剤と比較することは興味深い。液体FMT製剤の工程を通じた細菌の生存率に関する報告はいくつかあるが[12,14,24,31,36]、保存時の安定性を報告したものはほとんどない[12,37]。

本研究で、FMTの処理方法が製造段階や保存中の細菌数や生存率に及ぼす影響を明らかにしたことから、今後は細菌種の変動に対する処理の影響に焦点を当てた研究を行う予定である。これによって、FMTの好気性加工時における厳密な嫌気性菌種の生存について、より深い理解が得られるであろう。好気的に処理されたFMTは効果的であり[38]、再現性と実用性の理由から、FMT処理は好気的に行われた。FMTの科学における注目すべき問題は、移植中に嫌気性菌種が保持されるかどうか、バクテリオファージの寄与、可溶性または未溶解の生理活性成分である。ヒト腸内の総菌数1013～1014 CFU [40]と比較して比較的少ない菌量、例えば109～1012 CFU [29,39]の移植が、どのようにして治療効果をもたらすのかは不明である。腸内マイクロバイオーム介入に関する臨床試験が進むにつれて、有益な結果が臨床で再現できるように、可能な限り定義された「薬」を試験で使用するというのが我々のアプローチである。

このカプセル製剤は、ガイズ・アンド・セント・トーマスNHS財団トラストにおいて、「薬局免除」規則の下、非正規医薬品として再発性CDIを治療するための日常臨床使用に採用されている。以前は、前述のようにFMT懸濁液を大腸内視鏡的に投与する方法でのみ治療が可能であった[25]。

患者は臨床的治癒、すなわちCDIに対する追加治療の必要なく下痢が改善/消失したかどうかで評価された（表2）。6人（86％）の患者が、1×80gの便サンプルの処理物をカプセル化した5カプセルを単回投与した後、12週目に臨床的治癒を達成した。1人の患者は症状が部分的に消失したが、3週目に再発し（C. difficile毒素EIA陽性）、別のドナーからのFMTで再治療した。この患者は12週後の評価で臨床的治癒を達成した（二次的臨床的治癒率100％）。これは、Du, Luo [19]による最近の系統的レビューとメタアナリシスで報告された経口FMTカプセルの全有効性82.1％と比較して高い。

表2. 凍結乾燥FMTカプセル投与後のClostridioides difficile感染症（CDI）再発患者7例における臨床転帰。

患者 性別、年齢 以前のCDIエピソード数 以前のCDI治療歴 併存疾患 12週時の臨床的治癒率
1 女性, 40 3 Vanc, FDX 再発性尿路感染症 Y
2 女性, 85 4 Vanc, FDX 多発性骨髄腫、2 型糖尿病、慢性腎臓病、高血圧、喘息 Y
3 女性, 67 3 Vanc, FDX 乳がん、水腎症を伴う転移性膵臓がん、胆汁酸吸収不良 Y
4 男性, 74 3 Vanc, FDX 慢性腎臓病、大動脈弁置換術、虚血性心疾患 Y
5 女性, 58 2 Vanc 潰瘍性大腸炎 Y
6 女性, 83 7 MTZ、Vanc、FDX 高血圧、再発性尿路感染症 初回投与時N
2回目Y
7 男性, 64 2 Vanc, FDX 原発性硬化性胆管炎、潰瘍性大腸炎 Y
Vanc＝バンコマイシン、FDX＝フィダキソマイシン、MTZ＝メトロニダゾール。

すべての患者は5カプセルすべてを問題なく飲み込むことができ、カプセル投与直後および12週間のフォローアップ期間中、有害事象は報告されなかった。

このカプセル製剤は現在、抗生物質耐性菌の消化管キャリッジを減少させるFMTの無作為化プラセボ対照試験（Faecal microbiota transplant to ERadicate gastrointestinal carriage of Antibiotic Resistant Organisms; FERARO試験）[8]で使用されている。その他にも、経口治療用のFMT製品が商業化されており、臨床開発が進められている [41] 。FMTを医薬品としてより深く理解し、品質と有効性に関する規制を策定するためには、この分野でのさらなる研究が必要である。

興味深いことに、疾患の病態と治療における腸内細菌叢の役割がますます明らかになる一方で、経口薬物送達生物薬剤学に対する他の意味合いも認識されつつある。全身的な薬物代謝の前段階における腸内細菌叢の役割はよく知られており [42]、機械学習は、薬物枯渇の潜在的な臨床関連メカニズムとして、腸内細菌叢による薬物代謝と生物蓄積を予測するために採用されている [43] 。しかし、胆汁酸の微生物代謝 [44,45] や製剤の賦形剤 [46] など、薬物薬物動態に影響を及ぼす可能性のある他の生物薬剤学的相互作用も同定されつつある。ヒトの腸内細菌叢とその操作方法についてより多くのことが解明されるにつれ、FMT治療薬や予防薬の開発だけでなく、薬物送達にもより広範な影響が及ぶ可能性がある。薬剤とマイクロバイオームとの相互作用がどのように薬剤開発プログラムに組み込まれ、腸内細菌異常症患者の薬物治療レジメンに組み込まれるのか、興味深いところである。

  1. 結論
    我々は、MHRAのMIA（IMP）ライセンスに基づき製造されたGMP準拠の凍結乾燥FMTカプセル製剤について、初めて詳細な説明を行った。このような製剤を使用することで、患者がFMTに広くアクセスできるようになる可能性がある。さらに、FMT懸濁製剤のような侵襲的な投与経路を必要としないため、コスト削減や物流障壁の克服が期待できる。さらに、標準化されたFMT製剤は、FMT療法の治療効果を評価するための構造化された比較臨床試験を可能にする。本研究で開発されたカプセル製剤は、未承認の臨床使用において、1回の投与で高い成功率を示し（臨床的治癒を達成するために2回目の投与を必要とした患者は1例のみ）、有害事象は報告されていない。

FMTがどのようなメカニズムで治療効果を発揮するかは十分に解明されておらず、病態によって異なる可能性がある。我々が実証したアプローチは、安全な微生物叢の生菌数が十分に保存され、保存期間が確認された一貫した製品を生産する再現可能なプロセスを定義することにより、医薬品の品質を保証するものである。標準化された方法が開発されたとはいえ、各バッチは固有の提供物から得られたものであり、これが大きなばらつきの原因となっている。FMTを研究する臨床試験が進むにつれ、有益な結果が臨床で再現できるよう、十分に管理された手順で治験薬が製造されることが重要になっている。

資金提供
本研究は、King's Together Fundを通じてキングス・カレッジ・ロンドンから資金提供を受けた。

CRediT著者貢献声明
ヌール・マシラ・M・ザイン： 概念化、方法論、検証、調査、形式分析、執筆-原案、視覚化、執筆-校閲・編集。ダニエレ・テル・リンデン 方法論、調査、執筆-原案、視覚化、執筆-校閲・編集。アンドリュー・K・リリー 形式分析, 執筆 - 原案, 視覚化, 執筆 - 査読と編集. ポール・G・ロイアル 概念化、方法論、検証、執筆-校閲・編集。ソフィア・ツォカ 概念化、形式分析、執筆-校閲・編集。Kenneth D. Bruce: 概念化、方法論、執筆-原案、視覚化、執筆-校閲・編集。ジェームズ・メイソン 概念化、方法論、執筆-校閲・編集。グレース・B・ハットン 方法論、調査、執筆-校閲・編集。エリザベス・アレン 概念化、方法論、検証、執筆-校閲・編集。サイモン・D・ゴールデンバーグ 概念化、方法論、検証、執筆-原案、執筆-校閲・編集、プロジェクト管理。ベン・フォーブス 概念化、方法論、検証、執筆-原案、執筆-校閲・編集、プロジェクト管理、資金獲得。

利益相反宣言
SDGは、塩野義製薬（コンサルテーション）、Tillotts（コンサルテーションおよび謝礼）、Enterobiotix（コンサルテーション）およびファイザー（コンサルテーション）との関係を報告している。KDBとNMZはNIHR Nottingham Biomedical Research Centreから資金援助を受けている。GBHはSymproveおよび諮問委員会、Sensyne Health株から謝礼を受けている。

付録A. 補足データ
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補足資料

参考文献
[1]
E. van Nood, et al.
再発性クロストリジウム・ディフィシルに対するドナー糞便の十二指腸注入療法
N. Engl. J. Med., 368 (5) (2013), pp.
スコープで見るGoogle Scholar
[2]
G. Cammarota, et al.
無作為化臨床試験：再発性クロストリジウム・ディフィシル感染症の治療に対する大腸内視鏡検査による糞便微生物叢移植とバンコマイシンの比較
Aliment. Pharmacol. Ther., 41 (9) (2015), pp.
CrossRefView in ScopusGoogle Scholar
[3]
D. Kao, et al.
再発性Clostridioides difficile感染症に対する微生物生態系治療薬（MET-2）の効果：第1相非盲検単群試験
Lancet Gastroenterol. Hepatol., 6 (4) (2021), pp.282-291
PDFで記事を見るScopusで記事を見るGoogle Scholar
[4]
C. Haifer, et al.
クロストリジオイデスディフィシル感染症における経口凍結乾燥糞便微生物叢移植後の細菌および真菌の長期動態
mSystems, 6 (1) (2021)
Google Scholar
[5]
Z. Qu, et al.
疾患に対する糞便微生物叢移植：治療の可能性、方法論、臨床におけるリスク管理
ライフサイエンス, 304 (2022), Article 120719
PDFで記事を見るScopusで記事を見るGoogle Scholar
[6]
K. Dixit, et al.
恒常性維持のための腸内細菌叢の修復
生命科学, 278 (2021), 第119622号
PDFで記事を見るScopusで記事を見るGoogle Scholar
[7]
S.M.D. Baunwall, et al.
ヨーロッパにおける糞便微生物叢移植（FMT）の使用：ヨーロッパ全体の調査
Lancet Regional Health Eur., 9 (2021)
Google Scholar
[8]
B. Merrick, et al.
抗生物質耐性菌の消化管キャリッジを根絶するための糞便微生物叢移植（FERARO）：前向き無作為化プラセボ対照実現可能性試験
BMJ Open, 10 (5) (2020), p. e038847, 10.1136/bmjopen-2020-038847
スコープで見るGoogle Scholar
[9]
J.J. Keller, et al.
糞便微生物叢移植のための便バンクの標準化モデル：学際的なUEGワーキンググループからのコンセンサスレポート
United European Gastroenterol J, 9 (2) (2021), pp.
CrossRefView in ScopusGoogle Scholar
[10]
B.H. Mullish, et al.
再発性または難治性のクロストリジウム・ディフィシル感染症に対する治療としての糞便微生物叢移植の使用とその他の潜在的適応：英国消化器病学会（BSG）と医療感染学会（HIS）の合同ガイドライン
Gut, 67 (11) (2018), 1920-1941頁
CrossRefScopusで見るGoogle Scholarで見る
[11]
S.C. Ng, et al.
糞便微生物叢移植の科学的最前線：アジア太平洋消化器病学会（APAGE）とアジア太平洋消化器内視鏡学会（APSDE）の共同文書
Gut, 69 (1) (2020), pp.
CrossRefView in ScopusGoogle Scholar
[12]
S.D. Burz, et al.
糞便微生物叢移植を目的とした便サンプルの生体外での取り扱いと保存の手引き
Sci. Rep., 9 (1) (2019), p. 8897
ScopusGoogle Scholarで見る
[13]
M. Yalchin, et al.
炎症性腸疾患の治療における糞便微生物叢移植の使用に関する知識のギャップと今後の方向性
Ther. Adv. Gastroenterol.
(p. 1756284819891038)
Google Scholar
[14]
J. Reygner, et al.
凍結乾燥した糞便サンプルは長期保存後も生物学的に活性であり、Clostridioides difficile感染症の前臨床マウスモデルにおける糞便微生物叢移植に適している
腸内細菌, 11 (5) (2020), pp.
CrossRefView in ScopusGoogle Scholar
[15]
K.O.キム、M.グラック
糞便微生物叢移植：臨床の最新情報
Clin. Endosc., 52 (2) (2019), pp.
ScopusGoogle Scholarで見る
[16]
T. Louie, et al.
再発性クロストリジウム・ディフィシル感染症（rCDI）に対する経口糞便微生物カプセルを介した糞便微生物移植（FMT）、in ID Week 2013
(2013)
(サンフランシスコ、カリフォルニア州）
Google Scholar
[17]
I. Youngster, et al.
再発性クロストリジウム・ディフィシル感染症に対する経口カプセル化凍結糞便微生物叢移植療法
Jama, 312 (17) (2014), pp.
クロスリーフScopusで表示Google Scholar
[18]
A. Varga, et al.
FMTをより効果的に、便利に、柔軟に適用する方法 - FMT法の比較
Front. Cell. Infect. Microbiol., 11 (2021), Article 657320
スコープで見るGoogle Scholar
[19]
C. Du, et al.
再発性クロストリジオイデスディフィシル感染症に対する経口糞便微生物移植カプセルの安全性と有効性：系統的レビューとメタ解析
J. Clin. Gastroenterol., 55 (4) (2021), pp.
CrossRefView in ScopusGoogle Scholar
[20]
E. Reigadas, et al.
再発性Clostridioides difficile感染症に対する糞便微生物叢移植：凍結乾燥経口カプセルの経験
J. Hosp. Infect., 105 (2) (2020), 319-324頁
PDFで記事を見るScopusで記事を見るGoogle Scholar
[21]
C. Staley, et al.
カプセル化糞便微生物叢移植後のClostridium difficile感染症の再発予測
マイクロバイオーム, 6 (1) (2018), p. 166
ScopusGoogle Scholarで見る
[22]
A. Clancy, et al.
クロストリジウム・ディフィシル（Clostridium difficile）感染症患者における糞便微生物叢移植のための凍結乾燥微生物叢カプセルの使用： 114
Off. J. Am. Coll. Gastroenterol. ACG, 113 (2018), p. S62
CrossRefGoogle Scholar
[23]
S. Khanna, et al.
Rbx7455 の第 1 相臨床試験における 6 か月追跡期間中のクロストリジウム・ディフィシル感染再発からの持続的な解放とマイクロバイオームの回復?
消化器病学, 156 (6) (2019)
(p. S-1158)
Google Scholar
[24]
Z.D. Jiang, et al.
再発性クロストリジウム・ディフィシル感染症に対する凍結乾燥便微生物製剤の経口投与と浣腸による凍結製剤の比較の安全性と予備的有効性：無作為化臨床試験
PLoS One, 13 (11) (2018), Article e0205064
RefRefScopusで表示Google Scholar
[25]
S.D. Goldenberg, et al.
英国の2病院におけるクロストリジウム・ディフィシル感染症再発患者を治療するための糞便微生物叢移植の異なる戦略の比較：レビュー
Infect. Dis. Ther., 7 (1) (2018), 71-86頁
CrossRefView in ScopusGoogle Scholar
[26]
J.C.アルグエレス
細菌と酵母におけるトレハロースの生理的役割：比較分析
Arch. 微生物学, 174 (4) (2000), pp.
スコープで見るGoogle Scholar
[27]
T. チェン、A.ファウラー、M.トナー
文献レビュー：トレハロース-水二元系混合物の補足相図
低温生物学, 40 (3) (2000), pp.
PDFを見る記事を見るScopusで見るGoogle Scholar
[28]
P. Dráber, et al.
トレハロース存在下での凍結乾燥によるタンパク質の安定化：チューブリンのケーススタディ
Methods Mol. Biol., 2178 (2021), pp.
CrossRefView in ScopusGoogle Scholar
[29]
C. Staley, et al.
凍結乾燥しカプセル化した糞便微生物叢を用いた再発性クロストリジウム・ディフィシル（Clostridium difficile）感染症の成功的解決；実用的コホート研究（Pragmatic Cohort Study
Am. J. Gastroenterol., 112 (6) (2017), 940-947頁
CrossRefView in ScopusGoogle Scholar
[30]
R. アモ
C. Inc (Ed.), DRcaps® Capsules Achieve Delayed Release Properties for Nutritional Ingredients in Human Clinical Study, Capsugel Inc (2014)
Google Scholar
[31]
L.E. Papanicolas, et al.
移植用糞便スラリー中の微生物の生存率を測定するためのプロピジウムモノアジドに基づく方法の最適化
J. Microbiol. Methods, 156 (2019), 40-45頁
PDFを見る記事を見るGoogle Scholar
[32]
L.E. Papanicolas, et al.
移植用糞便スラリー中の微生物の生存率を測定するためのプロピジウムモノアジドに基づく方法の最適化
J. Microbiol. Methods, 156 (2019), 40-45頁
PDFを見る記事を見るGoogle Scholar
[33]
G.B. Rogers, et al.
原発性毛様体ジスキネジアにおける気道細菌群集組成の複雑性、時間的安定性、および臨床的相関性
J. Clin. Microbiol., 51 (12) (2013), pp.
スコープで見るGoogle Scholar
[34]
R. Jawad, et al.
簡便な(1)H-NMR法を用いた噴霧凍結乾燥法で調製した非晶質乳糖内のβ/αアノマー組成の測定
Pharm. Res., 29 (2) (2012), pp.
CrossRefView in ScopusGoogle Scholar
[35]
A. Alqurshi, et al.
ナロキソンを緊急投与するための口腔内崩壊錠の非晶質製剤化とin vitro性能試験
Mol. Pharm., 13 (5) (2016), pp.
CrossRefView in ScopusGoogle Scholar
[36]
L.E. Papanicolas, et al.
糞便移植における細菌の生存率：どの細菌が生き残るか？
EBioMedicine, 41 (2019), pp.
PDFで記事を見るScopusで記事を見るGoogle Scholar
[37]
Z.D. Jiang, et al.
クロストリジウム・ディフィシル感染症（CDI）モデルマウスにおける凍結乾燥便微生物移植（FMT）製剤の安定性と有効性
Anaerobe, 48 (2017), pp.
PDFで記事を見るScopusで記事を見るGoogle Scholar
[38]
T.G.グォン、S.Y.ナ
次世代糞便微生物叢移植
Clin. Endosc., 54 (2) (2021), pp.152-156
CrossRefView in ScopusGoogle Scholar
[39]
A.K. Groen, M. Nieuwdorp
感染症および代謝性疾患の治療における糞便微生物叢移植の治療可能性の評価
EMBO Mol. Med., 9 (1) (2017), pp.
CrossRefView in ScopusGoogle Scholar
[40]
E. Rinninella, et al.
健康な腸内細菌叢組成とは？年齢、環境、食事、疾患を超えて変化する生態系
微生物, 7 (1) (2019)
グーグル スカラー
[41]
L.E.マコウブリー、M.エルバダウィ、A.W.バシット
マイクロバイオーム医薬品の臨床応用の現状
Trends Pharmacol. Sci., 43 (4) (2022), pp.
PDFで記事を見るScopusで記事を見るGoogle Scholar
[42]
A.W.バシット
大腸ドラッグデリバリーの進歩
薬物, 65 (14) (2005), 1991-2007頁
CrossRefView in ScopusGoogle Scholar
[43]
L.E. McCoubrey, et al.
機械学習による腸内細菌叢による薬物代謝と生物濃縮の予測
薬剤学, 13 (12) (2021)
Google Scholar
[44]
E.F. Enright, et al.
微生物が介在する胆汁酸修飾：腸管での薬物吸収と代謝における役割
Pharmacol. Res., 133 (2018), 170-186頁
PDFで記事を見るScopusで記事を見るGoogle Scholar
[45]
E.F. Enright, et al.
腸内細菌叢を介した胆汁酸の形質転換は、in vitroにおける多剤耐性トランスポーター基質に対する細胞応答を変化させる：P糖タンパク質に着目して
Mol. Pharm., 15 (12) (2018), 5711-5727頁
CrossRefScopusで表示Google Scholar
[46]
L. Zou, et al.
細菌代謝が食品・医薬品添加物による腸管薬物吸収阻害を救う
Proc. Natl. Acad. Sci., 117 (27) (2020), pp.
CrossRefView in ScopusGoogle Scholar
引用者: (5)
糞便微生物叢移植： 自己免疫疾患における新たな応用
2023, 自己免疫ジャーナル
抄録を表示
糞便微生物叢移植のための乾燥アルギン酸ビーズ： モデル株から糞便サンプルまで
2023, 国際薬剤学雑誌
抄録を表示
抗菌薬耐性（AMR）を制御するための腸内細菌叢の調節-糞便微生物叢移植（FMT）を中心とした叙述的レビュー
2023年、感染症レポート
消化器疾患および代謝性疾患の治療における糞便微生物叢移植の応用と発展： 総説
2023年、サウジアラビア消化器病学会誌
市販の腸溶性空硬カプセル、生産技術と用途
2022, 医薬品
© 2022 The Authors. 発行：エルゼビアB.V.
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