乳化剤が微生物叢と宿主代謝に及ぼす悪影響に対抗するAkkermansia muciniphilaの研究

2023年2月7日 09:19

https://gut.bmj.com/content/early/2023/01/03/gutjnl-2021-326835

Noëmie Daniel1、http://orcid.org/0000-0002-6338-7578Andrew T Gewirtz2、http://orcid.org/0000-0002-4285-769XBenoit Chassaing1
Dr Benoit Chassaing, Team "Mucosal microbiota in chronic inflammatory diseases", INSERM U1016, CNRS UMR 8104, Université Paris Cité, Paris, France; benoit.chassaing@inserm.fr 宛てにご返信ください。
要旨
背景乳化剤であるカルボキシメチルセルロース（CMC）やポリソルベート80（P80）を含む一部の非吸収性食品添加物は、腸内細菌叢に悪影響を及ぼし、細菌叢の侵入、慢性低レベル腸内炎症、ひいては代謝異常の促進につながることを示す証拠が蓄積されてきている。乳化剤の摂取による腸内細菌叢への悪影響には、健康に関連する粘液強化細菌であるAkkermansia muciniphilaの枯渇が含まれる。

目的乳化剤の有害な影響から保護する手段として、外因性A. muciniphilaの投与の可能性をマウスで検討する。

結果 A. muciniphilaを毎日経口投与することにより、CMCおよびP80の摂取による過食、体重増加および血糖値異常を含む表現型の影響を防ぐことができた。また、A. muciniphilaの投与は、低グレードの腸内炎症によるCMCおよびP80を打ち消すことができた。さらに、A. muciniphilaの補給は、低悪性度慢性炎症および代謝異常を引き起こすと考えられている腸内細菌叢へのCMCおよびP80の近接影響を防いだ。特に、A. muciniphilaは、CMCとP80によって誘発される腸内細菌叢の種構成の変化と侵入を防いだ。また、CMCとP80は大腸のトランスクリプトームを変化させるが、A. muciniphilaはこれらの変化をほぼ防ぐことができたことは注目に値する。

結論 A. muciniphilaの毎日の投与は、微生物叢と宿主の両方に対する乳化剤の有害な影響から保護される。これらの結果は、慢性炎症性疾患を促進する現代社会のさまざまなストレスの中で、A. muciniphilaをプロバイオティクスとして使用することにより、腸と代謝の健康を維持できるという考えを支持するものである。

データ提供について
データはリクエストに応じて提供されます。未処理のシーケンスデータは、European Nucleotide Archiveにアクセッション番号PRJEB57855で寄託されています。

https://creativecommons.org/licenses/by/4.0/
本論文は、Creative Commons Attribution 4.0 Unported (CC BY 4.0) ライセンスに従って配布されるオープンアクセス論文であり、原著作物が適切に引用され、ライセンスへのリンクが示され、変更がなされたかどうかが示される限り、いかなる目的でもこの作品をコピー、再分配、リミックス、変換、構築することを他者が許可するものです。参照： https://creativecommons.org/licenses/by/4.0/.

http://dx.doi.org/10.1136/gutjnl-2021-326835

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このトピックについて既に知られていること
これまでの知見では、一般的に使用されている食物用乳化剤が腸内細菌叢を変化させ、慢性的な腸の炎症および代謝異常を促進することが報告されています。

乳化剤が引き起こす有害な結果には、微生物叢の侵食が中心的なステップである。

Akkermansia muciniphilaは、腸管バリアを強化し、代謝異常を予防することができる次世代の有益なプロバイオティクスである。

この研究で追加されたこと
A. muciniphilaの補給は、乳化剤の消費によって誘発される代謝異常を防ぐ。

A. muciniphilaは、カルボキシメチルセルロースとポリソルベート80によって誘発される腸内細菌叢の種構成の変化と侵入を防止する。

食餌性乳化剤は大腸のトランスクリプトームを変化させるが、A. muciniphilaはこれらの変化からほぼ保護される。

本研究が研究、実践、政策に与える影響
我々の発見は、乳化剤が微生物叢と宿主の両方に与える有害な影響から保護するための治療アプローチとして、A. muciniphilaを支持するものである。

A. muciniphilaは、慢性炎症性疾患を促進する現代的なストレスの中で、腸と代謝の健康を維持するのに役立つ可能性がある。

はじめに
人類は、肥満とインスリン抵抗性を主な特徴とするメタボリックシンドロームと呼ばれる代謝異常の著しい増加に直面している。メタボリックシンドロームは、腸内細菌叢の組成の変化と関連している。1 マウスやヒトを用いた糞便微生物叢の移植研究では、このような変化は、単に代謝異常を示すだけでなく、むしろ代謝異常を促進すると主張されている2。変化した微生物叢が代謝異常を促進するメカニズムは完全には明らかにされていないが、微生物叢-上皮間距離と糖代謝異常の程度との逆相関3は、通常は無菌に近い内側の粘液層に侵入する微生物叢の重要な役割を示唆しており、おそらくこのような侵入細菌が低レベルの炎症を促進し、その結果代謝異常が生じることを反映しているものと考えられる。

高脂肪・低繊維の「欧米型」食事4や乳化剤と呼ばれる食品添加物5など、様々な要因がマイクロバイオータの異常増殖や侵入を誘発する可能性がある。乳化剤は、保存期間を延ばし、有機的特性を改善するために多くの加工食品に組み込まれており6 7 、超加工食品の消費と慢性炎症性疾患の発症を関連付ける重要な要因であることが疑われている8 9 。CMCとP80の摂取は、マウスにおいて腸内細菌叢の組成を変化させ、細菌叢の侵食を誘発する。最近の報告では、CMCがヒトにおいて同様の働きをすることが示唆されている10。このような微生物叢の異常や侵入は、野生型マウスでは代謝異常として現れる慢性的な低グレードの腸の炎症に関連し、遺伝的にこの疾患を起こしやすいマウスでは大腸炎の増強につながる。

人間の食物消費の大部分を占める加工食品には、乳化剤やその他の添加物が遍在しており、これらの添加物を避けることは困難である。そこで、乳化剤の対策として、メタボリックシンドロームで存在量が減少し、さらに、外因的に投与するとメタボリックシンドロームを予防できるAkkermansia muciniphilaという細菌に着目しました13。14 A. muciniphilaは、粘液産生を刺激することにより粘膜バリアを強化し、粘液破壊的な高脂肪食15 16下で粘液層を厚くし、さらに、Reg3γなどの抗菌ペプチドの産生を誘導する17。A. muciniphilaの有益な効果は、菌体そのまま、低温殺菌（オートクレーブは不可）、外膜および分泌タンパク質15 18-20 を用いた場合に観察される。このことは、その有益な特性が、粘液消化を含む代謝活性ではなく、表面／分泌分子に関連していることを示唆するものである。A. muciniphilaのパイロット臨床研究では、ヒトにおける有益性が示唆され、脂肪質量増加の低下と股関節周囲の減少傾向、インスリン感受性の向上、太り過ぎの被験者における内毒素血症と炎症の減少が見られた21。したがって、この研究の目的は、A. muciniphilaが、乳化剤によるホスト-マイクロバイオータの恒常性乱れの予防と、低レベルの炎症および代謝への影響を調べることであった。その結果、A. muciniphilaは乳化剤による代謝異常やその原因とされる腸管内の低レベルの炎症からマウスを保護することがわかった。さらに、A. muciniphilaは乳化剤による微生物叢の構成と局在の変化を防ぎ、大腸のトランスクリプトームの変化も防ぐことがわかった。A. muciniphilaのこのような能力は、メタボリックシンドロームやその他の慢性炎症性疾患を促進する宿主-微生物叢の相互作用を乱す現代のストレス要因に対抗する手段としての利用を支持するものである。

研究成果
乳化剤の摂取がA. muciniphilaの糞便中存在量に与える影響
合成化合物であるCMCおよびP80を含むいくつかの食事用乳化剤は、宿主と微生物叢の相互作用を阻害し、低悪性度腸炎および代謝異常を引き起こす可能性がある5 11 15 これらの乳化剤が微生物叢に及ぼす影響には、相対的な種の存在量における多くの変化および有益細菌の枯渇がある5。10 この考えと一致するように、乳化剤処理マウスの微生物叢組成を解析したところ、CMCまたはP80の慢性摂取により、A. muciniphilaの糞便中相対量が有意に減少した（図1A）。A. muciniphilaの粘液を強化する能力など、この細菌のプロバイオティックな健康への可能性が確立されていることを考慮すると、A. muciniphilaの外因性投与により微生物叢を補充することが、乳化剤摂取による有害な影響を打ち消すかもしれないという仮説が立てられる。

図1
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図1
アッケシソウの投与により乳化剤による代謝異常が抑制された。(A) 飲料水、CMC 1.0%、P80 1.0%に慢性的に暴露したマウスの糞便中のアッケシソウの相対的存在量。(B)実験デザインの模式図。マウスをCMC 1.0%（オレンジ）またはP80 1.0%（紫）を含む飲料水（青）に9週間暴露し、週5日、ビヒクル（滅菌PBS、実線および棒グラフ）またはA. muciniphila（A. 粘液、波線および棒グラフ）を摂取させた。(C)ビヒクルまたは(D)A. muciniphilaを経口投与したマウスの経時的体重増加。(E) 最終体重、(F) 精巣上体脂肪パッド重量、(G) 毎日の摂食量測定、(H) 15時間空腹時血糖値。(I-K) 8週目に、マウスを5時間絶食させ、ブドウ糖の腹腔内ボーラス（2g/kg体重）でチャレンジした。(I) ビヒクルまたは (J) A. muciniphila を投与したマウスで、15, 30, 60, 90, 120 分後に血糖値反応を測定した。(K）グルコース負荷試験から得られた曲線下の面積。データは平均値±SEMで表される。棒グラフについては、一元配置分散分析に続いてボンフェローニ・ポストホック検定を使用して統計分析を行い、有意差は以下のように記録した。*p<0.05, **p<0.01, ***p<0.001. 折れ線グラフについては、二元配置分散分析または混合モデル（欠損値がある場合）を実行し、その後、Bonferroniポストホックテストを行い、有意差を以下のように記録した。CMC vs 水, *p<0.05, **p<0.01, ***p<0.001; P80 vs 水, #p<0.05, ##p<0.01, ###p<0.001. 傾向の正確なp値（0.05≦p<0.10）は、追加表示のためにグラフに記録されている。ANOVA, 分散分析; CMC, カルボキシメチルセルロース; P80, ポリソルベート80.

Akkermansia muciniphilaの投与は乳化剤による代謝異常を防ぐ
C57/Bl6マウスを水、CMC（1%）またはP80（1%）に9週間暴露し、同時にDerrienらによって分離された#BAA-835（ATCC） A. muciniphila株を用いて、リン酸緩衝液（PBS） - ビークルまたは A. ムチンフィラを週5日経口投与（図1B）13した。培養の純度は、菌の増殖、洗浄、分注（詳細は方法の項参照）の後、16S rRNA遺伝子の増幅と配列決定により確認した（オンライン補足図S1A）。その後、これらの確認されたA. muciniphilaのアリコートを用いて、2.5×108 CFUでマウスを毎日処理した。このアプローチにより、qPCRアプローチで評価したように、軽度ではあるが有意にA. muciniphila糞便相対存在量が増加した（オンライン補足図S1B）。

補足資料
[gutjnl-2021-326835supp004.pdf]
既報の通り、P80は対照群と比較してマウスの体重増加を誘発し、CMC投与マウスでも同様の傾向が見られた（図1C）。この体重増加はA. muciniphilaを投与したマウスでは抑制され、A. muciniphila投与群はすべて非乳化剤投与のコントロールマウスと同様の最終体重を示した（図1D,E）。一方、A. muciniphilaは水処理マウスの体重に影響を与えなかった（図1D,E、p=0.80）。これは、A. muciniphilaが宿主代謝に直接影響を与えるというよりも、むしろ生物学的異常状態を改善している可能性と一致している。乳化剤の体重への影響は、図1Fに示すように、一般に脂肪パッド重量への影響と関連していた。さらに、A. muciniphilaの投与は、CMCおよびP80による過食および高血糖の誘発を完全に抑制した（図1G,H）。A. muciniphila投与によるグルコースホメオスタシスへの影響をより良く評価するために、8週間の乳化剤曝露後に腹腔内グルコース負荷試験（GTT）を実施した。図1I,Jに示すように、CMC投与マウスおよびP80投与マウスはいずれもグルコース排出曲線に大きな変化を示したが（図1I）、A. muciniphila投与マウスでは差が認められず（図1J）、CMC投与群およびP80投与群はいずれも水のみ投与群と同等であった。さらに、曲線下の面積を測定すると、乳化剤による耐糖能異常はA. muciniphilaの毎日の投与で完全に防止されることが裏付けられた（fig. 1K）。これらのデータから、A. muciniphilaの投与は、乳化剤による代謝異常の促進をほぼ防ぐのに十分であることが示された。

A. muciniphilaの投与は乳化剤による低悪性度腸炎を防ぐ
この炎症は、病理組織学的解析、リポカリン-2（Lcn2）などの炎症マーカーの測定、大腸や脾臓の肉眼的形態変化で確認することが可能である。したがって、CMCとP80の両方を摂取すると、微妙ではあるが、それでも病理組織学的に明らかな結腸の炎症、特に粘膜と粘膜下層に浸潤する炎症細胞の数が増加した（図2A、B、オンライン補足表S1）。炎症の他の指標はより多様で、P80は糞便中のLcn2および結腸の重量/長さ比の上昇を、CMCは軽度の脾臓腫大を誘発した（図2C-G）。A. muciniphila単体は、水処理マウスにおいてこれらのパラメータに有意な影響を与えなかった。しかし、CMCとP80による低悪性度炎症の誘発は、A. muciniphilaの投与により抑制された。このことは、本菌が乳化剤による悪影響を広く防いでいることを示唆している。

補足資料
[gutjnl-2021-326835supp001.xlsx]
図2
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図2
Akkermansia muciniphilaの投与は、乳化剤による低悪性度腸炎を予防する。マウスをCMC（オレンジ）またはP80（紫）を1.0％含む飲料水（青）に9週間暴露し、週5日、ビヒクル（滅菌PBS、実線バー）またはA. muciniphila（A. muc.、ハッチングバー）を経口投与した。(A）H&E染色した大腸切片の（B）病理組織学的スコアの代表画像；スケールバー、100 µm. (C）63日目の糞便リポカリン-2（Lcn2）レベル、（D）重量／長さ比、（E）結腸長、（F）結腸重量、および（G）脾臓重量。データは平均値±SEMで表した。統計解析は、一元配置分散分析に続いてボンフェローニ・ポストホック検定を用い、有意差は以下のように記録された。*p<0.05, **p<0.01, ***p<0.001. 傾向の正確なp値（0.05≦p＜0.10）は、追加表示のためにグラフに記録されている。ANOVA, 分散分析; CMC, カルボキシメチルセルロース; P80, ポリソルベート80.

A. muciniphilaの投与は乳化剤による微生物叢組成の変化を防ぐ
乳化剤が腸内細菌叢に与える影響は、腸内炎症とその下流域の影響を促進する上で中心的な役割を果たす5 11。そこで次に、A. muciniphilaが乳化剤による腸内細菌叢組成の変化をどの程度改善し得るかを検討した。16S配列解析とUnifrac距離の主座標分析（PCoA）により、投与開始前（0日目、図3A）のマウスのベースライン微生物叢は均質であることが明らかになった。一方、CMCまたはP80に7週間暴露すると、処理に基づく微生物叢のクラスタリングが明らかになった（49日目、図3A、B）ことから、CMCとP80の両方が微生物叢組成を著しくシフトさせたことが示された。この微生物叢組成の明確な変化は、重み付けされていないUnifrac距離の定量化によって確認され、水処理マウスと比較して、微生物叢組成に対するCMCおよびP80の摂取の影響が非常に大きいことが示された（図3C、D）。A. muciniphilaの投与は、それ自体でも、微生物叢の組成に明確なクラスタリングを示し（図3B）、これらの2つのグループからマウスを分離する非加重Unifrac距離が著しく増加する（図3D）一方で、微生物叢α多様性に影響は観察されなかった（図3E）。しかし、A. muciniphila投与中のCMCおよびP80の摂取は、微生物叢の構成にわずかな影響しか及ぼさなかった。具体的には、A. muciniphila投与群は乳化剤処理に関係なく、すべて緊密にクラスタリングしていることが観察され、非加重Unifrac距離測定では、A. muciniphila非投与時のCMCおよびP80による影響よりもはるかに小さいわずかなシフトが見られた。このことから、これらの乳化剤摂取によって引き起こされるマイクロバイオータの障害は、ほぼ完全に防止できることが明らかとなった。最後に、A. muciniphilaに基づくクラスタリングが、そのDNAが糞便中に排泄されることのみによるものではないことを確認するため、Verrucomicrobia門に関連するQiime2生成のアンプリコン配列変異（ASV）をすべて除去して、重み付けしないUnifracを計算した（オンライン補足図 S2）。この方法は上記のクラスタリングに影響を与えず、A. muciniphilaはその門とは独立して腸内細菌叢の構成に影響を及ぼしていることが示された。

図3
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図3
Akkermansia muciniphilaの投与は乳化剤による微生物叢組成の変化を抑制する。マウスをCMC（オレンジ）またはP80（紫）を1.0％含む飲料水（青）に9週間暴露し、滅菌したビヒクル（滅菌PBS、実線バー）またはA. muciniphila（A. muc.、ハッチバー）を週5日投与した。0日目と49日目に採取した糞便から細菌DNAを抽出し、16S rRNA遺伝子の塩基配列を決定した。(A, B) 0日目と49日目の16S rRNA遺伝子配列決定で評価した微生物相の非重み付けUnifracマトリックスの主座標分析(PcoA)。各点は個々の動物を表し、色分けされている（青、水；オレンジ、CMC；紫、P80、水色、水-A. muciniphila；薄いオレンジ、CMC-A. muciniphila；薄い紫、P80-A. muciniphila）。(C, D) (C) 0日目と(D) 49日目の異なるグループのマウスを分離したUnifrac距離 (E) 49日目のShannon alpha-diversity index. データは平均値±SEMで表した。Unweighted Unifracの指標はn=10-25、Shannon indexはn=4-5である。統計解析は一元配置分散分析とボンフェローニ・ポストホックテストで行い、有意差は以下のように記録した。*p<0.05, **p<0.01, ***p<0.001. ANOVA、分散分析；CMC、カルボキシメチルセルロース；P80、ポリソルベート80。

次に、MaAsLin2（Microbiome Multivariable Associations with Linear Models）分析を行い、水処理動物とCMC処理動物またはP80処理動物を比較して、乳化剤摂取によってより有意な影響を受ける特徴を特定しました（オンライン補足図S3）21。その中で、Allobaculum属に属するものが2個（オンライン補足図S3A,B）、Clostridiaceae科に属するものが2個（オンライン補足図S3C,D）、S24-7科に属するものが10個（オンライン補足図S3E-N）、Rikenellaceae科に属するものが2個（オンライン補足図S3O-P）、残りのものはTuricibacter、Plevotella、Odoribacter属およびRuminococcaceaeに属している（オンライン補足図S3Q-T）ことが分かりました。興味深いことに、A. muciniphilaの投与は、これらの分類群のほとんどで、乳化剤の消費による変化を防いだが、わずかな差は、A. muciniphilaを毎日投与してもベースライン（水処理）レベルに戻らなかった。例えば、S24-7ファミリーに属する様々なメンバーは、CMCおよびP80の摂取により有意に増加した。一方、これらのOTUは、A. muciniphilaを毎日投与しても、CMCやP80によって変化しなかった（オンライン補足図S3E-I）。さらに、乳化剤投与マウスではPrevotellaに関連する機能が消失していたが、A. muciniphilaの投与によりそのような減少は完全に防止された（online supplemental figure S3R）。したがって、これらのデータは、A. muciniphilaが腸内細菌叢の構成に著しい影響を与え、細菌叢を乳化剤による変化に抵抗性にしていることを実証している。

A. muciniphilaの投与は乳化剤による腸の異常と微生物叢の侵入を防ぐ。
CMCやP80をはじめとする微生物相の変化は、フラジェリンやLPSといった炎症性アゴニストのレベルに影響を及ぼすことがある5。そこで次に、TLR5およびTLR4レポーター細胞を用いて、糞便中のこれらのアゴニストの機能レベルを測定した。乳化剤によってフラジェリン（FliC）とLPSが上昇する傾向が見られたが、統計的な有意差には至らなかった（オンライン補足図S4A,B）。先行研究22-24に基づき、CMCおよびP80を摂取した動物に大腸の形態学的変化を求めたところ、クリプトあたりの杯細胞数の減少が観察された（図4A,B）。一方、A. muciniphilaを毎日投与した動物は、乳化剤による杯細胞への影響から完全に保護された。さらに、乳化剤の摂取だけでは大腸クリプトの構造に十分な影響を与えなかったが、A. muciniphila投与マウスは、以前報告したようにクリプト深度の増加を示した（図4A-C）22-24 乳化剤摂取の別の結果として、後に上皮/微生物叢距離の減少として現れる微生物叢の粘液への侵入を誘導する5。11 25 このような微生物叢の侵入は、様々な自然免疫および適応免疫シグナルの活性化を通じて、乳化剤による慢性低グレード腸炎および代謝異常の中心的役割を果たすと仮定される。そこで、我々は、Carnoy固定結腸標本を用いた共焦点イメージングにより、上皮表面から微生物叢メンバーまでの距離を測定し、微生物叢の侵入を検討した。この方法は、CMCまたはP80の摂取が微生物叢の侵入を誘導するという報告を再現しており、平均細菌/上皮は水処理マウスの13.80μmからCMC処理マウスでは4.75μm（p<0.001）、P80処理マウスでは5.55μm（<0.001）へと減少した（図4D、E）。このような微生物叢の侵入は、FliCおよびLPSに対する循環免疫反応に対するいかなる影響とも関連しなかった（オンライン補足図S4C,D）。A. muciniphilaの投与は、それ自体では細菌-上皮間距離を変化させなかったが、驚くべきことに、A. muciniphila投与は乳化剤による微生物群の侵入を完全に防ぎ、水処理、CMC処理およびP80処理群ではそれぞれ14.21 μm, 13.56 μm および 12.99 μmの距離を観察した（図4D,E）。このように、A. muciniphilaは、腸内炎症の主要な特徴である乳化剤による微生物叢の侵入を防ぐことができる。

図4
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図4
Akkermansia muciniphilaの投与は、乳化剤による腸の異常と微生物叢の侵入を防ぐ。マウスを1.0%のCMC（オレンジ）またはP80（紫）を含む飲料水（青）に9週間暴露し、週5日、ビヒクル（無菌PBS、実線バー）またはA. muciniphila（A. muc.、ハッチバー）を経口投与した。大腸は免疫染色と蛍光in situハイブリダイゼーション（FISH）の後、共焦点顕微鏡で微生物叢の局在を解析した。(A, B) 大腸切片をアルシアンブルーで染色し、1動物あたり17-23個のクリプト（大腸切片あたり3-5個）をランダムに選択し、クリプトあたりの杯細胞数（A）およびクリプト深度（B）を測定した。(C) 5個の生物学的複製から得られた代表的な写真、アルシアンブルー染色。スケールバー：100 µm。(D) 各条件における腸管上皮細胞(IEC)に最も近い細菌の距離。 (E) 5生物学的複製から得られた代表写真、微生物叢と粘液の染色。MUC2（緑）、アクチン（紫）、細菌（赤）、DNA（青）。スケールバー：50μm。統計解析は一元配置分散分析とボンフェローニ・ポストホック検定を行い、有意差は以下のように記録した。**p<0.01, ***p<0.001. ANOVA, 分散分析; CMC, カルボキシメチルセルロース; P80, ポリソルベート80.

A. muciniphilaの投与は乳化剤による大腸のトランスクリプトームの変化を抑制した。
次に、乳化剤による微生物叢の変化をA. muciniphilaがどの程度改善するのか、腸内遺伝子発現に影響を与えるのかを検討した。乳化剤の摂取が大腸の遺伝子発現に与える影響と、A. muciniphilaの補給が果たす調節的役割の可能性を明らかにするために、アンターゲットRNA-seq解析を実施した。RNA-seqデータセット全体を用いたブレイ・カーティス距離のPCoAによって明らかになったように、CMCとP80の消費はどちらも大腸トランスクリプトームに有意な影響を与え（図5A、Permanova p=0.048）、CMCとP80はそれぞれ351と478の遺伝子発現を有意に変化させた（図5B、C、Cuffdiff cut-off q-value<0.05 ）ことが確認されました。さらに、A. muciniphila の投与は、乳化剤によるトランスクリプトームの変化を完全に止めることはできないが、劇的に減少させた（図 5D およびオンライン補足図 S5）（Permanova p=0.430）（図 5E）。微量発現遺伝子（DEGs）の詳細な解析により、CMCとP80は、CMCで202遺伝子、P80で329遺伝子、そして両方の乳化剤で149遺伝子が影響を受け、共有および化合物特異的な変化を誘発することが明らかになった（図5B、オンラインの補足図5B、C、オンライン補足表S2およびS3）。興味深いことに、研究した変数の数と影響を受けた遺伝子の割合から、CMCとP80が独立したメカニズムで結腸の遺伝子発現に影響を与えているなら、149の代わりに8つの共通遺伝子だけが観察されるはずであり、これら2つの化合物が粘膜炎症に関連すると思われる共通の変化を促すことを裏付けている。このことは、これらの遺伝子に着目したBray Curtis距離のPCoAによってさらに支持された。PCoAは、PC1に沿って水処理群と乳化剤処理群の間で強い差分集積を示し、PC2に沿ってCMCとP80群の間ではそれほど差がなかった（オンライン補足図S5F、Permanova p=0.006）。さらに、A. muciniphilaの補給は、オンライン補足図S5Gに示されるように、このクラスタリングを完全に防止し（Permanova p=0.150）、A. muciniphila投与がCMC誘導性およびP80誘導性の両方のトランスクリプトーム変化に対抗できることを示している。

補足資料
[gutjnl-2021-326835supp002.xlsx]
補足資料
[gutjnl-2021-326835supp003.xlsx]
図5
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Akkermansia muciniphilaの投与により、乳化剤による大腸のトランスクリプトームの変化が抑制された。マウスにCMCまたはP80を1.0%含む飲料水を9週間与え、滅菌PBSまたはA. muciniphila (A. muc.)を週5日経口投与した。大腸RNAを抽出し、NextSeqシークエンスに供した。(A) 大腸トランスクリプトーム（全遺伝子を含む）のBray-Curtis距離行列の主座標分析（PCoA）、ドットは処理によって色分け（水＝青；CMC＝オレンジ；P80＝紫）。また、様々なグループからサンプルを分離するブレイカーチス距離も示している。(B) CMC（オレンジ）および/またはP80（紫）により発現が有意に変化した遺伝子の数を示すベン図。(C) 大腸トランスクリプトーム（全遺伝子を含む）のブレイ・カーティス距離行列のPCoAを、処理ごとにドットで色分けしたもの（水-A. ムチニフィラ＝水色、CMC-A. ムチニフィラ＝薄橙、P80-A. ムチニフィラ＝薄紫）。また、各グループのサンプルを分離したBray-Curtis距離も表示した。(D) A. muciniphila処理群において、CMC（橙色）および／またはP80（紫色）により発現が有意に変化した遺伝子の数を示すベン図である。(E) CMC対水、P80対水の比較で変化したパスウェイ/機能を表すヒートマップ。PERMANOVAのp値は各PCoAの下部に表示されている。CMC、カルボキシメチルセルロース、P80、ポリソルベート80。

機能レベルでは、乳化剤に反応して変化したDEGは、炎症（マクロファージマーカー、抗原処理および提示、インターロイキン-7およびインターロイキン-27シグナル伝達経路、サイトカイン刺激に対する応答の調節）および代謝（不飽和脂肪酸代謝プロセス、脂質代謝プロセス分泌の調節）プロセスなどの機能の配列からなる（図5Cおよびオンラインの補足図S6）。A. muciniphilaを毎日投与すると、これらの遺伝子やプロセスの発現が基礎レベルに回復したことは、オンライン補足図S6、S7に示すように、この細菌が、通常は慢性腸炎や代謝異常を伴う状況において健康な粘膜環境を促進するという考えをさらに裏付けるものであった。

考察
微生物叢形成不全は、腸の炎症、ひいては多くの慢性炎症性疾患を引き起こす中心的な役割を果たすと考えられている28 29。微生物叢形成不全の特徴には、有益な細菌の枯渇を伴う種組成の変化と、通常はほぼ無菌の内粘液層への細菌侵入の増加によって定義される微生物叢の侵襲とがある3。5 細菌叢の侵入は、腸の炎症を引き起こす大きな役割を果たすと考えられています。微生物叢の異常や侵入には幅広い原因があると思われますが、慢性炎症性疾患の発生率の増加は、環境（すなわち非遺伝的）決定要因の大きな役割を支持しています30。例えば、我々や他の研究者は、食事性乳化剤の摂取が微生物叢の組成変化と浸食を引き起こし、低悪性度炎症とメタボリックシンドロームを最もよく引き起こすことを明らかにしてきた5。33-36 我々は、乳化剤によって内因性A.muciniphilaが枯渇する一方で、外因性A.muciniphilaの投与によって乳化剤が微生物叢と宿主に及ぼす影響が完全に抑制されることを観察した。特に、CMCとP80が微生物叢の構成、微生物叢の局在、結腸の遺伝子発現、炎症指標、代謝に与える顕著な影響は、A. muciniphila投与マウスではすべて見られなかった。したがって、A. muciniphilaの投与は、乳化剤の摂取による有害な影響を回避する一つの手段であると考えられる。

この菌は2004年にDerrienらによって初めて単離され13 、その後、マウスやヒトに存在し、前臨床試験および臨床試験において代謝異常を予防することが確認され注目されている16。 -A. muciniphilaがこれらの疾患に効果を発揮するメカニズムはまだ完全に解明されていませんが、この粘液を好む細菌が、粘液を消化する能力によって、あるいは最も可能性の高い、表面分子や分泌分子を通じて宿主の防御と粘液分泌をアップレギュレートすることによって、粘液のターンオーバーを早め、それを強化する能力に関係していると考えられています17。A. muciniphilaが乳化剤から腸を保護するメカニズムはまだ解明されていないが、膜結合型Amuc_100、17 38分泌型P9、19膜結合型リン脂質ジアシルホスファチジルエタノールアミン、39、そして最近NF-kBシグナル経路を調節する能力を持つADPヘプトース様分子を放出することが明らかになった40が関係しているのかもしれない。さらに、A. muciniphila と宿主の相互作用には、TLR2 シグナル経路17 39 や IL10 および IL22 サイトカインの調節が関与していることを示唆する証拠が蓄積されている。

本研究は、乳化剤がin vitroのヒト微生物叢に直接影響を与えるという過去の報告11 12 と共に、A. muciniphilaが微生物叢の構成に直接影響を与えることなく乳化剤による微生物叢の侵入とその炎症および代謝への影響を防ぐのではないかという仮説に至った。しかし、A. muciniphilaは、意外にも乳化剤による微生物叢の組成変化をも防いでいるようである。したがって、この結果は、A. muciniphilaの主な作用機序が、乳化剤による大腸杯細胞の減少を逆転させることから示唆されるように、粘液バリアの強化にあり、in vivoでの微生物叢組成の変化は、我々のin vitro研究で示唆されていた乳化剤と微生物叢の直接的相互作用を反映しているというよりは、侵食による炎症の結果であるという可能性もある。しかし、この可能性に対して、我々はA. muciniphila単独あるいは乳化剤の存在下で粘液の遺伝子発現に変化を観察しなかった。そこで、我々はA. muciniphilaの作用メカニズムについて、別の、あるいは追加の可能性を提案する。すなわち、A. muciniphilaは微生物叢に直接作用し、その構成を乳化剤の影響を受けにくいものに変化させる可能性があると考えた。しかし、A. muciniphilaがどのようにして微生物相を乳化剤から守るのかについては、さらなる研究が必要である。また、A. muciniphilaの投与期間中の微生物相の変化を経時的に調査することにより、このプロバイオティクスが粘液と微生物相の関係に与える影響を明らかにすることができる。さらに、他の常在菌の影響を分析することによって、A. muciniphilaが介在する防御の特異性を調査することも重要である。これには、Bifidobacterium、Prevotella、Faecalibacteriumなど、乳化剤曝露によって有害な影響を受ける他の微生物叢メンバー5 10や、Bacteroides thetaiotaomicronなど、粘液層の恒常性を調節する能力を持つ細菌が含まれる45。これらの研究を総合すると、ムチンフィラが食事性乳化剤摂取に対してどのように防御するのかという機構的理解が得られると予想される。

本研究では、主にA. muciniphilaに焦点を当てましたが、その作用を研究する過程で、RNA-seq解析により乳化剤による微生物叢の侵入が大腸のトランスクリプトームに与える影響について初めて非標的研究を実施しました。このアプローチにより、両方の乳化剤によって誘発される深い宿主応答が明らかになりました。制御された遺伝子の22%はCMC処理マウスとP80処理マウスで共通でしたが、78%は一方の化合物にのみ特異的でした。このことは、これら2つの乳化剤が宿主-微生物叢界面で共通および特異的なメカニズムを介して作用するというこれまでの観察結果を裏付けています。乳化剤によって誘発される腸の炎症について、さらなる詳細な検討が必要である。例えば、フローサイトメトリーによる免疫細胞の表現型解析やシングルセルRNAシークエンスによる細胞レベルでのトランスクリプトーム解析により、乳化剤摂取に対する宿主応答やA. muciniphila投与の影響についてより深い理解が得られると思われる。

乳化剤によって引き起こされる代謝異常は、代謝異常の改善方法の候補となる扱いやすいモデルであるが、このモデルにおけるA. muciniphilaによる保護は、他の炎症の引き金にも広く適用できる可能性があると思われる。実際、CMCとP80はWTマウスでは代謝異常を促進するが、遺伝的にこれらの疾患に罹患しやすいマウスでは大腸炎や癌の発症率と重症度を高める。さらに、A. muciniphilaはCMCやP80の暴露に対しても同様の保護効果を示したが、これらはいずれも非代謝物であり46 47、異なるメカニズムで腸内細菌叢に作用することから11、観察された保護効果は化合物特異的ではないことが示唆された。しかし、A. muciniphilaのサプリメントが、微生物叢の構成と炎症誘発性に著しい悪影響を及ぼすことが判明したカラギーナン乳化剤などの他の添加物から保護する能力を調査する必要がある12。同様に、微生物叢の安定性と粘液層の迅速な更新が、微生物叢の異常とその結果として起こる炎症を誘発する現代の様々なストレス因子から保護すると予想される。この見解は、カニの研究室と共同研究者たちが、生きたムチニフィラや低温殺菌したムチニフィラが、マウスだけでなく、被験者のメタボリックシンドロームがさまざまな多因子性の根本原因から生じたと推定される小規模臨床試験の代謝パラメータを改善することを示した研究結果と一致する16 -18 20。 -18 20 しかし、複数の乳化剤を含むことが多い超加工食品の消費との関連性がますます認識されていることから、そのような食品の消費者は、A. muciniphilaサプリメントから恩恵を受ける可能性が特に高いと推測している。このような食品を保護する実用的な戦略を立てるには、根本的なメカニズムの理解を深める必要があるが、最終的には、これらの食品が持つ負の側面を軽減する手段となることが証明されるかもしれない。

材料と方法
材料
Sodium CMC (average MW ~250 000) と P80 は Sigma (Sigma, St. Louis, MO) から購入した。Derrien ら13 によって以前に単離された A. muciniphila は ATCC から購入した (Reference #BAA-835) 。ATCCの推奨に従い、A. muciniphilaをBrain Heart Infusion broth中で37℃、72時間、厳密な嫌気条件下で増殖させた。その後、4500 gで15分間遠心分離して細菌をペレット化し、滅菌PBSで2回洗浄した後、6.32×108個/mL（連続希釈およびBrain Heart Infusion寒天プレート上でのプラッティングにより決定）で分注し、-80℃で保管した。得られたアリコートの純度は、細菌DNA抽出と16S rRNA遺伝子配列決定によって決定され、A. muciniphila懸濁液に環境汚染がないことが明らかになった（オンライン補足図S1A）。

マウス
5-6週齢の野生型C57BL/6雄マウスをThe Jackson Laboratoryから購入した（文献番号000664）。ジョージア州立大学にて、機関承認のプロトコル（Institutional Animal Care and Use Committee No A18006）のもと、マウスを無作為にグループ分けして収容し（1ケージあたりn=5）、LabDiet rodent chow diet #5001 ad libitumと逆浸透膜処理したアトランタ市水ad libitumで飼育した。マウスは水（対照群、N=10）、CMC（N=10）またはP80（N=10）を飲料水で希釈した溶液（それぞれ1.0％w/vとv/v）に9週間暴露し、1週間ごとに溶液を交換した。各グループについて、半数のマウス（N=5）には滅菌PBS（ビヒクル）400μLを週5日投与し、半数のマウス（N=5）にはA. muciniphilaのコロニー形成単位2.528×108個を含むPBS400μLを週5日投与した。体重は1週間ごとに測定した。摂餌量は、同じ週に2回、マウス群を清潔なケージに入れ、既知の量の餌を与えて24時間置き、その時点で残りの餌の重量を測定することにより測定した。摂餌量は、24時間当たりのマウス1匹あたりのグラム数で表した。0日目、49日目、63日目に新鮮な糞を採取し、下流域での分析に使用した。9週間の処置後（63日目）、マウスを安楽死させ、片側の副睾丸脂肪パッド重量、脾臓重量、結腸重量および結腸長を測定した。組織は、以下に詳述するように、下流解析のために収集された。詳細な実験デザインは、図1Bに表されている。

空腹時血糖値測定
5週間の投与後、マウスを清潔なケージに入れ、15時間絶食させた。その後、Nova Max Plus Glucose Metreを用いて血糖値を測定し、mg/dLで表示した。

経口GTT
8週間投与後、マウスを15時間絶食させ、GTTを実施した。グルコース（2g/kg）を腹腔内投与し、Nova Max plus Glucose Metreを用いて、グルコース負荷前と15, 30, 60, 90, 120分後の糖代謝を記録した。

ELISAによる糞便中リポカリン-2（Lcn-2）の定量化
ELISAによる糞便中Lcn-2の定量では、凍結した糞便サンプルを0.1% Tween 20を含むPBSで最終濃度100 mg/mLに再構成し、20分間ボルテックスして均質な糞便懸濁液とした48。透明な上清を回収し、分析まで-20℃で保存した。Lcn-2レベルは、発色ペルオキシダーゼ基質テトラメチルベンジジンを用いたDuoset murine Lcn-2 ELISAキット（R&D Systems, Minneapolis, Minnesota, USA）を用いて上清中に推定し、光学密度は450 nm（Versamaxマイクロプレートリーダー）で読み取った。

illumina技術を用いた16S rRNA遺伝子配列決定による微生物叢の解析
微生物叢の解析は、食餌性乳化剤曝露前（0日目）および曝露後（49日目）に実施した。図1Aに示したA. muciniphilaの相対量は、16週間の食餌性乳化剤曝露後に、以前のプロトコルで測定したものである。16S rRNA遺伝子の増幅と配列決定は、Earth Microbiome Projectのプロトコルに従い、MOBIO PowerSoil DNA Isolation KitのDNA抽出手順に修正を加えてIllumina MiSeqテクノロジーを用いて行った（https://press.igsb.anl.gov/earthmicrobiome）49 50 MoBio Laboratories（米国カリフォルニア州カールズバッド）のPowerSoil-htpキットで、機械破砕（ビーズビート）により冷凍糞便からバルクDNAを抽出した。16S rRNA遺伝子、領域V4は、複合フォワードプライマーと、Golayエラー訂正スキームを用いて設計したユニークな12塩基バーコードを含むリバースプライマーを用いて各サンプルからPCR増幅し、PCR産物にタグ付けした50)。フォワードプライマー515F 5'- AATGATACGGCACCGAGATCTACGCTXXXXXXXXTATGTAATTGTGYCAGCMGCCGCGTAA-3'を使用した。斜体の配列は5'イルミナアダプター、12 X配列はゴレイバーコード、太字の配列はプライマーパッド、斜体および太字の配列はプライマーリンカー、下線の配列は保存細菌プライマー515Fである。使用したリバースプライマー806Rは、5'-CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATTCAGCCAGCCGACTACNVGGTWTCTAAT-3'：斜体の配列は、Illuminaアダプターの3'逆相補配列、太線の配列はプライマーパッド、斜体の太線の配列は、プライマーリンカー、下線の配列は、保存された細菌のプライマー806Rである。PCR反応はHot Master PCR mix (Quantabio, Beverly, Massachusetts, USA), 0.2 mM of each primer, 10-100 ng templateからなり、反応条件はBiorad thermocyclerで95℃で3分、その後95℃で45秒、50℃で60秒、72℃で90秒を30サイクル行った。PCR産物はAmpure magnetic purification beads (Agencourt, Brea, California, USA)で精製し、ゲル電気泳動で可視化した。産物はQuant-iT PicoGreen dsDNA assayを用いて定量した(BIOTEK Fluorescence Spectrophotometer)。精製された生成物から等モル比のマスターDNAプールを作製した。プールした生成物をQuant-iT PicoGreen dsDNA assayを用いて定量し、Cornell University, IthacaでIllumina MiSeq sequencer (paired-end reads, 2×250 bp) を用いて塩基配列を決定した。

16S rRNA遺伝子配列解析
16S rRNA配列は、QIIME2-バージョン2019を使用して分析した51。イルミナアンプリコン配列データを検出および修正するために、QIIME2デフォルトパラメータでDada2法52を使用して配列を脱多重化および品質フィルターし、Qiime 2アーティファクトのテーブルを作成した。次に、align-to-tree- mafft-fasttreeコマンドを用いて系統多様性解析のための木を生成し、core-metrics-phylogeneticコマンドを用いてアルファおよびベータ多様性解析を計算した。PCoAプロットは、実験グループ間のばらつき（β多様性）を評価するために使用された。分類学解析では、Greengenes参照データベース13_8とのペアワイズ同一性が99%の閾値を持つオペレーション分類学ユニット（OTU）に特徴を割り当てた。53 未処理のシーケンスデータは、中国科学院北京ゲノム研究所BIGデータセンターのゲノムシークエンスアーカイブ（GSA）にアクセッション番号XXXXXで寄託されていて、一般にアクセスできる。 http://bigd.big.ac.cn/gsa.

定量的PCR解析
QIAamp Fast DNA Stool Mini Kitを用い、製造元の指示に従い、連続希釈したA. muciniphila株から細菌DNAを抽出した（Qiagen）。その後、LigthCycler 480（Roche Molecular Systems社製）を用いて、連続希釈したA. muciniphilaストックからのDNA、および28日目に採取した糞便サンプルから抽出したDNAに対して定量的PCRを実施した。結果は、順次希釈したA. muciniphilaストックから得た標準曲線に基づき、A. muciniphila /mg faecesで示した16。

大腸組織の染色と病理組織学的解析
マウス近位結腸をメタノール-カルノー固定液（60%メタノール、30%クロロホルム、10%氷酢酸）中に室温で3時間以上置き、4℃で保存した。その後、組織をメタノール2×30分、絶対エタノール2×15分、エタノール/キシレン（1：1）15分、キシレン2×15分で洗浄し、パラフィンに垂直方向に包埋した。その後、組織を4μmの厚さで切開した。組織学的スコアを得るために、標準プロトコルを用いてスライドをH&Eで染色した。画像は、Hist'IMプラットフォーム（INSERM U1016、パリ、フランス）でLamina Slide Scanner（Perkin Elmer）を使用して取得された。組織学的スコアリング(0から36の範囲)は、以前に記述されたように、各大腸について盲検で決定した48 54。簡単に言えば、各大腸は粘膜、粘膜下層、筋層/漿膜の上皮損傷と炎症浸潤の程度に基づいて、4つのスコアを割り当てられた54。

大腸切片（4 μm）をアルシアンブルーで染色し、ムコ多糖を優先的に染色し、動物ごとに17-23個の小嚢（大腸切片あたり3-5個）をランダムに選択し、小嚢あたりのゴブレット細胞数と小嚢深さを決定した。

統計解析
データは平均値±SEMで表し、統計解析はGraphPad Prismソフトウェア（V.8）を用いて実施した。有意性は、一元配置分散分析（ANOVA）を用いて決定し、次いで棒グラフについてボンフェローニ・ポストホック検定を行い、以下のように記した。*p<0.05, **p<0.01, ***p<0.001. 折れ線グラフ形式の異なるタイムポイントで収集したデータについては、二元配置反復測定ANOVAまたは混合効果モデル（欠損値の場合）をBonferroniポストホックテストとともに実施し、有意性は以下のように記した。CMC vs 水, *p<0.05, **p<0.01, ***p<0.001; P80 vs 水, #p<0.05, ##p<0.01, ###p<0.001. 結果はp<0.05で有意とみなした。マイクロバイオータデータの統計解析のため、Microbiome Multivariable Associations with Linear Models (MaAsLin 2) を用いて最も有意に差のある20の特徴を特定した21。Volcanoプロットの閾値をq<0.05とした。

補足方法についてはオンライン補足資料をご覧ください。

補足資料
[gutjnl-2021-326835supp005.pdf]
データ提供について
データは、合理的な要求に応じて利用可能です。未処理のシーケンスデータは、European Nucleotide Archiveにアクセッション番号PRJEB57855で寄託されています。

倫理に関する記述
論文発表のための患者同意書
該当なし

謝辞
Hist'IM and the Genom'IC platforms (INSERM U1016, Paris, France)の協力に感謝します。Emilie Viennois博士とOmry Koren博士には、原稿の批評や有益な議論をしていただき、感謝している。

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補足資料
補足資料
このウェブのみのファイルは、著者から提供された電子ファイルからBMJ Publishing Groupが作成したもので、内容については編集されていません。

データ補足1
データ補足2
データ補足3
データ補足4
データ補足5
脚注
ツイッター @NoemieDaniel2, @BenoitChassaing

寄稿者 ND、ATG、BCは本研究の構想・設計に貢献した。ND と BC は実験の実施と分析を行った。NDとBCは統計解析を行った。全著者が論文に貢献し、提出されたバージョンを承認した。BCは本研究の保証人である。

資金提供この研究は、欧州連合のHorizon 2020研究・革新プログラムの下での欧州研究評議会（ERC）からの開始助成金（助成金契約番号：No. ERC-2018-StG- 804135）、IdEx Université de ParisのChaire d'Excellence（ANR-18-IDEX-0001）、Kenneth Rainin財団のInnovator Award、Fondation de l'avenir (AP-RM-21-032), ANR grant EMULBIONT (ANR-21-CE15-0042-01) and DREAM (ANR-20-PAMR-0002) and the national program 'Microbiote' from INSERM.,の助成金を得た。研究計画、データ収集、分析、解釈、原稿執筆において、資金提供者は一切関与していない。

競合する利益なし。

患者および一般市民の参加この研究のデザイン、実施、報告、普及計画において、患者および一般市民は関与していない。

証明および査読受託研究ではなく、外部査読を受けている。

補足資料本内容は、著者により提供されたものである。BMJ Publishing Group Limited (BMJ)の審査を受けておらず、査読を受けていない可能性がある。本コンテンツは、BMJ Publishing Group Limited (BMJ)の審査を受けておらず、査読を受けていない可能性があります。BMJは、コンテンツに依存することから生じるすべての責任および義務を負いません。コンテンツに翻訳物が含まれる場合、BMJは翻訳の正確性と信頼性を保証せず（現地規制、臨床ガイドライン、用語、薬剤名、薬剤投与量を含むがこれに限らない）、翻訳および翻案から生じるいかなる誤りおよび不作為に対して責任を負わない。

キーワードは以下の通りです。微生物叢、粘液、乳化剤、代謝、炎症、プロバイオティクス、Akkermansia muciniphila、腸内トランスクリプトーム

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