アッカーマンシア（Akkermansia muciniphila）とパラバクテロイデス（Parabacteroides distasonis）は腸内のILC3を促進することで相乗的に大腸炎を予防する

2024年6月17日 11:25

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研究論文
2024年3月12日
アッカーマンシア（Akkermansia muciniphila）とパラバクテロイデス（Parabacteroides distasonis）は腸内のILC3を促進することで相乗的に大腸炎を予防する

https://journals.asm.org/doi/10.1128/mbio.00078-24

著者 Joana Gaifem https://orcid.org/0000-0001-7306-7378 jgaifem@i3s.up.pt, Ana Mendes-Frias, Mathis Wolter, Alex Steimle, Maria Jose Garzón, Carles Ubeda, Clarisse Nobre, SHOW ALL (15 AUTHORS), Ricardo Silvestre https://orcid.org/0000-0002-9270-2717 ricardosilvestre@med.uminho.ptAUTHORS INFO & AFFILIATIONS
DOI: https://doi.org/10.1128/mbio.00078-24
引用
PDF/EPUB

mBio
第15巻第4号
10 2024年4月
概要
はじめに
材料と方法
結果
考察
謝辞
補足資料
参考文献
情報と貢献者
指標と引用
参考文献
図表とメディア
表
シェア
ABSTRACT
炎症性腸疾患（IBD）は、消化管の炎症性疾患群である。IBDの病因はいまだ解明されていないが、この疾患は、不適切な免疫応答と腸内の炎症を引き起こす環境因子と遺伝因子の相互作用から生じることが示唆されている。腸内細菌叢は環境変数として疾病に大きく関与しており、いくつかの原因菌は同定されているが、腸内細菌叢のどの特定のメンバーが腸管上皮のバリア機能を助け、疾病から身を守るのかについてはほとんど知られていない。我々は、2つの異なる動物施設のマウスに化学的に大腸炎を誘発したところ、偶然にも1つの施設のマウスが発病に対して顕著な抵抗性を示し、それが上皮バリア完全性のマーカーの増加と関連していることを見出した。重要なことは、抵抗性マウスの微生物叢において、Akkermansia muciniphilaとParabacteroides distasonisが有意に増加していたことである。これらの微生物と病気に対する防御との因果関係を明らかにするために、この2つの細菌種を感受性マウスにコロニー形成させた。その結果、A. muciniphilaとP. distasonisは、大腸の3型自然リンパ球の頻度を高め、腸上皮の完全性を改善することによって、急性および慢性大腸炎モデルにおいて相乗的に保護効果を発揮することが明らかになった。以上のことから、腸管免疫を形成し、腸管上皮バリアの安定性を高めることによって、重篤な腸管炎症に対する防御を提供する常在微生物の複合的な働きが明らかになった。本研究は、腸内ホメオスタシスを規定する腸内細菌の有益な役割を明らかにするものであり、IBDの臨床管理に微生物主導型の治療アプローチを採用するための重要な一歩である。
重要性
恒常性と炎症のバランスに対する腸内細菌叢の寄与は広く知られている。それにもかかわらず、遺伝学、免疫応答、環境的手がかりの影響を受けることが知られている炎症性腸疾患の病因は依然として不明である。従って、腸内環境を保護する新規な因子、すなわち微生物叢の構成因子を解明することは、IBDに対処する新規な戦略を開発する上で極めて重要である。本研究では、Akkermansia muciniphilaとParabacteroides distasonisという2つの常在細菌株が、大腸粘膜における上皮バリアーの完全性を高め、3群自然リンパ球を促進することによって、急性および慢性の大腸炎誘発モデルに対する防御を誘導する相乗的相互作用を明らかにした。本研究は、常在細菌が腸の恒常性維持にどのように有益に作用するかについての新たな知見を提供するものであり、IBDに取り組むための微生物由来の戦略の利用に向けて新たな道を開く可能性がある。
はじめに
消化管には、細菌から真菌、ウイルスに至るまで、宿主と共進化し相互作用を発達させてきた微生物の広大なコミュニティーが存在する。これらの微生物は、ニッチを占拠し（その結果、病原体のコロニー化を回避する）、微生物代謝を通じてのみ宿主に利用可能なビタミン、代謝産物、その他の栄養素を合成するなど、腸内に見られる複雑な環境において役割を果たしている(1)。感染に対する防御機構として働くだけでなく、いくつかの病原体認識レセプターが微生物叢を感知し、ホメオスタシスに向けて宿主と有益な関係で応答することで、腸管上皮バリアとの相互作用を媒介する(1)。その結果、腸管上皮バリアが存在することで、微生物と免疫細胞の過剰な接触を防ぐことができる(2)。この意味で、腸内恒常性を維持するためには、微生物叢、腸管バリア機能、免疫系の相互作用を微調整する必要がある。したがって、このダイナミックな相互作用に影響を及ぼす変化は、炎症性腸疾患（IBD）のような腸の炎症を誘発する可能性がある(3, 4)。
IBDは、クローン病（CD）と潰瘍性大腸炎（UC）の両方を含む、消化管の慢性的で衰弱性の疾患である。この疾患は、その病因病態に関する知識がまだ不足しており、効率的な治療法の開発を妨げているため、臨床上大きな問題となっている(5)。とはいえ、腸内細菌叢に対する免疫反応の増悪が、しばしば遺伝的感受性因子によって増強されることが、この疾患の主な原因であることはよく知られている(5, 6)。長年にわたり、常在細菌が腸内恒常性維持にいかに有益または有害であるか、Faecalibacterium prausnitziiやBacteroides fragilisのような常在細菌がそれぞれいかに有益または有害であるかが、いくつかの報告で実証されてきた（7, 8）。しかし、これらの研究のいくつかは、門レベルに限定されているため、特定のプレイヤーを特定するのに必要な精度に欠けている（9, 10）。さらに、単一の微生物が疾患の進行に及ぼす影響だけでなく、異なる常在細菌間の相互作用がIBDの発症に何らかの役割を果たすかどうかも不明である。本研究で得られた知見は、A. muciniphilaとP. distasonisがUCに対する防御を促進する上で重要な役割を果たしうることを示している。さらに、A. muciniphilaによる有益な効果は、大腸の3型自然リンパ球（ILC3）の濃縮と腸上皮の完全性の改善に依存していることが明らかになった。さらに、A. muciniphilaの特性は、P. distasonisとの共コロニー化によって増幅される可能性があり、IBDに対処するための新しい微生物ベースの治療法を開発するためには、単一の微生物プロバイオティクスに焦点を当てるのではなく、微生物叢のプレーヤー間の複雑な相互作用を研究することの重要性を補強している。
材料と方法
マウス
一方のグループはCharles River Laboratories（フランス）から購入したもので、もう一方のグループは以前は同じ企業から購入したものであったが、ICVS Animal Facilitiesで特定の病原体フリー条件下で飼育・繁殖されたものである（1ケージあたり4～6匹）。本研究で用いたRag2ノックアウト（Rag2-ko）マウスは上記の条件に従って飼育された。マウスの安楽死は、苦痛を最小限にするよう努めながらCO2吸入により行った。
大腸炎の誘発
7-9週齢のマウスにデキストラン硫酸ナトリウム（DSS；3％(wt/vol)、分子量約40,000Da；TdB Consultancy）を7日間自由摂取させた。大腸炎の臨床徴候を毎日モニターし、CardosoらおよびGaifemら(11, 12)の両者から採用した段階的スコアを用いて疾患活動性指数(DAI, 表1)を測定した。マウスは各実験の終了時、または臨床的疾患の症状が20％以上の体重減少、下痢、肉眼的出血のいずれかのエンドポイントに達した場合、それ以前に安楽死させた。慢性大腸炎モデルについては、2%DSSを飲料水に5日間、3週間の間隔をおいて2段階に分けて投与した。
表1
表 1 疾患活動性指標スコアa
スコア体重減少便の硬さ出血
0 出血なし正常
1 1%-5% 軽度-軟便褐色
2 6%-10% 非常に軟らかい赤褐色
3 11%-15% 下痢血便
4 16%-20% 重大な出血
5 >20%
a
最終スコアは各パラメータの合計で求められる。
組織学的分析
大腸のサンプルを4％パラホルムアルデヒドで固定し、5μmのパラフィン包埋切片をヘマトキシリン・エオジンで染色した。炎症は病理医が盲検で評価し、以下のように目盛りのついた半定量的システムを用いた（表2）(11)。アルシアンブルー/過ヨウ素酸シッフによる結腸切片の染色は、多糖構造を評価するために行った。杯細胞の数は、各実験条件について盲検で評価した。陰窩開口部から底部まで縦に切断した無傷の陰窩のみを定量した。画像はOlympus BX61顕微鏡で撮影し、Cell^Pソフトウェアを用いてデジタルカメラ（DP70）で記録した。画像解析はFiji（ImageJ）ソフトウェアを用いて行った。
表2
表 2 大腸炎の重症度を組織学的に解析するためのパラメータa
スコア上皮の過形成と杯の減少前膜の白血球浸潤患部重症炎症のマーカー
0 なし／まれなし
1 軽度の増加 3分の1の増加
2 軽度コンフルエント 2/3コンフルエント
3 著明 Transmural すべて Transmural
a
最終スコアは個々のスコアの合計である。重度の炎症のマーカーには潰瘍形成と陰窩膿瘍が含まれる。
フルオレセインイソチオシアネート-デキストラン腸管透過性アッセイ
生体内腸管透過性は、フルオレセインイソチオシアネート（FITC）標識デキストランの投与により評価した。餌と水は8時間絶飲した。マウスに44mg/100g体重のFITC標識デキストラン（4kDa、TdB Consultancy社製）を経口投与した。4時間後に血清を採取し、蛍光強度を分光光度法（励起：485 nm、発光：528 nm）で測定した。
RNA抽出、cDNA、および定量的リアルタイムPCR（qRT-PCR）
TripleXtractor（Grisp社製）を用い、氷上で組織を機械的に破砕しながら大腸サンプルから全RNAを単離し、Xpert cDNA synthesis kit（Grisp社製）を用いて逆転写することによりcDNAに変換した。 qRT-PCRは、Bio-Rad CFX6 Real-Time System C1000 Thermal Cycler（Bio-Rad社製）を用い、KAPA SYBR FAST Universal（Roche社製）を用いて行った。マウスのムチンをコードする遺伝子Muc1、Muc2、Muc13；クローディンをコードする遺伝子Cldn2、Cldn3、Cldn4、Cldn7；およびE-カドヘリン（Cdh1）に対する特異的オリゴヌクレオチドを表3に示す。発現レベルはユビキチン（Ubq）で正規化し、相対発現は∆Ct法に基づいて以下のように決定した： 2(housekeeping gene mRNA expression - target gene mRNA expression) × 100,000。
表3
表3 PCRに用いたプライマーのリスト
プライマーID 順方向配列
(5′→3′) 逆配列
(5′→3′)
Cdh1 CACCTGGAGAGGCCATGT TGGGAAACATGAGCAGCTCT
Cldn2 GGCTGTTAGCACATCCAT TGGCACCAACATAGGAACTC
Cldn3 AAGCCGAATGGACAAAGAA CTGGCAAGTAGCTGCAGTG
Cldn4 CGCTACTCTTGCCATTACG ACTCAGCACCATGACTTG
Cldn7 AGGGTCTGCTCTGTCCTT GTACGCAGCTTTGCTTTCA
Muc1 CCCTATGAGGAGGTTTCGGC AAGGGCATGAACAGCCTACC
Muc2 TCCTGACCAAGCGAAC ACAGCACGACAGTCTTCAGG
Muc13 CTGGCAGCTACATGAGCACT GAACTACCCACGGTCACCAA
Ubq TGGCTATTAATTATTCGGTCTGCAT GCAAGTGGCTAGTGCAGAGTAA
Am CAGCACGTGAAGGTGGGAC CCTTGCGGTTGGCTTCAGAT
Pd TGCCTATCAGGGGGATAAC GCAAATTCCCATGCGGGAT
薄層前膜白血球分離とフローサイトメトリー解析
薄層前膜白血球を分離するために、大腸をCaおよびMgを含まないリン酸緩衝生理食塩水（PBS）に25mM HEPES（Gibco）、50mM炭酸水素ナトリウム（Sigma-Aldrich）、および5％ウシ胎児血清（FBS、Gibco）を加えて洗浄した。0.5-1.0cmの結腸片を、1.3-mM EDTA（Sigma-Aldrich）、25-mM HEPES、50-μg/mL ペニシリン/ストレプトマイシン（Gibco）、および2-mM L-グルタミン（Gibco）を含むCa-およびMg-フリーのHank's balanced salt solution（Gibco）中で、200rpmの攪拌下、37℃で40分間インキュベートした。 15-mg/mLコラゲナーゼD（Roche）、10％FBS、25-mM HEPES、50-μg/mLペニシリン/ストレプトマイシン、および2-mM L-グルタミンを添加したRPMI 1640培地（Gibco）中で、37℃、200rpmの撹拌下で40分間インキュベートした。組織を解離し、70μmのセルストレーナー（BD Biosciences）で濾過した。細胞懸濁液を遠心分離した。ペレットを40% Percoll（GE Healthcare）に再懸濁し、80% Percollの上に置き、600 gで20℃、20分間遠心した。界面に保持された細胞を回収し、2%FBSを含むRPMIで洗浄し、回収した。
細胞を50ng/mL酢酸ミリスチン酸ホルボール、500ng/mLイオノマイシンカルシウム塩、10-μg/mLブレフェルジンAで37℃、4時間刺激した（Sigma-Aldrichより）。細胞をeBioscience Fixable Viability Dye eFluorで染色して生存率コントロールを行い、続いてeBioscience Foxp3/Transcription Factor Staining Buffer Setを用いて表面および細胞内染色をメーカーの指示に従って行った。表面染色は抗マウスCD45（クローン30-F11）、CD90.2（Thy1.2、クローン53-1.2）、CD3（クローン145-2C11）、CD4（クローンGK1.5）、CD19（クローン6D5）、CD11c（クローンN418）、CD11b（クローンM1/70）を用いて4℃で30分間行った。細胞内染色は、RORγT（クローンB2D）、インターロイキン（IL）-17A（クローンTC11-18H10.1）、IL-22（クローンPoly5164）について、4℃で30分間行った。すべての抗体はBioLegendおよびeBioscienceから購入した。ゲーティング戦略を図S1に示す。細胞解析はBD LSRII（Becton Dickinson, USA）で行った。データはFlowJoソフトウェア（Tree Star, USA）を用いて解析した。
ELISAによるサイトカイン定量
大腸組織を秤量し、プロテアーゼ阻害剤（Roche）を含む氷冷PBS中でホモジナイザーを用いて溶解した。タンパク質濃度は、Pierce BCA protein assay kit（Bio-Rad）を用いて定量した。IL-10、IL-17A/F、およびIL-22のレベルは、市販のキット（BioLegend）を用いて、製造業者の指示に従ってELISAで測定した。
細菌培養
ヒト由来のAkkermansia muciniphila（DMS 22959）を、改良酵母・短鎖脂肪酸含有（mYCFA）培地（13）中で、嫌気条件下、ビニール製嫌気チャンバー（Coy Laboratory Products、米国）で培養した。細菌は光学密度（OD）が1.0になるまで増殖させた後、4℃で5,000×g、10分間の遠心分離でペレット化した。細胞はODが0.05になるように新鮮なmYCFAに再懸濁し、2mLのスクリューキャップチューブに嫌気的に封入した。培養物は常温でルクセンブルグからポルトガルまで夜行便で輸送した。
マウスA. muciniphilaは、Eric Martens（米国ミシガン大学）の好意により提供された。この株は、Martensの研究室で、以前に記述したように野生型C57BL/6マウスから分離された（14）。凍結したマウスA. muciniphilaとParabacteroides distasonis（DSM 29491；ドイツのDSMZから購入）のストックを、大腸の体液をシミュレートしたFEED培地［参考文献(15)に記載されているように調製］に10%（vol/vol）の濃度で接種した。接種した培地は、嫌気条件下（80:20, N2:CO2）で37℃に24時間保った。その後、細菌を新鮮なFEED培地（10％vol/vol）に再接種し、600 nmでODが1.5になるまで同じ条件で培養した。生育した細菌を、ペプトン酵母エキスグルコース寒天培地（A. muciniphila用）またはコロンビア血液寒天培地（P. distasonis用）に、Anaerogen 2.5 L（Thermo Scientific社製）を用いた嫌気ジャーで48～72時間培養し、CFU/mLを定量した。細菌の新しい凍結ストックを25%グリセロールで調製し、-80℃で保存した。細菌培養物は、投与前に37℃で30～60分間インキュベートした。
微生物叢の調節
微生物叢減少のための抗生物質投与
C57BL/6マウスにアンピシリン（1 mg/mL）、ストレプトマイシン（1 mg/mL）、バンコマイシン（0.5 mg/mL）、および硫酸ネオマイシン（1 mg/mL）を4週間飲水投与した。抗生物質はすべてSigma-Aldrichから購入した。腸内内容物の好気性培養および嫌気性培養を、5%のヒツジ血液を添加したコロンビア寒天培地プレートで37℃にて行い、治療期間を通じて微生物叢の減少を評価した。CFU数を数え、糞便1ミリグラムあたりの細菌数を算出した。
糞便微生物叢移植
抵抗性マウスの新鮮糞便を直接滅菌済み2mLキャップ付きマイクロチューブに採取し、氷冷PBS（Gibco）に懸濁した後、遠心分離（800×g、5分間）して残存塊を除去した。この再懸濁液（150 μL/日）を感受性群のマウスに経口投与した。図3AおよびCに示すように、それぞれ疾患寛解モデルを用いて抗生物質投与後に糞便微生物叢移植（FMT）を行った。
細菌投与
A. muciniphilaおよびP. distasonisの懸濁液を、滅菌PBS中に最終濃度2×109 CFU/mLで調製した。マウスには群ごとに、各菌株2×108 CFUを100 μLのPBS中に毎日12日間経口投与した。対照群には同量のPBSを投与した。
マイクロバイオーム解析と細菌定量
糞便からゲノムDNAをQIAamp Fast DNA Stool Mini Kit（Qiagen社製）を用いて、メーカーの説明書に従って抽出した。260nmの分光光度計でゲノムDNAを定量した後、16S rRNA遺伝子を増幅し、イルミナのMiSeqプラットフォームを用いて塩基配列を決定し、既述のようにmothurを用いて解析した（17）。配列は、20塩基のウインドウの最小平均品質スコアが30を下回らないように、スライディングウインドウ法を用いてトリミングした。この基準を満たすまで、配列を3′末端からトリミングした。次に、トリミングしたフォワードおよびリバースペアエンド配列を、デフォルトのパラメーターを適用して、fastq-join (18)を用いてアセンブルした。アセンブルしたペアエンド配列のうち、400 bp以上のものはその後の解析に使用した。SILVA reference alignment (19)をテンプレートとし、Needleman-Wunschアルゴリズムをデフォルトのスコアリングオプションで使用して、配列を16S rRNA遺伝子にアライメントした。キメラの可能性のある配列はUchime (20)を用いて除去した。微生物の多様性を過大評価する配列決定エラーの影響を最小化するために(21)、高存在量配列と1%異なる希少存在量配列は、mothur (22)のpre.clusterオプションを使用して高存在量配列にマージした。サンプルあたりの配列数が異なると多様性が異なる可能性があるため（すなわち、カバレッジの高いサンプルではより多くの操作分類単位（OTU）が得られる可能性がある）、配列数が最も少ないサンプル（すなわち、27,287）で得られた配列数に全サンプルを希薄化した。配列はVsearch (23)を用い、abundance-based greedy (agc)クラスタリング法でOTUにグループ化した。距離ベースの類似度が97％以上の配列は同じOTUに割り当てられた。シャノンインデックスはmothurを用いてOTUレベルで求めた。
各配列の系統分類は、Wangらによって記述されたベイズ分類アルゴリズムを用い、ブートストラップカットオフを60%として行った(24)。分類は可能な限り属レベルに割り当て、そうでない場合は属レベルに最も近い分類レベルを示し、その前に "unclassified; UC "を付けた。
細菌の絶対量は、A. muciniphila（Am）（25）およびP. distasonis（Pd）（26）の特異的プライマーを用いて、便DNAサンプル中の細菌コピー数を定量化することにより行った（表3）。値は、それぞれの細菌に属する標的配列の異なるコピー数によって得られた標準曲線から補間した。A. muciniphilaまたはP. distasonisの標的配列は、CloneJET PCR Cloning Kit（Thermo Scientific）を用いてpJET1.2にクローニングし、定量的PCR標準曲線の鋳型として用いた。
CD90+ ILCの枯渇
Rag2-koマウスに250μgのmAb抗マウスThy1.2（CD90.2）（BioXCell）を腹腔内注射し、3日間隔で計3回、CD90+ ILCの枯渇を行った。対照群にはアイソタイプコントロールのラットIgG2b（IchorBio）を同様に投与した。最終注射の3日後に腸管固有層細胞を回収した。
統計解析
多群間比較には、t検定またはTukey多重比較後検定付き一元配置分散分析（ANOVA）検定を行い、反復測定による多群間比較には、Tukey多重比較後検定付き二元配置分散分析（ANOVA）検定を適用した。微生物叢解析データについては、まずt検定を適用して、感受性マウスに比べて抵抗性マウスおよびFMT治療マウスで相対量が増加した細菌属を同定した。その後、得られた結果を、マイクロバイオームデータの研究に特化して最近開発されたアプローチであるバイアス補正付きマイクロバイオーム組成分析（ANCOM-BC）試験（27）を適用して検証した。ANCOM-BCはRパッケージANCOMBCを用いて適用した。1群あたりのサンプル数は多くないため（n = 5-6）、推奨されるように検定統計量の保守的な分散推定値を使用した。多重仮説検定を調整するために、ANCOMBCとt検定の両方で、fdr.Rパッケージ(28)に実装されているBenjaminiとHochbergによる偽発見率(FDR)アプローチを使用した。q値（FDR）は0.05未満を有意とみなした。PCoA解析は、Rのveganパッケージを用いて算出したサンプルペア間のBray-Curtis距離（OTUレベル）を用いて行った。サンプルグループ間のマイクロバイオームにおけるコミュニティレベルの差異を解析するために、Rのveganパッケージのadonis関数を用いて、ノンパラメトリック検定であるpermutational multivariate ANOVAを適用した。画像は、少なくとも3回の独立した実験を代表するものである。データは平均値±標準偏差で示した。統計的に有意な値は、*P < 0.05, **P < 0.01, ***P < 0.001, ****P < 0.0001。
結果
異なる動物施設由来のマウスは、化学的に誘発された大腸炎に対して異なる感受性を示す
IBD発症に関連する免疫反応の特徴を明らかにするため、野生型C57BL/6マウスにDSSを7日間投与して化学的に大腸炎を誘発した（図1A）。体重減少、便の硬さ、血便の有無など、疾患の進行に関連するすべてのパラメーターを毎日モニターし、DAIに従ってスコア化した。予期せぬことに、野生型C57BL/6マウスは、長期間の治療を受けても発病の主要な臨床症状を示さないことが観察された（図1B；以降、抵抗性と呼ぶ）。この予期せぬ表現型を調べるため、別の動物施設で飼育されている野生型C57BL/6マウスに同様のプロトコルを用いて大腸炎を誘発した。これらのマウスは、予想された疾患経過に従って大腸炎を発症し、DSS投与後7日目のDAIスコアは平均8（10点満点）であった（図1B；以降、感受性マウスと呼ぶ）。診察の結果、感受性マウスは大腸が短く、有意な大腸病理と一致した（図1C）。大腸の潰瘍化、陰窩の短縮または切除、炎症性浸潤の有無からなる大腸の組織学的解析の結果、重篤な病態進行のない群と比較して、感受性群では重篤な組織病理学的所見が認められた（図1DおよびE）。杯細胞の総数もまた、恒常性条件下で感受性マウスと抵抗性マウスとで異なっており、DSS誘発大腸炎後にのみ、感受性マウスで杯細胞と粘液層の大規模な減少が観察された（図1FおよびG）。したがって、遺伝学的に同一であり、同じ実験プロトコルに従ったにもかかわらず、異なる動物施設のマウスは、大腸炎の誘発に対して異なる反応を示した。
図1

図1 動物施設の異なるマウスは、大腸炎発症に対する感受性が異なる。(A)2つの異なる動物施設のC57BL/6マウスに、飲料水に3%の黄砂を投与し、毎日モニターした。(B) 病気の進行は、実験を通してDAIをスコア化することで評価した。(C）代表的な大腸を画像化し、切除後7日目に大腸の長さを測定した。(D）大腸炎誘発前後のマウスのヘマトキシリン・エオジン染色の組織学的分析。(E）大腸炎スコアは7日目の結腸サンプルの組織学的評価により求めた。(F) 大腸組織のアルシアンブルー/過ヨウ素酸シッフ染色による杯細胞および粘液の分析。(G）陰窩あたりの杯細胞数の定量化。7日目の感受性マウスでは、無傷の陰窩は認められなかった。データは平均値±標準偏差で示した。統計的に有意な値は*P < 0.05, **P < 0.01, ***P < 0.001, ****P < 0.0001。DAIは疾患活動性指数、DSSはデキストラン硫酸ナトリウム、NDは検出されなかった。
抵抗性マウスは、上皮バリア機能に関連する遺伝子のアップレギュレーションと明瞭な腸管免疫を示す。
2群のマウスは遺伝的背景は同じであるが、大腸炎誘発時の表現型が異なっていることから、腸管上皮バリアの安定性と機能の変化が観察された表現型と関連している可能性が考えられた。IBD患者では、クローディンなどのタイトジャンクションタンパク質やアドヘレンスジャンクションタンパク質の発現が変化していることが報告されており、この病態における腸管上皮バリアの完全性の関連性が補強されている(29)。上皮バリアの他の重要な構成要素は、杯細胞によって産生・分泌されるムチン糖タンパク質によって構成される粘液層であり、内腔の微生物が直接接触するのを防いでいる(30)。恒常的な条件下では、ムチンをコードする遺伝子（Muc1、Muc2、Muc13）、およびE-カドヘリンとクローディンをコードする遺伝子（Cdh1、Cldn2、Cldn3、Cldn4、Cldn7）の転写レベルは、感受性群と比較して、抵抗性マウスで有意に上昇した（図2AおよびB）。これらのデータから、抵抗性マウスでは上皮バリア関連タンパク質の活性化が亢進していることが示唆され、上皮バリアが炎症性傷害に耐えられるようになっている可能性がある。腸管透過性の亢進はIBDの特徴であることが知られており、IBD患者にも認められるが(31)、恒常性では2群のマウス間で腸管透過性に有意差は認められなかった(Fig. 2C)。
図2

図2 抵抗性マウスは上皮バリア機能と腸管免疫に変化を示す。(AおよびB）Muc1、Muc2、Muc13（A）およびCldn2、Cldn3、Cldn4、Cldn7、Cdh1（B）の発現を恒常性条件下で定量PCR法により解析した。(C）恒常性状態における腸管透過性は、経口ガベージによるFITC-デキストラン投与後に測定し、投与4時間後の血清中で定量した。(D）IL-10、IL-17、およびIL-22の産生（pgサイトカイン/mg colon）を、恒常性条件下での大腸抽出液で定量した。(EおよびF）感受性マウスまたは抵抗性マウスの腸におけるTh17細胞（E）およびILC3（F）の頻度。パネルEおよびFでは、各ドットは3匹のマウスのプールに対応する。データは平均値±標準偏差で示した。統計的に有意な値は*P < 0.05, **P < 0.01; ****P < 0.0001。Th17、Tヘルパー17。
抵抗性マウスで観察された防御表現型が腸管免疫の変化によるものかどうかを調べるため、大腸炎誘発前の感受性マウスと抵抗性マウスの腸管における免疫環境をサイトカインレベルから評価した。抵抗性マウスではIL-10が増加しており（図2D）、これは抵抗性マウスが示す防御表現型と一致していた。さらに、抵抗性マウスは感受性マウスと比較して、IL-17AとIL-22のレベルも高かった（図2D）。IL-17AとIL-22はともに、腸内に存在する無数の免疫細胞、すなわちTヘルパー17（Th17）細胞とILC3によって産生され、状況に応じて、炎症促進作用または組織保護作用を持つ可能性がある(32-34)。我々は、感受性マウスと抵抗性マウスでは、恒常性維持状態における腸内のILC3細胞とTh17細胞の頻度が異なり、抵抗性マウスでは、感受性マウスと比較して、ILC3細胞の頻度が有意に高く、Th17細胞の頻度が逆に低いことを観察した（図2EおよびF）。ILC3は腸内でIL-22を産生する主要な細胞のひとつであり、腸の恒常性維持に極めて重要な役割を果たしていることから（35）、これらの結果は、定常状態におけるILC3細胞の頻度の増加が、抵抗性マウスにおいてより健康的な腸内環境の維持に寄与している可能性を示唆している。
マイクロバイオームは大腸炎発症に対する防御を調節する
大腸炎誘発時の防御表現型が、特徴的な微生物叢組成によって駆動されているかどうかを調べるため、耐性マウスの糞便内容物を用いて、抗生物質誘発で微生物叢が枯渇した感受性マウスにFMTを行った（図3A）。感受性のマウスは、あらかじめ抗生物質の混合液で5週間処理し、本来の腸内細菌叢を枯渇させておいた。抗生物質投与期間中、微生物叢枯渇の有効性が評価された（図S2）。この後、感受性群には3日間連続で耐性マウスの糞便懸濁液を投与した。FMTの3週間後、大腸炎誘発のためにマウスを黄砂処理に供し、DAIをFMTなしの感受性マウスと耐性マウスとで比較した。大腸炎誘発に対する明らかな防御が観察された（図3B）。これらのデータは、同様のDAIに反映されるように耐性群を反映し、大腸炎発症に対する防御表現型における腸内細菌叢の重要な役割を支持するものである。
図3

図3 耐性マウスのFMTは急性大腸炎の発症を予防し、感受性マウスの慢性大腸炎の再発を回避できる。(A）感受性マウスを抗生物質で5週間治療した後、耐性マウスの糞便を3日間経口投与した。3週間後、コロニー形成のため、マウスに3％DSSを7日間投与した。(B) 病気の進行は、実験を通してDAIをスコア化することで評価した。画像は少なくとも3回の独立した実験の代表である。(C）感受性マウスを2％DSSで5日間治療した。寛解後、マウスは耐性マウスからFMTを5日間経口投与された。対照群にはビヒクル（PBS）を投与した。2週間後、両群とも前述のように2％DSSを投与した。(D）疾患の進行は、実験を通してDAIをスコア化することで評価した。(E）投与7週目にFMTまたはPBSを投与したマウスの大腸組織のヘマトキシリン・エオジン染色およびアルシアンブルー／過ヨウ素酸シッフ染色の組織学的分析。(F）大腸炎スコアは、7週目の結腸サンプルの組織学的評価により求めた。(G）陰窩あたりの杯細胞数の定量化。画像は少なくとも3回の独立した実験の代表である。データは平均値±標準偏差で示した。統計的に有意な値は*P < 0.05, **P < 0.01, ***P < 0.001, ****P < 0.0001。FMT、糞便微生物叢移植。
大腸炎の再発寛解モデルにおける保護効果を理解するために、感受性マウスに疾患を誘発し、疾患が寛解した後、マウスに5日間経口投与で耐性マウスのFMTを投与した。この際、抗生物質の投与は行わなかった。FMTから2週間後、マウスは再び大腸炎を起こした（図3C）。抵抗性マウスの糞便内容物を投与したマウスは、ビヒクル（PBS）のみを投与した対照群とは逆に、軽度の大腸炎症状しか示さなかった（図3D）。FMTを投与したマウスは、対照群よりも病態の徴候が有意に少なく、陰窩あたりの杯細胞の量も多かった（図3E～G）。
アッケマンシア属とパラバクテロイデス属は、大腸炎誘導から保護されたマウスの腸内細菌叢で有意に増加している
腸内細菌叢組成の16S rRNA遺伝子解析は、感受性のあるマウスと抵抗性のあるマウスの便について、恒常性条件下で行った。抵抗性マウスと感受性マウスを比較したところ、明確な微生物叢シグネチャーが見出され、教師なし多変量解析ではこれらが別々にクラスタリングされた（図4AおよびB）。抵抗性マウス群では、菌数の減少（図4C）と菌種の多様性（図4D）が著しく減少しており、これは予想外であった。どの細菌種が大腸炎に対する防御表現型の根底にあるのかを突き止めるために、抵抗性マウスからFMTを受けた感受性マウスも微生物叢解析に含めた。FMTの前後で、感受性群では菌種の数と多様性に関して大きな変化は観察されなかった。しかし、Akkermansiaのような限られた属の相対的な存在量に非常に明確な変化が見られたことから、少数派の集団が防御的表現型の原因である可能性が示唆された（図4A～D）。実際、同定された129属のうち、6属は抵抗性マウスと感受性マウスの間で有意差が認められ、7属は感受性マウスとFMTを受けた感受性マウスの間で有意差が認められた（P < 0.05、FDR < 0.05；表4）。これらのヒットはANCOM-BCテストでも検証された（表S1およびS2）。Akkermansia属とParabacteroides属は、耐性表現型が観察されたときにコピー数が有意に増加することから、候補として特定された（Akkermansia属の相対存在量は、感受性、耐性、感受性＋FMT群でそれぞれ1.29％、12.07％、15.55％であり、Parabacteroides属の相対存在量は、感受性、耐性、感受性＋FMT群でそれぞれ0.14％、5.66％、0.78％であった）。また、16S RNA遺伝子の塩基配列をBasic Local Alignment Search Toolで解析した結果、Akkermansia muciniphilaとParabacteroides distasonisが各属の代表種として特定された。
図4

図4 耐性マウスと感受性マウスの糞便サンプルの16S rRNA塩基配列解析から、異なる微生物相組成が明らかになった。(A）腸内細菌叢組成に関する感受性マウス、抵抗性マウス、感受性＋FMTマウスの主座標分析。抵抗性vs感受性：抵抗性vs感受性：P = 0.001；抵抗性vs感受性＋FMT：P = 0.005；感受性vs感受性＋FMT：P = 0.006。(A.muciniphilaとP.distasonisはそれぞれ紫とベージュの矢印で示されている。(C)感受性マウス、抵抗性マウス、および感受性＋FMTマウスで見つかった種の操作的分類単位の数と(D)多様性。(E）感受性マウス、抵抗性マウス、感受性＋FMTマウスにおけるA. muciniphilaとP. distasonisの絶対量の定量。画像は少なくとも3回の独立した実験の代表である。データは平均値±標準偏差で示した。統計的に有意な値は*P < 0.05, **P < 0.01, ****P < 0.0001である。
表4
表4 16S rRNAシーケンス解析で見つかった最も有意なヒット（P値＜0.05、FDR＜0.05）a,b
耐性マウスで増加（対感受性）感受性＋FMTマウスで増加（対感受性）
遺伝子 Log2FC P値調整後P値遺伝子 Log2FC P値調整後P値
Clostridium_XlVa 2.0492 0.00002002 0.00138125 Akkermansia 3.5844 0.0000225 0.00153222
アッカーマンシア 3.2186 0.00131297 0.01132440 パラバクテロイデス 2.4413 0.00028237 0.00860324
パラバクテロイデス 5.2930 0.00204649 0.01283708 クロストリジウム_XI 4.3576 0.00037956 0.00860324
ラクトコッカス 2.8413 0.00559808 0.02425864 バクテロイデス 1.1833 0.00085129 0.01447191
ウレアプラズマ 7.4717 0.00755823 0.03067753 オルセネラ 1.6756 0.00342211 0.02908795
バクテロイデス 3.2818 0.00835472 0.03202644 クロストリジウム_XlVb 1.5458 0.00918029 0.04855569
コプロコッカス 2.0000 0.00928271 0.04855569
a
FC, fold change; FDR, false discovery rate.
b
抵抗性マウスと感受性マウス、感受性＋FMTマウスと感受性マウスで比較。
A.muciniphilaとP.distasonisが大腸炎誘発に対する防御を示したマウスで増加していることを確認するため、これらの細菌の絶対量を調べた。予想通り、A. muciniphilaおよびP. distasonisは、感受性マウスと比較して、FMT後の抵抗性マウスおよび感受性マウスの両方で有意に増加した（図4EおよびF）。抵抗性マウスのA. muciniphilaおよびP. distasonisの存在量は、感受性マウスと比較して、それぞれ平均で50万倍および15,000倍であった。一方、感受性マウスでは、FMT後、A. muciniphilaおよびP. distasonisの存在量は、FMTを受ける前と比較して、それぞれ3,000,000倍および7,000倍であった。全体として、この結果は、大腸炎から保護されたマウスの腸内細菌叢にこれら2種が有意に存在していることを確認するものであり、これらの細菌が単独で、あるいは組み合わせて、腸が傷害を維持できるような非常に特殊な免疫学的環境を作り出している可能性を示唆している。
Akkermansia muciniphilaとParabacteroides distasonisは相乗的に作用し、大腸炎の重症度を低下させる。
化学的に誘発された大腸炎における炎症の制御におけるA. muciniphilaとP. distasonisの保護特性を評価するために、感受性マウスに3％DSSで大腸炎を誘発する12日前から細菌を補充した（図5A）。A. muciniphilaまたはP. distasonisの単独投与では、大腸炎を抑制することはできなかった。一方、A. muciniphilaに加えてP. distasonisを投与すると、対照マウスに比べて有意に大腸炎のレベルが低下した（図5B）。A. muciniphilaの保護効果は、マウス由来の分離株を用いても維持された（Fig.）杯細胞数には大きな変化は見られなかったが（図5CおよびD）、組織学的分析によると、A. muciniphilaとP. distasonisの両方を補充したマウス（Am + Pd）では、建築物の損傷と炎症が少なく、組織学的スコアは対照群およびPdよりも低かった（図5C～E）。このことは、A. muciniphilaとP. distasonisの組み合わせが、急性大腸炎に伴う炎症を抑制する上で有益であることを示している。
図5

図5 アッカーマンシア（Akkermansia muciniphila）とパラバクテロイデス（Parabacteroides distasonis）の併用は大腸炎の発症を抑制する。(A）マウスにAm、Pd、または両者の組み合わせ（Am＋Pd）を12日間毎日経口投与し、その後3％DSSを7日間投与した。(B) 疾患の進行は、実験期間を通してDAIをスコア化することで評価した。(C-E）大腸炎誘発後の陰窩あたりの杯細胞数の定量化、およびDSS投与後の結腸サンプルの組織学的評価によって得られた大腸炎スコア。各群N = 5。(F）再発-寛解実験を行い、感受性マウスを2％DSSで5日間大腸炎誘発に供した。回復後、マウスにAm、Pdまたはその両方を組み合わせたもの（Am＋Pd）を12日間毎日経口投与し、その後2サイクル目の大腸炎誘発を行った。対照マウス（無補給）にはビヒクルとしてPBSを投与した。(G)疾患の進行はDAIをスコア化することで評価した。* 黒字はコントロールとAm+Pdの比較。* 青字はAmとAm+Pdの比較。* 黄色はPdとAm+Pdの比較。青字の$は、コントロールとAmの間の比較に対応する。(H）AUCは、大腸炎誘発時の疾患経過に基づいて計算した。(I-K）大腸炎誘発後の陰窩あたりの杯細胞数の定量化、およびDSS処理後の結腸サンプルの組織学的評価によって得られた大腸炎スコア。データは平均値±標準偏差で示した。統計的に有意な値は*P < 0.05, **P < 0.01, ***P < 0.001, ****P < 0.0001。Am、Akkermansia muciniphila；AUC、曲線下面積；Ctr、対照；Pd、Parabacteroides distasonis。
A.muciniphilaとP.distasonisの組み合わせの保護効果も、再発寛解慢性大腸炎モデルで評価した。このモデルでは、感受性マウスに、2サイクルの黄砂誘導の間の12日間、経口投与でこれらの細菌を補充した（図5F）。その結果、Am単独あるいはP. distasonisとの併用（Am + Pd）により、2サイクル目の黄砂誘発大腸炎からマウスを部分的に保護することができた。逆に、Pdのみの補充では不十分であった（図5G）。曲線下面積の減少が示すように、A. muciniphila単独、またはP. distasonisとの併用で、全体的に最も良好な結果が得られた（図5H）。A.muciniphilaと両菌の併用は、コントロール群およびPd群と比較して、杯細胞数の増加ももたらした（図5IおよびJ）。組織学的解析では、A. muciniphilaおよびA. muciniphilaとP. distasonisの組み合わせは、病理学的スコアが低い傾向にあったが、統計学的な差は認められなかった（図5I～K）。この結果は、両菌の併用が急性炎症事象に対する保護に効果的であり、慢性炎症時にはA. muciniphilaの補充が際立つことを示唆している。
アッケマンシア・ムチニフィラのサプリメントは、腸内のILC3集団を促進することにより、腸管免疫を形成する。
微生物叢は免疫系と相互作用することが知られており、直接的に、あるいはILC3などの免疫集団の反応を制御するシグナルを産生することによって、免疫系と相互作用する(37)。A.ムチニフィラの補充が本当に腸管免疫反応を妨げているのかどうかを理解するために、細菌を補充したときの免疫プロフィールを特徴付けた（恒常性条件）。A.ムチニフィラを単独またはP.ジスタゾニスと組み合わせて補充したマウスは、対照群と比較して、上皮バリアの完全性が改善され（図S4）、ILC3頻度が増加した（図6A）。これは、IL-17産生ILC3の増加（図6B）と、有意ではないがIL-22産生ILC3の傾向（図6C）を伴っている。一方、Pdを補充すると、コントロールおよびAm処理と比較して、Th17およびIL-17産生Th17頻度が増加する（図6DおよびE）。IL-22産生Th17細胞の頻度には大きな変化は見られなかった（図6F）。実際、A. muciniphilaのコピー数は、腸内のILC3レベルと正の相関があることがわかった（図6G）。Th17とILC3は、ホメオスタシスと炎症を管理する上で重要な、しかし二律背反するプロフィールをもっており、Th17は腸の炎症に大きく関与し、ILC3は腸のホメオスタシスを促進する重要な役割を担っている(38, 39)。このことは、A. muciniphilaおよびA. muciniphilaとP. distasonisが大腸炎の発症に有益な影響を及ぼしたという観察結果とともに、A. muciniphilaが腸管免疫をより恒常的な免疫プロフィールへと形成し、炎症事象からある程度保護できることを示唆している。A.ムチニフィラの保護作用が腸内のILC3頻度の増加によるものであることを確認するため、T細胞とB細胞の集団が欠損しているRag2-koマウスにA.ムチニフィラを補充し、一方の実験群でCD90+ ILCを枯渇させた（図S5；図6H）。予想通り、A. muciniphila（Am＋ビヒクル）を投与したマウスは、非投与マウス（コントロール）と比較して、大腸炎に対する感受性が低下した。重要なことに、A. ムチニフィラ投与によるこの保護効果は、CD90+ ILCの枯渇（Am + aCD90）により消失することから、A. ムチニフィラは大腸のILCを促進することで腸管免疫に寄与し、その結果、大腸炎に対する保護につながることが示された（図6I）。
図6

図6 アッカーマンシア・ムチニフィラ（Akkermansia muciniphila）のサプリメントは、大腸におけるILC3の頻度を増加させ、組織の完全性をもたらす。(A-F)対照マウスおよびAm、Pdまたは両者の組み合わせ（Am + Pd）を補充したマウスの結腸におけるILC3（A）、IL-17産生ILC3（B）、IL-22産生ILC3（C）、Th17細胞（D）、IL-17産生Th17（E）、IL-22産生Th17（F）の頻度。(G）Amのコピー数と大腸組織におけるILC3の頻度との相関。(HおよびI）マウスに12日間経口投与でAmを補充し、3％DSS投与の-3、0、3日目に抗CD90モノクローナル抗体（Am＋aCD90）で処理するか、抗体処理なし（Am＋ビヒクル）とした。実験的コントロールとして、抗CD90の代わりにアイソタイプコントロール（Am + isotype）を投与するか、抗体処理を行わなかった（Am + vehicle）。マウスには3％DSSを投与し、大腸炎の発症をDAIで評価した。対照群は、補充も処置もしなかったマウスに関するものである。(J) 補給したマウスの結腸におけるAkkermansia muciniphila単独（Am）またはParabacteroides distasonisとの併用（Am + Pd）の絶対量。(K）Amのコピー数とDAIとの相関。データは平均値±標準偏差で示した。統計的に有意な値は*P < 0.05, **P < 0.01, ***P < 0.001である。
我々は、A. muciniphilaがP. distasonisの存在によって、急性モデルにおいて有益な、大腸炎発症に対する保護作用を有することを観察した。この意味で、我々はP. distasonisがA. muciniphilaによるコロニー形成に何らかの好影響を与えるかどうかを検討した。A.muciniphilaの存在量は補充によって時間とともに増加するが、P. distasonisと併用すると顕著に増加した（図6J）。このことから、A. muciniphilaとP. distasonisの間に共生関係があることが示唆され、2つの細菌種を併用した場合に観察される有益な効果の増加の原因となっている可能性がある。これを裏付けるように、A. muciniphilaの量はDAIと逆相関があることがわかった（図6K）。
これらの結果を総合すると、A. muciniphilaは腸内のILC3の増加を促進することで炎症を抑制し、P. distasonisはそのコロニー形成に積極的に寄与することで、大腸炎の発症予防効果を発揮することが示唆される。
考察
腸内細菌叢の組成の変化は、いくつかのヒト疾患において起こることが知られている(36, 40, 41)。IBDでは腸内細菌組成に重大な障害が生じ、それが疾患の発症や重症化に大きく関与している(36, 42)。IBDの発症予防や発症しやすさには微生物叢が大きく関与していることを示すエビデンスが増えつつあり、現在の治療法がすべての患者に等しく有効とはいえないこの疾患に対する、微生物叢由来の新規治療法の開発に注目が集まっている。腸内細菌叢そのものを標的にすることは新しいことではない。クロストリジウム・ディフィシル感染を制御するための糞便微生物叢移植（43）や、特定菌株のプロバイオティクスの使用（9、44）など、いくつかのアプローチがすでに報告されている。とはいえ、微生物叢の調節をIBDの治療や予防のための確実な戦略として用いる際の主な目的は、局所または末梢のいずれかに効果的な免疫調節効果が必要であることである。そのためには、特定の微生物の組み合わせが極めて重要であり、その組み合わせによって、炎症性株を抑制し、より寛容な免疫環境を作り出すことができる。したがって、IBDの潜在的治療法として前進するためには、防御的常在菌を同定し、免疫細胞集団を調節するその能力を理解することが重要である。
ここで我々は、腸内常在菌A. muciniphilaとP. distasonisの濃縮が、急性および慢性の大腸炎誘発モデルにおいて保護作用を発揮することを明らかにした。この微生物シグネチャーは、腸内のILC3頻度の増加や腸上皮の完全性の向上と同時に見られ、炎症を制御しやすいバランスのとれた腸内環境を作り出し、重症の大腸炎から保護する。A.muciniphilaは潜在的な保護作用があることから、腸の炎症に取り組む有望なプロバイオティクスとして注目されている(45)が、マウス実験モデル(46,47)やIBD患者(48,49)では、P. distasonisの役割に異論があり、大腸炎発症の亢進や減弱に関連するという報告もある(50)。A.muciniphilaは厳密な嫌気性ムチン分解菌で、ヒトの腸内微生物組成の約1〜5％を占める(51)。A.ムチニフィラはムチンを分解し、短鎖脂肪酸（SCFA）であるプロピオン酸や酢酸を産生し、腸管免疫反応など宿主の生物学的プロセスの制御に寄与する(52, 53)。A. muciniphilaの有益な効果については、文献に広く記載されている。例えば、A. muciniphilaは肥満に関連した代謝障害を治療または予防する有望な候補として浮上したことが示されており（54, 55）、健康に関連することが知られている微生物種と関連する能力があることが知られている（56）。実際、最近、低温殺菌したA. muciniphilaを毎日経口投与すると、食事誘発性肥満が緩和されることが示された。これは、炭水化物の吸収が抑えられ、腸上皮のターンオーバーが促進されたためと考えられる(57)。さらに、A. muciniphilaは腸の保護を誘導する有望なプレーヤーとして注目されている。IBD患者ではA. muciniphilaの存在量が少ないことが報告されており(58)、これは炎症スコアの高さと相関していた(59)。最近の研究では、A. muciniphilaは粘膜病原体であるCitrobacter rodentiumによる急性大腸炎モデルにおいても有益であることが示された。しかし、この有益な効果は状況に依存しており、マウスに食物繊維欠乏食を与えた場合、A. muciniphilaはむしろ病原体感受性を促進した(60)。食物繊維を欠乏させたマウスでは、A. muciniphilaが食物アレルギーを悪化させるという、状況に依存した同様の有害作用が観察された（61）。
A.ムチニフィラが腸の炎症を制御する上で保護的な役割を果たすことを示唆する研究はいくつかあるが、この細菌が病気の進行を妨げる正確なメカニズムはまだ完全には解明されていない。A.muciniphilaの摂取は、DSS誘発急性大腸炎におけるNLRP3インフラマソームを減少させ（62）、UCのマウスモデルにおけるメトホルミンの有益な役割の一部を担っていることが示されている（63）。また、A. muciniphilaの投与は、腫瘍壊死因子αやIL-6などの炎症性サイトカインの大腸レベルや血清レベルを調節するだけでなく、腸内細菌叢に変化を与え、DSS投与に由来する微生物叢の異常を回復させることによっても、DSS投与によって引き起こされるマウスの炎症を抑えることができることが報告されている(64)。我々の研究により、A. muciniphilaの単独投与またはP. distasonisとの併用投与により、ILC3およびIL-17+-ILC3が増加し、マウスの大腸炎の抑制に関連することが明らかになった。ILC3は、IL-17、IL-22、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子を定常状態で産生することにより、腸のホメオスタシスの調節に特に関係している(39)。UCとCDの両患者はILC3集団の変化、すなわちIL-22産生能の変化を示すことが知られており、これはこれらの患者でみられる上皮障害の増強と関連している可能性がある(65, 66)。免疫サブセットが微生物叢の構成などの多様な環境的手がかりにどのように反応するかについては、さらに解明される必要がある。例えば、腸内細菌叢が産生するSCFAは、AKT-STAT3シグナル伝達経路を介してILC3やIL-22産生を誘導する能力があることが報告されている(67)。このことは、腸内ホメオスタシスの調節における微生物叢由来の代謝産物の影響を研究する必要性を補強している。いずれにせよ、腸内におけるILC3の頻度の増加は、腸内に存在するA.muciniphilaの量によって、用量依存的に大きく形成される可能性があることが示された。また、A. muciniphilaの保護特性が、この腸内のILC3頻度の増加と複雑に関連していることも示した。微生物とILC3の相互作用を研究した他の報告では、いくつかのメカニズムがILC3の機能、特にIL-22産生を誘導することが示されている。これらには、樹状細胞によって産生されるIL-23やIL-1βを介したILC3の促進や、腸内細菌によるNKp44を介したILC3の活性化が含まれる(68)。A.muciniphilaが直接接触することによって腸内のILC3の増加を促進するのか、それとも他の因子による媒介を介して促進するのかは、今後の研究で明らかにされる予定である。この意味で、今回の研究は、腸の炎症を回避または制御するための防御戦略を開示するために、今後調査する必要のある微生物叢と免疫反応の間の新規の相互作用を明らかにした。
以前、A. muciniphilaとParabacteroidesが、アミノ酸のガンマグルタミル化を減少させ、海馬のGABA/グルタミン酸比を増加させることによって、てんかんの予防に相乗的に関与し、発作を予防することが実証された(69)。腸の炎症におけるこれらの細菌のそれぞれの効果に焦点を当てた先行研究では、腸の保護を促進する上で両者の組み合わせの可能性については扱われていなかったため、このことは特に重要であり、今回の研究の新規性を裏付けている。実際、我々はA. muciniphilaがマウスの大腸炎誘発を抑制する効果を持つことを確認したが、興味深いことに、この効果はP. distasonisと組み合わせることでさらに顕著になることを発見した。A.ムチニフィラの腸内コロニー形成は、耐好性P.distasonisの存在下で有利に促進されることが確認されたが、この共生的相互作用が成立するメカニズムは今後の重要な研究課題である。しかし、これらの細菌の代謝がこの疑問に答える鍵になるかもしれない。P. distasonisは酢酸とコハク酸を合成できると記載されている(70)。また、A. muciniphilaは主にムチン発酵を介してプロピオン酸を生産することが知られている（71, 72）。また、A. muciniphilaによるプロピオン酸の生産は、メチルマロニル-CoA合成酵素を介したコハク酸からプロピオン酸への変換において補酵素として使われるビタミンB12によって促進されることが記載されている(73)。したがって、A. muciniphilaとP. distasonisの組み合わせによるこの相乗効果は、P. distasonisがA. muciniphilaにプロピオン酸生成のための余分な供給源を提供し、その代謝とコロニー形成に利益をもたらすという、常在性摂食メカニズムによって説明できるかもしれないという仮説が成り立つ。
A. muciniphilaとP. distasonisの共補給は、腸管上皮バリアにも好影響を与えた。A. muciniphilaとP. distasonisを濃縮したマウスは、感受性マウスと比較して、ムチンやクローディンといった上皮バリアの安定性維持に関与する遺伝子の発現が上昇し、杯細胞数が増加し、大腸炎誘発時の組織学的スコアと疾患スコアが低下した。これらの結果は、これらの細菌が存在することで、上皮バリアが炎症性傷害をよりよく維持できるように準備されることを指摘している。このことは、A. muciniphilaがin vitroで腸細胞単層を強化し(74)、腸の保護を促進する抗炎症特性を持つ細胞外小胞を放出することによって、腸管上皮バリアの完全性を促進する能力を強調した過去のデータ(75)と一致する。
腸内の細菌組成は環境的な手がかりによって急速に変動する可能性があり、腸の健康に有益な特定の微生物を同定することは大きな課題である。今回の研究では、2つの特定の細菌種を特定した。これらの細菌種を組み合わせると、腸管免疫をより寛容で恒常的な環境へと形成することにより、腸管の保護を促進することができる。これらの微生物の組み合わせによる保護効果の根底にあるメカニズムを、疾患の重症度や腸管免疫とともに解明することが重要であろう。観察された防御的表現型は、腸内のこれらの細菌のレベルに直接依存しており、補充を中止すると急速に減少する。この意味で、またA. muciniphilaについて報告された局所的・全身的な保護効果に基づいて、プロバイオティクスとしての可能性を十分に評価するためには、これらの細菌を含む混合物による補給の安定性と、他の微生物集団におけるその生態学的・機能的影響を研究することが極めて重要であろう。加えて、プロバイオティクスとしての細菌補充が長期にわたる効果を持つか、少なくともIBDに関連する炎症プロセスを制御する上でより効果的であるかどうかを確認することは、徹底的に研究されなければならない重要な要素である。全体として、さらに補足的な研究が必要であるにもかかわらず、本研究は、IBDの発症と予防における腸内細菌叢の役割を支持する確かな貢献となった。
謝辞
マウスAkkermansia muciniphila株を提供してくれたミシガン大学のEric MartensとNicholas Pudloに感謝する。
本研究は、科学技術振興財団を通じて、国家資金により行われた（プロジェクト UIDB/50026/2020、UIDP/50026/2020、UIDB/04469/2020；契約 DOI 10.54499/2020.00185.CEECIND/CP1600/CT0004をR. S.; PD/BD/106053/2015 via InterUniversity Doctoral Programme in Ageing and Chronic Disease, PhDOC and DOI 10.54499/2020.00088.CEECIND/CP1608/CT0001 to J.G.; 10.54499/CEECIND/04058/2018/CP1581/CT0015 to C.C.、 2021.07836.BDをA.F.に、2021.06268.BDをA.G.に、DOI 10.54499/2021.01234.CEECIND/CP1664/CT0019をC.N.に、また、バイオテクノロジー、バイオエンジニアリング、マイクロエレクトロメカニカルシステムのAssociate Laboratory, LA/P/0029/2020による。J.G.はまた、European Society of Clinical Microbiology and Infectious Diseases（研究助成金2022号）およびEuropean Crohn's and Colitis Organisation（ECCO助成金2023号）の助成を受けた。S.S.P.はECCO Pioneer Award 2022からの資金提供を受けた。本研究は以下の助成金も受けた：M.S.D.の研究室：ルクセンブルク国立研究基金（FNR）CORE（C15/BM/10318186およびC18/BM/12585940）助成金およびFNR BRIDGES助成金（22/17426243）、MICINNからのPID2020-120292RB-I00およびC.U.へのConselleria d'Innovació, Universitats, Ciència i Societat DigitalからのCIPROM/2021/053。
補足資料
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Bacteroides distasonis, Bacteroides goldsteinii, Bacteroides merdaeをParabacteroides distasonis gen. Bacteroides distasonis、Bacteroides goldsteinii、Bacteroides merdaeをParabacteroides distasonis gen.nov.comb.nov.、Parabacteroides goldsteinii comb.nov.、Parabacteroides merdae comb.nov.に分類し直した。
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