ビフィズス菌MH-02の逆流性食道炎患者における併用療法としての治療評価： 無作為二重盲検プラセボ対照試験

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ジャーナル Nutrients 16巻 3号 10.3390/nu16030342
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オープンアクセス論文
ビフィズス菌MH-02の逆流性食道炎患者における併用療法としての治療評価： 無作為二重盲検プラセボ対照試験

https://www.mdpi.com/2072-6643/16/3/342

Lihong Gan 1,2,Yufan Wang 3,Shenan Huang 4,Li Zheng 2,Qi Feng 1,Hui Liu 2,Peng Liu 2,Kaige Zhang 1,Tingtao Chen 5,6,ORCID andNian Fang 1,2, 著
1
江西医科大学第三臨床医学院、南昌大学、南昌330006、中国
2
南昌第一病院消化器科、南昌330006、中国
3
南昌大学クイーンメアリースクール、南昌330031、中国
4
南昌大学第二附属病院消化器科、南昌330006、中国
5
南昌大学トランスレーショナル医学研究所生物工学薬物および技術国家工学研究センター、南昌330036、中国
6
南昌大学江西医科大学薬学院、南昌330006、中国
*
著者宛先
Nutrients 2024, 16(3), 342; https://doi.org/10.3390/nu16030342 (DOI登録中)
投稿受理： 2023年11月17日／改訂：2024年1月13日／受理：2024年1月21日／発行：2024年1月24日
(本論文は特集号「ヒト微生物叢と栄養・健康」に属する： Proceedings from the 5th International Scientific Conference on Probiotics and Prebiotics（プロバイオティクスとプレバイオティクスに関する第5回国際学術会議議事録）
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要旨
プロトンポンプ阻害薬（PPI）は現在、逆流性食道炎（RE）の治療薬として日常的に使用されているが、投与中止後に症状が再発することが多く、それに伴う消化器症状の臨床的改善は限定的である。本研究の目的は、逆流性食道炎患者に対するビフィズス菌サプリメントの補助的治療効果を検討することである。合計110人の適格なRE患者を募集し、プラセボ群とプロバイオティクス群に無作為に割り付けた。全患者にラベプラゾール錠を投与し、同時にビフィドバクテリウム・アニマリス・サブスピーシーズ・ラクティスMH-02またはプラセボを8週間投与した。臨床的寛解が得られた患者はその後12週間の追跡を受けた。臨床的改善を評価するためにRDQ、GSRSスコア、内視鏡検査が行われ、腸内細菌叢の変化はハイスループットシークエンスで解析された。その結果、MH-02併用療法は症状消失までの期間を早め（50.98％対30.61％、p＝0.044）、GSRSスコアを有意に低下させ（p＝0.0007）、再発までの平均期間を延長させた（p＝0.0013）。さらに、ハイスループット解析によると、MH-02併用療法は腸内細菌叢のα（p = 0.001）多様性を増加させ、β多様性解析による微生物組成を変化させ、ビフィドバクテリウム属、クロストリジウム属、ブラウチア属を含むいくつかの微生物属の存在量が増加する一方で、ストレプトコッカス属とロチア属の相対的存在量が減少する（p < 0.05）という、属レベルでの有意な腸内細菌叢の変化を伴っていた。これらの結果を総合すると、MH-02はREルーチン治療における新たな補完的戦略として有益であることが支持される。
キーワード Bifidobacterium animalis subsp. lactis MH-02; RE; PPI; 逆流; 胃腸症状; 再発; 腸内細菌叢

  1. はじめに
    逆流性食道炎（RE）は胃食道逆流症（GERD）の一次亜型であり、世界的に流行している消化器疾患である [1,2] 。胃食道逆流症の初期症状には酸の逆流や胸焼けがあるが、重症例では食道狭窄や出血、さらにはバレット食道などの合併症に進行する可能性がある [3] 。現在、プロトンポンプ阻害薬（PPI）がRE治療の第一選択薬であり、患者の主症状の約80％を緩和している [4] 。しかし、PPIは上腹部痛や腹部膨満感などの消化器症状を伴うものに対しては効果が限定的であり、治療中止後も症状が再発することが多い。そのため、RE管理における新たな補完的アプローチを積極的に模索することは、臨床家にとって緊急の課題となっている。
    REの病態は複雑であり、食道クリアランスの弱化、粘膜バリア機能の低下、炎症を介した影響など、様々な危険因子を含んでいる [5] 。現在では、腸内細菌叢の異常がREの発症やさらなる進行に関与している可能性を示す証拠が蓄積されつつあり、GERD患者の腸内における微生物の多様性や存在量が、健常者と比較して減少していることが報告されている [6]。さらに、RE患者は、口腔、食道、腸において、口腔咽頭から逆流する分類群に支配されている健常者と比較して、異なる微生物叢プロフィールを示した [7]。さらに、in vitroおよびin vivoの実験では、特定の食道マイクロバイオームの改変が、炎症反応を直接惹起し、リポ多糖（LPS）シグナルをアップレギュレートすることによって、炎症を悪化させ、食道の逆流や転移のリスクを増大させることが示されており、消化管のマイクロバイオータがREの発症と進行に重要な役割を果たしている可能性が示唆されている [8,9,10] 。しかし、現在推奨されている治療法にはPPIが含まれており、このPPIは細菌異常症を誘発する可能性があると報告されている [11] 。さらに、PPIの長期投与は小腸内細菌の過剰増殖（SIBO）を誘発し、炎症反応の継続、食道平滑筋細胞の反応性の低下、メタンの産生を増加させ、最終的には胃内容物の食道への逆流を助長する可能性がある [12,13] 。したがって、腸内細菌叢を標的とした介入は、逆流性食道炎の治療における新しい治療法となりうる。
    現在、プロバイオティクスの補充は、腸内微生物生態系を調節するための主要な介入方法として、ヒトの消化管（GI）微生物関連疾患の予防と治療に広く利用されている [14,15,16] 。GIプロバイオティクスの重要なメンバーであるビフィズス菌は、代謝産物の排出、炎症反応の緩和、免疫機能の操作など、多様な機序を介して生理的利益をもたらす [17,18]。20人の妊婦を対象とした最近の臨床試験では、ビフィズス菌を含むプロバイオティクス複合体の投与が逆流エピソードを効果的に減少させることが実証された [19]。また、ビフィズス菌を含む発酵乳を摂取することで、機能性消化器疾患の患者における腹痛、腹部膨満感、下痢などの胃腸の不快症状が緩和されるという報告もある [20,21,22]。さらに、我々の先行研究でも、ビフィズス菌の経口投与は、消化管手術後の患者の胃腸症状を改善するだけでなく、炎症の緩和や腸内細菌叢の多様性の回復にも寄与することが発見されている［23,24］。とはいえ、ビフィズス菌とPPIを併用することで、REの治療効果を高める相乗効果が得られるかどうかは不明である。
    そこで我々は、Bifidobacterium animalis subsp. さらに、MH-02介入後の腸内細菌叢の変化を評価するために、ハイスループット配列決定も行った。本研究は、REの補助的治療におけるプロバイオティクスの使用について、エビデンスに基づいた裏付けを与える可能性がある。

  2. 材料と方法
    2.1. 倫理声明
    本研究に参加した全ての患者は、インフォームド・コンセントに署名した。本研究におけるすべての手順は、南昌第一病院倫理委員会（KY2021071）の審査と承認を受け、本研究は中国臨床試験登録（Chinese Clinical Trial Registry）に登録され、登録番号はChiCTR2200059624であった。私たちの臨床試験は、ヘルシンキ宣言、世界保健機関（WHO）の国際倫理指針、中国臨床試験実施ガイドライン（2020年第57号）などの法律やガイドラインを厳守した。
    2.2. 研究デザインと参加者選択基準
    本試験は単施設無作為化二重盲検プラセボ対照試験である。2022年6月から2023年6月まで、南昌第一病院消化器内科で治療を受けている外来患者または入院患者を募集し、全患者の臨床記録が完備していた。REの診断は、逆流性食道炎の診断と管理に関する2013年のガイドライン[25]に基づいて行われた。組み入れ基準は以下の通りである： (1)臨床症状および胃カメラ検査により逆流性食道炎（Los Angeles分類のグレードLA、LB、LCを含む）と確定診断された患者、(2)18〜65歳の患者、(3)PPIの使用歴がない、またはPPI治療を少なくとも1ヵ月間中止している患者、(4)過去4週間に抗生物質、プロバイオティクス、ラクツロース、その他の制酸薬、プロキネティック薬を使用していない患者。除外基準は以下の通り： (1)肝硬変、腎障害、炎症性腸疾患、腫瘍、甲状腺障害、糖尿病、重症心血管系疾患、脳血管系疾患の既往歴、(2)消化器潰瘍、消化管出血、食道狭窄、慢性下痢、便秘、吸収不良； (3)消化管手術歴、(4)妊娠中または授乳中の女性、(5)免疫抑制療法を受けている患者、(6)本試験で使用したラベプラゾール、プロバイオティクス、プラセボ成分に対するアレルギー、(7)過去3ヵ月間に他の薬剤の臨床試験に参加していること。すべての臨床データの収集は南昌第一病院が担当した。
    2.3. 無作為化と盲検化
    参加者は、乱数表法を用いてプロバイオティクス群（Probio）とプラセボ群に1対1の割合で割り付けられた。非参加の試験スタッフが、対応するプロバイオティクスとプラセボに乱数でラベルを貼った。その後、専任の薬剤管理スタッフが乱数に対応するプロバイオティクス剤とプラセボを参加者に提供した。さらに、割り付けの隠蔽を確実にするため、プロバイオティクス剤とプラセボ剤には包装、色、においに大きな違いはなかった。研究期間中、サンプル配布、データ収集、データ整理、解析を担当した研究者、および参加者は、無作為化順序を知らないままであった。盲検化は、重大な有害事象が発生した場合にのみ公表された。
    2.4. 胃カメラ検査と食道炎のグレーディング
    すべての胃カメラ検査は、標準化されたプロトコールに従って経験豊富な上級医師2名によって行われた。内視鏡検査は登録された全患者のベースライン時と治療終了時（8週目）に再度行われた。食道炎のグレードは胃カメラ検査の結果に基づいてLos Angeles分類のグレーディングシステム（グレードA：5mm未満の粘膜断裂、グレードB：5mm以上の粘膜断裂、グレードC：粘膜断裂が2つの粘膜ヒダの頂点の間に広がっているが周囲の75％未満、グレードD：粘膜断裂が周囲の75％以上に広がっている）を用いて分類された。食道炎のグレードの改善は以下の基準で計算された： (1)治癒：グレードN（正常）まで改善、(2)有意な改善：2グレード改善、(3)効果的な改善：1グレード改善、(4)効果なし：変化なし。
    2.5. 逆流疾患質問票（RDQ）および胃腸症状評価尺度（GSRS）
    Reflux Disease Questionnaire（RDQ）を用いて、1週間の想起期間中に自覚的な逆流症状を評価した。RDQには胸やけ、胸痛、酸逆流、食物逆流の4つの症状が含まれた。症状は頻度と重症度に基づいて0～5の5段階で評価された。総スコアは0〜40の範囲で、スコアが高いほど症状が重いことを示す。RDQスコアが12点以上の患者は、寛解していないか、または再発があると考えられた。Gastrointestinal Symptom Rating Scale（GSRS）は、5つの主な症状クラスターに分類された15項目からなる自己評価尺度である： 腹痛（腹痛、空腹痛、吐き気）、逆流症候群（灼熱感、胃酸逆流）、下痢症候群（下痢、緩便、切迫感）、消化不良症候群（腹部膨満感、噯気、鼓腸増加）、便秘症候群（便秘、硬便、排便困難感）。各項目は、過去1週間の症状の重症度に基づいて0～3（なし、軽度、中等度、重度）のリッカート尺度で採点された。合計得点は0～45点で、得点が高いほど症状が重いことを示す。採点者のばらつきを最小限にするため、採点はすべて同じ医師が行った。
    2.6. 臨床介入戦略と管理
    第1段階：基準を満たした患者は、プロバイオティクス（Probio）またはプラセボ（Placebo）のいずれかに無作為に割り付けられた。プロバイオティクスとプラセボはHeilongjiang Meihua Biotechnology Co, Ltd（中国、ハルビン）から提供され、4℃の冷蔵庫で保管された。実験用プロバイオティクスは、Bifidobacterium animalis subsp. lactis MH-02（CGMCC No.2899）とマルトデキストリンの混合物で、1包あたり2×109コロニー形成単位（CFU）の生菌を含んでいた。プラセボ剤にはプロバイオティクス剤と同量のマルトデキストリンのみが含まれ、外観、サイズ、色は活性介入剤と同一であった。ラベプラゾールナトリウム腸溶錠10mg/錠はエーザイ（中国）製薬有限公司（蘇州、中国）から提供された。プロバイオティクス群とプラセボ群の患者にはいずれもラベプラゾールナトリウム腸溶錠（1錠BID）が投与され、プロバイオティクス群にはビフィズス菌MH-02の小袋（1日1回）、プラセボ群にはプラセボの小袋（1日1回）が、いずれも8週間投与された。服薬コンプライアンス（PPIおよびプロバイオティクス／プラセボ）は、隔週の電話による問い合わせと、消費された薬の小袋の数を計算することによって評価された。コンプライアンス不良とは、3日以上服薬しなかった場合と定義した。この期間中、ベースライン時および1～8週目（週1回）にGSRSおよびRDQスコアを収集し、患者の臨床症状の改善を評価した。食道粘膜の改善や治癒を評価するため、8週目に内視鏡検査が行われた。さらに、介入前と介入8週後に便サンプルが採取された。
    Stage2：Stage1で内視鏡的寛解（食道粘膜の完全治癒）と臨床的寛解（RDQ < 12）の両方を達成した患者には、引き続きフォローアップを行った。フォローアップのエンドポイントは症候性再燃（RDQ≧12）または12週間のフォローアップ期間の終了（20週目）とした。追跡期間中、全対象者は隔週で電話による問診または臨床的フォローアップを受け、GSRSとRDQの評価を完了した。
    2.7. 有害事象と禁止薬物
    有害事象は試験期間中モニタリングされた。患者は他のプロバイオティクスやプレバイオティクスの摂取を禁止され、通常の食事や生活習慣を継続するよう指示された。追跡期間中、酸抑制剤、運動促進剤、または試験結果に影響を及ぼす可能性のある他の薬剤の中止は、症状の再発または関連する薬剤を必要とする他の症状が出現した場合にのみ許可された。試験成績に影響を与えない薬剤の併用は、その薬剤の摂取記録とともに許可された。
    2.8. DNA抽出とハイスループットシークエンシング
    全微生物ゲノムDNAは、TIANamp Stoll DNA Kit（TIANGEN Biotech Co., Ltd., Beijing, China; Catalog No. 抽出したDNAの量と質は、それぞれNanoDrop NC2000 spectrophotometer（Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA）とアガロースゲル電気泳動を用いて測定した。その後の16S rRNAのV4領域のPCR増幅（520F 5′-AYTGGGYDTAAAGNG-3′、802R 5′-TACNVGGTATCTAATCC-3′）、シークエンシングライブラリーの構築、およびハイスループットシークエンシング（Illumina NovaSeq 6000プラットフォーム）は、Shanghai Personalbio Technology Co. (Ltd.（中国、上海）で実施した。マイクロバイオームバイオインフォマティクスはQIIME2 2019.4で実施し、配列はDADA2プラグインを使用して品質フィルター、ノイズ除去、マージ、キメラ除去を行った。分類学的分類にはGreengenesデータベースv13.8（19）を用いた。本試験のハイスループットシーケンスデータはNCBIデータベース（PRJNA1036777）にアップロードされた。
    2.9. 結果の評価
    主要アウトカムはRDQ、GSRS、内視鏡評価を用いて治療後に評価され、全治療率、一次症状緩和までの期間、付随する消化器症状の改善、内視鏡的食道炎グレードの改善が含まれた。副次的アウトカムには2つの側面があった。1つ目は追跡期間後のRDQとGSRSスコアによる患者の再発の評価、2つ目は糞便サンプルに基づき、α多様性、β多様性、種組成の違いを含む腸内細菌叢の変化を群間で比較することであった。
    2.10. データ解析
    臨床データは、GraphPad Prism（v8.0.2）ソフトウェアを用いて分析し、図表化した。定量的データは平均値±標準偏差または中央値（四分位範囲）で示し、定性的データは比率で示した。定量的データには非対t検定またはノンパラメトリックMann-Whitney検定を、定性的データにはFisherの正確検定またはカイ二乗検定を用いた。両側p＜0.05を統計的に有意とみなした。REの累積再発率の評価にはKaplan-Meier解析を用いた。糞便サンプルの微生物叢分析は、QIIME2(2019.4)ソフトウェアパッケージおよび計算と可視化のためのGraphPad Prism(v8.0.2)ソフトウェアを用いて実施した。α-多様性検定はKruskal-Wallis順位和検定およびポストホック検定としてのDunn検定を用いて実施し、β-多様性はJaccard距離および非加重UniFrac距離に基づいて評価し、種の相対存在量は一元配置分散分析（ANOVA）に続いてKruskal-Wallisノンパラメトリック検定によって比較した。

  3. 結果
    3.1. 患者の登録と臨床的ベースライン特性
    患者の登録と臨床的ベースラインの特徴： 第1段階では、合計110名の適格患者が登録され、55名がプロバイオティクス群（Probio）に、55名がプラセボ群（Placebo）に無作為に割り付けられた。このうち、Probio群では4例、Placebo群では6例が、治療中に実験結果に影響を及ぼす可能性のある薬剤を服用したため、あるいは中止を希望したため、介入を完了しなかった。第1段階の治療は、プロバイオティクス群51人、プラセボ群49人が完了した。その後、症状スコアリングと内視鏡評価に基づき、それぞれ46人と42人が第2段階に入る基準を満たした。追跡期間中にプロビオ群2名、プラセボ群3名が脱落し、最終的にプロビオ群44名、プラセボ群39名が第2段階を終了した（図1の実験スケジュール全体を参照）。患者のベースライン特性とアンケートスコアを表1に示す。ベースライン時、年齢、性別、肥満度（BMI）、喫煙歴、不安・抑うつ症状、食道炎グレード、GSRSとRDQスコアにおいて、両群間に統計学的有意差はなかった（p＞0.05）。両群とも全体的にバランスのとれた状態であり、実験結果の比較可能性が確保された。
    栄養素 16 00342 g001図1. 試験全体のフローチャート。RDQ：逆流診断質問票。
    表1. 患者のベースライン特性。

3.2. プロバイオティクスの併用は症状緩和時間を短縮し、逆流性食道炎患者の胃腸症状を緩和する。
試験の第一段階では110人を登録し、最終的に100人が8週間の介入を完了した。治療後のRDQスコア、GSRSスコア、主要症状の緩和時間、治癒率を図2に示す。8週間の介入後、プラセボ群ではRDQスコアは7.45±3.68点、GSRSスコアは13点（11、16）であったが、MH-02を補充するとそれぞれ6.33±3.74点、11点（9、13）となった。Probio群ではプラセボ群に比べGSRSスコアが有意に低下した（p＝0.0007）が（図2A）、RDQスコアには統計学的に有意な差は認められなかった（p＝0.136）（図2C）ことから、MH-01とラベプラゾールの併用は、RE患者の胃腸症状を改善する可能性が示唆された。GSRS総スコアでは、腹痛症候群（2.73±0.83 vs. 3.93±1.33、p＜0.001）と消化不良症候群（4.22±1.62 vs. 5.61±1.63、p＜0.001）のスコアが有意に低下したが、逆流症候群、下痢症候群、便秘症候群のスコアはプラセボ群と有意差はなかった（図2B）。両群の主症状が改善するまでの期間を観察したところ、最初の2週間におけるプロビオ群の改善率（50.98％）は、プラセボ群（30.61％）よりも有意に高く、統計学的に有意な差（p = 0.044）が認められた（図2D）。しかし、4週目の主要症状の改善率（80.39％対71.43％、p＝0.353）については、両群間に有意差は認められなかった（図2E）。さらに、8週目の治癒率（92.16％対87.76％、p＝0.689）（図2F）にも統計学的有意差は認められなかった。最後に、追跡内視鏡検査の結果に基づいて食道炎のグレードの改善を評価すると、両群とも食道粘膜の内視鏡的治癒率は90％以上に達し（図2G）、両群間に統計学的有意差は認められなかった。これらの結果は、プロバイオティクスの併用が最終的な治癒率や内視鏡的治癒に顕著な影響を及ぼさないにもかかわらず、一次症状の緩和を達成するまでの時間を短縮し、患者の胃腸症状を改善できることを示している。
Nutrients 16 00342 図2. プロバイオティクス介入後の臨床効果の評価。(A）GSRSスコア：治療前と治療8週間後。(B）GSRSスコアの症状群スコア。(C）RDQスコア：治療前と8週間治療後。(D）2週間の症状寛解率。(E）4週間の症状寛解率。(F）8週間の治癒率。(G）食道炎グレードの改善度比較。Probio： 経口ラベプラゾールおよびMH-02、プラセボ： プラセボ：ラベプラゾールおよびプラセボ。GSRS：Gastrointestinal Symptom Rating Scale。：p＜0.05、：p＜0.001、ns：有意でない。
3.3. プロバイオティクス治療の併用は症状の再発を遅らせることができる
第一段階の治療が終了した時点で、患者はRDQスコアと内視鏡検査による食道粘膜治癒度で評価された。RDQスコアが12以下となり、食道粘膜の治癒が完了した患者は治癒したとみなされた。この研究では、合計88人の治癒した患者が第2段階の追跡調査に入り、その内訳はプロバイオティクス群46人、プラセボ群42人であった。最終的に、プロバイオティクス群42人、プラセボ群39人が全試験を終了した。
88人の適格な治癒患者のうち、Probio群44人、Placebo群39人がその後の12週間の追跡調査を完了した。追跡調査終了時点で、Probio群の18人が再発を経験し、平均再発期間は64.00±9.99日であったのに対し、プラセボ群の21人が再発を経験し、平均再発期間は54.10±10.58日と短縮した。全再発率は両群間に有意差はなかったが（40.91％対53.85％、p＝0.275）（図3C）、Probio群ではPlacebo群と比較して有意に再発期間が延長した（p＝0.005）（図3A）。さらに、Probio群のGSRS総スコアはプラセボ群より有意に低かった（15(12, 19) vs. 19(16, 22), p = 0.0013）。また、図3Dに示すように、累積再発率曲線では、プラセボ群の再発時期がプロビオ群より早く、しかも、8週目（9.1％対30.8％）、10週目（29.5％対51.3％）など、ほぼ毎週、プラセボ群の累積再発率がプロビオ群より高い傾向にあった。
栄養素 16 00342 g003図3. プロバイオティクスの併用はRE患者の症状の再発を遅らせた。(A）症状の再発時間。(B）追跡調査終了時点のGSRSスコア。(C）両群における全再発率。(D）患者の累積再発率。Probio： 経口ラベプラゾールおよびMH-02；プラセボ： 経口ラベプラゾールおよびプラセボ。：p＜0.01、ns：有意差なし。
3.4. プロバイオティクスの併用療法は腸内細菌叢の多様性の強化に寄与する
治療前（RE）に50検体、第1相試験終了後に100検体（Probio 51検体、Placebo 49検体）の計150検体の便を採取した。
α多様性分析では、Probio群のChao1指数とShannon指数が、RE群とPlacebo群に比べ有意に増加した（p < 0.01）（図4A,B）。しかし、プラセボ群とRE群の間では、この2つの指数に有意差は見られなかった。観察されたspecies indexの傾向は、Probio群で他の2群に比べて高かったChao1 indexの傾向と似ており（補足図S1A）、各群のサンプルの平均Goodsカバー率は99.9％を超えていた（補足図S1B）。さらに、補足図S1Cの疎曲線は、本実験のシーケンスデータ量が十分であったことを示している。
栄養素 16 00342 g004図4. プロバイオティクスはRE患者の腸内細菌叢の多様性を増加させた。(A）Chao1指数。(B）シャノン指数。(C）ジャカード距離に基づくβ多様性指数のPCoA。(D）同定された細菌種のベン図。RE：治療前の逆流性食道炎。Probio： 経口ラベプラゾールおよびMH-02；プラセボ： プラセボ：経口ラベプラゾールとプラセボ。：p＜0.05、**：p＜0.01。
β-多様性解析では、Jaccard距離行列および重み付きUniFrac距離行列に基づくPCoAによる解析結果から、Probio群の大部分の検体がRE群およびPlacebo群の検体と顕著に離れている一方で、RE群およびPlacebo群の大部分の検体は互いに重なっていることが明らかになった（図4C、補足図S1D）。さらに、品質管理後、配列決定されたサンプルから合計8975の操作的分類単位（OTU）が生成され、576のOTUが全グループで共有された。各群におけるOTUまたは総糞便細菌数の順位は以下の通りであった： Probio＞RE＞Placeboであった（図4D）。これらの結果は、RE患者におけるプロバイオティクスの併用療法が腸内細菌叢の多様性の増加に寄与することを示している。
3.5. プロバイオティクス併用療法は腸内細菌叢の組成を変化させた
全群にわたり、ファーミキューテス属、バクテロイデーテス属、放線菌属、プロテオバクテリア属、脊椎動物を含む細菌門が微生物組成の90％以上を占めた（図5A）。さらに統計解析を行ったところ、Probio群ではRE群に比べ、菌門レベルでのフソバクテリアの存在量が有意に減少していた（p < 0.05）（図5B）。また、Probio群では、プラセボ群と比較して、ファーミキューテス属がわずかに増加し、プロテオバクテリア属、バクテロイデーテス属、ベルコミクロビア属が減少した（図5C、補足図S2A-C）。上位20属レベル（図5D）では、ビフィドバクテリウム属とクロストリジウム属の相対量が、RE群とプラセボ群の両方と比較して、Probio群で有意に高いことが観察された（図5E,F）。逆に、連鎖球菌とロチア菌の相対量は、RE群とプラセボ群に比べ、Probio群で有意に低かった（図5G,H）。また、Sutterellaの相対量も、RE群と比較してProbio群で低かった（図5I）。これらの所見は、REに対するプロバイオティクスの併用療法が、腸内細菌叢の属レベルでの組成に有意な変化をもたらすことを示している。
栄養素 16 00342 g005図5. プロバイオティクスはRE患者における腸内細菌叢の組成を調節する。(A）門レベルでの種組成分析マップ。(D）属レベルでの種組成分析マップ。(E-I）Bifidobacterium、Clostridiaceae_Clostridium、Streptococcus、Rothia、Sutterellaの相対量。(J) 属レベルの上位20位に基づくクラスタリングヒートマップ。(K）LDA値分布のヒストグラム（LDA閾値＞2）。RE：治療前の逆流性食道炎。Probio： 経口ラベプラゾールおよびMH-02；プラセボ： プラセボ：経口ラベプラゾールとプラセボ。：p＜0.05、：p＜0.01、*：p＜0.001、ns：有意差なし。
属レベルの上位20種の平均存在量に基づいてクラスタリングヒートマップを作成した（図5J）。ビフィドバクテリウム（Bifidobacterium）、クロストリジウム（Clostridiaceae_Clostridium）、ブラウチア（Blautia）、コプロコッカス（Coprococcus）、ファスコラクトバクテリウム（Phascolarctobacterium）、プレボテラ（Prevotella）など、特定の有益な腸内細菌が、他のグループと比較してProbioグループで相対的存在量が高いことが観察できる。一方、ムチンの分解に関与するアッカーマンシア、腸の炎症に関連するスッテレラ、一般的な病原性のある腸球菌属や連鎖球菌属のような細菌は、Probioグループと比較してプラセボグループでより濃縮されていた。特筆すべきは、一般に有益とされる乳酸桿菌がプラセボ群では多く、Probio群では少なかったことである。また、これまでの研究で、PPIの使用は乳酸桿菌レベルを有意に増加させ、他の腸内細菌叢の生態学的構造を破壊することが支持されている [11,26,27]。本研究では、プロバイオティクス治療がこの不均衡を是正した可能性がある。LEfSe分析（≥2）により、糞便サンプル中の高存在細菌分類群も各群で大きく異なることが明らかになった（図5Kおよび補足図S3）。Probio群では、Bifidobacteriumのような有益な分類群や、Blautia、Butyricicoccus、Lachnospira、Clostridiumのような短鎖脂肪酸産生菌が、他の群に比べてより濃縮されていた。一方、プラセボ群では、連鎖球菌科から連鎖球菌、腸球菌科から腸球菌、放線菌科から放線菌、乳酸桿菌科から乳酸桿菌、Rothia、Sutterellaといった分類群の濃縮がみられた。以上の結果から、プロバイオティクスの併用は、有益な腸内細菌の増殖を促進し、潜在的な病原性細菌の増殖を抑制する上でプラスの役割を果たす可能性があることが示された。
3.6. プロバイオティクスサプリメントは治療中の有害薬物反応を減少させる可能性がある
介入期間中、両群で合計6人の患者が新たに発症した胃腸症状をPPI薬に関連した副作用と評価したが、重篤な有害事象を経験した患者はいなかった（表2）。プラセボ群では、1例に悪心・嘔吐、2例に腹部膨満感、2例に下痢がみられた。一方、プロバイオティクス群では、吐き気と嘔吐を経験した患者は1名のみであった。両群間で副作用の発生率に統計学的な差はなかった（1.96％対10.20％、p＝0.108）。
表2. 有害事象の要約。

  1. 考察
    世界人口の統計によると、GERDの有病率は8％から33％と国によって差があり、世界的に重要な健康問題であることが明らかになっている [2]。胃酸逆流はGERDの重要な症状であり、胃酸逆流や胸やけといった典型的な臨床症状だけでなく、吐き気、腹鳴、上腹部痛、腹部膨満感などの症状を伴うことが特徴である [28] 。RE症状を速やかに緩和し、再発頻度を減らす方法を見つけることは、臨床医にとって長年の臨床的課題であった。本研究は、ビフィズス菌サプリメントMH-02をREの補助的治療薬として用いることの潜在的有益性を検討することを目的とした。この二重盲検無作為化プラセボ対照試験の結果、プロバイオティクスがREの症状の改善、再発の遅延、腸内微小生態系の再構築にプラスの治療効果を示すことが明らかになった。
    現在の研究では、RE治療の鍵は胃酸抑制療法であり、これは胃内のpHを上昇させることにより、胃酸逆流による食道粘膜へのびらん作用を軽減することを目的としている。プロトンポンプ阻害薬（PPI）は、現在最も広く使用されている酸抑制薬であり、RE患者の胃酸逆流や胸やけ症状を有意に軽減する [4] 。しかし、胃酸逆流には上腹部痛や腹部膨満感などの付加的な症状が伴うことが多く、運動促進薬などの他の治療が必要となる。プロバイオティクスはこのような症状の管理に有望である。GERDとプロバイオティクスに関するレビューでは、13件の研究のうち11件が、逆流、消化不良症状、吐き気、腹部不快感に対するプロバイオティクスの有益な効果を報告している [29] 。さらに、いくつかの臨床研究では、プロバイオティクスが胃排出を効果的に促進し、機能性胃腸障害を有する乳幼児や妊婦の逆流症状を軽減することが実証されている［30,31］。予想されたとおり、本研究では、プロバイオティクス介入群はプラセボ群と比較して、治療開始後2週間で酸逆流と胸やけの症状がより早く緩和されることが示された。4週間および8週間の治療期間中、主症状の寛解率および治癒率に差は認められなかったが、これは主にラベプラゾールの治療効果が長期にわたって優勢であったためと考えられた。さらに、治療8週後、プロバイオティクス群はプラセボ群よりもGSRSスコアが有意に低いことが観察された。最後に、REにMH-02を併用しても副作用は増加せず、減少傾向にあることも示された。このことから、MH-02とラベプラゾールの併用は安全であり、早期の疼痛緩和を達成し、患者のQOLに寄与し、患者のコンプライアンスを改善する可能性があることが示唆された。
    REの症状が頻繁に再発することは、治療における大きな課題であり、多くの場合、維持のためにPPI薬の長期使用が必要となる。最近の研究では、PPIの長期使用は、栄養吸収障害、細菌転座感染、腸内細菌叢の不均衡といった問題と関連している [32,33] 。本研究では、8週間の治療で寛解を得たRE患者について12週間の追跡調査を行った。その結果、有望な発見があった： MH-02併用療法は、従来の治療レジメンと比較して再発時期を遅らせることができる。このことは、プロバイオティクスを従来のRE治療と併用することで、疾患の経過を通じてPPI投薬の必要性が減少し、患者のQOLの向上と医療負担のさらなる軽減に貢献できる可能性を示唆している。プロバイオティクスが再発時期に影響を及ぼす正確なメカニズムはまだ不明である。先行研究者らは、小腸内細菌の過剰増殖（SIBO）がガス産生の増加、腹圧の上昇、消化管免疫炎症経路の活性化を通じて食道逆流を助長し、悪化させる可能性を示唆している [34,35,36]。PPIによる酸分泌抑制はSIBO発症の前兆と考えられている。Tsudaら [37] は、機能性ディスペプシア患者を対象とした臨床研究において、PPIのわずか4週間の適用がSIBOの発症につながることを明らかにした。Jacobsらは、PPIの使用がSIBOの独立した危険因子であると同定しており、メタアナリシスでもこの関連が支持されている [38,39,40] 。逆に、プロバイオティクスがSIBOの症状や予後を改善することが複数の研究で示唆されている [41,42,43] 。したがって、プロバイオティクスに起因するRE再発の遅延は、部分的にこの効果に関連している可能性があると推測される。しかし、具体的な病理学的・生理学的メカニズムについては、今後さらなる研究が必要である。
    腸内細菌叢とその代謝産物は、身体の代謝と免疫機能の両方を調節することによって、ヒトの健康と疾病に重要な役割を果たすことがよく知られている。しかし、腸内細菌叢とREとの相互作用に関する研究は、現在の科学界ではまだ大きな隔たりがある。Shiらによる研究 [6] では、GERD患者と健常人の腸内細菌叢の組成と存在量に有意な差があることが示唆されている。さらに、別の最近の報告では、微生物叢移植療法が非びらん性胃食道逆流患者の全寛解率を大幅に上昇させることが示されており、正常な腸内細菌叢の回復がGREDの管理において重要な役割を果たす可能性が示唆されている [44] 。したがって、MH-02が介在する胃食道逆流症の改善メカニズムの根底にあるものをさらに探るために、患者の糞便サンプルについてハイスループット配列決定を行った。その結果、プロバイオティクスの同時投与が、胃食道逆流症患者において腸内細菌叢のα多様性を増加させ、β多様性分析によって微生物組成を変化させることが示された。しかし、RE群とプラセボ群ではα-多様性に有意差は認められず、β-多様性の観点からはサンプルクラスターの分離が軽度であったことから、本研究におけるプロトンポンプ阻害薬（PPI）の使用は、患者コホートにおける腸内細菌叢の多様性にわずかな影響を与えるに過ぎないことが示唆された。これらの変化は先行研究 [6,45,46] と一致している。一方、このことは、プロバイオティクス療法の併用が患者の腸内細菌叢をより健康的なプロフィールへと導き、RE管理を強化する可能性があることを示唆している。
    図5に示す腸内細菌叢の組成に関するさらなる解析により、PPIとMH-02の併用投与後に属レベルの分類群の存在量が有意に変化することが示された。クラスタリングヒートマップとLEfSe分析により、細菌存在量のグループ間変動がより直感的に表現され、プラセボグループと比較して、Probioグループはビフィドバクテリウム属、クロストリジウム属、ブラウチア属、コプロコッカス属、ファスコラクトバクテリウム属に属する分類群の濃縮を示し、腸内微小生態系の改善が示唆された。宿主の免疫系の発達を支援し、腸の恒常性と機能を改善し、病原体の増殖を防ぐというビフィズス菌の役割を支持する証拠が増えつつある [17,47,48]。さらに、ビフィズス菌は短鎖脂肪酸のような有益な代謝産物を産生することができ、これらの代謝産物は宿主の上皮細胞や腸内細菌叢に好影響を与えると考えられている [49,50,51]。さらに、Clostridiaceae_Clostridiumには、腸管内のpHを著しく低下させる能力を持ち、ビフィズス菌を含む正常な腸内細菌叢の増殖を効果的に促進することができる酪酸を産生することができるC. butyrateを含む有益な細菌群が含まれている［52,53］。Blautia属はまた、代謝性疾患、炎症性疾患、生体内変換において有益な役割を果たす可能性がある[54,55,56,57]。対照的に、プラセボ群と比較して、Probio群ではStreptococcus属、Lactobacillus属、Rothia属、Sutterella属の存在量が有意に減少した。いくつかの先行研究では、GERD患者を含む患者において、PPI使用後に腸内のレンサ球菌数が有意に増加することが報告されている[11,26,32]。今回の研究では、MH-02使用後にこの増加が逆転したようである。Streptococcus属は正常な食道微生物の一般的な属の一つであるが[58]、胃の胃酸が抑制され、下部消化管にStreptococcus属が侵入すると、しばしばいくつかの疾患状態と関連する[26,59,60]。このことは、レンサ球菌が部位によって異なる分布と機能を持つことも示唆している [61] 。興味深いことに、一般的に有益と考えられている乳酸菌は、プラセボ群では存在量が多く、Probio群では存在量が少なかった。一方、食道疾患における乳酸菌の増加を報告した研究もあるが、そのほとんどはPPIに関連したものと考えられている。PPIの長期服用は、腸内細菌叢の組成と多様性を変化させることにより腸内細菌叢異常を誘発し、一般的にStreptococcusとLactobacillusの増加をもたらす[11,62]。しかし、PPI使用後の乳酸桿菌の増加が身体にどのような影響を及ぼすかは明らかではない。また、菌血症や肝膿瘍など、乳酸桿菌による重篤な感染症を報告した研究もあり [63,64]、2型糖尿病やパーキンソン病などの疾患患者でも乳酸桿菌の増加が観察されている [65,66]。このことは、一部の細菌が有益な効果を発揮するためには適切な濃度を維持する必要があり、細菌と宿主の共進化関係がプロバイオティクスの特性を決定することを示しているのかもしれない[67,68]。したがって、本研究におけるMH-02の補充は、乳酸菌の恒常性を維持する可能性があるが、これはより多くの研究によって確認される必要がある。Rothiaもまた、人体における一般的な日和見病原体として同定されており、扁桃炎、肺炎、心内膜炎を引き起こす可能性がある[61,69]。また、サッテレラは潰瘍性大腸炎、抗生物質関連下痢、その他の消化器疾患との関連も報告されている [70,71]。一方、この追跡調査において、プロバイオティクスの介入は、これらの微生物集団で観察された変化に対抗することができ、さらに有益な微生物叢の増殖に貢献し、潜在的な病原体の増殖を防ぐことができる。まとめると、これらの知見から、RE治療におけるプロバイオティクスの補充は、腸内細菌叢を再構築し、微生物生態系のより良好なバランスを促進する可能性があることが強く示唆される。
    現在、REに対する補助療法としてのプロバイオティクスの応用に関する質の高い臨床研究は少ない。本研究は、この方向での今後の研究のための貴重な参考となるものである。しかし、本研究には一定の限界もある。第一に、試験に支障をきたす可能性のあるプロバイオティクスやプレバイオティクスを含む薬物や食品を除外する努力はしたが、食事摂取を完全に標準化することはできず、その結果、食事によって誘導される腸内細菌叢にばらつきが生じる可能性があった。第二に、我々は臨床症状と腸内細菌叢の改善について分析したが、両者を結びつける直接的な証拠はまだ検討されていない。Liuらによる最近の研究[10]では、REにおいて微生物叢が食道傷害を媒介するメカニズムを調べるためにプロテオーム解析を行い、食道と腸の微生物叢のアンバランスが、循環LPSレベルを上昇させることによってフェロプターシスとパイロプターシスを誘発することが示唆された。したがって、MH-02の補充は、腸内細菌叢の再形成、LPSレベルおよび他の微生物代謝産物の調節を通して、最終的に食道粘膜障害を軽減し、粘膜修復を促進するように作用するのではないかと我々は仮定した。プロバイオティクスがこのような改善を媒介するメカニズムをさらに研究することで、REにおけるプロバイオティクスの潜在的治療効果についてより深く理解することができるであろう。さらに、今回のサンプルサイズと追跡期間は限られており、それぞれの観察と比較のために逆流性食道炎のグレード層別化は行われなかった。したがって、今後、逆流性食道炎におけるプロバイオティクスの継続的な効果を検討するためには、より大規模なコホートとより長期間の追跡が必要である。

  2. 結論
    結論として、本研究の結果から、MH-02の併用は、典型的な症状の早期緩和、関連する胃腸症状の改善、再発の遅延など、RE患者の治療成績の改善に役立つことが示唆された（図6）。さらに、MH-02は腸内細菌叢のバランスを回復させるのに役立つ可能性があり、特定の細菌属の変化がその効果の一部を説明する可能性がある。したがって、これはRE患者のQOLを改善し、腸の健康を促進する有望な新しい治療戦略であり、臨床医が将来この慢性疾患を管理するための、より包括的で潜在的により効果的なアプローチを提供するものである。
    栄養素16 00342図6. REに対するMH-02とPPIの投与による治療改善の模式図。Bifidobacterium animalis subsp. lactis MH-02とPPIを併用した経口サプリメントは、酸逆流を抑制し、胃腸症状を緩和し、症状緩和時間を短縮し、再発を遅らせ、胃腸の有益な微生物叢を豊かにし、薬物有害反応を軽減することに貢献できる。
    補足資料
    https://www.mdpi.com/article/10.3390/nu16030342/s1、補足図S1：腸内細菌叢の多様性の変化、**：p<0.01、補足図S2： 補足図S2：門レベルでの細菌の相対的存在量；補足図S3： LEfSeクラドグラムは、RE患者の腸内細菌叢の多様性を異なるレベルで示している。
    著者貢献
    概念化、L.G.およびN.F.、方法論、L.G.、ソフトウェア、L.G.およびY.W.、検証、L.G.、S.H.、L.Z.およびP.L.、正式解析、L.G.、調査、L.G.、 S.H.、L.Z.およびP.L.；リソース、L.G.およびT.C.；データキュレーション、L.G.；執筆-原案作成、L.G.およびY.W.；執筆-校閲および編集、T.C.、 L.G.、Y.W.、Q.F.、H.L.およびK.Z.、可視化、L.G.およびY.W.、監督、T.C.およびN.F.、プロジェクト管理、T.C.、資金獲得、T.C.およびN.F. 著者全員が本原稿の出版版を読み、同意した。
    資金提供
    本研究は、江西省自然科学基金会（Nian Fang, 2023, No.20232ACB206040）；江西省保健家族計画委員会科学技術計画（Lihong Gan, 2020, No.20204009）の助成を受けた。
    施設審査委員会声明
    本研究はヘルシンキ宣言に従って実施され、南昌第一病院倫理委員会（KY2021071、2022年1月5日）の審査・承認を得た。
    インフォームド・コンセント
    本研究に参加したすべての被験者からインフォームド・コンセントを得た。
    データ利用声明
    16S rRNAハイスループットシーケンスの生データはNCBIのSequence Read Archive（SRA）データベースにアップロードした（PRJNA1036777）。その他のデータについては、著者らにより過度の留保なく利用可能である。
    謝辞
    図6はBioRender（biorender.com）を用いて作成した。
    利益相反
    著者らは、本研究が利益相反の可能性があると解釈されるような商業的または金銭的関係がない状態で実施されたことを表明する。
    参考文献
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著者による© 2024。ライセンシー MDPI, Basel, Switzerland. 本論文は、クリエイティブ・コモンズ 表示（CC BY）ライセンス（https://creativecommons.org/licenses/by/4.0/）の条項および条件の下で配布されるオープンアクセス論文である。
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MDPIおよびACSスタイル
ビフィズス菌MH-02の逆流性食道炎患者に対する併用療法としての治療評価： 無作為二重盲検プラセボ対照試験。Nutrients 2024, 16, 342. https://doi.org/10.3390/nu16030342

AMAスタイル
逆流性食道炎患者における補助的治療としてのビフィズス菌MH-02の治療評価： 無作為二重盲検プラセボ対照試験。Nutrients. 2024; 16(3):342. https://doi.org/10.3390/nu16030342

シカゴ/トゥラビアンスタイル
Gan, Lihong, Yufan Wang, Shenan Huang, Li Zheng, Qi Feng, Hui Liu, Peng Liu, Kaige Zhang, Tingtao Chen, and Nian Fang. 2024. 「Bifidobacterium animalis subsp： A Randomized, Double-Blind, Placebo-Control Trial" Nutrients 16, no. 3: 342. https://doi.org/10.3390/nu16030342

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