ルーメン微生物群におけるコア繊毛虫の代謝的影響力

オープンアクセス
発行：2023年5月11日
ルーメン微生物群におけるコア繊毛虫の代謝的影響力

https://www.nature.com/articles/s41396-023-01407-y

テア・O・アンデルセン
イアニナ・アルトシューラー
...
フィリップ・B・ポープ
著者を表示する
ISME Journal (2023)この記事を引用する
19 Altmetric
メトリックス詳細
概要
原生動物は、ルーメン微生物群の微生物バイオマスの主要な部分を構成しており、その中でも、反芻動物の多様な遺伝的・地理的宿主において、エントディニオモルフ（Entodiniomorphida）とホロトリックス（Vestibuliferida）が常に優勢であることが観察されている。原生動物が重要な役割を果たしていることは明らかですが、ルーメン機能に対する原生動物の生物学的および代謝的な貢献は、生体内ではまだほとんど明らかにされていないのが現状です。ここでは、脂質とデンプンの含有量が異なる飼料を与えたウシとヤギのルーメン液サンプルから得られたメタプロテオーム（メタゲノム）を活用し、原虫が微生物と共存する中で占める特定の代謝ニッチについて詳述することにした。総タンパク質数とラベルフリー定量による最初のプロテオーム推定では、エントジニオーム属のEntodiniumとEpidinium、ホロトリックス属のDasytrichaとIsotrichaがルーメンメタプロテオーム全体の大部分を構成していることが示された。ヒドロゲナーゼ（Dasytricha, Isotricha, Epidinium, Enoplastron）、糖質活性酵素（Epidinium, Diplodinium, Enoplastron, Polyplastron）、微生物捕食（Entodinium）、揮発性脂肪酸生産（Entodiniumと Epidinium）などの原虫代謝に関するプロテオームの検出が高メタン放出動物で高レベルで観察されています。ある種の原生動物はデンプンを消化することがよく知られているにもかかわらず、高デンプン食を与えた低メタン排出動物では予想外に検出されず、代わりに宿主に関係なく捕食に対して耐性があると疑われるプロピオン酸/サクシネート生産細菌集団が優勢であった。最後に、地理的に独立したデータセットで上記の観察結果を再確認し、未解明の真核生物集団がルーメンに与える代謝上の影響力の大きさを明らかにし、消化とメタン代謝の両者に大きな影響を与えることがわかった。
背景
反芻動物はルーメン微生物群と共生しており、ルーメン微生物群は飼料を揮発性脂肪酸（VFA）の形で栄養分に分解し、宿主の純エネルギーの約70％を供給しています [1] 。ルーメン微生物群は、細菌、真菌、古細菌、ウイルス、原生動物の複雑な集合体であり、その複雑な組成と機能は、飼料効率、乳量、動物の健康、温室効果ガス（GHG）排出など、宿主の生産性形質に関連しています [2、3、4、5]。ルーメンマイクロバイオームの同定と特性解析のために、培養および配列決定されたゲノムの公開カタログを作成するなど、大規模な共同研究が行われています[6,7,8]。ルーメンでは、全微生物バイオマスの50-90%を細菌、10-50%を原生動物、5-10%を真菌、4%未満を古細菌が占めると推定されています [9, 10]。ルーメンの真核生物集団を軸培養することは困難であり、その複雑なゲノムの特徴は、現在のメタゲノム解析やビニング技術に阻まれるため、ルーメンマイクロバイオームの再構成は、細菌と古細菌に大きく偏っていますが、ルーメンの真菌と原虫の貢献については、現在ほとんど明らかになっていません。嫌気性真菌はルーメンの繊維分解者として評判の高い役割を担っていますが、現在、草食動物の嫌気性腸内真菌は18種類しか記載されておらず、ゲノムも11種類しかありません [11,12,13] 。同様に、現在までに配列が決定され、公開されているルーメン原生動物ゲノムはほとんどなく、中でもルーメン繊毛虫原生動物Entodinium caudatumはその代表格である[14]。最近では、Isotricha、Dasytricha、Diplodinum、Enoplastron、Metadinium、Eremoplastron、Ostracodinium、Polyplastron、Ophryoscolex、EpidinumおよびEntodiniumの13属にわたる5種のホロトリックと14種のエントディノームの代表として、単一細胞増幅ゲノム (SAGs) がラムネ微生物サンプルで回収されています [15]．
EntodiniumとEpidiniumはEntodiniomorphida目のentodiniomorphで、ルーメン原虫の最も支配的な属の2つを示し、以前は592個のルーメンサンプルの99％以上で、それぞれ〜38と16％の平均原虫相対存在率（2015ルーメンセンサー：32動物種、35か国）［16］で検出されています。Entodiniomorphsは以前、メタン生成を刺激することが観察されているが[17]、Epidinium caudatumのようにヒドロゲノソームを有するものもあるが[18]、数的に優勢なEntodinium caudatumはそうではなく、メタン生成内共生生物にとって有益な、水素生成を示すと考えられるミトコームおよび鉄ヒドロゲナーゼをコードしていると考えられている[19]。DasytrichaやIsotrichaなどのVestibuliferida目のHolotrich種は、一般的にentodiniomorphsと比較して存在量が少ないが、可溶性炭水化物の発酵とVFAsや水素の生産で有名である[20、21]。ここでは、ホルスタイン種の乳牛（Bos taurus）とアルプス山羊（Capra hircus）の2つの異なる宿主種のルーメン微生物群のゲノム中心のメタプロテオミクス解析を紹介します。これらの牛は、45：55の飼料と濃厚飼料比率のファーストカット草原乾草を食べ、濃厚飼料には脂質を追加しない（CTL）、またはコーンオイルと小麦デンプン（COS）のいずれかを添加しています [5, 22, 23] 。以前の顕微鏡分析では、entodiniomorphsの数が多く、holotrichsはそれほどでもなかったが、メタデータでは、COSを与えた動物は宿主に関係なく、メタン排出量が減少していた。これらの飼料がメタンとVFAの消化・生産にどのような影響を与えるかを説明するため、複雑なルーメン微生物群の機能と組成の変化を調査することを目的としました。ショットガンメタゲノムシーケンスを用いて、合計244の原核生物メタゲノム集合ゲノム（MAG）を回収し、選択された分離およびSAG由来の真核生物ゲノム [14, 15, 24, 25, 26, 27, 28, 29] とともに、ルーメン原生動物種のゲノム中心メタプロテオミック解析のためのデータベースとした。植物繊維やデンプンの分解、細菌の捕食、水素やVFA生産に関連する主要な原生動物代謝が検出されました。多くの原生動物種がデンプンを分解する遺伝的能力を有しているにもかかわらず、我々の解析では、デンプンを多く含む飼料を与えた動物のルーメン微生物叢では、ルーメン原生動物の代謝活性が低いという対照的なデータが示されました。このようなシナリオでは、PrevotellaやFibrobacter、SuccinivibrionaceaeやAminobacteriaceaeのメンバーなど、デンプン分解やプロピオン酸やコハク酸を生成する他の細菌属がより優勢であるようでした。以上のことから、COSを添加した飼料を食べたウシとヤギのメタン生成量の減少は、水素がメタン生成ではなく、コハク酸やプロピオン酸の生成に方向転換されることによって引き起こされる可能性が高いことがわかった。最後に、地理的に独立した二次データセットを分析することで、水素、植物繊維、デンプン関連の代謝に関する原虫の優勢とパターンに関する我々の主要な観察結果を再確認し、この原虫種がルーメン微生物群の機能において中核的役割を果たすという我々の仮説を支持しました。
方法
動物実験とサンプルの取り扱い
実験手順は、Auvergne-Rhône-Alpes Ethics Committee for Experiments on Animals (France; DGRI agreement APAFIS#3277-2015121411432527 v5)の承認を得て、欧州連合指令2010/63/EUガイドラインに準拠した。実験は、2016年2月から7月まで、フランス国立農業研究機構（INRAE, Saint-Genès-Champanelle, France）のHerbiPôle site de Theixの動物実験施設において実施した。実験デザイン、動物および飼料は、他の場所で説明されたとおりであった[5、23]。簡単に言うと、4頭のホルスタイン牛と4頭のアルプス山羊（すべて授乳中）を、4つの28日間の実験期間にわたって4つの飼料の効果を調べるために、それぞれ2つの4×4ラテンスクエア設計試験に登録した（補足表S1）。オリジナルの研究では、草地乾草をベースとした4種類の実験飼料に、様々な脂質源を添加した濃厚飼料を加えた；脂質を添加しないコントロール飼料（CTL）、コーン油と小麦デンプンを添加した飼料（COS）、海藻粉末を添加した飼料（MAP）、水素添加パーム油（HPO）を添加した飼料（補足表S2） [23]. 本研究では、反芻動物の両種において最も極端なメタン（CH4）排出プロファイルに関連するCTLおよびCOS飼料に焦点を当てた。CTL飼料は牧草乾草の自由摂取と脂質を含まない濃厚飼料からなり、COS飼料はコーンオイル（総乾物摂取量（DMI）5.0%）と小麦デンプン（COS）-総DMIの5.0%を含む（表1）。コーン油（Olvea、Saint Léonard、フランス）は、濃縮物に、総DMIの5％で添加され、以下を含んでいた（g／kgの総FA）：16：0（114）、18：0（16． 4）、cis-9 18：1（297）、cis-11 18：1（6.30）、18：2n-6（535）、18：3n-3（7.57）、20：0（3.48）、 22：0（1.0）24：0（1.5） および総FA（1000 g/kg）。詳細な飼料組成は、Martinら[5]に掲載されている。各実験期間は28日間であった。食事は0830hと1600hの2回に分けて提供された。動物たちは常に新鮮な水を自由摂取できるようにした。濃厚飼料と乾草の断食量は毎日計量した。翌日の飼料供給量は、飼料乾物（DM）45％、濃厚飼料55％という飼料比率を維持するため、拒否量に応じて調整された。ルーメン液のサンプリングポイントを1つだけにしたことで、動物間の個体誤差を最小化するための本来の実験的ラテン方陣設計の威力が低下していることは認める。
表1 原虫の機能を調べるために使用したルーメンサンプルにリンクされている動物の宿主、食事条件、付随するメタデータの概要。
フルサイズの表
ルーメン液は、各実験期間の27日目の朝の給餌前に胃管を通して採取した。胃管は、牛の場合はプローブの頭に10cmのストレーナーを取り付けた外径23mmのフレキシブルなPVCホースからなり、ヤギの場合は12cmのストレーナーを取り付けた15mmのフレキシブルなPVCホースからなる。唾液による汚染を最小限に抑えるため、最初の200mlのルーメン液は廃棄した。サンプルは、ポリエステルモノフィラメント布（280μmポアサイズ）でろ過し、2mlスクリューキャップチューブに分注し、15,000×gで10分間遠心分離し、ペレットを液体窒素でスナップ凍結させた。サンプルは、Yu and Morrisonビーズビート法[30]を用いてDNAを抽出するまで-80℃で保存した。合計 32 個のルーメン液サンプル（元の研究 [23] に含まれる 4 種類の飼料を与えた牛 4 頭とヤギ 4 頭）を、メタゲノムおよびメタプロテオミクス解析のためにノルウェー生命科学大学（NMBU）に送付した。呼吸チャンバーを用いて5日間のメタン排出量を測定し、VFAとNH3濃度は炎イオン化検出器を用いたガスクロマトグラフィーによって測定した[31]。原生動物は顕微鏡でカウントし、小型のentodiniomorphs（<100 µm）、大型のentodiniomorphs（>100 µm）、またはholotrichs DasytrichaとIsotrichaに分類された[9]。飼料と測定に関する詳細はMartinら[5]に記載されており、VFAとメタンの測定値は表1にまとめられている。
メタゲノミックシークエンシングと解析
メタゲノミックショットガンシーケンスは、Norwegian Sequencing Centerで、HiSeq 3/4000（Illumina）の2レーンで行われ、両方のレーンで150 bpペアエンドリードを生成した。シーケンスライブラリは、シーケンス前にTruSeq DNA PCR-Free High Throughput Library Prep Kit（Illumina）を用いて調製した。レーン間のシーケンスバイアスの可能性を防ぐため、32サンプル（元の研究[23]に含まれる4種類の飼料を与えた牛4頭とヤギ4頭）すべてを両方のレーンで実行しました。FASTQファイルは、Trimomatic [32] (v. 0.36)を用いて、塩基品質エンコーディングのパラメータ-phred33、先頭および末尾の塩基閾値を20に設定して品質フィルターをかけ、イルミナのアダプターを除去しました。4塩基のスライディングウィンドウで平均品質スコアが15以下の配列はトリミングされ、リードの最小長は36bpに設定されました。MEGAHIT [33] (v.1.2.9) を用いて、牛とヤギから別々に採取したサンプル由来のリードを、 [7] に従って -kmin-1pass, --k-list 27,37,47,57,67,77,87, --min-contig-len 1000 オプションでコ・アセンブルしました。Bowtie2 [34] (v. 2.3.4.1) を用いてリードをアセンブリに戻し、SAMtools [35] (v. 1.3.1) を用いてSAMファイルのBAMフォーマットへの変換とソートしたBAMファイルのインデックスを作成した。
Maxbin2[36]、MetaBAT2[37]、CONCOCT[38]を用いて、2つのコ・アセンブリ（牛由来のサンプルとヤギ由来のサンプル）のビニングを行った。MetaBAT2（v.2.12.1）はパラメータ-minContig 2000と-numThreads 4で実行し、Maxbin2（v.2.2.7）はデフォルトパラメータと-thread 4, min_contig_length 2000で、CONCOCT (v.1.1.0) はデフォルトパラメータと-length_threshold 2000で実行されました。さらに、DASTool [39] (v. 1.1.2) を用い、パラメータ -write_bins 1, --threads 2、検索エンジンとして BLAST [40] を用いて、ビンのフィルタリング、複製解除、集約が行われた。その結果、2つの宿主種で合計244個の重複排除されたMAGが得られました（ウシ由来が104個、ヤギ由来が140個）。各 MAG の完全性と汚染を計算するために CheckM [41] (v. 1.1.3) lineage ワークフローを使用し、パラメータは -threads 8, --extension fa。各 MAG の相対存在量を計算するために CoverM (v. 0.5.0) (https://github.com/wwood/CoverM) を使用し、分類学的注釈には GTDB-tk [42, 43] (v.1.3.0) が使われた。回収されたMAGの約90%（244個中219個）は、ゲノム報告基準の完全性と汚染に関するMIMAGsの閾値［44］に従って、高または中質のMAGとみなされた（補足表S3）。最終的なMAGの遺伝子呼び出しと機能アノテーションは、データベースdbCAN [46], Pfam [47], Uniref90 [48], Merops [49], VOGdb and KOfam [50]を用いてDRAM [45] パイプラインで実行した。公開されているドラフトEn. caudatum macronucleusゲノムの翻訳アミノ酸配列は、Parkら[14]によるBlastKOALA[51]を用いてKEGG代謝パスウェイデータベースでアノテーションしました。その結果得られたKEGG Orthology（KO）番号を持つタンパク質は、KEGG Mapper Reconstruct Tool [52]を用いて代謝経路に機能的に割り当てられた。
各 MAG、およびヤギ（Capra hircus, NCBI ID: 10731）および牛（Bos taurus, NCBI ID: 82）のホストゲノムから得られたタンパク質配列は、2つのデータベースにまとめられ、以降、ヤギ用サンプル別 RUmen DataBase (RUDB-G) および牛用サンプル別 RUmen DataBase (RUDB-C) と称する。さらに、両データベースには、原生動物Entodinium caudatumのゲノム[14]と、Li et al.の18個のSAGを追加しました。[Dasytricha ruminantium SAG3、Diplodinium dentatum SAGT1、Diplodinium flabellum SAG1、Enoplastron triloricatum SAGT1, Entodinium bursa SAG3, Entodinium longinucleatum SAG4, Epidinium cattanei SAG3, Epidinium caudatum SAG1, Eremoplastron rostratum SAG2、 Isotricha intestinalis SAGT2、Isotricha prostoma SAG3、Isotricha sp YL-2021a SAG1、Isotricha sp YL-2021b SAG3、Metadinium minomm SAG1、Ophryoscolex caudatus SAGT3、Ostracodinium dentatum SAG1、Ostracodinium gracile SAG1 及び Polyplastron multivesiculatum SAGT3. また、Fibrobacter succinogenes S85（NCBI ID: 932）は、ルーメン微生物群における主要なセルロース分解菌としてよく知られており、同様の研究において活性な微生物として観察されているが、本研究では固有のMAGとして徹底的にビン詰めされていなかったため、両方のルーメンデータベースに追加された。Joint Genome Institute (JGI) Mycocosm [53]からダウンロードした9つの利用可能な真菌ゲノムをRUDB-Cに追加した（Anaeromyces sp. S4 [25], Caecomyces churrovis [28], Neocallimastix californiae [25], Neocallimastix lanati [29], Piromyces finnis [25], Piromyces sp. E2 [25], Piromyces UH3-1 [24, 25, 27], Piromyces eukMAG [54], Orpinomyces sp [26]) 。合計で、RUDB-GとRUDB-Cについて、それぞれ1 291 083と1 190 938のタンパク質エントリからなる完全なデータベースが完成しました。
メタプロテオミクスデータ作成
300μLのルーメン液サンプル（オリジナルの研究[23]に含まれる4種類の飼料を与えた4頭の牛と4頭のヤギから得られた合計32個のルーメン液サンプル）に150μLの溶解バッファ（30mM DTT、150mM Tris-HCl (pH=8), 0.3% Triton X-100, 12% SDS）と4mmガラスビーズ（≤160μm）を加え、短時間ボルテックスを行い氷上に30分静置しました。溶解は、FastPrep-24 Classic Grinder (MP Biomedical, Ohio, USA) を用いて、4.0 m/s で 3 × 60 s で行った [55]. サンプルを16,000×gで15分間、4℃で遠心分離し、溶解液を注意深く取り除いた。タンパク質濃度は、Bio-Rad DC Protein Assay (Bio-Rad, California USA) を用いて、ウシ血清アルブミンを標準として測定した。サンプル溶解液の吸光度は、BioTek Synergy H4 Hybrid Microplate Reader (Thermo Fisher Scientific Inc., Massaschusetts, USA)のA750で測定されました。40〜50μgのタンパク質をSDS-バッファーで調製し、水浴中で99℃で5分間加熱し、Any-kD Mini-PROTEAN TGX Stain-Free gels (Bio-Rad, California, USA) を用いて、サンプルクリーンアップ目的で2分間のランで、Coomassie Blue R-250での染色前にSDS-PAGEにより分析した。可視バンドをゲルから注意深く切り出し、還元、アルキル化、トリプシンによる消化の前に1×1mm片として分割した。ペプチドは、製造者の指示に従ってC18 ZipTips（Merck Millipore, Darmstadt, Germany）を用いて濃縮・溶出し、乾燥させ、既述のようにQ-Exactive hybrid quadrapole Orbitrap MS (Thermo Fisher Scientific Inc., Massaschusetts, USA）を用いてナノLC-MS/MSで分析した［56］。
メタプロテオームデータ解析
質量分析（MS）の生データをFragPipeバージョン19で解析し、MSFragger [57]でサンプル固有のタンパク質配列データベース（RUDB-GとRUDB-Cについてそれぞれ1 291 083と1 190 938のタンパク質エントリ）に対して検索しました（補足表S4）。このデータベースは、偽発見率（FDR）を推定するために、すべてのタンパク質エントリーの逆配列に加えて、ヒトケラチン、トリプシン、ウシ血清アルブミンなどの汚染タンパク質エントリーを追加した[58]。メチオニンの酸化とタンパク質のN末端アセチル化は可変修飾として、システイン残基のカルボミドメチル化は固定修飾として使用された。消化酵素としてトリプシンを選択し、許容される最大ミス切断は1回、MSおよびMS/MSのマッチング許容レベルは20 ppmとした。結果は1%FDRにフィルタリングされ、定量化はIonQuant [59]を使用して行われました。サンプル間の正規化、およびタンパク質同定を最大化するための「ラン間の一致」機能を含みます。さらなる解析には、Perseus [60] バージョン1.6.2.3を使用しました。タンパク質群は、少なくとも1つの条件下で、少なくとも50%の複製で定量された場合に有効とみなされた。潜在的な汚染物質として特定されたタンパク質群は削除された。個々のゲノム/SAG/MAGの貢献度の計算は、Kleinerら[61]が概説したワークフローを用いて計算し、各ゲノム/SAG/MAGに割り当てられたすべてのタンパク質の存在量（ラベルフリー定量（LFQ）値）を合計し、飼料間の存在量の差は、不対2面スチューデントt検定（p値＜0.05）で検出した。
ろ過後、ウシの16サンプルで3657のユニークなタンパク質グループ、ヤギの15サンプルで3818のユニークなタンパク質グループを解決しました（補足表S5および補足表S6）。図1のドットプロットは、R (v. 4.2.0) [63]のggplot2 [62]で作成した。En.caudatumが各食事・動物で有意に濃縮された発現代謝経路を決定するために、RのhyperRパッケージ[64]のhypeR()関数を用い、有意性の超幾何学的検定を採用している。hyperRの「遺伝子セット」は、KEGGREST RパッケージのkeggGet()関数を用いてKEGGデータベースからエントリーを取得し、En. caudatum KOがどのパスウェイに属するかを決定することで生成した。遺伝子セットは、目的の代謝パスウェイのみを含むように手動でキュレーションされた（すなわち、「ハンチントン病」などのパスウェイは削除された）。hyperR()の "background "設定には、保守的に、En. caudatumゲノムの発現可能なユニークKOの総数（7592個）を使用しました。p値<0.05で有意に濃縮されたKOは、手動でフィルターにかけた。p値およびFDR調整後のp値の両方が補足表S7に掲載されており、FDR調整後のp値<0.05は太字で強調されています。
図1： ルーメン微生物叢における同定された原生動物タンパク質の量は、宿主動物および食餌条件によって異なる。
乳牛（n = 4）およびヤギ（n = 4）の対照食（CTL）およびコーン油と小麦デンプンを添加した食（COS）において、原虫、細菌、古細菌、または真菌の種に属する、特定された総タンパク質（a）および平均回復メタプロテオーム発現（bは、合計LFQ強度の割合として表示）のドットプロットです。原生動物および細菌集団の検出されたタンパク質量は、補足表S6に記載されています。
フルサイズ画像
独立した検証用データセットのための動物実験、サンプルハンドリング、メタゲノムデータ作成
サンプルは、Holstein Friesian雄牛を用いた以前に行われた摂食実験からも分析された[65]。簡単に説明すると、これらの雄牛は、Keoghら[65]に詳述されている代償成長モデルにおいて、自由摂取または制限された摂食体制のいずれかに従った。両給餌群とも、濃厚飼料と牧草サイレージの比率は同じで、それぞれ 70%と 30%であり、濃厚飼料は主にデンプンを多く含むロール大麦 (72.5%) と大豆 (22.5%) で構成されていた。ルーメンサンプルは屠殺時に採取し、本研究におけるメタゲノムおよびメタプロテオミクス解析の前に-80℃で保存した。
サンプル調製、細胞溶解、およびDNAの抽出は、McCabeら[66]の既述に従って実施された。fastqファイルの品質チェックと低品質リードの除去は、fastp（V.0.19.5）を用いて実施した。配列リードはminimap2（V.2.16）を用いてウシゲノム（ARS-UCD1.3）に対してマッピングし、ホスト配列を除去した。メタゲノムが複雑なため、Megahit (V1.2.6) で "-meta-large" オプションを設定してリードを共アセンブルした。メタゲノム解析のビニングは、MetaBAT2を用いて標準的なパラメータ（V.2.12.1）を用いて共集合に適用しました。その後、dRep（V.1.4.3）を用いてMAGの複製を解除し、得られたMAGをBin Annotation Tool（BAT）を用いて分類学的に割り当てました（https://github.com/dutilh/CAT）。このツールは、内部的に遺伝子予測にprodigal（V.2.6.3）、non-redundant（nr）タンパク質データベース（2020年2月現在）とのアライメントにDIAMOND（V.0.9.14）を使用しています。
メタプロテオミクスのサンプル調製は、100 mM Tris, pH8, 5% SDS, 10 mM DTT中、2種類のガラスビーズサイズ（≤106 µmと0.5 mm）を用いたビーズビートで細胞を溶解することで行いました。FastPrep 24装置を6.5m/sの速度で3×45秒間作動させた。サンプルを20.000×gで15分間遠心分離し、タンパク質抽出物をWessel-Flügge沈殿によって洗浄した[67]。ペレットを5％SDS、100mM Tris-Cl、pH8、10mM DTTに溶かし、さらに処理するまで-20℃に保存した。タンパク質消化は、懸濁トラッピング（STrap）[68]を用いて行い、SpeedVac（Eppendorf Concentrator Plus）で乾燥し、Nanodrop One装置を用いたペプチド濃度推定とその後のMS/MS-分析用に0.05 %トリフルオロ酢酸、2 %アセトニトリルで再溶解した。サンプルは、Ultimate3000 RSLCnano UHPLCとQExactiveハイブリッド四重極オービトラップ質量分析計（Thermo Fisher, Bremen, Germany）を用いて、前述のように分析しました[56]。MS生データをFragPipeで解析し、上述の同じワークフローでHolstein Friesian bulls sample-specific protein sequence database (2 533 362 protein entries)に対して検索しました。
結果および考察
原生動物集団はルーメン微生物叢の中で大きなプロテオームを持つ
原生動物種はそのサイズが大きいため、ルーメンの微生物バイオマスのかなりの割合を占めることがあります [9]。原生動物種の総数や多様性は、ルーメン内の細菌種よりも少ないものの、そのゲノムサイズやコード化された遺伝子の総数は、かなり大きいです。さらに、代替スプライシングと翻訳後修飾により、原虫集団のタンパク質表現（プロテオーム）は、原虫ゲノムの遺伝子数よりも大きくなります[69]。したがって、原生動物種のタンパク質量は、プロテオーム研究で同定・定量化できる細菌種のタンパク質量をはるかに上回ると予想されます。このような背景から、我々のメタプロテオミクスデータは、乳牛とヤギの両方において、ゲノムデータベースに表現された細菌種の組み合わせに比例して、原虫種やその他の近縁種に関連する検出可能なタンパク質の広範な割合を示した（図1a）。また、原虫に分類されるタンパク質の検出強度は、対照（CTL）飼料を与えた動物のルーメン微生物群の細菌分画の検出強度よりも比例して大きく（図1b）、サンプルにおける原虫の検出レベルが有意であることをさらに裏付ける結果となりました。Ep.cattaneiとEn.caudatumは、それぞれウシとヤギのルーメンメタプロテオームを支配しています（図2）。牛では、D. dentatum、En. bursa、Ep. caudatum（図2a、補足表S6）も高レベルで検出されたが、ヤギではEntodinium種En. caudatum、En. longinucleatum、En. bursaが高レベルで検出されたエントディノモルフの一つであった（図2c）。ヤギでは牛の3倍以上のEn. caudatum由来のタンパク質が検出されましたが、これはヤギのサンプルで牛に比べて7倍高いエントディノーム濃度（細胞/mL）が観察されたことから、ある程度予想されたことでした（表1）[5]。ホロトリックスの顕微鏡による細胞数と一致し、牛とヤギの両方でDasytricha属とIsotricha属（表1）のタンパク質が検出されました（図2a、c）。
図2：対照食（CTL）またはコーン油と小麦デンプンを添加したもの（COS）を与えた乳牛（n = 4）およびヤギ（n = 4）のルーメン微生物群における原虫ゲノム/SAGおよび細菌メタゲノム集合ゲノム（MAG）にマッピングされた検出タンパク質。
図は、CTLまたはCOS飼料を与えたウシ（a、b）およびヤギ（c、d）において、繊維/デンプン分解、解糖およびピルビン酸、酪酸、酢酸、コハク酸の生産に活性を持つ選択された発現タンパク質（短い酵素の説明とともにEnzyme Commission（EC）番号として提示）と代謝活性集団（ゲノム、SAGsまたはMAGsとして）です。a,cは牛とヤギでそれぞれ検出された原虫プロテオームで、タンパク質定量値のスケールが10倍程度大きいため、細菌（b,d）とは分けて表示しています。タンパク質定量値（y軸）は、MAG/SAG/ゲノムあたり検出されたタンパク質の数とそのLFQ強度の両方を考慮して算出した。各食餌条件（CTL：緑またはCOS：オレンジ）の生物学的複製物にわたって検出されたタンパク質ごとにLFQ強度を平均し、その後MAG/SAG/ゲノムあたりの検出タンパク質すべてについて合計を算出した。ヒートマップは、CTLまたはCOSのいずれかの飼料を与えたウシ（RUDB-C）およびヤギ（RUDB-G）から回収した、EC番号として示される代謝活性タンパク質を有する選択されたMAG/SAG/ゲノムを示す。与えられたMAG/SAG/ゲノムの平均タンパク質存在量が、COS飼料とCTL飼料との間で有意に異なる場合（対のウィルコクソン検定により決定、p値<0.05）、与えられたMAG/SAG/ゲノムには赤い星が付けられています。MAGは、MAG IDとGTDB-tkの分類学的アノテーションで表示されています。ヒートマップ作成に使用したゲノム注釈とLFQ強度は、補足表S6に記載されています。
フルサイズ画像
ルーメンの炭水化物代謝に重要な役割を果たすentodiniomorphsとholotrichs
ルーメン原虫は、植物繊維やデンプンなどの非構造性貯蔵多糖の分解者として長い間特徴づけられてきた [70, 71]。牛で検出率の高いEpidinium属のEp.cattaneiとEp.caudatumのプロテオームを詳しく調べたところ、多くのタンパク質が検出された。caudatumのプロテオームを詳しく調べると、セルロース（GH5、GH9）、キシラン（GH10、GH11、GH30、CE1）、マンナン（GH26）、繊維由来のオリゴ糖（GH2、GH3、GH94）といったリグノセルロース系多糖類を標的とする糖質活性酵素（CAZymes）の検出数が非常に多かった（図2a、補足表S6）。ヤギでも同様のCAZyファミリーが検出されたが、E. triloricatumやP. multivesiculatumなど、異なるエントディノモーフ種から検出された（図2c、補表S6）。このin vivo CAZymeの結果は、Epidinium、Polyplastron、Enoplastronのようなエントディノーム属はエンドグルカナーゼとキシラナーゼ活性が高いが、Entodinium属は弱い活性しかないことを示した長年にわたるin vitroデータと強く一致した [70]. 同様に、Dasytricha spp.などのホロトリックスは、グルコシダーゼとセロビオシダーゼ活性を持つが、繊維分解活性はごくわずかであることが以前in vitroで示されており[72]、今回のin vivoデータもこれを支持した（図2a、c）。デンプンを代謝する原虫の構成（分解と合成の両方）も2つの動物宿主間で異なり、ヤギではEntodinium spp.とD. ruminantiumが優勢であるのに対し、ウシの原虫によるデンプン代謝はEpidinium spp.、D. ruminantium、Isotricha spp.だった（図2、補足表 S6）。リグノセルロースを標的とする細菌性CAZymesも検出されたが（例えば、牛のRuminococcaceae集団からのGH48セルラーゼ）、リグノセルロースとデンプンを標的とするCAZymesは、原虫種でより高い頻度とタンパク質定量レベルで検出され、それらがラムナ繊維消化の中心的役割を担っていることを示唆していた。
En. caudatumの代謝は捕食活動とVFAsの代謝を示す
En. caudatumは捕食活動で有名であり、ルーメン内で最も豊富な原生動物として認識されており、毎分0.1％のルーメン原核生物がルーメン原生動物集団によって消化されていると推定されている[73]。我々のデータではEn. caudatumが優勢であったため、この普遍的な種の代謝の影響をよりよく理解する機会を得た。これまでの研究では、単培養で増殖したEn. caudatumのゲノムとトランスクリプトームを調査してきましたが [14, 74]、今回のメタプロテオーム解析では、ルーメン微生物群におけるEn. caudatumの生体内代謝と機能を明らかにしようと考えました。Wangら[74]と同様に、メタプロテオミクス解析では、炭素代謝、解糖・糖新生、デンプン・ショ糖（およびグリコーゲン）代謝、ピルビン酸代謝、酸化的リン酸化、アルコール生成などの代謝経路に起因する発現タンパク質が明らかになりました（補足表S6）。Wangらは、En. caudatumがデンプンなどの炭水化物を主基質とし、セルロースやヘミセルロースもある程度利用することを明らかにし[74]、その転写物解析からEn. caudatumはアミラーゼの発現量が高く、ヘミセルラーゼ、セルラーゼ、ペクチナーゼの発現量は低いことを示した。同様に、我々のメタプロテオミクス解析では、En. caudatumがアミラーゼを発現しており、En. caudatumがデンプン顆粒を飲み込み、より単純な糖に分解し、最も重要な貯蔵糖質であるグリコーゲンを生産することができると予測された [75]。しかし、ヘミセルロースやペクチンに関連するEn. caudatumのCAZymは、どのメタプロテオームからも検出されなかったことから、分析のためにサンプルを採取した時点（摂食前）では、これらの糖質の分解に関与していないことが示唆された。発酵可能な基質が増加した結果、ルーミナルの発酵活性、VFAsおよびメタンの生産は、給餌後に最も高くなることに留意すべきである [76]。サンプリング時間は、回収された微生物組成とその機能に影響を与える可能性があるが、サンプリング時間が一定であることから、本試験における代謝パラメータや種の存在量の違いは、両食品間で同等であると考えられる。
En. caudatumの単培養培養は、生産可能なVFAを確認するために確立されていないが、Wangらは、酢酸と酪酸の発酵形成に関与する酵素の転写物を見つけた[74]。同様に、En. caudatumの酢酸、酪酸、アルコールの代謝に関与すると推測されるタンパク質も検出された。CTL飼料を与えたヤギは、En. caudatumのタンパク質の割合が有意に高く、同時に酢酸と酪酸の相対レベルが上昇し、トウモロコシ油と小麦デンプン飼料（COS）を与えた動物に比べ、En. caudatumタンパク質が少なく、酢酸／酪酸レベルが低かった（図2および表1）。En.caudatumの集団は、CTL飼料を与えたヤギに最も多く存在すると思われたため、これらのメタプロテオームを用いて代謝の特徴を再構築しました（図3）。CTL飼料を与えたヤギで同定された538個のEn. caudatumタンパク質のうち、244個に固有のKO番号が付与されており、そこからKEGG Mapper [52] による再構築で217個のタンパク質を代謝経路に機能割り当てました。代謝経路の再構築により、エンドサイトーシス、ファゴソーム、リソソームのプロセスで、捕食活動、細菌の飲み込み、消化に関わるタンパク質が発現していることがわかりました（図3、補足表S6）。本研究で使用したルーメンサンプルについて、Martinらは以前、牛と比較してヤギで高いNH3濃度を観測し、捕食活動で知られるentodiniomorphsの密度が高いため、細菌のタンパク質分解と飼料タンパク質分解性が増加したためではないかという仮説を立てています [5]. これらを裏付けるように、ヤギで検出されたEn. caudatum（図3、補足表S7）タンパク質のメタプロテオミクスパスウェイ濃縮解析を行ったところ、エンドサイトーシス代謝が有意に濃縮されていることがわかりました。また、En. caudatumでは、解糖、デンプンやスクロースの代謝など、他の生物学的プロセスも有意に濃縮されたパスウェイだった（Supplementary Table S7）。メタン生成古細菌との代謝的相互作用が疑われるが、Entodiniumのようないくつかの原生動物集団は、グラム陰性ガンマプロテオバクテリアの特定のメンバーとの関連があると仮定されており、複数の研究が、原生動物のエンゲージメントに耐性があると推測している[77,78,79]。一方、GutierrezとDavisは、Entodinium-speciesがグラム陽性デンプン分解菌を呑み込むことを以前に証明した[79]。今回のデータから、CTL飼料を与えた動物はEn. caudatumのような捕食に最適な条件を与えたが、COS飼料中のデンプン量が増加したことにより、原虫が飲み込まれにくいグラム陰性種の増加やpHレベルの低下が起こり、Entodiniumにとって最適でない条件とそのレベルの低下が起こったと推測される（図2）。
図3：メタプロテオミクス解析に基づく、対照食（CTL）を与えたヤギのルーメン微生物群内でのEntodinium caudatumのファゴリソソーム形成と澱粉代謝の再構築例。
同定されたタンパク質のKO識別子をKEGGマッパーで解析し、En. caudatumの代謝における発現した主要機能を再構築した。破線の矢印は、メタプロテオームで検出されなかったが、それぞれのパスウェイで重要なステップであるタンパク質またはパスウェイを示す。KO識別子をそれぞれの遺伝子ID、LFQ、動物/食事に関連付ける詳細情報は、補足表S6に記載されています。
フルサイズ画像
原生動物は、デンプン代謝の評判にかかわらず、デンプンを補充した飼料では活性が低下していた
Martinら[5]が以前に測定した、高でんぷんCOS飼料を与えた動物におけるVFAおよびメタンレベルの変化は、宿主種に関係なくルーメン微生物群の組成およびしたがって機能に大きな変化があることを示唆した。特に、COS飼料を与えた動物では、CTL飼料と比較して、酢酸と酪酸の割合の減少、酢酸：プロピオン酸比の減少、プロピオン酸相対値の増加が観察されました（表1）。デンプン含有量が多い、あるいは飼料：濃厚飼料比が低い飼料は、ルーメンで発酵しやすく通過率が高いため、プロピオン酸およびコハク酸の生産量が高くなることが以前に示されている [80, 81] 。そこで、COSまたはCTL飼料を与えたウシ（図2a、b）とヤギ（図2c、d）のゲノム中心のメタプロテオミクスデータを活用し、個々の集団のタンパク質発現の概要を把握しました。特に、デンプン（CTL：トウモロコシデンプン、COS：トウモロコシ＋小麦デンプン）の分解に関わる経路に注目し、解糖によるピルビン酸、最終的に酢酸、酪酸、プロピオン酸の生成（コハク酸経由）を確認しました。宿主に関係なく、またデンプン代謝の評判が高いにもかかわらず [74, 75] 、Entodinium、Epidinium、Isotricha、Dasytricha属は、CTL飼料を与えた動物に比べて、COS飼料を与えた動物の方がデンプンの分解に関わるタンパク質量が少なく、存在量が少なかった（図2A、C）。さらに、解糖に関与し、ピルビン酸、酢酸、酪酸を生成するEntodinium属およびEpidinium属と同定されたタンパク質については、COS飼料を与えた牛とヤギの両方で、COS飼料と比較して高いレベルで検出され、反対のパターンが観察されました。
いくつかの推定原生アミラーゼはすべての動物および飼料で検出されたが、それらの定量レベル（すなわち、タンパク質存在量）は、より高いレベルのデンプンが利用可能である場合に予想されるように増加しなかった（図2a、c）。したがって、デンプンの増加に対応して観察されたVFAプロファイルのシフトは、ルーメン微生物群の細菌分画によってさらに影響を受けると仮定した。COS飼料を与えた動物では原虫のレベルが低かったのとは対照的に、宿主に関係なく細菌プロテオームの検出量が増加し（図4）、デンプン分解菌、コハク酸およびプロピオン酸産生菌が疑われました（図2b、d）。例えば、サクシニブリオナ科、プレボテラ属、さらにヤギではアミノバクテリア科に属する集団ゲノムからのデンプン発酵経路は、CTL飼料を与えた動物と比較して、COS飼料を与えた動物で高いプロテオームレベルで検出されました（図2b, d）。
図4：ルーメン微生物叢における原虫タンパク質の検出は、宿主に関係なく、食餌に影響される。
対照食またはCOS食を与えた乳牛（a）およびヤギ（b）の異なるルーメン微生物群のタンパク質を示すボルケーノプロットで、LFQ強度の大きな倍率変化（x軸）および高い統計的有意性（-対t検定による公称p値の10倍、y軸）の両方を示している。破線の横線は、p値＜0.05を示す。いずれの動物宿主においても、高でんぷん食を与えた動物では、細菌集団（緑青）のタンパク質検出量が増加し、対照食を与えた動物ではより高いLFQ強度で検出された原虫集団（紫）と比較されることが観察された。
フルサイズ画像
メタン生成量が少ない動物では、原虫の活性が低い
本研究でサンプリングした動物について、Martinらは、COS飼料を与えた牛とヤギの両方において、対照と比較してメタン排出量が〜25〜30%減少することを実証しました（表1）[5]。脱糞した動物と畜産した動物の間の以前の比較では、原虫を含まない反芻動物におけるメタン生成の減少が示されており、メタン生成古細菌と原虫種の間の共生的相互作用を示唆している [77]. また、メタン生成菌の原生動物とのエピおよびエンド共生関係は、ルーメンメタン生成の9-37%に寄与することが示唆されている [77, 82,83,84]. さらに、原生動物種が存在するマイクロコズムと存在しないマイクロコズムを研究したSolomonらは、メタン排出量の増加に加えて、原生動物が存在するマイクロコズムでは酢酸と酪酸のレベルが高いことを報告しており［77］、これは本研究のCTL飼料を与えた動物に関する主な知見を支持している（表1）。メタプロテオミクスデータで検出された原生動物種のいくつかは、ヒドロゲノソームを持つことが知られており、詳しく調べたところ、Dasytricha、Isotricha、Diplodinium、Epidinium、Entodinium、Enoplastronなどのホロトリッチ属とエントディノーム属の両方から、CTLを与えられた動物はCOS与えられた動物に比べて高い定量レベルで検出されていた（図2a、c、補足表s6）。また、プロテオミクスデータから、ヒドロゲノソームを持たないEn. caudatumがルーミナルの水素生成に寄与していることを示す部分的な証拠が確認され、その存在量が高いメタンレベルと関連しているという過去の報告 [77, 84, 85] を支持した。ヤギでは、8つの[FeFe]-ヒドロゲナーゼのうち1つだけが検出されたが（ウシにはない）、メタン収量の高い動物（CTL）でも低い動物（COS）でもタンパク質量に変化は見られなかった。このことから、本研究で予測されるメタン濃度の上昇につながる原生動物-メタノジェンヌの関係は、水素移動が中心であると推測される。
反芻動物の飼料に脂質を添加することは、メタン緩和戦略として大きく研究されている [86, 87]。しかし、脂質はルーメンで発酵せず、むしろ修飾／水素化されるため、ルーメンでの水素生成やメタン生成には寄与しないと広く信じられている。コーン油などの不飽和脂肪酸のバイオ水素化は水素シンクとして機能するが、バイオ水素化に使用される代謝水素は非常に少量（1～2%）であることが観察されている [86, 87]. また、脂質の CH4 緩和効果は、投与量と脂肪酸組成の両方に依存することが、いくつかの研究によって示されている [82, 88]。例えば、ラウリン酸などの中鎖脂肪酸（MCFA）は、リノール酸を主成分とするコーン油などの長鎖多価不飽和脂肪酸（PUFA）よりも原生動物に対する抑制効果が高いことが証明されている［82、87、88、89］。Zhangら[88]が行った研究では、コーンオイルをサプリメントとして与えたヤギは、ルーミナルの水素濃度と総メタン排出量が減少した。それにもかかわらず、ルーメン原虫の集団には一見何の影響もなかったことから、Zhangの研究で使用されたコーンオイルの用量は、抗原虫剤として作用しなかったと考えられる[88]。さらに、飼料中の高レベルのPUFAは、様々な細菌および古細菌種［82、87、88］、特に様々なレベルのVFAおよび水素を生成する基幹繊維分解グラム陽性細菌種［90、91］の代謝にも影響を与えると考えられる。これらの先行研究結果を総合すると、COS飼料を与えた本研究のウシおよびヤギにおけるCH4産生の減少と一致し、さらに、プロピオン酸の増加、酪酸および酢酸レベルの減少など、他の細菌代謝およびルミナル発酵パラメータにも影響を与えることが観察された（表1）[5]。したがって、脂質を高濃度に添加した飼料が原虫の生息数に直接影響している可能性を明確に否定することはできないが、コーンオイルがルーメン内の他の繊維分解種や水素生成種に影響を与え、その結果、ルーメン発酵とメタン排出に影響を与えている可能性もあると考える［87、92］。しかしながら、我々の知見を検証するためには、異なる条件下や長期間のサンプリングでこれらの結果を検証することが必要である。
反芻動物の飼料に含まれるデンプンが増加すると、デンプン分解菌のプロピオン酸経路とコハク酸経路が刺激されることが知られており、代謝水素［H］の純化により、水素栄養メタン生成の他にルーメン発酵における［H］シンクとなる [82, 93]. デンプンが豊富な飼料はルーメンでの発酵性が高く、メタン生成古細菌と繊維分解細菌種を抑制できるレベルまでルーメン pH を低下させることができる [94, 95]。しかし、ルーメン内の pH レベルが低下すると、臨床的（またはほとんどの生産シナリオでは亜臨床的）なルーミンアシドーシスに至ることもある [96, 97]。したがって、メタンを犠牲にしてプロピオン酸の生産を増加させる高濃度飼料は、必ずしも長期的に実行可能なメタン緩和戦略として選択されるとは限らない。このことは、水素を産生する原生動物やバクテリアのレベルが低いこと、また、コハク酸やプロピオン酸の代謝を行うため外来水素を産生しないバクテリア集団の代謝が原因であることが予想される。この予測は、COSを与えたヤギのルーメンで優勢だった推定フマル酸還元性Aminobacteriaceae集団に、水素分子を利用すると考えられるいくつかの推定ヒドロゲナーゼが検出されたことによって部分的に支持された。特に、RUDB_G023（ORF_4456741_13）とRUDB_G016（ORF_1143158_19）からは、NADP還元型ヒドロゲナーゼサブユニット（EC：1.12.1.3）として注釈された2つの［FeFe］-ヒドロゲナーゼがCOS飼料動物で検出されています（図2d、補足表S6）。
原虫の優位性は地理的に独立したデータセットで検証された
ルーメン生態系において原虫種が中心的な役割を果たしているという我々の仮説をさらに検証するために、我々は、アイルランドで60頭のホルスタイン・フリージアンの雄牛に対して行われた独立した摂食実験から得られた、メタゲノム中心のメタプロテオームデータセットをさらに調査した [65]. 簡単に説明すると、これらの雄牛は、Keogh ら [65]に詳述されている代償成長モデルにおいて、濃厚飼料と牧草サイレージの同じ比率を、自由摂取または制限された摂食体制で摂取させた。我々は、記述されたホルスタイン乳牛とアルパインヤギの場合と同じ戦略を適用し、15匹のサブセット（制限食7匹と自由食8匹）のメタプロテオミクスデータセットを、781個の再構成されたサンプル特異的MAG（RUDB-HF）に対して解決し、En. caudatumのゲノム、18個の原虫SAG［15］、ならびに利用できる嫌気性菌のゲノムで補完した。この微生物原核生物および真核生物ゲノムのコレクションは、生成されたタンパク質スペクトルの配列データベースとして使用されました。乳牛における以前の観察と同様に、検出されたタンパク質のかなりの割合がEpidinium (Ep. cattanei and Ep. caudatum), Entodinium (En. caudatum and En. bursa) and Isotricha属に属しており、原虫がルーメン微生物群に重要かつ代謝的に活性な寄与をしているということをさらに裏付けるものでした（図5、補表S8）。タンパク質の定量化（各 MAG/ ゲノムに属する LFQ 強度の合計、各食餌の平均値として測定）は、制限食の雄牛のルーメンサンプルでも高く、これは自由食のグループと比較して利用できるデンプンが少なく、保持時間が長かったと考えられる（図 5a、補足表 S8）。これら2つの食餌群のルーメン微生物群の系統的な違いについて以前に発表された16S rRNAアンプリコンの調査では、デンプンが豊富なアドリビタブル食でSuccinivibrionaceaeが増加していることが強調されています [66]。私たちのメタプロテオミクス解析では、いくつかのSuccinivibrionaceae-MAGが、アドリビタムのグループ下で有意に高い（不対t検定、p値<0.05）プロテオーム検出を確認し（補足表S8）、ルーメンの酢酸：プロピオン酸比が低下し、これはしばしば飼料効率の向上とメタン生成の減少に関連しています［66］。これらの観察結果は、COS飼料を与えた乳牛とヤギにおけるSuccinivibrionaceae-MAGの優勢をほぼ反映しており、EntodiniumとEpidinium属は、宿主動物の飼料中の利用可能なデンプンの増加に代謝的に反応せず、主要デンプンの分解者以外の役割を持つという仮説をさらに強化している。
図5：ホルスタイン・フリージアン肉牛のルーメン微生物集団のプロテオームは、高デンプン食の影響を受けている。
合計60頭の肉牛を、2つの食餌対照条件に供した： 30頭は自由摂食、30頭は125日間の摂食制限を行った。両試験区の飼料構成は濃厚飼料70％、牧草サイレージ30％で、濃厚飼料はロール大麦72.5％、大豆22.5％、糖蜜3％、子牛ミネラル2％である。圧延大麦はエネルギーが高く、デンプン含有量も50%程度と高い。15頭の動物（制限食7頭、自由食8頭）のメタプロテオームを、19の原生動物SAG/ゲノム（a）および真菌の代表を含む781のMAGと分離ゲノム（b）を組み合わせたデータベースと比較分析した。原生動物プロテオームは、タンパク質定量値のスケールが〜10倍大きかったため、別掲しています。タンパク質定量値は、MAG/SAG/ゲノムあたり検出されたタンパク質の数とその存在量の両方を考慮して計算されました。各食事条件（ad libitum：緑、restricted：オレンジ）の生物学的複製で、検出されたタンパク質ごとにLFQ強度を平均し、それをMAG/SAG/ゲノムあたり検出されたタンパク質すべてについて合計しました。ホルスタイン種未経産牛とアルパイン種ヤギで得られた結果と同様に（図2）、原生動物種のプロテオームはルーメンメタプロテオーム全体の大部分を占めていましたが、デンプン含量が高い食事条件では大幅に減少していたことがわかります。乳牛での結果をさらに裏付けるように、高デンプン条件下では、サクシニブリオナ科に属する細菌集団のタンパク質検出量が増加することが確認された。 c LFQ強度の倍率変化の大きさ（x軸）と統計的有意性（-log10、非対t検定による公称p値、y軸）の両方を示した異なるルーメン微生物群のタンパク質がボルカノプロットに示されています。破線の水平線は、p値<0.05のカットオフを示す。ボルケーノプロットでは、制限条件下の動物でより高いLFQ強度で検出された原虫集団（紫）と比較して、自由摂取の動物で細菌集団（緑青）のタンパク質検出量が増加することが示された。(a,b)の作成に使用したLFQ強度は、補足表S8で確認できます。
フルサイズ画像
本研究で使用した地理的に異なる2つのデータセット間で、食事によるマイクロバイオームのシフトの類似パターンが一貫しているかどうかを評価するために、一般的に観察される分類学的ファミリーのタンパク質存在量レベルの比率を比較しました。スピアマンの順位相関係数は比較のために計算され、ここでは2つのテストが行われました：肉牛（RUDB_HF）と乳牛（RUDB_C）のルーメン、肉牛（RUDB_HF）とアルパインヤギ（RUDB_G）それぞれの共通分類群間の相関（両条件にわたってタンパク質が検出された＜2 MAGを持つ稀な観察群については除外しました）。肉牛と乳牛のルーメン微生物群の間で、合計16の分類群からのタンパク質存在レベルの変化が共通して見つかり（有意な相関：p値<0.05、相関係数rho 0.68）、高スターチと低スターチの食餌を与えた牛の独立データセット間で、同様の構造的ルーメン微生物群のシフトが生じているという我々の仮説をさらに強化しました（図S1、補表 S9）。しかし、ヤギ（RUDB_G）と肉牛（RUDB_HF）のルーメン微生物群の間には、分類群間でタンパク質存在量レベルに同様の傾向が観察されたにもかかわらず、当然のことながら、有意な相関関係は見られませんでした（p値>0.05、相関係数rho 0.19 、補足表S9、補足図S1）。
結論として、我々は（メタ）ゲノム中心のメタプロテオミクスアプローチを用いることで、主に、様々な食餌条件にさらされた肉牛と乳牛、および乳山羊のルーメン微生物群におけるルーメン原虫の役割を調べた。その結果、Entodinium、Epidinium、Dasytricha、Isotrichaなどの中核的なエントディノーム属とホロトリック属のプロテオームが、回収したルーメン微生物プロテオームのかなりの部分を占めていることがわかりました。これは、反芻動物の多くの種において、16S/18S rRNA遺伝子ベースのルーメンセンサスが、世界的に優位であると強調してきた過去のデータを裏付けるものでした。いずれの動物宿主においても、リグノセルロースを標的とする原虫のCAZymは、COS添加飼料に比べ、CTL飼料を与えた動物でより頻繁に、より高い定量レベルで検出されましたが、これはおそらく後者の方が細胞密度が低いためと思われます（表1）。En. caudatum、Epidinium、Isotricha、Dasytricha属と同定されたタンパク質は、デンプン代謝能力が高いという評判があるにもかかわらず、小麦デンプンを多く与えた動物では意外にも低いレベルで検出された（図2-5）。我々は、COSを与えた動物では、原虫がグラム陰性細菌種（例えば、牛のSuccinivibrionaceaeおよび/またはヤギのAminobacteriaceae）と競合しており、原虫が飲み込まれにくい[77, 78, 79]、またはpHレベルが低く、デンプン分解原虫集団にとって最適でない条件を作っている可能性があると仮定している。また、本研究のサンプリング時（給餌前）にCH4収量が25-30%程度低かったCOS給与動物において、原虫の[FeFe]-ヒドロゲナーゼの検出率が低いことが確認され、コハク酸およびプロピオン酸生成集団を繁栄させる特定の条件が、その後ルーメン微生物群の水素およびメタン代謝に影響を及ぼすことをさらに示唆した。コーン油を追加摂取した動物では、脂質を添加した飼料が原生動物数の減少に影響を与える可能性があることが認められていますが、本研究では直接的な影響を示す証拠は得られていません。上記の仮説を確認するためにはまだ多くの研究が必要ですが、我々の統合メタプロテオミクスアプローチは、ルーメン微生物群およびそれがGHG緩和戦略や宿主生産性形質に与える影響を正確かつ有意義に分析するために、真核生物集団を含めることの重要性を将来的に実証しています。
データの利用可能性
ショットガンメタゲノミクスの生データは、BioProjectのアクセッション番号PRJNA844951にリンクしたアクセッション番号SRR19524239～SRR19524270でNational Center for Biotechnology Sequence Read Archive（NCBI-SRA）に寄託されています。注釈付き原核生物MAGはすべて、https://doi.org/10.6084/m9.figshare.20079461 および https://doi.org/10.6084/m9.figshare.20066972 で一般公開されています。質量分析プロテオミクスデータは、PXD040467、PXD040454およびPXD040349のデータセット識別子で、PRIDE [98] パートナーリポジトリを介してProteomeXchange Consortiumに寄託されています。本研究で使用した原生生物SAGのNCBIアクセッション番号は以下の通りです： Dasytricha ruminantium SAG3 (JAJJKK000000000), Diplodinium dentatum SAGT1 (JAJJLX000000000), Diplodinium flabellum SAG1 (JAJJLB000000000), Enoploplastron triloricatum SAGT1 (JAJNAB000000000), Entodinium bursa SAG3 (JAJJKR000000000)、 Epidinium cattanei SAG3 (JAJJKG000000000), Epidinium caudatum SAG1 (JAJMZR000000000), Eremoplastron rostratum SAG2 (JAJMZO000000000), Isotricha intestinalis SAGT2 (JAJJLT000000000), Isotricha prostoma SAG3 (JAJMZS000000000), Isotricha sp. YL-2021a SAG1 (JAJJLH000000000), Isotricha sp. YL-2021b SAG3 (JAJJKW000000000), Metadinium minomm SAG1 (JAJMZT000000000), Ophryoscolex caudatus SAGT3 (JAJJLZ000000000)、 Ostracodinium dentatum SAG1 (JAJJKF000000000), Ostracodinium gracile SAG1 (JAJJKZ000000000), Polyplastron multivesiculatum SAGT3 (JAJJLS000000000).
参考文献
Bergman EN. 様々な生物種における消化管からの揮発性脂肪酸のエネルギー貢献度。Physiol Rev. 1990;70:567-90.
論文CAS PubMed Google Scholar
Wallace RJ, Rooke JA, McKain N, Duthie CA, Hyslop JJ, Ross DW, et al. 牛の高メタン生産に関連するルーメン微生物のメタゲノム。BMC Genom. 2015;16:839.
記事 Google Scholar
Jami E, White BA, Mizrahi I. Potential role of the bovine rumen microbiome in modulating milk composition and feed efficiency. PLoS ONE. 2014;9:e85423.
記事 PubMed PubMed Central Google Scholar
McCann JC, Luan S, Cardoso FC, Derakhshani H, Khafipour E, Loor JJ. 亜急性ラムナルアシドーシスの誘発は、ラムナルマイクロバイオームと上皮に影響する。Front Microbiol. 2016;7:701.
記事 PubMed PubMed Central Google Scholar
Martin C, Coppa M, Fougère H, Bougouin A, Baumont R, Eugène M, et al. Corn oil and wheat starch, marine algae, or hydrogenated palm oilを添加した飼料は、乳用ヤギと牛のメタン排出を同様に調節するが、摂食行動は調節しない。Anim Feed Sci Technol. 2021;272:114783.
記事CAS Google Scholar
Seshadri R, Leahy SC, Attwood GT, Teh KH, Lambie SC, Cookson AL, et al. Cultivation and sequencing of rumen microbiome member from the Hungate1000 Collection. Nat Biotechnol. 2018;36:359-67.
記事CAS PubMed PubMed Central Google Scholar
Stewart RD, Auffret MD, Warr A, Walker AW, Roehe R, Watson M. Compendium of 4,941 rumen metagenome-assembled genomes for rumen microbiome biology and enzyme discover. Nat Biotechnol. 2019;37:953-61.
記事CAS PubMed PubMed Central Google Scholar
Xie F, Jin W, Si H, Yuan Y, Tao Y, Liu J, et al. 反芻動物の消化管マイクロバイオームからの統合遺伝子カタログと1万を超えるメタゲノム集合ゲノム. Microbiome. 2021;9:137.
記事CAS PubMed PubMed Central Google Scholar
ウィリアムズAG、コールマンGS．ルーメン微生物生態系．2nd ed. Dordrecht: Springer; 1997.
Google Scholar
Lin C, Raskin L, Stahl DA. 家畜の胃腸管における微生物群集構造：rRNA標的オリゴヌクレオチドプローブを用いた比較解析。FEMS Microbiol Ecol. 1997;22:281-94.
記事CAS Google Scholar
Hagen LH, Brooke CG, Shaw CA, Norbeck AD, Piao H, Arntzen MO, et al. Recalcitrant plant fiberのルーミナル分解における嫌気性真菌のプロテオーム特殊化。isme j. 2021;15:421-34.
論文CAS PubMed Google Scholar
Saye LMG, Navaratna TA, Chong JPJ, O'Malley MA, Theodorou MK, Reilly M. The anaerobic fungi: challenges and opportunities for industrial lignocellulosic biofuel production. Microorganisms. 2021;9:694.
記事CAS PubMed PubMed Central Google Scholar
Stabel M, Hanafy RA, Schweitzer T, Greif M, Aliyu H, Flad V, et al. Aestipascuomyces dupliciliberans gen. nov, sp. nov., the first cultured representative of the uncultured SK4 clade from aoudad sheep and alpaca. Microorganisms. 2020;8:1734.
記事CAS PubMed PubMed Central Google Scholar
Park T, Wijeratne S, Meulia T, Firkins JL, Yu Z. The macronuclear genome of anaerobic ciliate Entodinium caudatum reveals its biological features adapted to the distinct rumen environment. Genomics. 2021;113:1416-27.
記事CAS PubMed Google Scholar
ルーメン繊毛虫の系統とバイオマス分解酵素に関するゲノムの知見。ISME J. 2022;16:2775-87.
論文CAS PubMed Google Scholar
Henderson G, Cox F, Ganesh S, Jonker A, Young W, Global Rumen Census C, et al. ルーメンの微生物群集組成は食事や宿主によって異なるが、コアマイクロバイオームは広い地理的範囲に存在することがわかった。Sci Rep. 2015;5:14567.
記事CAS PubMed PubMed Central Google Scholar
Ranilla MJ, Jouany JP, Morgavi DP. 単一原生動物種を含むルーメン微生物群集によるメタン生成と基質分解 in vitro. Lett Appl Microbiol. 2007;45:675-80.
論文CAS PubMed Google Scholar
Yarlett N, Coleman GS, Williams AG, Lloyd D. 既知種のルーメン腸管原虫におけるヒドロゲノソーム。FEMS Microbiol Lett. 1984;21:15-9.
記事CAS Google Scholar
ルーメン繊毛虫Entodinium caudatumの抗生物質による阻害について（Park T, Meulia T, Firkins JL, Yu Z. Front Microbiol. 2017;8:1189.
記事 PubMed PubMed Central Google Scholar
Belanche A, de la Fuente G, Newbold CJ. 異なるルーメン原生動物集団に関連するメタン生成生物群集の研究。FEMS Microbiol Ecol. 2014;90:663-77.
記事CAS PubMed Google Scholar
Hillman D, Lloyd K, Yarlett N, Williams AG. ルーメンホロトリッチ原生動物による水素生産：酸素の影響とin situ条件による代謝制御の意味。J Protozool. 1989;36:205-13.
記事 PubMed Google Scholar
Fougere H, Bernard L. でんぷん、コーン油、海藻、水素添加パーム油を添加した飼料が、ウシとヤギの乳腺脂質生成遺伝子発現に及ぼす影響： 比較研究。J Dairy Sci. 2019;102:768-79.
記事CAS PubMed Google Scholar
Fougere H, Delavaud C, Bernard L. 澱粉とコーン油、海藻、または水素添加パーム油を補充した飼料は、牛とヤギの乳脂肪分泌と組成に異なる変調を与える： 比較研究。J Dairy Sci. 2018;101:8429-45.
記事CAS PubMed Google Scholar
Solomon KV, Haitjema CH, Henske JK, Gilmore SP, Borges-Rivera D, Lipzen A, et al. Early-branching gut fungi possess a large, comprehensive array of biomass-degrading enzymes. Science. 2016;351:1192-5.
記事CAS PubMed PubMed Central Google Scholar
Haitjema CH, Gilmore SP, Henske JK, Solomon KV, de Groot R, Kuo A, et al. 比較ゲノミクスで明らかになった真菌セルロソームのパーツリスト(A parts list for fungal cellulosome revealed by comparative genomics. Nat Microbiol. 2017;2:17087.
記事CAS PubMed Google Scholar
Youssef NH, Couger MB, Struchtemeyer CG, Liggenstoffer AS, Prade RA, Najar FZ, et al. 嫌気性真菌Orpinomyces sp. strain C1Aのゲノムは、注目すべき植物バイオマス分解菌の独自の進化史を明らかにしている。Appl Environ Microbiol. 2013;79:4620-34.
論文CAS PubMed PubMed Central Google Scholar
Hooker CA, Hillman ET, Overton JC, Ortiz-Velez A, Schacht M, Hunnicutt A, et al. 未処理リグノセルロース原料の加水分解は、新たに嫌気性真菌に分類されたPiromyces sp. UH3-1のSリグニン組成に依存しない。Biotechnol Biofuels. 2018;11:293.
記事CAS PubMed PubMed Central Google Scholar
Brown JL, Swift CL, Mondo SJ, Seppala S, Salamov A, Singan V, et al. 嫌気性菌Caecomyces churrovisとMethanobacterium bryantiiの共培養は、特定の基質における糖質結合モジュール、ドッケリン、ピルビン酸ギ酸リアーゼの転写を高める。Biotechnol Biofuels. 2021;14:234.
記事CAS PubMed PubMed Central Google Scholar
Wilken SE, Monk JM, Leggieri PA, Lawson CE, Lankiewicz TS, Seppälä S, et al. 嫌気性Neocallimastigomycota菌のゲノムスケール代謝モデルの実験的に検証された再構成と分析. mSystems. 2021;6:e00002-21.
記事CAS PubMed PubMed Central Google Scholar
Yu Z, Morrison M. Improved extraction of PCR-quality community DNA from digesta and fecal samples. Biotechniques. 2004;36:808-12.
記事CAS PubMed Google Scholar
羊のリファウンテーションによるメタン排出量とルーメン発酵パラメーターの変化。Aust J Exp Agric. 2008;48:69-72.
論文CAS Google Scholar
Bolger、Lohse、Usadel、B. Trimmomatic: a flexible trimmer for Illumina sequence data. Bioinformatics. 2014;30:2114-20.
記事CAS PubMed PubMed Central Google Scholar
Li D, Liu CM, Luo R, Sadakane K, Lam TW. MEGAHIT: an ultra-fast single-node solution for large and complex metagenomics assembly via succinct de Bruijn graph. Bioinformatics. 2015;31:1674-6.
記事CAS PubMed Google Scholar
ラングミードB、サルツバーグSL. Bowtie 2による高速ギャップドリードアライメント。Nat Methods. 2012;9:357-9.
論文CAS PubMed PubMed Central Google Scholar
李赫、Handsaker B、Wysoker A、Fennell T、Ruan J、Homer N、他、The sequence alignment/map format and SAMtools. Bioinformatics. 2009;25:2078-9.
記事 PubMed PubMed Central Google Scholar
Wu YW, Simmons BA, Singer SW. MaxBin2.0：複数のメタゲノムデータセットからゲノムを復元するための自動ビニングアルゴリズム。Bioinformatics. 2016;32:605-7.
記事CAS PubMed Google Scholar
Kang DD, Li F, Kirton E, Thomas A, Egan R, An H, et al. MetaBAT 2: an adaptive binning algorithm for robust and efficient genome reconstruction from metagenome assemblies. PeerJ. 2019;7:e7359.
記事 PubMed PubMed Central Google Scholar
Alneberg J, Bjarnason BS, de Bruijn I, Schirmer M, Quick J, Ijaz UZ, et al. Binning metagenomic contigs by coverage and composition. Nat Methods. 2014;11:1144-6.
記事CAS PubMed Google Scholar
Sieber CMK, Probst AJ, Sharrar A, Thomas BC, Hess M, Tringe SG, et al. 脱複製、集約、スコアリング戦略によるメタゲノムからのゲノムのリカバリー。Nat Microbiol. 2018;3:836-43.
記事CAS PubMed PubMed Central Google Scholar
Johnson M、Zaretskaya I、Raytselis Y、Merezhuk Y、McGinnis S、Madden TL. NCBI BLAST: より良いウェブインターフェイス。NucleicAcidsRes.2008;36:W5-9。
論文CAS PubMed PubMed Central Google Scholar
Parks DH, Imelfort M, Skennerton CT, Hugenholtz P, Tyson GW. CheckM: 分離株、単細胞、メタゲノムから回収された微生物ゲノムの品質を評価する。Genome Res. 2015;25:1043-55.
記事CAS PubMed PubMed Central Google Scholar
Parks DH, Chuvochina M, Waite DW, Rinke C, Skarshewski A, Chaumeil PA, et al. A standardized bacterial taxonomy based on genome phylogeny substantially revises the tree of life. Nat Biotechnol. 2018;36:996-1004.
記事CAS PubMed Google Scholar
Parks DH, Chuvochina M, Chaumeil P-A, Rinke C, Mussig AJ, Hugenholtz P. A complete domain-to-species taxonomy for Bacteria and Archaea. Nat Biotechnol. 2020;38:1079-86.
論文CAS PubMed Google Scholar
Bowers RM, Kyrpides NC, Stepanauskas R, Harmon-Smith M, Doud D, Reddy TBK, et al. 細菌と古細菌の単一増幅ゲノム（MISAG）およびメタゲノム集合ゲノム（MIMAG）に関する最小情報（Minimum information about a single amplified genome）. Nat Biotechnol. 2017;35:725-31.
記事CAS PubMed PubMed Central Google Scholar
Shaffer M, Borton MA, McGivern BB, Zayed AA, La Rosa SL, Solden LM, et al. DRAM for distilling microbial metabolism to automate the curation of microbiome function. Nucleic Acids Res. 2020;48:8883-900.
記事CAS PubMed PubMed Central Google Scholar
Zhang H, Yohe T, Huang L, Entwistle S, Wu P, Yang Z, et al. dbCAN2: a meta server for automated carbohydrate-active enzyme annotation. Nucleic Acids Res. 2018;46:W95-101.
記事CAS PubMed PubMed Central Google Scholar
Mistry J, Chuguransky S, Williams L, Qureshi M, Salazar GA, Sonnhammer ELL, et al. Pfam.： 2021年のタンパク質ファミリーデータベース。Nucleic Acids Res. 2021;49:D412-9.
記事CAS PubMed Google Scholar
Suzek、Wang Y、Huang H、McGarvey PB、Wu CH、UniProt C. UniRef clusters: a comprehensive and scalable alternative for improving sequence similarity searches. Bioinformatics. 2015;31:926-32.
記事CAS PubMed Google Scholar
Rawlings ND, Barrett AJ, Thomas PD, Huang X, Bateman A, Finn RD. 2017年のタンパク質分解酵素、その基質および阻害剤のMEROPSデータベースと、PANTHERデータベースのペプチダーゼとの比較。Nucleic Acids Res. 2018;46:D624-32.
記事CAS PubMed Google Scholar
Aramaki T, Blanc-Mathieu R, Endo H, Ohkubo K, Kanehisa M, Goto S, et al. KofamKOALA: KEGG Ortholog assign based on profile HMM and adaptive score threshold. Bioinformatics. 2020;36:2251-2.
記事CAS PubMed Google Scholar
金久真紀子、佐藤恭子、森島恭子：BlastKOALAおよびGhostKOALA：ゲノムおよびメタゲノム配列の機能的特徴付けのためのKEGGツール．J Mol Biol. 2016;428:726-31.
論文CAS PubMed Google Scholar
金久正樹、佐藤恭子、川島雅彦：生物データの隠れた特徴を明らかにするためのKEGGマッピングツール．Protein Sci. 2022;31:47-53.
論文CAS PubMed Google Scholar
Nordberg H, Cantor M, Dusheyko S, Hua S, Poliakov A, Shabalov I, et al. The genome portal of the Department of Energy Joint Genome Institute： 2014年最新情報。Nucleic Acids Res. 2014;42:D26-31.
記事CAS PubMed Google Scholar
Peng X, Wilken SE, Lankiewicz TS, Gilmore SP, Brown JL, Henske JK, et al. ヤギ腸内細菌叢におけるリグノセルロース分解を可能にする真菌および細菌コンソーシアムのゲノムおよび機能解析。Nat Microbiol. 2021;6:499-511.
論文CAS PubMed PubMed Central Google Scholar
Mić M, Whyte JD, Karsten V. 土壌、植物、動物サンプルのためのサンプル調製技術において。Micic M, editor. ニューヨク： Springer New York; 2016. p. 99-116.
Michalak L, Gaby JC, Lagos L, La Rosa SL, Hvidsten TR, Tetard-Jones C, et al. Microbiota-directed fibre activates both targeted and secondary metabolic shifts in the distal gut. Nat Commun. 2020;11:5773.
記事CAS PubMed PubMed Central Google Scholar
Kong AT, Leprevost FV, Avtonomov DM, Mellacheruvu D, Nesvizhskii AI. MSFragger：質量分析に基づくプロテオミクスにおける超高速かつ包括的なペプチド同定。Nat Methods. 2017;14:513-20.
記事CAS PubMed PubMed Central Google Scholar
da Veiga Leprevost F, Haynes SE, Avtonomov DM, Chang H-Y, Shanmugam AK, Mellacheruvu D, et al. Philosopher: a versatile toolkit for shotgun proteomics data analysis. Nat Methods. 2020;17:869-70.
記事 PubMed PubMed Central Google Scholar
Yu F、Haynes SE、Nesvizhskii AI. IonQuantは、FDR制御のmatch-between-runで正確かつ高感度なラベルフリー定量を可能にした。Mol Cell Proteom. 2021;20:100077.
記事CAS Googleスカラー
TyanovaS、Temu T、Sinitcyn P、Carlson A、Hein MY、Geiger T、et al. Perseus computational platform for comprehensive analysis of (prote)omics data. Nat Methods. 2016;13:731-40.
論文CAS PubMed Google Scholar
Kleiner M, Thorson E, Sharp CE, Dong X, Liu D, Li C, et al. Assessing species biomass contributions in microbial communities via metaproteomics. Nat Commun. 2017;8:1558.
記事 PubMed PubMed Central Google Scholar
Wickham, H. ggplot2： Elegant Graphics for Data Analysis（データ解析のためのエレガントなグラフィックス）。Springer-Verlag New York. 2016. https://ggplot2.tidyverse.org.
R Core Team. R: A language and environment for statistical computing. R Foundation for Statistical Computing, Vienna, Austria. 2021. https://www.R-project.org/.
Federico A, Monti S. hypeR: an R package for geneset enrichment workflows. Bioinformatics. 2020;36:1307-8.
記事CAS PubMed Google Scholar
Keogh K, Waters SM, Kelly AK, Kenny DA. ホルスタイン種雄牛における飼料制限とその後のリアニメーション： I. Effect on animal performance; muscle, fat, and linear body measurements; and slaughter characteristics. J Anim Sci. 2015;93:3578-89.
記事CAS PubMed Google Scholar
McCabe MS, Cormican P, Keogh K, O'Connor A, O'Hara E, Palladino RA, et al. Illumina MiSeq系統樹アンプリコンシーケンスにより、飼料制限牛において特性不明のサクシニブリオネアの大幅減少とMethanobrevibacter gottschalkiiクレードの増加の確認。PLOS ONE. 2015;10:e0133234.
論文 PubMed Central Google Scholar
ウェッセルD、フルッゲUI．洗剤や脂質の存在下で希薄溶液中のタンパク質を定量的に回収する方法。Anal Biochem. 1984;138:141-3.
記事CAS PubMed Google Scholar
Zougman A, Selby PJ, Banks RE. ボトムアッププロテオミクス解析のためのSuspension Trapping (STrap) サンプル調製法。プロテオミクス(Proteomics). 2014;14:1006-000.
記事CAS PubMed Google Scholar
ハーパーJW、ベネットEJ. プロテオームの複雑さとプロテオームのアンバランスを促進する力。Nature. 2016;537:328-38.
記事 CAS PubMed PubMed Central Google Scholar
ウィリアムズAG、コールマンGS. ルーメン原生動物. New York： Springer; 1992.
書籍 Google Scholar
Williams CL, Thomas BJ, McEwan NR, Stevens PR, Creevey CJ, Huws SA. ルーメン原虫は、真菌の捕食と植物の炭水化物の分解に重要な役割を果たす。Front Microbiol. 2020;11:720.
ルーメン繊毛虫原生動物による食物繊維の消化。Microbes Environ. 2004;19:203-10.
論文 Google Scholar
Coleman GS, Sandford DC. ルーメン繊毛虫原生動物の単種および混合種による混合ルーメン細菌および個々の細菌種の生体内への取り込みと消化。J Agric Sci. 1979;92:729-42.
記事 Google Scholar
Wang L, Abu-Doleh A, Plank J, Catalyurek UV, Firkins JL, Yu Z. The transcriptome of the rumen ciliate Entodinium caudatum reveals some of its metabolic features. BMC Genom. 2019;20:1008.
記事CAS Googleスカラー
Belzecki G, McEwan NR, Kowalik B, Michalowski T, Miltko R. Entodinium caudatumがルーメンと網状体におけるEudiplodinium maggiiによるデンプン摂取とグリコーゲン生成に与える影響。Eur J Protistol. 2017;57:38-49.
記事 PubMed Google Scholar
アレンMS. ルーメンでの発酵酸産生と物理的に有効な繊維の必要量との関係。J Dairy Sci. 1997;80:1447-62.
論文 CAS PubMed Google Scholar
Solomon R, Wein T, Levy B, Eshed S, Dror R, Reiss V, et al. 原虫集団は、ルーメン微生物生態系の原核生物群集構造および機能を形成する生態系エンジニアです。isme j. 2022;16:1187-97.
記事 PubMed Google Scholar
ルーメン繊毛虫は獲物や原核生物の共生先を選択するのか？Front Microbiol. 2018;9:1710.
論文 PubMed PubMed Central Google Scholar
グティエレスJ、デイビスRE. ルーメン繊毛虫EntodiniumとDiplodiniumによる細菌摂取。J Protozool. 1959;6:222-6.
記事 Google Scholar
Bauman DE, Davis CL, Bucholtz HF. コントロールまたは高穀物低繊維食を給与した牛のルーメンにおけるプロピオン酸産生。J Dairy Sci. 1971;54:1282-7.
記事CAS PubMed Google Scholar
Jiao HP, Dale AJ, Carson AF, Murray S, Gordon AW, Ferris CP. 放牧乳牛からのメタン排出量に及ぼす濃厚飼料レベルの影響。J Dairy Sci. 2014;97:7043-53.
記事CAS PubMed Google Scholar
Martin C, Morgavi DP, Doreau M. Methane mitigation in ruminants: from microbe to the farm scale. Animal. 2010;4:351-65.
記事CAS PubMed Google Scholar
(1)ルーメン繊毛虫の種類、(2)ルーメン繊毛虫の種類、(3)ルーメン繊毛虫の種類、(4)ルーメン繊毛虫の種類。ルーメン繊毛虫の中には、メタン菌が共生しているものがある。FEMS Microbiol Lett. 1994;117:157-61.
論文CAS PubMed Google Scholar
ニューボルドCJ、ラサラスB、ジュアニーJP. ルーミナルのメタン生成における繊毛原生動物に関連するメタン生成物質の重要性 in vitro. Lett Appl Microbiol. 1995;21:230-4.
記事CAS PubMed Google Scholar
ニューボルドCJ、デ・ラ・フエンテG、ベランチA、ラモス＝モラレスE、マキューンNR. ルーメンにおける繊毛虫原生動物の役割。Front Microbiol. 2015;6:1313.
記事 PubMed PubMed Central Google Scholar
Hristov AN, Oh J, Firkins JL, Dijkstra J, Kebreab E, Waghorn G, et al. Special topics-Mitigation of methane and nitrous oxide emissions from animal operations： I.腸内メタンの緩和オプションのレビュー。J Anim Sci. 2013;91:5045-69.
記事CAS PubMed Google Scholar
Jenkins TC, Wallace RJ, Moate PJ, Mosley EE. Board-invited review： ルーメン微生物生態系における不飽和脂肪酸のバイオ水素化における最近の進歩。J Anim Sci. 2008;86:397-412.
論文CAS PubMed Google Scholar
Zhang XM, Medrano RF, Wang M, Beauchemin KA, Ma ZY, Wang R, et al. Corn oil supplementation enhances hydrogen use for biohydrogenation, inhibits methanogenesis, and alters fermentation pathways and the microbial community in the rumen of goats. J Anim Sci. 2019;97:4999-5008.
記事 PubMed PubMed Central Google Scholar
Guyader J, Eugène M, Nozière P, Morgavi DP, Doreau M, Martin C. Influence of rumen protozoa on methane emission in ruminants: a meta-analysis approach. Animal. 2014;8:1816-25.
記事CAS PubMed Google Scholar
Niu P, Schwarm A, Bonesmo H, Kidane A, Aspeholen Aby B, Storlien TM, et al. A basic model to predict enteric methane emission from dairy cows and Its application to update operational models for the national inventory in Norway. Animals. 2021;11:1891.
記事 PubMed PubMed Central Google Scholar
McAllister TA, Cheng K-J, Okine EK, Mathison GW. 反芻動物のメタン生成の食餌、環境、微生物学的側面。Can J Anim Sci. 1996;76:231-43.
記事CAS Google Scholar
Gruninger RJ, Zhang XM, Smith ML, Kung L Jr., Vyas D, McGinn SM, et al. 肉牛の腸内メタン排出を緩和するために3-ニトロオキシプロパノールとカノーラ油を適用すると、ルーメン微生物群に異なる影響を及ぼす。Anim Microbiome. 2022;4:35.
記事CAS PubMed PubMed Central Google Scholar
Popova M, Martin C, Eugène M, Mialon MM, Doreau M, Morgavi DP. 繊維質およびデンプンを多く含む仕上げ用飼料が肥育牛のルーメンのメタン生成アーキアの多様性および活性に及ぼす影響。Anim Feed Sci Technol. 2011;166-167:113-21.
記事CAS Google Scholar
Van Kessel JAS, Russell JB. ルーメンのメタン生成に及ぼすpHの影響。FEMS Microbiol Ecol. 1996;20:205-10.
記事 Google Scholar
Russell JB, Muck RE, Weimer PJ. ルーメンにおけるセルロース分解とセルロース分解菌の増殖の定量的解析。FEMS Microbiol Ecol. 2009;67:183-97.
論文CAS PubMed Google Scholar
Russell JB. ルーメンの酢酸／プロピオン酸比とメタン生成のin vitroでの制御におけるpHの重要性。J Dairy Sci. 1998;81:3222-30.
記事CAS PubMed Google Scholar
Kleen JL, Hooijer GA, Rehage J, Noordhuizen JP. 亜急性ルミナルアシドーシス（SARA）：レビュー。J Vet Med A Physiol Pathol Clin Med. 2003;50:406-14.
記事CAS PubMed Google Scholar
Perez-Riverol Y, Csordas A, Bai J, Bernal-Llinares M, Hewapathirana S, Kundu DJ, et al. 2019年のPRIDEデータベースと関連ツール・リソース：定量化データのサポートを改善する。Nucleic Acids Res. 2019;47:D442-50.
記事CAS PubMed Google Scholar
参考文献のダウンロード
謝辞（Acknowledgements
PBPとTOAは、The Research Council of Norway (FRIPRO program, PBP: 250479)、ならびにEuropean Research Commission Starting Grant Fellowship (awarded to PBP: 336355-MicroDE), and the Novo Nordisk Foundation (awarded to PBP: 0054575-SuPAcow) からの支援に感謝しています。LHHはノルウェー研究評議会（FRIPROプログラム、LHH：302639-SeaCow）の支援を受け、MØAはノボノルディスク財団（プロジェクト番号NNF20OC006131）の支援を受けました。実験試験は、NutriLipプロジェクトの一環として、APIS-GENE（フランス、パリ）の資金援助を受けて実施した。ガス放出測定は、UMR 1213 Herbivores (INRAE, Saint-Genès-Champanelle, France)から資金提供を受けた。配列決定サービスは、オスロ大学が主催する国家技術プラットフォームであるNorwegian Sequencing Center (www.sequencing.uio.no) が提供し、ノルウェー研究評議会とSoutheastern Regional Health Authoritiesの「機能ゲノム」「インフラ」プログラムによって支援されました。本論文で報告したメタオミクス計算に貢献した計算資源を提供してくれたNorwegian University of Life SciencesのOrion High Performance Computing CenterとノルウェーのSigma2-National Infrastructure for High Performance Computing and Data Storageに謝意を表します。質量分析に基づくプロテオミクス解析は、Norwegian University of Life Sciences (NMBU) のThe MS and Proteomics Core Facilityで行われました。この施設は、ノルウェー研究会議INFRASTRUKTUR-program（プロジェクト番号：295910）の助成を受けたNational Network of Advanced Proteomics Infrastructure（NAPI）のメンバーである。
著者情報
著者および所属
ノルウェー生命科学大学バイオサイエンス学部動物・水産科学科、ノルウェー、オース
テア・O・アンデルセン、イアニナ・アルトシューラー、フィリップ・B・ポープ
ノルウェー生命科学大学化学・バイオテクノロジー・食品科学学部、ノルウェー、オース
アルトゥーロ・ヴェラ＝ポンセ・デ・レオン、ジュリーヌ・M・ウォルター、トルゲア・R・フヴィッドステン、マグヌス・オ・アーントゼン、ライブ・H・ハーゲン＆フィリップ・B・ポープ
Teagasc, Animal and Bioscience Research Department, Animal and Grassland Research and Innovation Centre, Teagasc, Grange, Dunsany, County, Meath, Ireland.
エミリー・マクガバン、ケイト・キョウ、シニード・M・ウォーターズ
INRAE、VetAgro Sup、UMR Herbivores、Université Clermont Auvergne、Saint-Genes-Champanelle、フランス
セシル・マルタン、ローレンス・ベルナール、ディエゴ・P・モルガビ、ミルカ・ポポワ
大韓民国京畿道安城市、中央大学動物科学技術学部
パク・タンソル
オハイオ州立大学動物科学部（米国オハイオ州コロンバス
タンソル・パーク、ジェフリー・L・ファーキンス、ジュンタン・ユー
西北A&F大学畜産科学技術学院反芻動物遺伝学・進化学センター（中国・襄陽市陽陵
リー・ゾンジュン & ユー・ジャン（Zongjun Li & Yu Jiang
貢献度
TOA、LHH、MØA、PBPは、本研究を考案し、データの一次分析を行い、論文を執筆した（全著者からのインプットを得て）。MP、CM、LB、DPMは、INRAE動物実験の設計、実施、分析を行った。SMW、KK、EMは、TEAGASC動物実験の設計、実施、分析を行った。TOA、LHH、MØA、AVPDL、IA、JMWおよびTRHは、メタプロテオミクスデータを作成し、データ解析に貢献した。TP、ZY、JLF、YJおよびZLは、原虫ゲノムデータを作成し、解析した。
対応する著者
フィリップ・B・ポープに連絡する。
倫理的宣言
競合する利益
著者らは、競合する利害関係を宣言していない。
追加情報
出版社からのコメント Springer Natureは、出版された地図の管轄権の主張と所属機関に関して中立を保っています。
補足情報
補足図S1
補足表S1
補足表S2
補足表S3
補足表S4
補足表S5
補足表S6
補足表S7
補足表S8
補足表S9
権利と許可
オープンアクセス この記事は、クリエイティブ・コモンズ 表示 4.0 国際ライセンスの下でライセンスされており、原著者と出典に適切なクレジットを与え、クリエイティブ・コモンズのライセンスへのリンクを提供し、変更を加えたかどうかを示す限り、あらゆる媒体や形式での使用、共有、適応、配布、複製を許可します。この記事に掲載されている画像やその他の第三者の素材は、素材へのクレジット表示で別段の指示がない限り、記事のクリエイティブ・コモンズ・ライセンスに含まれています。素材が記事のクリエイティブ・コモンズ・ライセンスに含まれておらず、あなたの意図する使用が法的規制によって許可されていない場合、または許可された使用を超える場合、あなたは著作権者から直接許可を得る必要があります。このライセンスのコピーを見るには、http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/。
転載と許可について
この記事について
この記事を引用する
Andersen, T.O., Altshuler, I., Vera-Ponce de León, A. et al. Metabolic influence of core ciliates within the rumen microbiome. ISME J (2023). https://doi.org/10.1038/s41396-023-01407-y
引用文献をダウンロードする
2022年6月29日受領
2023年3月29日改訂
2023年3月30日受理
2023年5月11日発行
DOIhttps://doi.org/10.1038/s41396-023-01407-y
この記事を共有する
以下のリンクを共有した人は、このコンテンツを読むことができます：
共有可能なリンクを取得する
コンテンツ共有イニシアティブ「Springer Nature SharedIt」によって提供されています。
対象分野
DNAシーケンシング
メタゲノミクス
微生物生態学
マイクロバイオーム
ISME Journal (ISME J) ISSN 1751-7370（オンライン） ISSN 1751-7362（プリント版）
nature.comサイトマップ
Natureについて ポートフォリオ
ネイチャーズについて
プレスリリース
プレスオフィス
お問い合わせ
コンテンツ紹介
ジャーナルA-Z
テーマ別記事
ナノ
プロトコル交換
ネイチャーインデックス
出版ポリシー
Natureポートフォリオポリシー
オープンアクセス
著者・研究者向けサービス
リプリント＆パーミッション
研究データ
言語編集
科学編集
ネイチャー・マスタークラス
ネイチャーリサーチアカデミー
リサーチソリューション
ライブラリー＆インスティテューション
ライブラリアンサービス＆ツール
図書館員ポータル
オープンリサーチ
図書館に推薦する
広告とパートナーシップ
広告掲載
パートナーシップとサービス
メディアキット
ブランデッドコンテンツ
キャリア開発
ネイチャーキャリア
ネイチャーコンファレンス
ネイチャーイベント
地域別ウェブサイト
ネイチャー アフリカ
ネイチャーチャイナ
ネイチャーインディア
ネイチャー・イタリア
ネイチャージャパン
ネイチャーコリア
ネイチャー・ミドルイースト
個人情報保護方針

Cookieの使用

クッキーの管理/私のデータを販売しないでください
法的通知

アクセシビリティ・ステートメント

ご利用条件

カリフォルニアプライバシーステートメント
© 2023 シュプリンガー・ネイチャー・リミテッド