老化したメラノサイトによるシグナル伝達は、毛髪の成長を亢進させる。

2023年6月23日 10:13

出版：2023年6月21日
老化したメラノサイトによるシグナル伝達は、毛髪の成長を亢進させる。

https://www.nature.com/articles/s41586-023-06172-8/figures/1

王小傑、ラウル・ラモス、...マクシム・V・プリクス著者一覧を見る
Nature 618巻 808-817ページ (2023)この記事を引用する

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メトリクス詳細

要旨
ニッチシグナルは、幹細胞を長期の休止状態に維持したり、適切な再生のために一過性に活性化したりする1。バランスのとれたニッチシグナルが変化すると、再生障害を引き起こす可能性がある。ヒトのメラノサイト性皮膚母斑はしばしば過剰な毛髪成長を示すが、これは毛幹細胞の亢進を示唆している。ここでは、母斑の遺伝的マウスモデル2,3を用いて、老化メラノサイトの真皮クラスターが、上皮性毛幹細胞を休止期から脱却させ、転写産物と組成を変化させ、毛髪再生を強力に促進することを示す。母斑メラノサイトは、シグナル伝達因子が豊富な独特の分泌物を活性化する。母斑の代表的なシグナル伝達因子であるオステオポンチンは、発毛に必要かつ十分である。一方、オステオポンチンまたはその上皮性毛母細胞上の同族受容体であるCD44の生殖細胞系列および条件付き欠失は、真皮母斑メラノサイトによって誘導される毛髪成長の促進を救う。オステオポンチンはヒト毛母斑で過剰発現しており、ヒト毛包の新生を刺激する。老化や遺伝毒性ストレスなどによる老化細胞の広範な蓄積は、組織の再生能力にとって有害であるが4、我々は、老化細胞クラスターによるシグナル伝達が、隣接する無傷の幹細胞の活性を強力に増強し、組織の再生を刺激することを示した。この発見は、老化細胞とその分泌物が、再生疾患における魅力的な治療標的となることを明らかにするものである。

主な内容
幹細胞（SCs）は長期的な組織の維持と再生に決定的に必要である。その機能を果たすために、幹細胞は静止状態を保ち、必要な時だけ一過性に活性化する。即座の制御は、短距離シグナル伝達ニッチ1によって行われる。さらに、何千もの個々のSCニッチの活動は、周辺組織からの長距離シグナルによって調整される5。長距離シグナルは一度に多くのSCニッチの活動を調整するため、それらに何らかの変化が生じると、臓器の全体的な再生能が大きく変化する可能性がある。しかしながら、どのような細胞タイプがSCの効率的な長距離制御因子として機能しうるかは十分に理解されていない。

皮膚は、毛包細胞生物学の基本的側面を研究するための貴重なモデルシステムである。皮膚には前駆細胞が豊富な毛包（HF）があり、周期的に更新される6。各サイクルはSCの活性化7から始まり、特殊な毛乳頭線維芽細胞8を特徴とするニッチによるシグナル伝達を必要とする。原理的には、HFは外部からのシグナル入力なしに周期的に更新することができるが、適切な毛皮の「製造」という共通の目標のために、何千ものHFが生理的に毛髪形成活動を調整している9。この協調は、隣接する毛母細胞10や他の非毛母細胞との間で共有されるシグナル伝達によって達成される。毛の再生に最も顕著な影響を及ぼすのは、皮膚脂肪細胞11と脂肪前駆細胞12である。これは、HFと脂肪組織が互いに近接しており、WNT、BMP、ヘッジホッグ、PDGFといった同じシグナル伝達経路を使って細胞系列を制御しているためである。自然免疫細胞と適応免疫細胞もまた、毛髪の成長ダイナミクスを強力に調節する因子である13,14。

周期的な毛髪再生は、毛母細胞の休止期レベルで厳密に制御されているため、自然発生的に毛髪が過剰に成長する状態は稀である。先天性（図1a,c）および後天性（図1b）の毛髪性色素性母斑は、顕著な毛髪成長を示すことがあるヒトの良性皮膚病変の一種である。臨床的によく知られているにもかかわらず、母斑における過剰な発毛のメカニズムは解明されていない。皮膚メラノサイトのNras（Alps4としても知られる）またはBrafによく見られる癌遺伝子変異が母斑を誘発する15。変異細胞はまず一過性に拡大するが、その後がん遺伝子誘導性老化（OIS）16を活性化し、老化細胞に富む空間的に限定された病変を生じる。完全に老化すると、細胞は特殊な分泌物、すなわち老化関連分泌表現型（SASP）を発現する17。いくつかの炎症性サイトカインや成長因子はSASPの一部であり、正常な胚発生18、細胞の初期化19、傷害の修復20、癌の進行21,22において、それらのシグナル伝達の重要な役割が急速に認識されつつある。我々は、毛母斑における発毛促進は、老化メラノサイトの真皮クラスターからHF SCsへのシグナル伝達が活性化されることによって駆動されるという仮説を立てた。

図1：母斑皮膚における毛髪成長の亢進。
図1
a,b,ヒトの先天性（生後7ヵ月；a）および後天性（42歳；b）のメラノサイト母斑では、毛髪成長（矢頭）が亢進している。c,正常皮膚（左）では一般に休止期にとどまる顔面HFが、母斑皮膚（右）では活性化し、新たな休止期に入る。d,f,g,P33のWTのanagen皮膚と比較して、P56のTyr-NrasQ61K皮膚は真皮上部にTrp2+p15+Ki67negメラノサイトのクラスターを含んでいた。g, n = 4; P = 0.0455668. e, P56 Tyr-NrasQ61K皮膚は、TRP2+γH2AX+PCNAneg真皮メラノサイトのクラスターを含んでいた。 h, P30 WTアナジェン皮膚と比較して、P56 Tyr-NrasQ61K皮膚は、TRP2+Ki67neg（n = 3; P = 0. i-k,Tyr-NrasQ61Kマウスは毛の成長が亢進していた。調査したすべての出生後の時点で（Extended Data Fig.1も参照）、Tyr-NrasQ61Kの皮膚は多くの異所性anagen HFを含んでいた。Anagen HFは定量化されている（i）。iでは、P30でn=9、P44でn=12（P=0.0000108）、P56でn=21（P=0.00000000183）、P69でn=12（P=0.00329）、P100でn=17（P=0.0000239）。jでは、剃毛12日後のP50で、Tyr-NrasQ61Kでは多くの新しい毛が成長したが、WTマウスでは成長しなかった。kでは、P56で、Tyr-NrasQ61K;TOPGALマウスは、対照のTOPGALマウスとは異なり、多くのlacZ+anagen HFを示した（矢頭）。g-iにおいて、nは生物学的に独立したサンプルを示す。データは平均値±s.d.である。P値は、対応のない片側検定（g,i）または両側検定（h）のStudent's t-testを用いて計算した。*P≦0.05、**P≦0.01。スケールバー、20μm（e）、100μm（d）、500μm（c）、1mm（ホールマウント；k）、200μm（組織学；k）。aの画像はS. Liberの許可を得て掲載している。

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老化細胞は毛髪の成長を活性化する
まず、メラノサイト性母斑のマウスモデルが毛髪の成長を促進するかどうかを検討した。先天性母斑のモデルである構成性Tyr-NrasQ61Kマウス2と、後天性母斑のモデルである誘導性Tyr-CreERT2;BrafV600Eマウス3である。どちらのモデルでも、癌遺伝子は神経堤由来のメラノサイトに非常に特異的なTyrエンハンサー・プロモーター制御領域から過剰発現される。マウスの正常な毛髪成長は協調的である。すなわち、HFの大集団が共同で休止期（telogen）から活動的成長期（anagen）に移行し、その後退行期（catagen）を経て再びtelogenに戻る9,11。この連携により、毛包SCはライフサイクルの大部分を休止期で過ごし、個別の毛包グループ内で新しい毛を再生するために一時的に活性化されるだけである。休止期のHFには、上皮性SCと共有ニッチに位置するメラノサイトSCが存在するが、成長期のHFには、活性化した色素産生メラノサイトもその基底部に存在する。Tyr-NrasQ61Kマウスでは、HFそのものではなく真皮が、非増殖性p15+（図1d,f,g）および非増殖性γH2AX+メラノサイト（図1e,h）として同定された老化メラノサイトで占められるようになったが、毛髪の成長は劇的に促進され、どの時点でも多くの異所性anagen HFが存在した（各時点n = 3）（図1i-kおよびExtended Data Fig.）対照マウスでは、出生後15日目（P15）には背側HFが第一休止期にあり（Extended Data Fig. その後、HFはP44-P69にわたる長い第2休止期に入った（拡大図1d-g）。対照的に、Tyr-NrasQ61Kの皮膚は、調べたすべての時点で異所性anagen HFを含んでおり（図1i,jおよびExtended Data Fig. 異所性anagen表現型は、特にTyr-NrasQ61K;TOPGALマウス（n = 4）で見られ、すべてのanagen HFがTOPGAL WNTレポーターを強く活性化し、lacZ陽性に染色された（図1k）。Tyr-NrasQ61Kマウスの異所性anagen HF密度は時点によって異なるが、平均するとP30野生型（WT）皮膚の同期anagen HF密度に対して35.4％であった（図1i）。Tyr-NrasQ61Kマウスを、Tyr遺伝子に変異を持つアルビノのTyr(C-2J)バックグラウンドに交配した。メラニンがないにもかかわらず、アルビノのTyr-NrasQ61KマウスはP56とP100の両方で異所性蒙古斑を示した（Extended Data Fig.

次に、Tyr-CreERT2;BrafV600EマウスにタモキシフェンをP2-P4の初期またはP21-P25の後期に投与し、初期の後天性母斑をモデル化した。誘導された対照動物とは異なり、誘導された変異マウスは、HFに隣接する真皮に、老化した非増殖性p15+（拡張データ図2a）、非増殖性γH2AX+（拡張データ図2b,c）、非増殖性p16+（拡張データ図2d）のメラノサイトのクラスターを蓄積した。P2-P4で誘導された変異マウスは、P44、P56、P69、P100（各時点n = 4）で顕著な異所性anagenを示した（Extended Data Fig.）各時点で、P30 WT皮膚に対して平均35.7%のanagen HFを示し、これは先天性Tyr-NrasQ61K変異体とよく似ていた。同様に、P21-P25でタモキシフェンを投与した変異マウスも、P56から顕著な異所性anagenを示した（各時点につきn≥3）（Extended Data Fig.）また、母斑由来のメラノサイトを正常な休止期の皮膚に注入すれば、異所性anagenを誘導するのに十分かどうかも検討した。先天性Tyr-NrasQ61K;Tyr-CreERT2;tdTomato（拡張データ図3a）および後天性Tyr-CreERT2;BrafV600E;tdTomatoマウス（拡張データ図3c）の皮膚からtdTomato+メラノサイト系細胞を選別した。両方の母斑マウスモデルから選別した細胞をSCIDマウスの休止期皮膚（n = 4ずつ）に皮内注射すると、21日以内に新しいanagenが誘導された（Extended Data Fig. しかし対照的に、休止期（P56）と再生期（P33）の両方で単離されたコントロールのTyr-CreERT2;tdTomatoマウスから選別された細胞を注入しても、SCID宿主の皮膚（n = 4ずつ）では新しい再生期は活性化されなかった（Extended Data Fig.）我々はまた、初代CD117+新生マウスメラノサイトをin vitroでH2O2にさらすことにより、老化β-ガラクトシダーゼ陽性（β-Gal+）メラノサイトを作製した（Extended Data Fig.）コントロールの培養メラノサイト（n = 7）とは異なり、DiI標識H2O2処理メラノサイトは、注入21日後のtelogen SCID皮膚（n = 6）に新しいanagenを誘導した（Extended Data Fig.）また、低分子BCL-2阻害剤ABT-737をマウスに皮下投与したところ、P56 Tyr-NrasQ61Kマウスでは、メラノサイトの顕著なアポトーシスが誘導されたが、HF SCの存在量には影響を与えなかった（n = 5）（拡張データFig. 対照的に、Tyr-NrasQ61KマウスにABT-737を投与すると、P56における異所性anagen HFが有意に減少した（n = 6）（ExtendedデータFig. 次に、K14-Edn3マウスとK14-Kitlマウスを調べた。K14-Edn3マウスでは、それぞれ、がん遺伝子変異によらない真皮および表皮メラノサイトの拡大が見られた。両モデルマウスとも、毛周期の進行は正常で、P36でanagenが同期し（各モデルn = 3）、P56でtelogenが同期した（各モデルn = 3）（Extended Data Fig.）最後に、メラノサイトにTrp53（p53としても知られる）欠失を誘導したが、これはがん原性刺激であるにもかかわらず、NrasQ61KやBrafV600Eの過剰発現とは異なり、OIS17を誘導しなかった。対照マウスと同様に、タモキシフェン処理したP56 Tyr-CreERT2;Trp53fl/flマウスのHFは、休止期を維持した（n = 3）（ExtendedData図5j）。これらのデータを総合すると、メラノサイトOISの先天性および後天性マウスモデルは、ヒトの有毛性色素性母斑で臨床的に観察される毛髪成長亢進を再現すること、および、正常なメラノサイトではなく、老化した真皮メラノサイトがHFの更新を亢進させるのに必要かつ十分であることを示している。

老化はSCの静止状態を破壊する
次に、真性HFバルジSCが母斑環境によってどのような影響を受けるかを調べた。私たちは、WT HFがそれぞれanagenとtelogenにあるP30とP56において、RNA配列決定（RNA-seq）によりそのトランスクリプトームをプロファイリングした。バルジSCは、K14-H2B-GFPコントロールマウスとTyr-NrasQ61K;K14-H2B-GFP変異マウスの両方から、GFP+CD34+Pcadlow細胞として単離された（Extended Data Fig.） RNA-seqによって、Tyr-NrasQ61KとコントロールのバルジSCの間に顕著な遺伝子発現の違いがあることが明らかになった（図2a、拡張データ図6cおよび補足表1）。最大の違いはP56で見られ、変異型SCはそれぞれ973個と1,159個の遺伝子をダウンレギュレーションとアップレギュレーションしていた。変異SCの遺伝子オントロジーカテゴリーには、細胞周期ブロック、概日リズム、WNTおよびJAK-STAT抑制が含まれ、一方濃縮されたカテゴリーには、細胞周期、細胞移動、WNTシグナル伝達および皮膚発生が含まれた（拡張データ図6dおよび補足表1）。これらの遺伝子オントロジーシグネチャーは、Tyr-NrasQ61KバルジSCが休止期を失っていることを示している。遺伝子レベルでは、Axin2、Bmp2、Col17a1、Ctgf、Fgf18、Foxc1、Grem1、Nfatc1およびWif1を含む複数の休止期マーカーが、P56 Tyr-NrasQ61KバルジSCにおいて発現低下していた（図2b,cおよび補足表1）。

図2：母斑皮膚内の毛髪SCは静止状態を失う。
図2
a, RNA-seq解析において、Tyr-NrasQ61KバルジSCはP30およびP56 WTバルジSCとは異なる。主成分分析プロットを示す。b, WTに対するP56およびTyr-NrasQ61Kの発現低下（赤色）および発現上昇（緑色）遺伝子のリスト。細胞は5つのクラスターを形成している： e、相対的なクラスターの類似性を示すクラドグラム。 f、サンプルソース別に色分けしたt-SNEプロット。拡張データ図6参照。i、バルジSCのEdUパルスチェイス解析。CD34+CD49f+バルジSCの総数（上）とは異なり、そのEdU+標識保持サブセットはTyr-NrasQ61Kマウスではコントロールマウスに対して有意に減少した（下）。CD34+CD49f+SCについてはn = 7（P = 0.061857）、CD34+CD49f+EdU+SCについてはn = 6（P = 0.0002048）。Extended Data Fig.7を参照。k,l、K14-H2B-GFP+バルジ細胞（k）と有毛生殖細胞（l）の接着率は、WTマウスとTyr-NrasQ61Kマウスの間で互換性があった。m,WTと比較して、Tyr-NrasQ61KバルジSCは連続継代能を顕著に減少させたが、毛生殖前駆細胞には変化がなかった。c,i,mにおいて、nは独立した実験を意味する。P値は対応のない両側スチューデントのt検定を用いて計算した。有意ではない（NS）、P≥0.05、*P≤0.05、**P≤0.01。スケールバー、100 μm（j）および1 mm（k,l）。

出典データ

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Tyr-NrasQ61KバルクRNA-seqシグネチャーが、異所性anagen HFからのほぼ正常な活性化SCによって単純に支配されているのではないことを確認するために、P56変異体とP30anagenおよびP56 telogen WTバルジ細胞を単細胞RNA-seqで比較した。P30とP56のWT細胞は、共有クラスターC1と、2つの相特異的クラスター：anagen特異的C2とtelogen特異的C3を形成していた（図2d-f）。マーカー解析の結果、C1細胞はChit1、Krt6a、Krt80を含む内側バルジ細胞のシグネチャーと一致し、一方C2とC3細胞はともにCol18a1、Krt17、Lhx2、Tcf7l2、Vdr23を含む外側バルジ真性SCのシグネチャーと一致した（図2h、拡張データ図6e-j、補足表2および3）。P56変異バルジ細胞は、WT細胞に比べてその組成を劇的に変化させた。ある細胞は共有のインナーバルジクラスターC1に、他の細胞はWTアナゲン特異的アウターバルジクラスターC2に寄与したが、多くの細胞はコアとなるアウターバルジのシグネチャーを保持した2つの新しい変異特異的クラスターC4とC5を形成した（図2f、拡張データ図6e）。Bmp2、Col17a1、Ctgf、Grem1、Nfatc1、Tgm5、Wif1を含む休止期遺伝子発現シグネチャーを持つWTの休止期特異的アウターバルジクラスターC3には、変異細胞は寄与しなかった（Extended Data Fig.）変異体特異的アウターバルジSCによる静止状態の喪失は、推測される細胞周期解析からさらに明らかであった： C5細胞はもっぱらS期とG2/M期にあり（図2g）、有糸分裂マーカーが顕著に上昇していた（図2hと補足表3）。Tyr-NrasQ61Kの皮膚には休止期と退行期のHFが混在していることから、WTの退行期特異的C3アウターバルジ細胞の消失は、変異型退行期SCによる休止期の消失を支持する。C2〜C5クラスター間のアウターバルジマーカーの類似性から、母斑メラノサイトの存在下では、通常静止しているテロジェンSCが独自の活性化状態に移行することが示唆される。

次に、静止状態の喪失を機能的アッセイで確認した。細胞の細胞周期状態を測定するパルスおよびパルスチェイス実験では、WT HFが休止期にあり、そのSCが増殖するP27からP34の間にマウスをEdUで処理した。EdUパルスの4時間後、Tyr-NrasQ61KマウスはWT SCと同等のバルジSC標識効率を示した（Extended Data Fig.）しかしながら、パルス・チェイス・アッセイでは、P92（遺伝子型につきn＝4）で解析したところ、Tyr-NrasQ61KマウスではEdU保持SCの顕著な消失が認められた（図2i,j）。次に、クローン形成アッセイを行った。クローン形成アッセイは、培養細胞による長期間の増殖能を測定し、何度も継代して大きなクローンを形成することができるかどうかでSCを同定するものである。我々は、Tyr-NrasQ61KバルジSCの接着能力はWT SCと同様であったが、連続継代能は低下していたことを示した；WT SC（n＝3）が13.7継代であったのに対し、変異SCは6継代（n＝3）であった（図2k,m）。バルジSCによる継代能の低下は、増殖消耗が早いことを示し、これは培養前のin vivoにおける長期的な増殖亢進状態の結果と考えられる。しかしながら、休止期HF（n = 3）の上皮前駆細胞の短期間の集団である毛胚芽細胞については、付着率と継代能に変異マウス（n = 3）とWTマウスの間で差はなかった（図2l,m）。

オステオポンチンは毛髪成長を刺激する
次に、どのシグナル因子が母斑メラノサイトで発現されるかを調べた。タモキシフェンで誘導されたTyr-NrasQ61K;Tyr-CreERT2;tdTomato変異体およびTyr-CreERT2;tdTomato対照皮膚から、メラノサイト系をtdTomato+細胞として単離した。P56変異細胞は、バルクRNA-seqでP30anagen細胞およびP56 telogen WT細胞の両方と比較された（Extended Data Fig.）この戦略により、598個の変異体特異的な発現上昇遺伝子が同定され、正常なヘアサイクルの一部として制御されている遺伝子も除外された。変異体特異的遺伝子は、老化、WNT抑制、細胞周期ブロック、有糸分裂などの遺伝子オントロジー用語に富んでいた（Extended Data図7fおよび補足表4）。OISを受けた変異メラノサイトの真皮クラスターと一致して、腫瘍抑制因子Cdkn2b（p15としても知られる）、Lzts1、ならびにCdkn3、H2afx、有糸分裂関連遺伝子Aurka/b、Cdca3/8、Cdc20/25c、Cenpa、Mad2l1、Ncaph、Knstrn、Plk1、Psrc1、Reep4の発現が上昇した（Extended Data Fig.）有糸分裂関連遺伝子のアップレギュレーションは、がん遺伝子で刺激されたメラノサイトが、G0期を経由するのではなく、有糸分裂停止経路を経てOISに入るという事実と一致している24。BMPメンバーであるBmp4とFstl1、WNTメンバーであるFrzb、Wif1とWisp1、IGF制御因子であるIGFbp2/4/7、さらにDhh、Fgf7、Spp1（オステオポンチンとしても知られる）、Tnfを含む27のシグナル伝達因子が、母斑メラノサイトで特異的に発現上昇していることを同定した（Extended Data Fig.）注目すべきは、BRAFV600E誘導ヒト老化メラノサイトin vitroで濃縮されたセクレトーム遺伝子の68％2、およびin vitro SASPコア因子17の71％が、P56 Tyr-NrasQ61Kメラノサイトのトランスクリプトームで発現していたことである（Extended Data Fig.）

Spp1は、RNA-seqで母斑メラノサイトのシグナル伝達転写産物の中で、最も多く発現上昇した転写産物の一つであった。先天性、後天性両方の母斑モデルマウスから選別したメラノサイトで、この変化をタンパク質レベルで確認した。サイトメトリーでは、P56 Tyr-NrasQ61Kマウス（n＝3）（図3a）、およびタモキシフェン誘発Tyr-CreERT2;BrafV600Eマウスのメラノサイトでは、P44からP100の間の5時点（各n＝3）で、コントロールのメラノサイトに比べてSPP1レベルが有意に増加した（図3dおよび拡張データ図4f-i）。P56 Tyr-NrasQ61KおよびP69 Tyr-CreERT2;BrafV600EメラノサイトにおけるSPP1レベルの有意な増加は、ウェスタンブロットで確認された（各n = 3）（図3c,f）。P56のTyr-NrasQ61Kマウス（n＝3）から選別した初代メラノサイト（図3b）、およびP56からP100までの4時点におけるTyr-CreERT2;BrafV600Eマウスから選別した初代メラノサイトの5日目の培養において、コントロールのメラノサイト培養（n＝3ずつ）に対するSPP1分泌の有意な増加がELISAによって観察された（図3eおよび拡張データ図4e）。染色すると、Trp2+Spp1+メラノサイトのクラスターは、先天性（図3g）と後天性（拡張データ図4l）の両方の母斑マウスにおいてのみ、HFのバルジ領域に隣接する真皮上部に観察されたが、対照マウスでは観察されなかった。公表されている遺伝子発現解析25と一致して、Spp1+/-マウス（β-Galノックインマウス）におけるlacZ染色は、恒常性の正常皮膚におけるSpp1の発現が非常に制限的であり、大部分はHFの真皮乳頭線維芽細胞に限られていることを示している（Extended Data Fig.）以上のデータを総合すると、SPP1は母斑メラノサイトの真皮クラスターでアップレギュレートされたシグナル伝達因子であることが支持される。

図3：母斑メラノサイトのセクレトームには、発毛を促進するSPP1が含まれている。
図3
a,d, サイトメトリーで、SPP1はP56 Tyr-NrasQ61K（a）とP69 Tyr-CreERT2;BrafV600E（d）のメラノサイトで増加した。aでは、透過条件では、WTではn=3、Tyr-NrasQ61Kではn=5（P=0.000000115）；表面結合条件では、WTではn=3、Tyr-NrasQ61Kではn=5（P=0.0257）。dでは、透過条件ではn=3（P=0.001397）、表面結合条件ではn=3（P=0.2888）。c,f, ウェスタンブロットで、SPP1レベルはP56 Tyr-NrasQ61K（c）およびP69 Tyr-CreERT2;BrafV600E（f）のメラノサイトで増加した。cでは、n = 3; P = 0.00784。fではn = 3; P = 0.0109。b,e, ELISAでは、P56 Tyr-NrasQ61K(b)とP69 Tyr-CreERT2;BrafV600E(e)のメラノサイトの5日目の培養でSPP1レベルが増加した。bでは、WTではn = 3、Tyr-NrasQ61Kではn = 4; P = 0.00072。eではn = 4; P = 0.00224。g, WTとは異なり、Tyr-NrasQ61Kの皮膚はHFバルジに隣接してTrp2+Spp1+メラノサイトを含んでいた。 h, Tyr-NrasQ61K;Spp1-/-対Tyr-NrasQ61K;Spp1+/-コントロールマウスにおけるアナゲンHF定量化。P44では、コントロールでn=12、Tyr-NrasQ61K;Spp1-/-でn=14（P=0.0000000191）；P56では、コントロールでn=12、Tyr-NrasQ61K;Spp1-/-でn=15（P=0.0000195）。i, Tyr-CreERT2;BrafV600E;Spp1fl/flマウスは、ヘアサイクルの休止期のレスキューを示した。代表的なサンプル（左）と定量（右）を示す。j,ELISAで、SPP1レベルは、Tyr-CreERT2;BrafV600E;Spp1fl/flとTyr-CreERT2;BrafV600Eメラノサイトの5日目の培養で減少した。WTではn = 8、Spp1-/-ではn = 7; P = 0.0000575. l, BSA浸漬ビーズ（青）とは異なり、SPP1浸漬ビーズは注入12日後にWTの皮膚でアナゲンを誘導した。n = 5; P = 0.00562. m,n,コントロールとは異なり、ドキシサイクリン（dox）処理したP54 TyrrtTA;tetO-Spp1マウスは早期anagenを示した。代表的なマウス（m）と定量（n）を示す。nではn = 9; P = 0.000000377。b,c,e,f,jにおいて、nは独立した実験を意味する。a,d,h,i,k,l,nにおいて、nは生物学的に独立したサンプルを指す。データは平均値±s.d.。P値は、対応のない両側スチューデントのt検定を用いて計算した。NS、P≥0.05、*P≤0.05、**P≤0.01。スケールバー、100μm（g）、200μm（組織学；i,m）、500μm（ホールマウント；i,k,l,m）。

出典データ

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次に、SPP1が毛母斑の表現型に機能的な役割を持つかどうか、また新しい毛の成長を誘導するのに十分かどうかを検討した。Tyr-NrasQ61K;Spp1-/-マウスを用いて、Spp1の生殖細胞系列機能喪失変異が先天性母斑皮膚のヘアサイクル休止を救うのに十分であることを示した。Tyr-NrasQ61Kマウスの毛母細胞はP23ですでに異所的に休止期を開始した（Extended Data Fig. また、タモキシフェン投与により、発がん性BRAF刺激とともにメラノサイトに条件付きSpp1機能喪失変異が誘導されるTyr-CreERT2;BrafV600E;Spp1fl/flマウスも作製した。メラノサイト特異的なSpp1欠失は、Spp1欠損母斑対照動物（n = 5匹ずつ）と比較して、P62 Spp1欠損母斑マウスの異所性ヘアサイクルをほぼ阻止し（図3i）、これはELISAによる初代メラノサイト培養におけるSPP1分泌の有意な減少（約70%）と相関することを示した（n = 3）（図3j）。SPP1の部分的な消失は、CreERに基づく組み換えの効率が不完全であることに起因する。

恒常性維持時とは異なり、SPP1は皮膚創傷において、創傷線維芽細胞26と創傷マクロファージ27の両方で顕著に発現が上昇する。このことを考慮し、創傷縁のHFが早発性無毛症に移行する際に、創傷誘発性発毛現象を媒介するかどうかを検討した。実際、WTマウス（n = 8）と比較して、Spp1-/-マウスでは、創傷後11日目（n = 7）の5mm創傷縁のanagen HFが有意に少なかった（図3k）。WTマウスでは、SPP1浸漬ビーズを皮内注射した12日後に、BSA浸漬コントロールビーズ（各n = 5）と比較して、異所性anagenが顕著に誘導された（図3l）。さらに、P42からドキシサイクリンで誘導したTyr-rtTA;tetO-Spp1マウスでは、早発性anagenがP54までに活性化された。Tyr-rtTA;tetO-Spp1マウスは、ドキシサイクリンを投与した対照マウスが休止期のままであったのに比べ、幅広いanagenの活性化を示した（n = 3匹ずつ）（図3m,n）。したがって、SPP1は新しい毛髪の成長を誘導するのに十分であり、メラノサイト母斑と創傷治癒という少なくとも2つの皮膚状態において、毛髪成長の活性化を媒介する。

CD44はオステオポンチン効果を媒介する
SPP1は、その同族レセプターへの異なる結合部位を介してシグナルを伝達する： β-インテグリンとCD44（CSPG8としても知られている）である。このうちCD44は、いくつかの癌種において確立された幹細胞マーカーであり、増殖、浸潤、放射線抵抗性を促進する28。SPP1は、RNA-seqでバルジSCに濃縮されたCD44vアイソフォームに優先的に結合する（Extended Data Fig.） SPP1に応答して、CD44はγセクレターゼによるタンパク質分解切断を受け、核内標的化細胞内ドメイン（CD44-ICD）を遊離し、HIF1A、EPAS1、EP300、CREBBPを活性化して遺伝子発現を制御する28。CD44-ICDシグナルの直接下流標的29であるMmp9は、Tyr-NrasQ61KバルジSCで最も発現が上昇した遺伝子の一つであり（Extended Data図6cおよび9b）、バルジSCではすべてのγセクレターゼサブユニットおよびCD44-ICD結合転写因子が高発現している（Extended Data図9c,d）。

我々は、CD44が母斑における毛成長亢進を媒介するかどうかを調べた。以前のシングルセルRNA-seqプロファイリングと一致して、CD44はコントロールマウスとTyr-NrasQ61Kマウスの両方で、バルジSCを含むHF27のすべての上皮コンパートメントにわたって顕著に発現していた（図4aおよび拡張データ図9e）。タンパク質レベルでは、Tyr-NrasQ61KマウスとTyr-CreERT2;BrafV600Eマウスの両方で、バルジSCにおいてSPP1はCD44と共局在していた（図4c,d）。次に、Cd44の欠失がバルジSCの存在量と増殖能を低下させるかどうかを検討した。CD34+CD49f+バルジSCの総数、あるいはEdUパルス7日後のEdU標識サブセットの割合は、生殖細胞系Cd44-/-変異マウス対コントロールマウス（各n＝3）（Extended Data図9f,g）でも、上皮特異的構成K14-Cre;Cd44fl/fl変異マウス対コントロールマウス（各n＝3）（Extended Data図9i,j）でも有意な変化はなかった。また、Cd44-/-マウスおよびK14-Cre;Cd44fl/flマウス対対照動物（各n = 6）の両方で、選別されたバルジSCによるin vitroでのコロニー形成能は変化しなかった（Extended Data Fig.）したがって、CD44の欠損だけではバルジSCの主要な特性は損なわれない。次に、CD44の機能がSPP1に対するHF反応に必要であるかどうかを調べた。実際、SPP1浸漬ビーズに対するanagen誘導は、Cd44-/-マウスでは対照マウスに比べて有意に抑制された（n = 5ずつ）（図4e）。同様に、Cd44-/-変異マウス（n = 5）では、対照マウス（n = 6）に対して、創傷縁に誘導されたanagen HFが有意に少なかった（図4f）。さらに、Tyr-NrasQ61K;Cd44-/-マウスにおけるCd44欠失は、異所性ヘアサイクルのレスキューにつながり、Tyr-NrasQ61KバックグラウンドにおけるSpp1欠失の効果を表現コピーした（図4g-iおよびExtended Data Fig.）ビーズ浸漬実験におけるSPP1応答性の消失は、K14-Cre;Cd44fl/flおよびタモキシフェン誘導K14-CreERT;Cd44fl/flマウスにおける上皮特異的Cd44欠失でも再現された。SPP1を投与したコントロールマウス（n = 4ずつ）と比較して、誘導されたanagen HFの数は、K14-Cre;Cd44fl/fl（n = 6）（図4j）および誘導K14-CreERT;Cd44fl/fl（n = 3）マウス（図4k）の両方で有意に減少した。したがって、母斑皮膚におけるSPP1の発毛活性化作用には、上皮CD44シグナル伝達が必要である。

図4：SPP1の発毛促進効果はCD44に依存する。
図4
a,b,WTコントロールマウス（a）とTyr-NrasQ61Kマウス（b）の両方の上皮性HF細胞はCD44を強く発現していた。c,d,Tyr-NrasQ61K（c）およびTyr-CreERT2;BrafV600E（d）の皮膚におけるSPP1とCD44の共染色では、SPP1シグナルが共局在するCD44+バルジ細胞に隣接する真皮細胞のSPP1高発現クラスターが弱く認められた（黄色の矢印）。e,Cd44-/-マウスは、WTマウスと比較して、SPP1浸漬ビーズに対するアナゲン活性化が有意に減少した。n = 5; P = 0.00938. f, Cd44-/-マウスはWTマウスと比較して、創傷による毛髪の成長が減少した。g,h,Cd44を欠損したTyr-NrasQ61K;CD44-/-マウスは、ヘアサイクルの休止期をレスキューした。P44では、Tyr-NrasQ61K;Cd44-/-HFは協調的な休止期にあった（g）。i,Tyr-NrasQ61K対Tyr-NrasQ61K;Cd44-/-マウスにおけるanagen HFの定量。二重変異体はP44とP52で異所性anagenの減少を示した。j,k,構成的上皮特異的K14-Cre;Cd44fl/fl(j)およびタモキシフェン誘発K14-CreERT;Cd44fl/fl(k)マウスは、コントロールマウスと比較して、SPP1浸漬ビーズに対するアナゲン活性化が有意に減少した。代表的なサンプル（左）と定量（右）を示す。jでは、コントロールではn=4、変異体ではn=6；P=0.0352。kでは、コントロールではn=4、誘発突然変異体ではn=3；P=0.0476。e,f,i-kにおいて、nは生物学的に独立したサンプルを指す。P値は対応のない両側スチューデントのt検定を用いて計算した。*P≦0.05、**P≦0.01。スケールバー、50μm（c,d）、100μm（a,b）、200μm（組織学、g,h）、300μm（j,k）、500μm（e,f）、1mm（ホールマウント、g,h）。

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ヒト毛母斑はオステオポンチンをアップレギュレートする
ヒトの先天性毛母斑のシグナル伝達についても調べた。全組織RNA-seqにより、先天性有毛母斑と隣接する正常顔面皮膚との間に顕著な差異があること、および患者間でばらつきがあることが明らかになった（図5a、拡張データ図9n,oおよび補足表5）。母斑はメラニン生成遺伝子BCAN、GPR143、MITF、MLANA、MLPH、PMEL、SOX10、TRP2、TYR、TYRP1に濃縮を示し、Tyr-NrasQ61Kマウスのデータと一致した、腫瘍抑制遺伝子CDKN2A、GAS5、LZTS1、MIA、および有糸分裂マーカーANKRD53、MAD1L1、NEK6、PSRC1をアップレギュレートした。分泌因子の中で、母斑はSPP1、いくつかのTGFβ/BMPメンバーであるGDF1/10/11/15およびBAMBI、WNTモジュレーターであるDKKL1、FRZB、さらにCCL18、IL17DおよびPDGFDを発現していた（図5b）。SPP1は、患者間で一貫してヒト毛母斑とTyr-NrasQ61Kマウスメラノサイトの間で共有される発現上昇型分泌因子であり（Extended Data図9p）、逆転写による定量的PCR（qRT-PCR）（図5c）と免疫染色（図5d-h）によって検証された。SPP1の発現は、HFのバルジ領域を取り囲むTRP2+（図5e）またはSOX10+メラノサイト（図5f）の真皮クラスターで顕著であった。最後に、アルビノヌードマウスまたは色素沈着SCID宿主マウス8を用いて、ヒト頭皮のHFに対するSPP1の発毛誘導効果を調べた。休止期HFの隣の皮膚に、SPP1または生理食塩水を1日3回投与した。コントロール（n = 7）と比較すると、SPP1（n = 11）はヒトHFのanagen進入を促進し、マウスHFのanagen進入を伴うこともあった（図5i,j）。我々は、SPP1がヒトの母斑メラノサイト由来の毛成長活性化因子であると結論づけた。

図5：ヒト母斑にはSPP1に富むセクレトームが存在する。
図5
a, バルクRNA-seqにより、ヒトの毛母斑と隣接する正常顔面皮膚との間に顕著な違いがあることが明らかになった。主成分分析プロットを示す。b,ヒトの母斑と正常皮膚で発現が異なる、選択されたアップレギュレート（2倍以上；緑）およびダウンレギュレート（2倍以上；赤）遺伝子。太字と下線の遺伝子はqRT-PCRによって検証された。c, バルクRNA-seqデータから選択された差次的発現遺伝子のqRT-PCR。正常皮膚では、TRP2+メラノサイトはSPP1を発現しなかったが（d）、母斑皮膚では、TRP2+SPP1+細胞のクラスターがHFバルジ領域の隣に見られた（e）。母斑皮膚では、HFバルジ領域の隣にSOX10+SPP1+細胞のクラスターが見られた。g,h, SPP1とKRT5の共染色。正常皮膚（g）とは異なり、ヒト母斑皮膚（h）ではHFの隣にSPP1+細胞クラスターが見られた。 i,j, SPP1マイクロインジェクションはヒト頭皮HFの早発成長を誘導した（矢印）。移植後50日目のヒトHFの代表的なサンプル（i）と、anagenのヒトHFの定量化（j）を示す。jでは、コントロールではn = 7、SPP1ではn = 11; P = 0.00034。cにおいて、nは独立した実験を示す。jにおいて、nは生物学的に独立したサンプルを指す。P値は、対応のない両側スチューデントのt検定を用いて計算した。**P ≤ 0.01. スケールバー、100μm（d-h）および1mm（i）。

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考察
この研究では、メラノサイト系皮膚母斑がどのようにして過剰発毛を起こすかを研究し、その結果、老化細胞が組織に常在するSCを顕著に活性化し、再生を刺激することを発見するに至った。従来、老化細胞が組織に蓄積することは、組織の再生能にとって有害であると考えられてきた。このシナリオは、自然な老化、病的な老化の促進、あるいは遺伝毒性への曝露の際に展開される4。老化細胞の広範な蓄積は、部分的にはSCの直接的な除去（つまり、多くのSCが老化し、その結果、増殖しなくなる）により、また部分的にはサイトカインリッチセクレトーム（つまり、SASP）の過剰な活性化により、組織の再生能力を低下させる17。SASP因子は低グレードの炎症に似た状態を引き起こし、これが持続すると組織の線維化を引き起こす。一方、老化細胞を選択的に死滅させる薬剤である抗老化薬は、加齢に関連した病態に対する有望な治療薬の候補として浮上している31。

しかしながら、最近の証拠は、老化細胞が組織の成長に別の有益な効果をもたらすことを指し示している。老化細胞は、マウスの発育中の四肢の先端外胚葉隆起を含む多くの胚組織で形成される18。このような "発生的 "老化細胞は、非生存胚細胞を取り囲んで成長を指示すると考えられるシグナル伝達因子を分泌する。老化していない成体組織でも、傷害を受けると老化細胞が頻繁に出現し、SASP因子が修復を促進する。このようなシナリオは、ゼブラフィッシュのヒレ切断32、運動誘発または心毒素誘発骨格筋損傷33,34、外科的肝臓切除35、切除皮膚創傷20の後のマウスで観察されている。腫瘍では、がん発生細胞による過剰な増殖は、隣接する老化細胞からのパラクリンシグナルの刺激に依存している可能性がある。老化細胞は、がん関連間質細胞21,22の間で形成されることもあれば、がん細胞系自体の中で形成されることもあり、がん原性突然変異（OISメカニズム）や遺伝毒性抗がん療法（DNA損傷誘発性老化）36によって誘発されることもある。上記の例は、細胞老化プログラムのパラクリン成分が、組織成長促進メカニズムの一部として一般的に使用されていることを示している。私たちが皮膚母斑で報告した毛髪の過剰成長のメカニズムは、老化細胞の成長促進特性を例証するものである（Extended Data Fig.10）。補足的考察1では、老化細胞の組織成長促進作用に必要な条件と、毛母斑モデルから得られた知見について述べている。

毛母斑が、老化細胞が毛母斑に及ぼす影響の典型的な例であるかどうかは、まだ分かっていない。実際、動物モデルや、老化細胞の負担が増加した人（高齢、早老症、放射線や化学療法を受けた人）では、毛髪の成長が促進されるのではなく、むしろ減少するのが一般的である。毛髪の過剰成長は、平滑筋過誤腫の代表的な臨床症状でもある。平滑筋過誤腫は、皮膚平滑筋細胞におけるOIS活性化突然変異によって引き起こされる、先天性または後天性の良性母斑様疾患である37。同時に、ケラチノサイトがOIS活性化変異を持つ脂腺母斑は、毛髪の過剰成長を認めないが、その代わりに皮脂腺の過剰な肥大を特徴とする38。われわれは、老化の組織レベルでの正確な結果（例えば、毛髪の成長と皮脂腺の肥大）は、SASPの正確な分子組成に依存し、その分子組成は、老化する細胞の元々の系統、老化誘導メカニズム、そしておそらく他の要因に依存すると仮定している。SASPの組成がおそらく不均一であることは、老化細胞分泌物に関する他の最近の研究から得られた分子データによっても強く支持されている（補論2に総説あり）。

SPP1は老化した真皮メラノサイトから分泌される主要なSASP因子で、発毛を強力に誘導する。SPP1はまた、老化したがん関連線維芽細胞によって産生されるSASP因子の筆頭であり22、CD44を介したそのシグナル伝達は、がん細胞の幹細胞化、腫瘍増殖、放射線抵抗性を促進する28。我々は、SPP1の毛髪成長促進作用には、上皮細胞上の無傷のCD44レセプターも必要であることを示した。CD44結合部位を欠くSPP1配列ベースの合成ペプチドは、培養ヒトHFsにおいて上皮の増殖を促進しない39。このことから、SPP1やそのCD44結合誘導体のような選択的なSASP因子を脱毛に悩む皮膚に注射することで、毛髪の成長を刺激する治療法が将来期待される。このアプローチを支持する臨床例として、普遍性脱毛症を含む脱毛症患者の頭皮に脱毛抵抗性のメラノサイト母斑が報告されている40。

われわれの研究から、今後の研究が必要ないくつかの興味深い疑問が生じた。第一に、人のメラノサイト母斑がすべて有毛であるわけではなく、それはおそらく、老化細胞の成長促進効果に必要な条件をすべて満たしていないからであろう。有毛性ヒト母斑と非有毛性ヒト母斑を詳細に比較することで、おそらくこれらの控えめな組織状態の新たな細胞的・分子的多様性が明らかになるであろう。第二に、より頻繁に成長することに加えて、ヒト母斑の毛は太く長くなる。マウスの毛は終末化を受けることができないので、ヒト母斑の毛に関する今後の研究により、おそらくSASPのSC以外のHF細胞へのシグナル作用がさらに明らかになるだろう。第三に、活性化する癌遺伝子変異を持っているにもかかわらず、Tyr-NrasQ61KマウスとTyr-CreERT2;BrafV600Eマウスのメラノサイトは、HFの隣の真皮で老化するが、HF自体では老化しない。このことは、HF内の別個のシグナル微小環境が、OISメカニズムに効果的に対抗できることを示唆している。今後、メラノサイトが真皮内とHF内の他の細胞から受け取るシグナルを比較する研究が進めば、おそらく新たな老化防止経路が発見されるであろう。最後に、通常、メラノサイトはHFのSCと毛髪の成長タイミングの重要な調節因子ではない。したがって、老化の獲得は、ニッチでない細胞に新たなニッチ様特性を与える可能性がある。同様に、「プロフェッショナルな」ニッチ細胞（例えば、HFの毛乳頭線維芽細胞）が老化とSASPを獲得することで、新たな制御特性が付与される可能性もある。今後の研究では、腸や骨髄など、活発に更新する他の臓器においても、細胞の老化がSC機能に及ぼす同様の影響を追求すべきである。

結論として、毛母斑という特殊な、しかしあまり理解されていない皮膚病態に関する我々の研究から、組織常在老化細胞による成体SCの独特な制御機構が明らかになった。これらの知見は、毛母細胞のニッチ制御に関する理解を深め、再生疾患に対する新たな治療戦略を開発する上で、広範な意味を持つものである。

研究方法
実験モデルマウス
以下のマウス系統を用いた： Tyr-NrasQ61K, Tyr-rtTA, Tyr-CreERT2, Tyr(C-2J), BrafV600E, Trp53flox, Spp1-/-, Spp1flox, tetO-Spp1, Cd44-/-, Cd44flox, K14-Cre, K14-CreERT, K14-H2B-GFP, K14-Edn3, K14-Kitl, tdTomato, TOPGAL, NudeおよびSCID。組織特異的マウスモデルは、Cre保有動物またはCreER保有動物とflox-ed遺伝子保有動物の交配、またはrtTA保有動物とtetO保有動物の交配によって作製した。すべての動物実験は、関連するすべてのガイドラインおよび規制に従い、中国農業大学のInstitutional Animal Care and Use Committee（Z.Y.へ）および／または岐阜大学のAnimal Care Committee（T.K.へ）および／または国立台湾大学のAnimal Care and Use Committee（C.-H.K.へ）の承認を得た。 H.K.へ）、および／またはカリフォルニア大学アーバイン校（B.A.および／またはA.K.G.および／またはM.V.P.へ）、および／または中南大学（J.L.へ）、および／または慶福国立大学（J.W.O.へ）の動物取扱委員会（Institutional Animal Care and Use Committee）。

マウス誘導プロトコール
Tyr-rtTA;tetO-Spp1マウスにおいて、2 mg ml-1 doxycycline hyclate (Sigma)を5%スクロースに溶解し、ドキシサイクリン含有飼料（Bio-Serv, 200 mg kg-1）を自由摂取させることにより、メラノサイトにおけるSPP1のテトラサイクリン制御過剰発現を達成した。CreER遺伝子保有動物およびflox-ed遺伝子保有動物では、75 mg kg-1の用量のコーン油中タモキシフェン（Sigma）を腹腔内注射することにより、条件付き遺伝子組換えを誘導した。P2動物では、DMSO中の(Z)-4-ヒドロキシタモキシフェン(4-HT; Sigma)を75 mg ml-1で局所投与することにより、条件付き遺伝子組換えを誘導した。

EdUパルスおよびパルスチェイスアッセイ
マウスにEdU（5μg g-1体重）を毎日7日間連続腹腔内注射し（パルス期間）、その後8週間追跡した。採取した皮膚の一部をEdUイメージングキット（Thermo Fisher）を用いて組織学的に検査した。残りの皮膚部分は、EdUフローキット（Thermo Fisher）を用いたフローサイトメトリーによる定量に用いる細胞の分離に用いた。トリプル陽性のCD34+CD49f+EdU+細胞を用いてEdU+バルジSCを定量した。

タンパク質注入手順
タンパク質浸漬アガロースビーズの皮内投与は、以前に記載された通りに行った8,11。簡単に説明すると、組換えSPP1タンパク質（441-OP、R&D）を0.1％BSAで再構成し、最終濃度を1.3mg ml-1とした。アフィ-ゲルブルービーズ（Bio-Rad）を滅菌PBSで3回洗浄し、風乾した後、再構成タンパク質溶液に再懸濁した。ビーズは移植前に氷上で1時間インキュベートした。リコンビナントタンパク質とBSAの両コントロールについて、ビーズをP51-P53動物の皮内に移植した。ビーズ移植部位には24、48、72時間後に追加タンパク質を補給した。

皮膚創傷処置
マウスを剃毛し、皮膚を消毒薬で洗浄した。手術はイソフルラン持続麻酔下で行った。皮膚生検パンチを用いて、下層の筋膜を傷つけることなく全層切除創を形成した。マウスには術後鎮痛剤としてケトプロフェンを皮下投与し、その後アセトアミノフェンを飲水投与した。

フローサイトメトリーおよびFACS法
背部皮膚をDispase II溶液（Roche）、次いでコラゲナーゼI溶液（Life Technologies）で単一細胞に消化した。細胞をまず70μM、次に40μMのストレーナーで濾過した。死細胞を除くためにバイアビリティ色素（BioLegend）を用いた。細胞懸濁液をFACS染色バッファー（2mM EDTAを含むPBS中1％BSA）中、ソート前に氷上で30分間、一次抗体で染色した。以下の抗体を用いた：マウス抗γH2AX（1:100; 564718, BD Biosciences）、マウス抗TRP2（1:50; sc-74439 AF647, Santa Cruz Biotechnology）、ラット抗Ki67（1:50; 58-5698-82, Thermo Fisher）、ラット抗CD117（1： 100; 105812, BioLegend）、ラット抗CD45（1:50; 103108, BioLegend）、ラット抗CD34（1:50; 560230, BD Biosciences）、ラット抗CD49f（1:100; 555736, BD Biosciences）、ウサギ抗SPP1（1:100; 702184, Thermo Fisher）を用いた。細胞はFACSAria IIソーター（BD Biosciences）でソーティングし、フローサイトメトリー解析はLSRIIフローサイトメーター（BD Biosciences）で行った。データはFlowJoソフトウェア（バージョン10.8.0）を用いて解析した。SPP1タンパク質の発現は、透過化細胞（透過化条件）と非透過化細胞（表面結合条件）の両方の染色を用いて検出した。透過化条件下では、細胞内に存在するSPP1の総量を測定し、表面結合条件下では、レセプターに結合するなどして細胞表面に存在するSPP1を測定した。透過化には、細胞をPBSで洗浄し、100μlあたり100万個の細胞を再懸濁し、透過化バッファー加え、Fixation/Permeabilization kit（BD Biosciences）の説明書に従って細胞を染色した。

初代メラノサイト培養アッセイ
P0マウス皮膚からFACSでメラノサイトをCD117+CD45neg集団として精製した。選別された細胞は、完全な初代メラノサイト培地（RPMI1640、5％FBS、抗生物質-抗真菌剤、2.5ng l-1 塩基性ヒト線維芽細胞増殖因子、10μM エタノールアミン、1mg ml-1 インスリン、1μM O-ホスホエタノールアミン、5nM エンドセリン、25nM α-MSH、50ng ml-1 マウスSC因子）中で、37℃、5％CO2で培養された。

H2O2処理手順
培養皿またはチャンバースライドで培養したメラノサイトを、100 mMのH2O2（シグマ社製）またはビヒクル（254培地およびHMGS-2）で、37℃で2時間処理した。処理した細胞をPBSで2回洗浄した。

DiI標識手順
細胞をDiI色素（Thermo Fisher）で標識した。簡単に説明すると、細胞を、1mlあたり5μlの細胞標識溶液を添加した培養液中で、37℃で15分間インキュベートした。標識後、細胞をAccutase（Stemcell Technologies社製）で解離し、続いてPBSで2回洗浄した。

細胞注入手順
細胞を血球計数装置で数え、細胞培養液で1マイクロリットル当たり2,000個に希釈した。細胞懸濁液のうち10-50μlを、29Gの注射針を用いてレシピエントマウスの背部皮膚にゆっくりと皮内注射した。

移植手順
4～6個のanagen HFを含む皮膚マイクログラフトを、6～8週齢の雌性SCIDマウスまたはNudeマウスの背部皮膚に、既述8と同様に移植した。移植後30日目に、10μlの組換えタンパク質または生理食塩水を3日間連続でHF移植部位にマイクロインジェクションした。宿主マウスは移植後50日目に安楽死させ、皮膚をホールマウントで分析した。

ABT-737投与手順
マウスにABT-737（Cayman Chemical社製）またはビヒクルコントロールを75mg kg-1の用量で2回（P10およびP12日目）皮下注射した。

β-Gal染色
β-ガラクトシダーゼ染色では、厚切片（20 µm）を、1.3 mM MgCl2、3 mM K3Fe(CN)6および3 mM K4Fe(CN)6を加えたPBS中、1 mg ml-1 X-gal基質中で37℃で一晩インキュベートした。老化に関連したβ-gal染色では、キットを用いて細胞を染色した（Cell Signaling）。簡単に説明すると、細胞を製造元から提供された固定液で室温で15分間固定し、その後pH6.0の染色液を用いて酸性β-galを37℃で一晩検出した。

免疫組織化学染色
パラフィン包埋切片の場合、皮膚サンプルは4%（vol/vol）パラホルムアルデヒドで4℃で一晩固定した。組織切片をPBS+0.1% Triton X-100（PBST）で15分間透過処理し、PBST+3% BSAで室温で少なくとも1時間ブロックした。マウス抗体はM.O.M. block kit（Vector Laboratories）でブロックした。一次抗体は4℃で一晩インキュベートし、二次抗体は室温で1時間インキュベートした。以下の一次抗体を用いた：ウサギ抗γH2AX（1:300; 9718, Cell Signaling）、ウサギ抗TRP2（1:200; ab74073, Abcam）、ウサギ抗TRP2（1： 200；ab103463、Abcam）、マウス抗PCNA（1:1,000；ab29、Abcam）、ラット抗CD34（1:100；14-0341-82、Thermo Fisher）、ウサギ抗SOX9（1:200；AB5535、Millipore）、ヤギ抗SPP1（1： 100；AF808、R&D）、ヤギ抗SPP1（1:300；AF1433、R&D）、ウサギ抗KRT14（1:2,000；ab119695、Abcam）、ウサギ抗CD44（1： 100；PA5-94934、Thermo Fisher）、ウサギ抗SOX10（1:100；ab180862、Abcam）、ウサギ抗KRT5（1:1,000；905501、BioLegend）、ヤギ抗Pcad（1:200；AF761、R&D Systems）を用いた。以下の二次抗体を使用した：ロバ抗ラットAF555（1:1,000; ab150154, Abcam）、ロバ抗ウサギAF555（1:1,000; A31572, Thermo Fisher）、ロバ抗マウスAF555（1:1,000; A31570, Thermo Fisher）、ロバ抗ウサギAF488（1:1,000; A21206, Thermo Fisher）、ロバ抗ヤギAF488（1： 1:1,000；A11055、Thermo Fisher）、ヤギ抗ラットAF488（1:1,000；A11006、Thermo Fisher）、ヤギ抗ラビットAF488（1:1,000；4412s、Cell Signaling）、ヤギ抗マウスAF555（1:1,000；4409s、Cell Signaling）、ヤギ抗ラビットAF555（1:1,000；4413s、Cell Signaling）。

RNAscope染色
RNA 染色は、Multiplex Fluorescent v2 kit（Advanced Cell Diagnostics）を用いて行った。簡単に説明すると、皮膚をOCT化合物中で凍結し、12-15μmで切片化した。切片はPBS中4％パラホルムアルデヒドで1時間室温で固定し、標準的な製造業者のプロトコールに従った（Advanced Cell Diagnostics）。ハイブリダイゼーション用RNAプローブはAdvanced Cell Diagnostics社から購入し、Mm-Spp1（カタログ番号435191-C1）、Mm-Dct-C2（Trp2；460461-C2）、Mm-Cdkn2b（p15；458341-C1）、Mm-Cdkn2a（p16；411011-C1）、Mm-Mki67-C3（Ki67；416771-C3）およびMm-Aurkb（461761-C1）を含む。

ウェスタンブロットアッセイ
選別した単一のメラノサイトまたはマウス全背部皮膚からの細胞を、プロテアーゼ阻害剤のカクテル（Thermo Fisher）を含むRIPA緩衝液（Sigma）で溶解した。各細胞溶解液から25μgを12%分離Bis-Trisゲルにロードした。タンパク質をニトロセルロース膜に移した。膜を一次ヤギ抗マウスSPP1抗体（1:100; AF808, R&D）またはウサギ抗β-アクチン抗体（1:1,000; 4967, Cell Signaling）と2.5 μg ml-1の濃度でインキュベートした。ブロットは Enhanced Chemiluminescence Plus Developer（Fisher Scientific）で現像した。

ELISA法
細胞培養の上清中のSPP1濃度を、マウスOPN/SPP1 ELISAキット（Thermo Fisher）を用いて、製造者の説明書に従って測定した。簡単に説明すると、SPP1濃度は、0～2,000 pg ml-1で希釈した組み換えSPP1タンパク質から標準曲線を作成することにより算出した。マイクロプレートは、Synergy マイクロプレートリーダー（BIO-TEK）を用いて波長 450 nm で測定した。

リアルタイムPCRアッセイ
選別された細胞から、RNeasy Micro Kit（Qiagen）とそのオンカラムDNase消化プロトコルを用いて全RNAを抽出した。その後、オリゴdT存在下、Superscript III（Life Technologies社製）を用いて全RNAを逆転写した。全長cDNAは、ハウスキーピング遺伝子GAPDHまたは18Sを用いて等量に正規化した。プライマーは補足表6に示す。

コロニー形成アッセイ
K14-H2B-GFPマウスから選別したGFP発現HFバルジSCおよび毛胚葉前駆細胞を、マイトマイシンCで前処理して細胞周期停止を誘導した3T3線維芽細胞フィーダー層細胞にプレーティングした。細胞はカルシウムと抗生物質-抗マイコチンを添加したウィリアムズE培地で37℃で共培養した。培地は48時間後に交換し、さらに12時間培養して接着率を評価した。接着した細胞はコンフルエントになった時点で継代し、4～6日ごとに継代した。カルシウム添加培地は2-3日ごとに交換した。他の実験では、バルジSCをCD34+CD49f+細胞としてFACS選別し、マイトマイシンC不活性化3T3線維芽細胞の存在下、1平方センチメートルあたり1,000細胞の濃度で培養した。2週間後、0.5％クリスタルバイオレット（シグマ社製）溶液を水：メタノール＝1：1の割合で各培養ウェルに添加した。その後、染色したプレートを水ですすぎ、風乾し、画像化した。

ヒト皮膚サンプル
ヒト皮膚サンプルの採取は、関連するすべてのガイドラインおよび規制に従い、国立台湾大学病院の研究倫理委員会および／または国立慶福大学病院の医療倫理委員会および／または中央南大学仙谷病院の倫理委員会の承認を受け、中華人民共和国科学技術部（MOST）のガイドラインに準拠した。すべての参加者は、書面によるインフォームド・コンセントを提供した。ヒト研究参加者の特定可能な画像は示していない。

マウス組織のバルクおよびシングルセルRNA-seq
バルクRNA-seqでは、FACSで選別した細胞から、生物学的3連複でRNAインテグリティナンバーが9.1以上のtotal RNAを抽出し、1 ngのmRNAを全長cDNA合成に使用した後、Smart-seq2を用いてPCR増幅を行った。ライブラリーはIllumina Next-Seq500システムで、ペア43-bpリードを用いてライブラリーあたり平均1,000万～3,000万リードの深度でシーケンスした。

シングルセルRNA-seqでは、Fluidigm C1チップを用いて、製造元のプロトコールに従って細胞を捕捉した。チップのローディングには、200,000-350,000細胞/mlの濃度を使用した。細胞捕捉後、チップを顕微鏡下で目視検査し、捕捉率を決定し、空のチャンバーまたは複数の細胞が存在するチャンバーは解析から除外した。cDNAは、Clontech SMARTer Ultra Low RNAキットおよびADVANTAGE-2 PCRキット（Clontech社製）を用いて、Fluidigm C1 Single-Cell Auto Prep System上で合成・増幅した。Fluidigm C1のマニュアルに従い、96ウェルプレートでシングルセルRNA-seqライブラリーを構築した。マルチプレックスライブラリーはAgilent 2100 Bioanalyzerでフラグメント分布を解析し、Kapa Biosystemのuniversal library quantification kitを用いて定量した。ライブラリーはIllumina Next-Seq500プラットフォームで75-bpペアエンドリードとしてシーケンスした。

バルクRNA-seqとシングルセルRNA-seqの両方で、まずSTAR v.2.4.2aを用い、パラメータ'--outFilterMismatchNmax 10 --outFilterMismatchNoverReadLmax 0.07 --outFilterMultimapNmax 10'でリードをリファレンスマウスゲノム（mm10/genocode,vM8）にアライメントした。遺伝子発現レベルはRSEM v.1.2.25を用いて定量し、発現値は100万マップリードあたりの転写産物1キロベースあたりのフラグメント数（FPKM）で正規化した。1,000,000以上のユニークにマップされたリードを持ち、60%以上のユニークにマップされた効率を持つサンプルがダウンストリーム解析に使用された。発現差解析は、edgeR v.3.2.2を用いて、タンパク質コード遺伝子とロングノンコードRNAについて行った。差次的発現遺伝子は、fold change ≥ 2、false discovery rate < 0.05、counts per million reads ≥ 2で選択した。

ヒト組織のバルクRNA-seq
RNAは、Qiagen RNA抽出キットを用いて、ヒト毛母斑皮膚および母斑端の正常皮膚から抽出した。cDNAは、Superscript III First-strand synthesis system（Invitrogen）を用いて合成し、Agilent Bioanalyzerを用いて定量した。バルクRNA-seq解析は標準的なパイプラインを用いて行った。簡単に説明すると、ペアエンドRNA-seqリードはSTAT/2.5.1bを用いてヒト参照ゲノムhg38にアライメントした。遺伝子発現はRESM/1.2/25を用いて測定し、発現値はFPKMに正規化した。

シングルセルデータ解析
すべてのシングルセルデータ解析において、低品質細胞をフィルターで除外し、細胞特有のバイアスを排除するために同じ正規化を行った。各細胞について、発現遺伝子数、転写産物の総数、ミトコンドリア遺伝子の転写産物の割合という3つの品質管理指標を計算した。単細胞データマトリックスを列正規化（転写産物の総数で割って10,000倍）し、擬似カウント+1で対数変換した。

バルジSCのシングルセルRNA-seqデータについては、P30 WT、P56 WTおよびP56 Tyr-NrasQ61Kサンプルの細胞を組み合わせ、複数のEnsembl IDを持つ遺伝子の発現を平均した。品質管理のため、TPM数の合計が750,000未満、ミトコンドリア遺伝子のTPM数の割合が20%以上、発現遺伝子数が7,000以上2,000未満の細胞を除去した。まとめると、20個の細胞が除去され、下流の解析には256個の細胞が用いられた。細胞のクラスタリングは、Seurat Rパッケージ（V2.3）を用いて行った。主成分分析（PCA）はまず、平均発現が0.01以上、分散が1以上の変動性の高い遺伝子を用いて行った。Jackstraw法（JackStraw関数）に基づき、上位17個のPCを選択した。これらのトップPCを用いて、Louvain modularity-based community detection algorithmを用いて、分解能1.1の細胞クラスターを求め、5つのクラスターを得た。尤度比検定を用いてクラスター間の遺伝子発現差解析を行った。P値が0.01より小さく、log fold changeが0.25より大きい遺伝子を差次的発現とみなした。細胞を2次元空間に可視化するために、t-distributed stochastic neighbour embeddingを行った。細胞クラスターの関連性は、変動性の高い遺伝子を用いて、細胞クラスターの平均遺伝子発現の教師なし階層クラスタリングを行うことで決定した（相関距離指標と平均連結）。各細胞の細胞周期フェーズを決定するために、43個のG1/S遺伝子と54個のG2/M遺伝子のコアセットを含む細胞周期関連遺伝子を用いた。各細胞について、SeuratのCellCycleScoring機能を用いて、これらの細胞周期関連遺伝子の発現に基づいて細胞周期フェーズ（G1、S、G2/M）を割り当てた。

統計と再現性
マウス実験ではサンプルサイズの計算は行わなかったが、n = 3は標準的な最小サンプルサイズであり、我々の以前の研究では、マウスの毛髪成長の変化を評価するのに十分であることがわかった。動物実験におけるグループサイズは、予備実験データに対して行われた検出力分析から導き出された。雌雄両方の動物を使用し、解析は雌雄別には行わなかった。動物の年齢はすべての実験で生後日数で定義した。統計解析は、対にならない片側または両側（図の凡例で定義）のStudentのt検定を用いて行った。図中のすべての棒グラフにおいて、エラーバーは平均値±s.d.である： P≧0.05（有意ではない）、*P≦0.05、**P≦0.01；正確なP値は図の凡例に記載されている。補足表1、3、4、5に報告されているRNA-seqデータの差次的発現遺伝子解析は、edgeRパッケージを用いて行った。遺伝子発現をグループ間で比較する場合、負の二項モデルをフィッティングし、分散を計算した後、P値計算のために正確検定（exactTest()関数、両側）を行った。P値はBenjamini and Hochbergの手法を用いて、偽発見率出力で調整した。補足表1、3、4、5で報告されている遺伝子オントロジー用語については、Metascapeを用いて解析を行った。P値は超幾何検定を用いて計算し、Benjamini and Hochberg補正を用いて調整した。正確なP値は上記の表に報告されている。すべての実験は独立に3回以上繰り返され、同様の結果が得られた。顕微鏡写真で示した代表的な実験の独立反復回数は以下の通りである： Fig. 1c (n = 3), Fig. 1d (n = 5), Fig. 1e (n = 3), Fig. 1k (n = 5), Fig. 2j (n = 3), Fig. 3g (n = 5), Fig. 4a-d (n = 3 each), Fig. 5d-h (n = 3 each), Extended Data Fig. 1c（n=6）、拡張データ Fig.1e（n=7）、拡張データ Fig.1j,k（各n=3）、拡張データ Fig.2a（n=4）、拡張データ Fig.2d（n=4）、拡張データ Fig.3j（n=4）、拡張データ Fig.3k（n=4）、拡張データ Fig. 4a（n=5）、拡張データFig.4l（n=3）、拡張データFig.5a（n=6）、拡張データFig.5f-j（n=各3）、拡張データFig.6a,b（n=各3）、拡張データFig.7i（n=3）、拡張データFig. 8a-c（n=各4）、拡張データ図8d（n=3）、拡張データ図8e（n=5）、拡張データ図8f（n=5）、拡張データ図8g（n=4）、拡張データ図9e（n=3）、拡張データ図9l,m（n=各3）。実験は、特記した場合を除き、無作為化せず、盲検下で行った。

模式図
回路図はAdobe Illustratorで作成した。

報告概要
研究デザインに関する詳しい情報は、この論文にリンクされているNature Portfolio Reporting Summaryを参照されたい。

データの利用可能性
マウスのバルクRNA-seqデータはGSE111999に、マウスのシングルセルRNA-seqデータはGSE112722に、ヒトのバルクRNA-seqデータはGSE112219にある。処理されたバルクRNA-seqおよびシングルセルデータは、補足表1-5に記載されている。プライマー配列は補足表6に掲載。メインおよび拡張データ図のすべてのグラフのソースデータは、本論文で提供されている。すべてのゲルとブロットの完全版は補足図1に掲載されている。シーケンシャルゲーティングストラテジーを補足図2に示す。ソースデータは本論文に掲載されている。

コードの利用可能性
カスタムコードは使用していない。ソースデータは本論文に掲載されている。

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参考文献のダウンロード

謝辞
M.V.P.は、LEO財団助成金LF-AW-RAM-19-400008およびLF-OC-20-000611、チャン・ザッカーバーグ・イニシアチブ助成金AN-0000000062、W.M.ケック財団助成金WMKF-5634988、NSF助成金DMS1951144、NIH助成金U01-AR073159、R01-AR079470、R01-AR079150、R21-AR078939およびP30-AR075047の支援を受けている。NSF助成金DMS1763272およびSimons財団助成金（Q.N.に594598）、California Institute for Regenerative Medicine SRL助成金CL1-00520-1.2、S. Seguraからの無制限贈与による追加支援。B.A.はR01-AR044882の支援を受けている。A.K.G.はU54-CA217378およびR01-CA244571の支援を受けている。J.D.E.はR61/33-AR073031の支援を受けている。Xiaojie Wangは、CIHRポスドク研究員奨学金（MFE-123724）およびカリフォルニア大学アーバイン校NSF-Simon Center for Multiscale Cell Fate Researchフェローシップの支援を受けている。E.N.G.はNSF GRFP助成金DGE-1321846の支援を受けている。J.L.は、中国国家自然科学基金（91749114）、中国国家自然科学基金（81773351）、国家自然科学基金特別青年研究員（82225039）の主要研究計画研修プログラムの支援を受けている。H.-L.L.はNIHトレーニンググラントT32-CA009054の支援を受けている。Y.L.は、中国政府の奨学金およびカリフォルニア再生医療研究所の研修助成金（EDUC4-12822）による臨床フェローシップの支援を受けている。図1aの画像はS. Liberの許可を得て転載した。

著者情報
著者および所属
米国カリフォルニア大学アーバイン校発生・細胞生物学科

Xiaojie Wang, Raul Ramos, Kosuke Yamaga, Shan Jiang, Chen-Hsiang Kuan, Truman Kt Nguyen, Heidi Y. Liang、Nitish Udupi Shettigar、Renzhi Hou、Kevin H. Tran、Andrew Nguyen、Kimberly N. Vu、Jennie L. Phung、Jonard P. Ingal、Katelyn M. Levitt、Xiaoling Cao、Yingzi Liu、Christian F. Guerrero-Juarez、Rabi Murad、Hye-Lim Lee、Ali Mortazavi、Qing Nie & Maksim V. Plikus

スー＆ビル・グロス幹細胞研究センター、カリフォルニア大学アーバイン校、カリフォルニア州、米国

Xiaojie Wang、Raul Ramos、Kosuke Yamaga、Chen-Hsiang Kuan、Truman Kt Nguyen、Heidi Y. Liang、Nitish Udupi Shettigar、Renzhi Hou、Kevin H. Tran、Andrew Nguyen、Kimberly N. Vu、Jennie L. Phung、Jonard P. Ingal、Katelyn M. Levitt、Xiaoling Cao、Yingzi Liu、Vanessa M. Scarfone、Guangfang Wang、Kara Nicole Paolilli、Xiaoyang Wang、Christian F. Guerrero-Juarez、Lily Halida Putri Widyastuti、Hye-Lim Lee、Bogi Andersen & Maksim V. Plikus。

米国カリフォルニア大学アーバイン校NSFサイモンズ・マルチスケール細胞運命研究センター

王暁潔、ラウル・ラモス、侯仁芝、Christian F. Guerrero-Juarez、Bogi Andersen、Qing Nie & Maksim V. Plikus

糖鎖生物学研究トレーニングセンター、細胞分子医学部門、カリフォルニア大学サンディエゴ校、ラホヤ、カリフォルニア州、米国

アン・Q・ファン & ジェフリー・D・エスコ

米国カリフォルニア大学アーバイン校生物化学科

ジェシカ・L・フレッシャー、ソハイル・ジャヒッド、エリシー・ノエラニ・グリーンバーグ、ロランド・ルイズ＝ヴェガ、プリヤ・ヴァスデーヴァ、ボギ・アンダーセン、アナンド・K・ガネサン

米国カリフォルニア大学アーバイン校複雑生物システムセンター

Shan Jiang、Christian F. Guerrero-Juarez、Rabi Murad、Ali Mortazavi、Qing Nie & Maksim V. Plikus

延世大学医学部解剖学教室（韓国・ソウル

オ・ジウォン

韓国、大邱広域市、キョンプク国立大学病院、解剖学教室および毛髪移植センター

オ・ジウォン

米国カリフォルニア大学アーバイン校数学科

スオキン・ジン、クリスチャン・F・ゲレロ＝ジュアレス、チン・ニー

中国・武漢・武漢大学数理統計学院

金素琴

台湾、台北、国立台湾大学病院外科、形成外科部門

關晨祥

国立台湾大学発生・再生医学研究センター（台湾・台北

チェン・シアン・クアン

アンプリフィカ・ホールディングス・グループ（米国カリフォルニア州サンディエゴ

ニティシュ・ウドゥピ・シェティガー＆マクシム・V・プリクス

中国・長沙、中南大学湘雅病院皮膚科

劉英子、鄧志利、李智

岐阜大学大学院医学系研究科組織・臓器発生・再生・先端医療学講座

田口信彦・國定隆宏

カリフォルニア大学アーバイン校生理学・生物物理学教室（米国・カリフォルニア州

ライアン・T・デイヴィス & デヴォン・A・ローソン

英国・ブラッドフォード大学皮膚科学センター

ケビン・J・マッケルウィー

フランス、ペサック、ボルドー大学、INSERM U1034、心血管系の虚血への適応

アラン＝ピエール・ガドー

米国カリフォルニア大学アーバイン校医学部

ボギ・アンダーセン

中国農業大学生物科学学院家畜生物育種国家重点実験室（中国・北京

ジンクワン・ユー

カリフォルニア大学サンディエゴ校医学部薬理学・病理学・遺伝子制御・シグナル伝達研究室（米国カリフォルニア州ラホヤ

マイケル・カリン

ウルム大学比較分子内分泌学研究所（CME）、ヘルムホルツシュトラーセ8/1、ウルム、ドイツ

ヤン・タッカーマン

ライプニッツ老化研究所・フリッツ・リップマン研究所（ドイツ・イエナ、ボイテンベルクシュトラーセ11番地

ヤン・タッカーマン

カリフォルニア大学皮膚科（米国カリフォルニア州アーバイン

アナンド・K・ガネサン

中国・長沙、中南大学湘雅病院、湖南省加齢生物学重点実験室

ジ・リー

貢献
M.V.P.は本論文の筆頭著者であり、プロジェクトを監督した。Xiaojie WangとM.V.P.が原稿を執筆し、図表を作成した。王小傑、R.R.、A.Q.P.、T.K.N.、N.U.S.、H.Y.L.、A.N.、K.N.V.、J.L.P.、K.H.T.、K.M.L.、N.T.、K.N.P.、C.F.G.-J.、L.H.P.W.、X.C.、J.W.O.、H.-L.L.はトランスジェニック動物実験を実施した。Xiaojie Wang、S. Jiang、S. Jin、R.T.D.、R.M.、J.L.がRNA-seq解析を実施。Xiaojie Wang、Xiaoyang Wang、J.L.F.、V.M.S.、G.W.が細胞培養とコロニー形成アッセイを実施。王暁潔、K.Y.、E.N.G.、R.R.-V.、S.JahidおよびP.V.はウェスタンブロットおよびタンパク質アッセイを実施した。Xiaojie Wang、J.P.I.、C.-H.K.およびR.H.がRNAscopeアッセイを実施した。Y.L.、Z.D.、J.W.O.、C.-H.K.およびJ.L.はヒトアッセイを実施した。A.-P.G.、T.K.、M.K.およびJ.T.は重要な助言を提供した。M.V.P.、J.W.O.、C.-H.K.、D.A.L.、Z.Y.、T.K.、J.D.E.、A.K.G.およびJ.L.は実験を監督した。M.V.P.とQ.N.はRNA-seqデータ解析を監修した。K.J.M.、D.A.L.、B.A.、A.M.、Q.N.、T.K.、J.D.E.およびA.K.G.が論文を編集した。

共著者
Xiaojie WangまたはMaksim V. Plikusまで。

倫理申告
競合利益
M.V.P.は、カリフォルニア大学アーバイン校が出願した特許の発明者であり、発毛を促進するための老化性分泌物因子の使用について述べている。M.V.P.はまた、アンプリフィカ・ホールディングス・グループ社の共同設立者兼最高科学責任者でもある。N.U.S.はアンプリフィカ・ホールディングス・グループ社に勤務している。その他の著者は、競合する利害関係がないことを表明している。

査読
査読情報
Nature誌は、本著作の査読に貢献したMaria Kasper氏とその他の匿名の査読者に感謝する。

追加情報
出版社注：Springer Natureは、出版された地図の管轄権の主張および所属機関に関して中立を保っています。

図表
Extended Data 図1 母斑マウスモデルは異所性発毛を示す。
a-h,調査したすべての出生後の時点で、Tyr-NrasQ61Kマウスは異所性のanagen HFを示した。WTコントロールマウスでは、HFはP15日目の第1休止期（a）；P23の第1休止期（b）；P36の第2休止期（c）；P44の拡張第2休止期（d）、P56（e）、P62（f）、P69（g）；およびP100の第3休止期（h）にある。対照的に、上記のすべての時点において、Tyr-NrasQ61Kの皮膚は多くの異所性anagen HFを含んでいた（緑色の矢頭）。各時点について、代表的なホールマウント（左）および組織学的サンプル（右）を示す。 i, WTコントロールマウス（上）およびTyr-NrasQ61Kマウス（下）における、指定した時点（中）でのヘアサイクルの状態を模式的に示す。j, アルビノTyr-NrasQ61Kマウス（アルビノTyr(C-2J)バックグラウンドに交配）は、P56（左）とP100（右）の両方で異所性毛成長表現型（緑矢印）を維持している。k,P2-4でタモキシフェンを誘導したTyr-CreERT2;BrafV600Eマウスは母斑を形成し、異所性発毛を示した。調査したすべての出生後の時点（P44、P69、P100）において、誘導Tyr-CreERT2;BrafV600Eマウスの背部皮膚には、多くの異所性anagen HF（緑色の矢頭）が認められた。一方、誘導コントロールマウスの上記時点のHFは休止期であった。各時点について、代表的なホールマウントおよび組織学的サンプル（Tyr-CreERT2;BrafV600Eマウス）を示す。また、Extended Data Fig. スケールバー、a-h, j (ホールマウント) - 1 mm; k (ホールマウント) - 500; a-h, j, k (組織学) - 200 μm。

Extended Data Fig. 2 母斑メラノサイトは発毛を活性化するのに十分であるが、正常なメラノサイトは活性化しない。
a, 対照マウスの皮膚と比較して、P21-25にタモキシフェンで誘導したP69 Tyr-CreERT2;BrafV600Eマウスの皮膚は、HFのバルジ領域の隣の真皮上部にTrp2+/p15+/Ki67negメラノサイトのクラスターを含んでいた。b, c, コントロールマウスの皮膚と比較して、P21-25で誘導されたP69 Tyr-CreERT2;BrafV600Eマウスの皮膚は、TRP2+/Ki67negメラノサイト（b）およびTRP2+/γH2AX+メラノサイト（c）を有意に多く含んでいた。左-代表的なサイトメトリープロット、右-定量。bではn = 3; P = 0.00239。d,コントロールマウスの皮膚（左）と比較して、Tyr-NrasQ61Kマウス（中央）とTyr-CreERT2;BrafV600Eマウス（右）の皮膚は、HFのバルジ領域の隣の真皮上部にTrp2+/p16+/Ki67negメラノサイトのクラスターを含んでいた。b, cでは、n = 独立した実験。P値は、対応のない両側Student's t-testを用いて計算した。**P ≤ 0.01. スケールバー、d-50μm；a-100μm。

出典データ

Extended Data 図3 母斑メラノサイトと老化メラノサイトが新しい毛髪の成長を刺激する。
a-i,メラノサイト移植実験。Tyr-CreERT2およびtdTomatoコンストラクトを含むマウスからtdTomato+細胞としてメラノサイト系細胞を単離し、P21でタモキシフェンで誘導した。a-e、tdTomato+メラノサイトは、P56 Tyr-NrasQ61K;Tyr-CreERT2;tdTomato（a）およびP69 Tyr-CreERT2;BrafV600E;tdTomato母斑マウス皮膚（c）から単離され、SCIDマウス皮膚に注入された。f-i, 対照のメラノサイト系細胞を、P56の休止期（f）とP33の休止期（h）にTyr-CreERT2;tdTomatoマウスから単離し、SCIDマウスの休止期の皮膚に皮内注射した。両条件の細胞（g, i）は、注入21日後に異所性anagenを誘導しなかった。代表サンプルを(b, e, g, i)に示す。(b, e, g, i)の実験のアナジェンHFを(d)に定量した。j-o、H2O2誘導老化実験（j）。H2O2処理したメラノサイトの老化状態は、老化β-Gal染色で確認した（k, l）。H2O2処理したメラノサイト（n）は、コントロールのDiI標識メラノサイト（m）とは異なり、SCIDマウスへの注入21日後にアナゲンを誘導した。アナジェンHFは(o)で定量した。lでは、n = 4; P = 0.0112。oでは、n = 7（ビヒクル）、n = 6（H2O2）；P = 0.000024。d, l, o, n = 生物学的に独立したサンプル。P値は、対応のない両側スチューデントのt検定を用いて計算した。*p≦0.05、**p≦0.01。スケールバー、m, n - 1 mm; a, b, c, e, f-i - 2 mm; j, k - 200 μm。

出典データ

Extended Data 図4 母斑の誘導は、発毛亢進とオステオポンチンの過剰発現をもたらす。
a-b,コントロールと比較して、P2-4でタモキシフェンを誘導したTyr-CreERT2;BrafV600Eマウスは顕著な発毛を示した。代表的なP56皮膚サンプルを(a)に示す。(a)ではアナゲンHFをマークし、(b)では定量化した。bでは、P44（n=12対照、n=20変異体；P=0.00218）、P56（n=12対照、n=21変異体；P=0.000000804）、P69（n=12対照、n=16変異体；P=0. c,d,P21-25でのタモキシフェン誘導後、Tyr-CreERT2;BrafV600EマウスはP44までに母斑を形成し、P56以降異所性発毛を示し始めた。P44-100の5時点における代表的なホールマウントおよび組織学的サンプルを（c）に示し、anagen HF密度の定量化を（d）に示す。e,ELISAにおいて、SPP1レベルは、P56以降の5つの指示された時点において、一次選別されたTyr-CreERT2;BrafV600Eメラノサイトの培養5日目の上清中で有意に高くなった。P69細胞のデータも図3eに示す。eでは、P44時（n = 4; P = 0.2686）、P56時（n = 4; P = 0.0000269）、P62時（n = 4; P = 0.003095）、P69時（n = 4; P = 0.00224）、P100時（n = 4; P = 0.0035）。f-i, サイトメトリーにおいて、透過化細胞中のSPP1レベル（f, h）および非透過化細胞中の表面結合SPP1レベル（g, i）は、野生型コントロールマウス（pWT, sWT）と比較して、誘導Tyr-CreERT2;BrafV600Eマウス（pBraf, sBraf）のメラノサイトにおいて、示された時点で有意に高かった。代表的なサイトメトリープロットを(f, g)に、定量化を(h, i)に示す。P69細胞のデータも図3dに示す。hでは、P44時（pWTはn=3、pBrafはn=4；P=0.000318）、P56時（n=3；P=0.0000533）、P62時（n=3；P=0.00426）、P69時（n=3；P=0.001397）、P100時（pWTはn=3、pBrafはn=4；P=0.00000386）。iでは、P44（n = 3; P = 0.0531）、P56（n = 3; P = 0.0912）、P62（n = 3; P = 0.2495）、P69（n = 3; P = 0.291）、P100（n = 3; P = 0.00399）。j-k, 透過化（j）および非透過化メラノサイト（k）のサイトメトリーでは、Tyr-NrasQ61Kマウス（pNras, sNras）およびTyr-CreERT2;BrafV600Eマウス（pBraf, sBraf）の両方で、アイソタイプコントロールと比較してSPP1のレベルが有意に高いことが示された。左側が代表的なサイトメトリープロット、右側がjとkの定量を示している。jでは、pNras（n = 3; P = 0.00000175）、pBraf（n = 3; P = 0.00000213）。l、P69 Tyr-CreERT2;BrafV600Eマウスの皮膚は、HFのバルジ領域に隣接する真皮上部にTrp2+/Spp1+メラノサイトを含んでいた。b, d, n = 生物学的に独立したサンプル。e, h, i, j, k, n = 独立した実験。データは平均値±s.d.である。P値は、対応のない片側検定（P56のb）または両側検定（P44、P69、P100、e、h、i、j、kのb）を用いて計算した。ns、p≥0.05、*p≤0.05、**p≤0.01。スケールバー、a（ホールマウント）-1 mm; c（ホールマウント）-300 μm; c（組織学）-200 μm; a（組織学）, l - 100 μm。

出典データ

Extended Data 図5 毛周期に対するABT-737治療と非母斑メラノサイト拡大の効果。
a-b,ビヒクルとは異なり、P10およびP12におけるTyr-NrasQ61KマウスのABT-737皮下投与は、毛皮の色素沈着を減少させ、P56におけるanagen HFを減少させた（a）。アナジェンHFは(b)で定量した。c-e、メラノサイト、バルジ幹細胞、毛周期の状態に対するABT-737処理の効果。c、P56でのサイトメトリーで、Tyr-NrasQ61KマウスのTRP2+/Annexin V+メラノサイトの割合は、P10-12でのABT-737処理に反応して有意に増加した。c, n = 5; P = 0.0001816. d, P56でのサイトメトリーで、Tyr-NrasQ61KマウスにおけるCD34+/CD49f+バルジ幹細胞の存在量は、P10-12でのABT-737処理によって変化しなかった。e,P10-12でのABT-737投与は、WTマウスの正常なanagenのタイミングに影響を与えなかった-ビヒクルおよびABT-737投与動物の両方の皮膚は、P33のanagenでHFを含んでいた。eではn = 7; P = 0.2898739。f-j,メラノサイトが非母斑に拡張したマウスは正常なヘアサイクルタイミングを示した。 f-i,コントロールマウスと同様に、真皮メラノサイトが拡張したK14-Edn3マウス（f, g）および表皮メラノサイトが拡張したK14-Kitlマウス（h, i）は、P36で休止期に同期し（f, h）、P56で休止期に同期した（g, i）。j, P12-14でタモキシフェンを誘導した後、メラノサイト特異的にp53を欠失させたTyr-CreER;p53fl/flマウスは、母斑を形成せず、誘導対照マウスと同様にP56で休止期のHFを示した。b, n = 生物学的に独立したサンプル。c, d, eではn = 独立した実験。データは平均値±s.d.である。P値は対応のない両側スチューデントのt検定を用いて計算した。ns、p≥0.05、*p≤0.05、**p≤0.01。スケールバー、f-j（ホールマウント）-1 mm; a、f-j（組織学）-200 μm; e - 100 μm。

出典データ

Extended Data 図6 Tyr-NrasQ61K HFs幹細胞における遺伝子発現パターン。
a-b,Tyr-NrasQ61Kの休止期HFは、バルジマーカーと毛乳頭マーカーの正常な発現パターンを維持している。CD34（赤）とPcad（緑）の共免疫染色により、Tyr-NrasQ61K休止期HF（b）におけるこれらの発現パターンは、WT休止期HF（a）における発現パターンと一致していることが示された。バルジ細胞はCD34+でPcadlow、一方、毛乳頭（HG）細胞はCD34negでPcadhighである。 c-d、WTとTyr-NrasQ61KバルジSCのRNA-seq解析。ベン図とDEGsヒートマップを（c）に示す。ベン図は、Tyr-NrasQ61Kに特異的な21のダウンレギュレート遺伝子と104のアップレギュレート遺伝子を同定している。(d)のバブルチャートは、P56 WTバルジSCで濃縮されたGO用語（赤）と枯渇したGO用語（緑）、およびTyr-NrasQ61KバルジSCで濃縮されたGO用語（青）を示している。 e-j、単細胞RNA-seqによるバルジ幹細胞の遺伝子発現パターン。細胞クラスターは図2dに従って色分けされ、以下の通りである： C1-内側バルジ細胞、P30とP56のWTサンプルとP56のTyr-NrasQ61Kサンプルに存在；C2-anagen特異的外側バルジ細胞、P30のWTサンプルとP56のTyr-NrasQ61Kサンプルに存在；C3-telogen特異的外側バルジ細胞、P56のWTサンプルに存在；C4とC5-Tyr-NrasQ61サンプルに特異的な外側バルジ細胞。ViolinプロットはY軸に沿って正規化された発現値で示されている。 e, 外バルジマーカーの発現パターン、クラスターC2、C3、C4での濃縮を示す。 f, テロジェン期外バルジマーカーの発現パターン、クラスターC3での濃縮を示す。g, クラスターC1に濃縮されたインナーバルジマーカーの発現パターン。 i, クラスターC4に濃縮された変異マーカーの発現パターン。スケールバー、a, b - 100 μm。

Extended Data 図7 母斑モデルマウスにおけるバルジ幹細胞とメラノサイトの特性。
a, b, EdUパルス7日後のバルジ幹細胞の標識効率は、WTコントロールマウスとTyr-NrasQ61Kマウスの間で一貫していた。(a)では全てのCD34+/CD49f+バルジ幹細胞について、(b)ではそのCD34+/CD49f+/EdU+サブセットについて、代表的なサイトメトリープロット(左)とデータの定量化(右)が示されている。aではn = 3; P = 0.63929124。c-f,RNA-seqにおいて、P56 Tyr-NrasQ61KメラノサイトはP30およびP56 WTメラノサイトと異なっている。PCAを（c）に、DEGsヒートマップを（d）に示す。Tyr-NrasQ61Kメラノサイトでアップレギュレートされたセクレトーム因子とTyr-NrasQ61K/WTのフォールド変化値を(e)に示す。Tyr-NrasQ61Kメラノサイトで濃縮されたGOタームを示すバブルチャートを(f)に示す。g、メラノサイトのバルクRNA-seqデータから選択された差次発現遺伝子のqRT-PCR検証。h,P56Tyr-NrasQ61Kメラノサイトトランスクリプトームと、公表されているin vitroヒト老化メラノサイトセクレトーム（青、68％）およびin vitro SASPコア因子（緑、71％）の重なりの程度を示すベン図。i, 野生型コントロールマウスの皮膚（左）と比較して、Tyr-NrasQ61Kマウス（中）および誘導型Tyr-CreERT2;BrafV600Eマウス（右）の皮膚は、HFのバルジ領域の隣の真皮上部にTrp2+/Aurkb+メラノサイトのクラスターを含んでいた。a, b, n = 独立した実験。データは平均値±s.d.である。P値は、対応のない両側スチューデントのt検定を用いて計算した。NS, P≥ 0.05。スケールバー、i - 100 μm。

出典データ

Extended Data 図8 Tyr-NrasQ61K皮膚における発現の変化とオステオポンチン欠失の効果。
a-c,オステオポンチンの発現はTyr-NrasQ61K皮膚で増加した。a,Spp1レポーター活性はTyr-NrasQ61K皮膚で増加した。Tyr-NrasQ61K;Spp1+/-と対照のSpp1+/-P56レポーターマウスの皮膚におけるLacZ染色（青）は、LacZ+細胞の幅広い増加を示した。真皮および真皮乳頭（DP）の発現部位に印をつけた。b-c、P56 WTコントロール（b）とTyr-NrasQ61K皮膚（c）におけるKRT5（赤）とSPP1（緑）の共免疫染色。Tyr-NrasQ61Kの皮膚では、HFのバルジ領域を含む真皮コンパートメントでSPP1の発現が顕著に増加した（挿入図）。d-g, オステオポンチン欠失は、Tyr-NrasQ61Kマウスの毛周期の休止期を回復させた。Tyr-NrasQ61K;Spp1-/-マウスでは、毛周期の休止期がレスキューされた。Tyr-NrasQ61Kマウス（Extended Data Fig.1参照）とは異なり、Tyr-NrasQ61K;Spp1-/-マウスは、P18でカタゲンが同期し（d）、P30でアナゲンが同期し（e）、P44で休止期が同期し（f）、P52でほぼ休止期が同期した（g）。各時点について、代表的なSpp1-/-コントロールおよびTyr-NrasQ61K;Spp1-/-変異体皮膚サンプルを示す。各パネルの右側にホールマウントサンプル、左側に組織像を示す。スケールバー、b、c-100μm；a、d-g（ホールマウント）-500μm；a、d-g（組織学）-200μm。

Extended Data 図9 Cd44欠失の発現と発毛への影響。
a-e,Cd44および関連遺伝子の発現。a,全長バルクRNA-seqから得られたCd44アイソフォームの相対量。アイソフォームには従来の命名法を用いて番号を付け、X軸に沿って示した。Cd44vアイソフォームは "v "で、Cd44sアイソフォームは "s "で示す。皮膚細胞のタイプはY軸に沿って列記した。WT-野生型細胞、MUT-Tyr-NrasQ61K変異細胞。バルジ幹細胞は、Cd44vアイソフォーム201、202、205、208に富んでいる。 b, Cd44は、P30とP56の両方で、WTコントロールマウス（青）とTyr-NrasQ61Kマウス（オレンジ）のバルジ幹細胞のバルクRNA-seqで顕著に発現している。CD44-ICDシグナルの直接下流標的であるMmp9は、P30およびP56の両方でTyr-NrasQ61Kバルジ幹細胞で顕著に過剰発現している。 c, P56 WTおよびTyr-NrasQ61Kバルジ幹細胞におけるγセクレターゼ複合体遺伝子の発現値。平均FPKM値をb-dに示す。e、Tyr-NrasQ61K;Cd44+/-と対照のCd44+/- P56レポーターマウスにおけるLacZ染色（青）は、上皮と真皮の両方の区画で、皮膚にLacZ+細胞を示した。f, CD34+/CD49f+バルジ幹細胞の総量は、生殖細胞系列のCd44-/-マウスとWTコントロールマウスとでは変化しなかった。g,EdUパルス7日後のバルジ幹細胞の標識効率は、生殖細胞系Cd44-/-マウス対WTコントロールマウスで変化しなかった。gではn = 3; P = 0.401。h, FACSで分離したバルジ幹細胞のin vitro培養アッセイでは、CD34+/CD49f+細胞のクローン形成能は、生殖細胞系Cd44-/-マウス対WTコントロールマウスで変化しなかった。上-代表的な培養プレート、下-データの定量化。i,CD34+/CD49f+バルジ幹細胞の総存在量は、上皮特異的コンディショナルK14-Cre;Cd44fl/fl（別名Cd44fl/fl）マウス対コントロールマウスで変化しなかった。i, n = 3; P = 0.328. j, EdUパルス7日後のバルジ幹細胞の標識効率は、Cd44fl/flマウス対コントロールマウスで変化しなかった。j, n = 3; P = 0.218。k, FACSで分離したバルジ幹細胞のin vitro培養アッセイでは、CD34+/CD49f+細胞のクローン形成能は、Cd44fl/flマウス対コントロールマウスで変化しなかった。上-代表的な培養プレート、下-データの定量化。l,m,Tyr-NrasQ61K;Cd44-/-マウスは、毛周期の静止のレスキューを示した。Tyr-NrasQ61Kマウス（Extended Data Fig.1参照）とは異なり、Tyr-NrasQ61K;Cd44-/-動物はP30で同調した休止期を示し（l）、P56ではごくまれに異所性の休止期HFが見られたのみであった（m）。両時点について、代表的なCd44-/-コントロールとTyr-NrasQ61K;Cd44-/-変異体皮膚サンプルを示す。n-o、ヒトの毛母斑と隣接する正常顔面皮膚とのバルクRNA-seq。p,ヒト母斑の分泌物（青）とTyr-NrasQ61Kマウスメラノサイト分泌物（赤）および発表されたin vitro SASP（黄）の比較。b-d, f-kでは、n = 独立した実験。データは平均値±s.d.である。P値は、対応のない両側スチューデントのt検定を用いて計算した。NS, P≥ 0.05。スケールバー、e, l, m（ホールマウント）- 500 μm、e, l, m（組織学）- 200 μm。

出典データ

Extended Data 図10 皮膚母斑における老化細胞誘導発毛モデル。
a, 正常で無傷な幹細胞ニッチに隣接する老化細胞の限定的な蓄積は、ニッチを増大させ、幹細胞の活性化をもたらす。メカニズム、効果、例を模式図の下に示す。組織幹細胞-橙色（休止期）および緑色（活性化）、正常ニッチ細胞-青色、老化細胞-紫色。 b, 皮膚母斑における発毛亢進を引き起こすメカニズムの模式図。老化メラノサイトの真皮クラスター（紫色）はSASP因子（着色された幾何学図形）を分泌する。SPP1（青い四角）は老化メラノサイトの代表的なSASP因子である。CD44レセプター（黒いY字型）を介して、隣接する毛包の上皮幹細胞にシグナルを送り、早発成長に誘導する（緑の矢印）。

補足情報
補足情報
このファイルには、補足的考察、補足的図1および2、補足的参考文献が含まれています。

報告の要約
補足表1
Tyr-NrasQ61K変異マウスとコントロールマウスで選別されたバルジ幹細胞間の遺伝子発現の違い。

補足表2
出生後P56日目のTyr-NrasQ61K変異マウスおよび出生後P30日目およびP56日目のコントロールマウスから選別したバルジ幹細胞のシングルセルRNAシーケンス遺伝子発現マトリックス。

補足表3
Tyr-NrasQ61K変異マウスとコントロールマウスの細胞を組み合わせた単一細胞RNAシーケンス解析によって明らかになったバルジ幹細胞クラスター間の遺伝子発現の違い。

補足表4
Tyr-NrasQ61K変異マウスとコントロールマウスの選別された真皮メラノサイト間の遺伝子発現の差。

補足表5
バルクRNAシークエンシングによって明らかになった、母斑対母斑でない対照ヒト皮膚間の遺伝子発現の差。

補足表6
RT-PCRに用いたマウス特異的プライマーとヒト特異的プライマーの塩基配列。

出典データ
出典データ Fig.
ソースデータ Fig.
ソースデータ Fig.
ソースデータ Fig.
ソースデータ Fig.
ソースデータ図2
ソースデータ拡張データ図3
ソースデータ拡張データ Fig.
ソースデータ拡張データ Fig.
ソースデータ拡張データ Fig.
ソースデータ拡張データ図9
権利と許可
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この記事の引用
Wang,X.、Ramos,R.、Phan,A.Q.ら、老化メラノサイトによるシグナル伝達が毛髪成長を亢進させる。Nature 618, 808-817 (2023). https://doi.org/10.1038/s41586-023-06172-8

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受領
2019年9月11日

受理
2023年05月05日

発行
2023年6月21日

発行日
2023年6月22日

DOI
https://doi.org/10.1038/s41586-023-06172-8

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